Caracterización química de compuestos fenólicos con factor de protección solar de Cuphea ciliata Ruiz & Pav “hierba del toro” de bosques nublados del norte del Perú

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(1)Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA. BI. Y. TESIS II. O. Q. UI M. IC A. ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA. AC. IA. Caracterización química de compuestos fenólicos con factor de. RM. protección solar de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del toro” de. CA. DE. FA. bosques nublados del norte del Perú. TE. PARA OPTAR GRADO ACADÉMICO DE. BI BL. IO. BACHILLER EN FARMACIA Y BIOQUÍMICA. AUTOR: TANTALEAN QUEZADA, Matbeth Elizabeth ASESOR: Mg. GANOZA YUPANQUI, Mayar Luis. TRUJILLO – PERÚ 2018. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DEDICATORIA A Dios Como prioridad en mi vida, dedico este trabajo a Dios por su infinita bondad y amor, por estar presente no solo en esta etapa tan importante de mi vida, sino en todo momento ofreciéndome lo mejor y buscando lo mejor para mi persona.. A mis queridos padres Doris y Wilder. IC A. Quienes son los principales promotores de mis sueños, fuentes de mi inspiración y motivación para superarme cada día, a mi madre por estar dispuesta a acompañarme cada. UI M. larga y agotadora noche de estudio y por su amor incondicional; a mi padre por siempre. O. Y. BI. palabras que me guiaron durante mi vida universitaria.. Q. desear y anhelar lo mejor para mi vida, gracias por cada consejo y por cada una de sus. IA. A mis hermanas Matgori y Rosita. AC. Por ser mi compañía, mi apoyo y mi fuerza para seguir adelante, por los momentos que. RM. hemos disfrutado juntas sobretodo siendo mis cómplices en cada travesura. Las quiero. FA. mucho, por eso las motivo a mantener una visión de éxito en sus vidas mediante el estudio. DE. continuo.. TE. CA. A mi abue Marcionila y A mis tíos Lucho y Fernando. IO. Abuelita por tu amor y cariño, por estar a mi lado desde que era una niña al igual que mi. BI BL. abuelito que desde el cielo me ilumina y me cuida. A ustedes tíos por estar presentes en cada etapa de mi vida, festejando mis logros y brindándome su apoyo incondicional en cada decisión.. A mi amor Ewaldo Tu ayuda ha sido fundamental, has estado conmigo incluso en los momentos y situaciones difíciles, siempre apoyándome porque somos NOSOTROS los que siempre vamos a poder lograr todo. Eres una persona muy importante para mí, no solo somos pareja sino muy buenos amigos porque aprendí de ti que NUNCA SERÁ EL TIEMPO, SIEMPRE ES LA PERSONA.. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. AGRADECIMIENTO. Mi respeto y agradecimiento al Mg. Mayar Luis Ganoza Yupanqui por su asesoría, por haberme brindado la oportunidad de recurrir a su capacidad y conocimiento científico, así como también por toda la paciencia para guiarme durante la realización del presente trabajo de investigación. Al Mg. Fidel Ángel Torres Guevara de The Mountain Institute INC, coordinador del. IC A. proyecto “Etnobotánica y bioprospección vegetal de páramos y bosques nublados del norte del Perú demandas por la innovación médica y el biocomercio” financiado por el. UI M. Programa Nacional de Innovación Agraria (PNIA).. O. Q. Al Programa Nacional de Innovación Agraria (PNIA) del Instituto Nacional de. BI. Innovación Agraria (INIA) del Ministerio de Agricultura y Riego del Gobierno. Y. Peruano, a la Asociación de Productores Conservadores de los Páramos y Bosques. AC. IA. Nublados de Pacaipampa – ACOBOSPA y la Asociación de Mujeres de los Páramos de. RM. Huancabamba – AMUPPA, por brindar el financiamiento para la realización del. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. presente trabajo de investigación.. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PRESENTACIÓN. Señores miembros del jurado dictaminador:. Dando cumplimiento a lo establecido por el reglamento de trabajos de investigación de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo, someto a vuestra consideración y elevado criterio profesional el presente informe de Tesis II intitulado: Caracterización química de compuestos fenólicos con factor de. IC A. protección solar de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del toro” de bosques. UI M. nublados del norte del Perú, con el cual pretendo optar el grado de Bachiller en. Q. Farmacia y Bioquímica.. BI. O. Es propicia esta oportunidad para manifestar mi sincero reconocimiento a mi alma. Y. Mater y su plana docente, que con su capacidad y buena voluntad contribuyen en. IA. formación profesional sólida. Guardo a su criterio, señores miembros del jurado la. FA. RM. AC. calificación del presente trabajo de investigación científica.. BI BL. IO. TE. CA. DE. Trujillo, setiembre del 2018. Tantaleán Quezada, Matbeth Elizabeth. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. IC A. JURADO DICTAMINADOR. UI M. Dr. ROBERTO OSMUNDO YBAÑEZ JULCA. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. PRESIDENTE. ASESOR. BI BL. IO. TE. CA. DE. Mg. MAYAR LUIS GANOZA YUPANQUI. Dr. IVÁN MIGUEL QUISPE DÍAZ MIEMBRO. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESUMEN. El presente trabajo de investigación tiene por objetivo caracterizar químicamente los compuestos fenólicos con factor de protección solar de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del toro” de bosques nublados del norte del Perú, esta especie vegetal se identificó en el Herbario de la Universidad Nacional de Cajamarca (CPUN) y la obtención de los extractos de las hojas de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del toro” se realizó en baño de ultrasonido (hidroetanólicos), por infusión y decocción (acuosos),. IC A. posteriormente se concentró y se liofilizó; obteniéndose los extractos liofilizados de los. UI M. cinco sistemas. Los compuestos fenólicos se cuantificaron por el método de FolinCiocalteu, y fueron expresados en miligramos equivalentes de ácido gálico por gramo. O. Q. de muestra (mg EAG/g), los valores obtenidos de los extractos liofilizados oscilan entre. BI. 321,90 ± 11,31 mg EAG/g y 411,58 ± 12,16 mg EAG/g para el infuso y extracto. Y. etanólico de 70° G.L. respectivamente y para los extractos purificados con Amberlite®. AC. IA. XAD-7HP oscilan entre 642,85 ± 15,32 mg EAG/g y 686,72 ± 10,56 mg EAG/g para para el infuso y extracto etanólico de 45° G.L. respectivamente. El factor de protección. RM. solar para los extractos liofilizados oscilan entre 15,89 ± 0,05 y 24,54 ± 0,29 para el. FA. infuso y extracto etanólico de 70° G.L. respectivamente y para los extractos purificados. DE. con Amberlite® XAD-7HP oscilan entre 27,29 ± 0,31 y 29,90 ± 0,02 para el extracto. CA. etanólico de 96° G.L. y el extracto etanólico de 70° G.L. respectivamente. Los perfiles cromatográficos de cada extracto purificado con Amberlite® XAD-7HP, detectaron 9. TE. picos en todos los cromatogramas. El perfil cormatográfico del extracto etanólico de. BI BL. IO. 96°G.L. de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del toro” purificado con Amberlite® XAD-7HP presentó picos con adecuada resolución cromatográfica, de este extracto purificado el compuesto fenólico mayoritario se identificó por cromatografía líquida acoplado a espectrometría de masas, el resultado fue un tipo de glucurónido de quercetina con un tiempo de retención de 14,89 min. , una relación masa/carga 479,07980 m/z con fórmula C21 H19O13.. Palabras claves: Cuphea ciliata, Compuestos Fenólicos, Factor de Protección Solar, Cromatografía Liquida, Espectrometría de Masas. i Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT. The objective of this research work is to characterize chemically the phenolic compounds with the sun protection factor of Cuphea ciliata Ruiz & Pav. "Herb of the bull" of cloud forests of the north of Peru, this vegetal species was identified in the Herbarium of the National University of Cajamarca (CPUN) and obtaining the extracts of the leaves of Cuphea ciliata Ruiz & Pav. "Bull grass" was carried out in an. IC A. ultrasound bath (hydroethanolic), by infusion and decoction (aqueous), then it was concentrated and lyophilized; obtaining freeze-dried extracts of the five systems. The. UI M. phenolic compounds were quantified by the Folin-Ciocalteu method, and were. Q. expressed in milligrams equivalents of gallic acid per gram of sample (mg EAG/g), the. BI. O. values obtained from lyophilized extracts range between 321.90 ± 11.31 mg EAG/g and. Y. 411.58 ± 12.16 mg EAG/g for the infusate and ethanolic extract of 70% respectively. IA. and for the extracts purified with Amberlite® XAD-7HP range between 642.85 ± 15.32. AC. mg EAG/g and 686.72 ± 10.56 mg EAG/g for the infuse and ethanol extract of 45%. RM. respectively. The sun protection factor for freeze-dried extracts ranged between 15.89 ±. FA. 0.05 and 24.54 ± 0.29 for the infusate and ethanolic extract of 70% respectively and for. DE. extracts purified with Amberlite® XAD-7HP range between 27.29 ± 0.31 and 29.90 ± 0.02 for ethanolic extract of 96% and the ethanolic extract of 70% respectively.. CA. Chromatographic profiles of each extract purified with Amberlite® XAD-7HP, detected. TE. 9 peaks in all chromatograms. The cormatographic profile of ethanolic extract of 96%. IO. of Cuphea ciliata Ruiz & Pav. "Bull grass" purified with Amberlite® XAD-7HP. BI BL. presented peaks with adequate chromatographic resolution, from this purified extract the major phenolic compound was identified by liquid chromatography coupled to mass spectrometry, the result was a type of quercetin glucuronide with a time Holding time of 14.89 min. , a mass/charge ratio 479.07980 m/z with formula C21 H19O13.. Keywords: Cuphea ciliata, Phenolic Compounds, Sun Protection Factor, Liquid Chromatography, Mass Spectrometry. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ÍNDICE. Página INTRODUCCIÓN…………………………………………………… 1. II.. MATERIAL Y MÉTODO………..………………………………….. 8. III.. RESULTADOS……………………………………………………... 17. IV.. DISCUSIÓN………………………………………………………… 24. V.. CONCLUSIONES…………………………………………………... VI.. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ….…………………….... 28. 29. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. I.. 34. BI BL. IO. TE. ANEXOS………………………………………………………. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I.. INTRODUCCIÓN. Los bosques nublados son ecosistemas frágiles de elevada biodiversidad, representan el 2,5% de los bosques tropicales del mundo, constituyen una de las fuentes importantes de agua, y debido a que se presentan como islas en las cumbres montañosas su distribución es fraccionada, lo que favorece la existencia de especies habituales propias de este ecosistema, registrándose en ellos la biodiversidad más alta del planeta, como también el mayor número de especies en. IC A. extinción [1-4].. UI M. La valoración de la gran diversidad de las plantas verdes de formaciones vegetales. Q. como estos bosques se basa en la identificación de los productos metabólicos. BI. O. secundarios, que son sustancias bioactivas (gomas, resinas, mucílagos, látex,. Y. aceites esenciales, etc.) que pueden ser usadas para la alimentación, medicina y. IA. diversas industrias, o como precursores para la síntesis de otras sustancias. AC. bioactivas [1,5]. Sobre estas propiedades bioquímicas de las especies vegetales y. RM. los conocimientos tradicionales que las han utilizado exitosamente las sociedades. FA. rurales agrarias, es que se concentran actualmente las inversiones de la. DE. biotecnología [1].. CA. La biodiversidad de los bosques nublados en comparación a los bosques de la. TE. selva baja es impactante, no obstante, han sido escasamente estudiados, por eso se. IO. sabe relativamente poco de ellos, debido al alto nivel de humedad que almacenan. BI BL. del medio ambiente generan un microecosistema que es suficiente para soportar su gran densidad vegetal, esto en gran medida a que se encuentran ubicados sobre la vertiente del Pacífico y la Amazonía. Estos bosques de neblina son espacios intermedios entre el páramo y los bosques de llanuras amazónicas que tienen importantes funciones como oportunidades de alto potencial económico y dinámica ecológica regional [1].. En la diversidad de especies vegetales que presentan los bosques nublados, se encuentra a Cuphea ciliata que pertenece a la familia Lythraceae, y tiene como nombres científicos Cuphea loxensis H.B.K., Cuphea microphylla H.B.K., Cuphea serphyllifolia H.B.K. y como nombres comunes “hierba del toro”, 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. “culebrilla”, “hierba de la culebra”,”ucushpa-tacllan”. Esta especie vegetal es una hierba, sufrútice o arbusto, erguido o postrado-ascendente, ramificado desde la base, tiene unas hojas subsésiles, lineal-oblongas lanceoladas y tiene flores axilares, solitarias opuestas, formando algunas veces seudoracimos terminales, bracteados apicalmente. La parte utilizada de esta planta, es la misma planta, su corteza, hojas, flores y frutos. La forma de preparación más común por los pobladores de la zona de Huancabamba (Piura) es por decocción y es popular por sus propiedades diuréticas, laxativas y sudoríficas, e igualmente como aperitiva;. IC A. las flores como antiepilépticas y la planta machacada para curar las fracturas. En otros lugares lo emplean contra las enfermedades venéreas y por sus propiedades. Q. UI M. balsámicas contra las inflamaciones y fiebres intermitentes [6].. BI. O. En el estudio de la actividad antimicrobiana de Cuphea ciliata Ruiz & Pav.. Y. (Lythraceae) realizado por: Rodríguez O, Torrenegra R, Bustos D, se determinó la. IA. actividad antimicrobiana de fracciones de diferentes polaridades y extractos de la. AC. especie vegetal Cuphea ciliata Ruiz & Pav. frente a microorganismos Gram. RM. negativos y Gram positivo por el método de difusión en gel por perforación en. FA. placa. Las pruebas de eficacia antimicrobiana exhibieron inhibición significativa. DE. en los extractos etanólicos [7].. CA. Los compuestos fenólicos son productos secundarios de las plantas, muchos son. TE. productos de defensa ante patógenos y herbívoros, otros proveen soporte. IO. mecánico a la planta, atraen polinizadores o dispersores de frutos, algunos de ellos. BI BL. absorben la radiación ultravioleta (UV) [1].. Los niveles altos de la radiación UV causan daño y perjuicio a las moléculas biológicas de gran importancia, como los ácidos nucleicos, nucleótidos y proteínas. Estas moléculas absorben radiación UV, altamente energética, propiciando la formación de radicales libres. Los anillos aromáticos reducen la absorción de radiación UV [8].. Los polifenoles o compuestos fenólicos ayudan a prevenir el riesgo de enfermedades. crónicas. como. cáncer,. enfermedades. cardiovasculares. y. degeneración neuronal relacionada con la edad, estos compuestos fenólicos 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. químicamente son un grupo que posee en común un anillo aromático con uno o más sustituyentes hidroxilos y frecuentemente se encuentran como glicósidos, combinado con azúcares. Tienden a ser solubles en agua y son relativamente polares; pueden ser detectados por el color púrpura, verde, negro o azul que producen cuando se les agregan una solución alcohólica de cloruro férrico 1% o acuosa además la gran cantidad y variedad de compuestos fenólicos que las plantas contienen (taninos, ligninas fenilpropanoides y derivados del ácido. IC A. benzoico) hacen que sus efectos sean del tipo pleyotrópico [9, 10-12].. Para cuantificar los compuestos fenólicos totales se usa comúnmente el ensayo de. UI M. Folin-Ciocalteu, que inicialmente se usó para el análisis de proteínas tomando. Q. como ventaja la actividad del reactivo frente a residuos de tirosina presentes en las. BI. O. proteínas. Este método utiliza un mecanismo de óxido/reducción; donde. Y. interviene el reactivo de Folin-Ciocalteu que está compuesto por una mezcla de. IA. ácido fosfotúngstico (H3PW12O40) y ácido fosfomolíbdico (H3PMo12O40) y los. AC. compuestos fenólicos que contiene la muestra. El ion molibdeno (Mo+6) se reduce. RM. a su forma Mo+5 en medio alcalino por la donación de un electrón por parte de los. FA. compuestos fenólicos, obteniéndose un cromóforo azul con una longitud de onda máxima alrededor de 760 nm. Por lo tanto, la respuesta en la intensidad del color. DE. depende de la cantidad de fenoles presentes y la cantidad de grupos hidroxilos.. CA. Este método puede sufrir interferencias por otras sustancias como azúcares,. TE. aminas aromáticas, dióxido de azufre, ácido ascórbico, ácidos orgánicos. Los. IO. resultados de este análisis usualmente se expresan en equivalentes de sustancias. BI BL. patrón como el ácido gálico [11, 15,16].. El factor de protección solar (FPS), básicamente mide la capacidad que tiene una sustancia de poder absorber la radiación UV. Existen diversos compuestos capaces de absorber la radiación UV, entre estos se ha reportado que los compuestos fenólicos (flavonoides, resveratrol, picnogenol, etc.) poseen acción fotoprotectora, pero esta acción varía dependiendo del número de anillos fenólicos y la forma como estos interaccionan, se ha demostrado que estos compuestos en combinación con filtros de protección solar (benzofenona-3, benzofenona-4, avobenzona, etc.), pueden prevenir el desarrollo de cáncer cutáneo [17, 18,23].. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Se ha observado que el contenido de compuestos fenólicos, actividad antioxidante y el potencial de absorción UV son fenómenos relacionados entre sí. Generalmente se atribuye que la alta disponibilidad de compuestos fenólicos y los dobles enlaces conjugados son los responsables de la actividad antioxidante y de la absorción UV de los productos naturales, respectivamente [15-17].. Torres (2013), realizó un estudio de etnobotánica y sustancias bioactivas de las. IC A. principales especies no maderables con potencial económico de los bosques de neblina de la región Piura donde diferentes especies de dos zonas distanciadas. UI M. dentro del bosque nublado seleccionadas por diferentes expertos locales revelan,. Q. por los análisis bioquímicos, similares proporciones en su composición de. BI. O. sustancias bioactivas (fenoles, sesquiterpenlactonas, taninos y esteroides) cuyos. Y. efectos en la fisiología humana corresponden a las propiedades de uso que ellos. IA. atribuyen a esas mismas especies que crecen en forma silvestre en el bosque. La. AC. hierba del toro que utilizó fue Cuphea strigulosa Kunth que es usada. RM. tradicionalmente por los pobladores como purgante, incrementa el apetito,. FA. fortalece huesos en niños; las formas de preparación de esta especie del bosque. DE. nublado utilizada por las familias es por infusión (49%) o macerado (10%) de la planta entera. Esta especie del bosque de neblina de Huancabamba de la zona de. CA. Corazón de Jesús presenta las siguientes sustancias bioactivas: antraquinonas. TE. (5%), compuestos fenólicos (18%), sesquiterpenlactonas (18%), esteroides o. IO. triterpenoides (14%), flavonoides (10%), glucósidos cardiotónicos (13%) y. BI BL. taninos (11%); además estas sustancias bioactivas pueden atribuirle la actividad de cicatrizante y antidiarreico (antraquinonas), hepatoprotector y gastroprotector (compuestos fenólicos), diuréticos y antibacterianos (sesquiterpenlactonas), antiinflamatorios endógenos (esteroides o triterpenoides), antibacterianos, antioxidantes y anticancerígenos (flavonoides), acción cardiotónica (glucósidos cardiotónicos) y antibacterianos y expectorantes (taninos) [1].. Veliz (2016), estudió los contenidos de compuestos fenólicos y las capacidades reductoras de las cáscaras de Musa sp. “plátano”. Determinó los contenidos de compuestos fenólicos por el método colorimétrico de Folin-Ciocalteu y las capacidades reductoras por el ensayo de eliminación de radicales libres del 1,14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. difenil-2-picrilhidracilo (DPPH). Obtuvo una correlación inversa relativamente alta entre los contenidos de compuestos fenólicos y las concentraciones reductoras medias (CR50) a partir de las cáscaras de Musa sp. “plátano” (r= -0,995; p<0,001), por lo que los compuestos fenólicos de las cáscaras de Musa sp. “plátano” tienen buena capacidad reductora [19].. Zavala (2016), evaluó el contenido de compuestos fenólicos totales, la capacidad de captación de radicales libres y la absorción UV de la cáscara de Mangifera. IC A. indica L. “mango”. Los compuestos fenólicos totales se cuantificaron por el método de Folin-Ciocalteu, los valores de concentración oscilaron entre 80,45 ±. UI M. 0,05 mg EAG/g (mango criollo 2) y 44,90 ± 0,58 mg EAG/g (mango criollo 1).. BI. O. Q. [15].. Y. Polo et al. (2016), determinaron los compuestos fenólicos totales y la actividad. IA. antioxidante de extractos alcohólicos (96°, 70° y 45° G.L.) y dos extractos. AC. acuosos (infuso y decocto) al 10% p/v de Myrcianthes myrsinoides (H. B. K.). RM. Grifo procedente del distrito de Cachicadán – La Libertad, Perú; resultando en. FA. compuestos fenólicos entre 25,29 ± 0,1 mg/g (96° G.L.) y 73,80 ± 0,1 mg/g. DE. (decocto) [20].. CA. Salas (2016), evaluó la actividad antioxidante y factor de protección solar de las. TE. cáscaras de Ananas comosus (L.) Merrill cv. Cayena Lisa y Ananas comosus (L.). IO. Merrill cv. MDII. Los compuestos fenólicos se cuantificaron por el método de. BI BL. Folin-Ciocalteu, y fueron expresados en equivalentes de ácido gálico (EAG), cuyos valores son 11 mg EAG/g y 12 mg EAG/g para la “piña blanca” y “piña amarilla” respectivamente. Determinó el factor de protección solar para los extractos liofilizados encontrándose con 1,47 para piña amarilla y 1,35 para piña blanca. La correlación entre el contenido de compuestos fenólicos y la IC50 de la actividad antioxidante fue de tipo directa, con nivel de significancia menor de 0,01 [21].. Quispe et al. (2014), estudiaron el jarabe hecho de las vainas de Prosopis spp. Haciendo un extracto con metanol 50% y después extrayendo los compuestos fenólicos con Amberlite® XAD-7 que se analizaron usando un cromatógrafo 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. líquido de doble arreglo de diodos acoplado a un espectrofotómetro de masas ionizado por electrospray. Los principales compuestos fenólicos en los jarabes fueron derivados 6,8-dihexosido, glucósidos de quercetina y C-glicósidos de apigenina. Todos los jarabes carecieron de citotoxicidad hacia fibroblastos de pulmón humano y células AGS gástrico humanos con valores de IC50 > 1000 µg/mL [22].. Zavala (2017), evaluó la capacidad antioxidante, regeneradora y el factor de protección solar de la cáscara de Mangifera indica L. “mango”. Determinándose. IC A. así el factor de protección solar, siendo el “mango criollo 2” el que mostró el. UI M. mayor valor (6,54 ± 0,02). La correlación entre el factor de protección solar y la. BI. O. Q. capacidad antioxidante fue elevada y significativa (p< 0,05) [23].. Y. Con lo expuesto anteriormente y debido a que no existen muchos estudios. IA. realizados sobre dicha especie vegetal, se realizó el presente trabajo de. AC. investigación que busca contribuir con el estudio de la caracterización química de. RM. compuestos fenólicos con factor de protección solar de Cuphea ciliata Ruiz &. FA. Pav. “hierba del toro” de bosques nublados del norte del Perú y así profundizar en el conocimiento de esta especie. Es necesario un estudio minucioso de las. DE. sustancias bioactivas que se encuentran en las plantas porque estas tienen una. CA. actividad biológica o terapéutica; uno de ellos es el grupo de compuestos. TE. fenólicos. Pero no basta con investigar el contenido de fenoles y el factor de. IO. protección solar, sino también purificar, aislar e identificar los compuestos. BI BL. fenólicos más abundantes en las especies vegetales.. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Objetivo General Caracterizar químicamente los compuestos fenólicos con factor de protección solar de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del toro” de bosques nublados del norte del Perú. Objetivos Específicos 1. Determinar el contenido de compuestos fenólicos de los liofilizados de extractos hidroetanólicos, infuso y decocto de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del toro” de bosques nublados del norte del Perú, mediante el método de Folin-. IC A. Ciocalteu.. UI M. 2. Determinar el factor de protección solar de los liofilizados de extractos. Q. hidroetanólicos, infuso y decocto de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del. O. toro” de bosques nublados del norte del Perú, mediante el método. BI. espectrofotométrico.. IA. Y. 3. Determinar el porcentaje de rendimiento de los compuestos fenólicos de los. AC. liofilizados de extractos hidroetanólicos, infuso y decocto de Cuphea ciliata. RM. Ruiz & Pav. “hierba del toro” de bosques nublados del norte del Perú,. FA. purificados con Amberlite® XAD-7HP. 4. Determinar el contenido de compuestos fenólicos de los purificados de extractos. DE. hidroetanólicos, infuso y decocto de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del. CA. toro” de bosques nublados del norte del Perú, mediante el método de Folin-. TE. Ciocalteu.. IO. 5. Determinar el factor de protección solar de los purificados de extractos. BI BL. hidroetanólicos, infuso y decocto de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del toro” de bosques nublados del norte del Perú, mediante el método espectrofotométrico. 6. Determinar el perfil cromatográfico de los compuestos fenólicos purificados con Amberlite® XAD-7HP de los liofilizados de extractos hidroetanólicos, infuso y decocto de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del toro” de bosques nublados del norte del Perú, por el método cromatográfico. 7. Identificar los compuestos fenólicos con factor de protección solar de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del toro” de bosques nublados del norte del Perú, por cromatografía líquida acoplado a espectrometría de masas.. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II.. MATERIAL Y MÉTODO. 2.1. Material 2.1.1. Material de estudio 1 kg de planta entera de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del toro” 2.1.2. Material de laboratorio. IC A. 2.1.2.1. Material de vidrio. UI M. Material de uso común en el laboratorio. O. Q. 2.1.2.2. Equipos de laboratorio. Y. IA.  HPLC, Hitachi Elite Lachrom. BI.  Balanza Analítica, AND GR-200. RM. AC.  Filtro de vacío , Kontes Ultra-Ware. FA.  Sistema de purificación para obtener agua ultra pura, Thermo scientific. DE.  Sonicador, Branson 3510. CA.  Espectrofotómetro de microplacas , Fisher Scientific. TE.  Estufa , Memmert. IO.  Micropipetas de 100 µL y 1000 µL , Transferpette. BI BL.  Agitador vibrador , Heidolph Reax control.  Rotaevaporador , Heidolph  Liofilizador , Labconco  UHPLC, Thermo Fisher Scientific. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.1.2.3. Reactivos  1,1-difenil-2-picrilhidracilo, Sigma-Aldrich  Acetonitrilo grado HPLC, J.T. Baker  Ácido clorhídrico, J.T. Baker  Ácido gálico, Merck  Agua destilada. IC A.  Agua ultra pura. UI M.  Amberlite® XAD-7HP, Sigma – Aldrich. Q.  Carbonato de sodio anhidro, Merck. Y. IA.  Hidróxido de sodio, J.T. Baker. BI. O.  Etanol 96° G.L., CKF. AC.  Metanol grado HPLC, J.T. Baker. DE. FA. RM.  Reactivo de Folin-Ciocalteu, Sigma-Aldrich. CA. 2.1.2.4. Otros. TE.  Filtro jeringa de celulosa regenerada de 2,5 cm x 0,45 µm. IO.  Vial ámbar de 1,5 mL con seta y tapa. BI BL.  Filtro de nylon de 45 mm x 0,45 µm  Parafilm  Papel aluminio (rollo x 8 m). 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2. Método 2.2.1. Recolección de la muestra La especie de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del toro” fue proporcionada por el proyecto “Etnobotánica y bioprospección vegetal de páramos y bosques nublados del norte del Perú demandas por la innovación médica y el biocomercio” co-financiado por el Programa Nacional de Innovación Agraria (PNIA) del Instituto Nacional de Innovación Agraria (INIA), The Mountain. IC A. Institute INC, la Asociación de Productores Conservadores de los Páramos y Bosques Nublados de Pacaipampa – ACOBOSPA y la Asociación de Mujeres. UI M. de los Páramos de Huancabamba – AMUPPA. La especie vegetal fue. Q. recolectada en los bosques nublados comprendidos en las provincias de. BI. O. Ayabaca y Huancabamba en la región Piura a una altitud de 2800 m s. n. m., a. AC. IA. Y. una latitud de 4° 50´ 14,1´´ y a una longitud de 74° 25´ 3,85´´.. RM. 2.2.2. Identificación y determinación taxonómica de la especie. FA. La identificación botánica de la especie vegetal se realizó en el Herbario de la. DE. Universidad Nacional de Cajamarca (CPUN) con constancia de determinación. CA. taxonómica N° 001-2016-CPUN.. IO. TE. 2.2.3. Preparación de la muestra. BI BL. 2.2.3.1. Secado y pulverizado La planta entera de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. se secó en estufa a 40 °C y se pulverizó con la ayuda de un mortero. 2.2.3.2. Preparación de liofilizados El material vegetal seco fue triturado en mortero hasta obtener partículas finas, los extractos fueron preparados al 10% p/v usando cinco diferentes sistemas de extracción: dos sistemas acuosos (infusión y decocción) y tres sistemas hidroetanólicos de 96° G.L., 70° G.L. y 45° G.L., se pesó 50 g de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del toro” para cada sistema, 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. luego se colocó la primera muestra en 500 mL de agua destilada y se llevó a ebullición (decocción), la segunda muestra se colocó en 500 mL de agua destilada caliente (infusión), ambas se filtraron y se lavaron hasta completar 500 mL. La tercera muestra se colocó en 500 mL de etanol a 45º G.L., la cuarta muestra en 500 mL de etanol a 70° G.L. y la quinta muestra en 500 mL de etanol a 96° G.L. y se dejó macerar durante 8 días, después de la maceración, el material vegetal fue filtrado y lavado hasta completar 500 mL. El disolvente se evaporó hasta sequedad completa. IC A. usando un evaporador rotativo; los extractos secos resultantes se volvieron a resuspender en agua destilada, se congeló a -80 °C por 24. Q. UI M. horas y finalmente se liofilizó.. BI. O. 2.2.4. Determinación del contenido de compuestos fenólicos. Y. Los compuestos fenólicos fueron cuantificados por el método de Folin-. AC. IA. Ciocalteu usando el ácido gálico como estándar de referencia [24].. RM. 2.2.4.1 Obtención de la curva de calibración. FA. Se preparó una solución stock de ácido gálico al 0,5 mg/mL en etanol de 96° G.L., a partir de la solución patrón fueron realizadas las diluciones. DE. correspondientes para obtener una serie de concentraciones desde 0,02. CA. mg/mL hasta 0,16 mg/mL (intervalos de 0,02 mg/mL). Se tomó 25 µL de. TE. las diluciones con 125 uL del reactivo de Folin-Ciocalteu al 10% y se llevó. IO. al espectrofotómetro de microplacas con agitación intermedia por 20. BI BL. minutos a temperatura de 45 °C. Posteriormente se adicionó 100 µL de Na2CO3 al 7% y se dejó reposar por 10 minutos. Finalmente se midió en el espectrofotómetro de microplacas a una longitud de onda de 760 nm, se utilizó como blanco etanol de 96° G.L., se realizó las mediciones por triplicado y se analizó los datos de absorbancia versus la concentración en Microsoft Excel, por lo que se obtuvo la ecuación de la recta correspondiente.. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2.4.2. Cuantificación de los compuestos fenólicos de los extractos liofilizados Los extractos liofilizados se prepararon a una concentración de 1 mg/mL, luego se realizaron las diluciones para alcanzar una concentración de 0,1 mg/mL, de esto se tomó 25 µL de cada dilución con 125 µL del reactivo de Folin-Ciocalteu al 10% y posteriormente se llevó al espectrofotómetro de microplacas con agitación intermedia por 20 minutos a temperatura de 45 °C. Posteriormente se adicionó 100 µL de Na2CO3 al 7% y se dejó. IC A. reposar por 10 minutos; luego se midió en el espectrofotómetro de microplacas a una longitud de onda de 760 nm, las determinaciones se. O. Q. las absorbancias obtenidas con los extractos.. UI M. realizaron por triplicado. Finalmente se aplicó la ecuación de la recta a. Y. BI. 2.2.5. Factor de protección solar de los extractos liofilizados. IA. Se pesó 20 mg de los extractos liofilizados de Cuphea ciliata Ruiz & Pav.. AC. “hierba del toro” y fueron transferidos a una fiola de 5 mL, que contiene 3 mL. RM. de etanol para disolver el extracto y posteriormente se aforó con el mismo. FA. solvente. De esta solución se tomó una alícuota de 250 µL, se transfirió a una fiola de 5 mL, se aforó con etanol y se homogenizó, con lo cual se obtuvo una. DE. concentración final de 0,2 mg/mL, que es la concentración estandarizada. Estas. CA. soluciones son medidas por triplicado en un espectrofotómetro UV-VIS, en el. TE. rango de 290 a 320 nm.. BI BL. IO. Una vez medidos los extractos liofilizados de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del toro” a las longitudes de ondas antes mencionadas, se calculó el factor de protección solar mediante la siguiente fórmula [23,25]: 320. 𝐹𝑃𝑆 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐𝑡𝑟𝑜𝑓𝑜𝑡𝑜𝑚é𝑡𝑟𝑖𝑐𝑜 = 𝐹𝐶 𝑥 ∑[ 𝐸𝐸 (𝜆) 𝑥 𝐼 (𝜆) 𝑥 𝐴𝑏𝑠 (𝜆)] 290. Dónde: FPS: Factor de protección solar. FC: Factor de la Corrección, de valor 10. EE (λ): Efecto Eritemogénico de la radiación de longitud de onda λ. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I (λ): Intensidad del sol en la longitud de onda. Abs (λ): Absorbancia de la solución en la longitud de onda. Los valores del efecto eritemogénico (EE) versus la intensidad de la radiación (I) fueron verificadas, en la siguiente tabla, para cada longitud de onda que se usó en el análisis que fueron obtenidos por Sayre en 1979 [25,26]. EE (λ) x I (λ). 290. 0,0150. UI M. IC A. Longitud de onda (nm). 0,0817. 295. 0,2874. BI. O. Q. 300. Y. 305. AC. IA. 310. RM. 315. FA. 320. 0,1864 0,0839 0,0180 1,0002. CA. DE. Total. 0,3278. IO. TE. 2.2.6. Determinación del rendimiento de purificación de compuestos fenólicos. BI BL. Se pesó 2,5 g de cada liofilizado y se resuspendió en 50 mL de agua y se puso en contacto en un matraz con 25 g Amberlite® XAD-7HP activada durante 5 minutos en agitación continua para extraer los compuestos fenólicos, luego se filtró y se lavó la Amberlite® XAD-7HP con agua destilada, se desorbió los compuestos con metanol puro luego estos se concentraron y se liofilizaron para su almacenamiento. La Amberlite® XAD-7HP fue activada primero con HCl 0,1 N, después se lavó 3 veces con agua destilada, posteriormente fue lavada con NaOH 0,1 N y finalmente se lavó con agua: metanol (1:1) y metanol puro.. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. El rendimiento fue calculado mediante la siguiente fórmula: % Rendimiento = Cantidad de extracto purificado x 100 Cantidad de extracto liofilizado. 2.2.7. Cuantificación de compuestos fenólicos de los extractos purificados De los compuestos fenólicos obtenidos por extracción por Amberlite® XAD7HP, se procedió según lo indicado en el punto 2.2.4.2.. IC A. 2.2.8. Factor de Protección Solar de los extractos purificados. UI M. De los compuestos fenólicos obtenidos por extracción por Amberlite® XAD-. Q. 7HP, se procedió según lo indicado en el punto 2.2.5.. BI. O. 2.2.9. Perfil cromatográfico de compuestos fenólicos purificados. Y. 2.2.9.1. Sistema cromatográfico. AC. IA.  Columna: C18 (longitud 250 mm x 4,6 mm diámetro, ϕ: 5 µm). (minutos). (A). (B). (C). CA. 12%. 70%. 30%. 20%. 50%. 20. 30%. 20%. 50%. 35. 18%. 12%. 70%. DE. Agua. 18%. IO. 15. TE. 0. Acetonitrilo. Ácido fórmico 1%. Tiempo. BI BL. FA. RM.  Fase móvil: gradiente.  Flujo: 1 mL/min.  Volumen de inyección: 20 µL  Detector: Doble arreglo de diodos  Longitudes de onda: 254 nm y 330 nm  Temperatura: 25 °C. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2.10. Identificación de compuestos fenólicos con factor de protección solar por cromatografía líquida acoplado a espectrometría de masas Evaluado el factor de protección solar de los compuestos fenólicos purificados tomando como base el perfil cromatográfico, se procedió a pasar la muestra por un cromatógrafo líquido de ultra resolución acoplado a un espectrómetro de masas (UPLC-MS/MS). LC-MS/MS se realizó en un UHPLC de Separación Rápida Cuaternaria Dionex Ultimate 3000. La separación se logró en una columna C18 (50×2,1. IC A. mm; 1,7 μm; 100 Å; Phenomenex). Ácido fórmico al 0,1% v/v en H2O y. UI M. CH₃CN (con ácido fórmico al 0,1% v/v) se emplearon como fases móviles A. Q. y B, respectivamente. Las condiciones de gradiente fueron las siguientes: 0,0-. O. 15 min 3-30% B; 15-25 min 30-50% B; 25-35 min 50-90% B, 35,0-40,0 min. BI. 90% B, 40,0-45,0 min 3% B. El caudal de la fase móvil fue de 300 μL/min. ,. IA. Y. la temperatura de la columna se mantuvo a 30 °C.. AC. El UHPLC, se acopló a un espectrómetro de masas Q Exactive Plus Orbitrap. RM. (Thermo Fisher Scientific) equipado con una fuente de ión de electrospray. FA. calentado (HESI) operado en los modos de ionización positiva o negativa. El. DE. voltaje de pulverización iónica se mantuvo a 4000 o 4200 V en los modos de ionización positiva y negativa, respectivamente. La temperatura seca se ajustó. CA. a 300 °C, y el flujo de gas seco se ajustó a 10 L/min. El nitrógeno se usó. TE. como gas seco, gas nebulizador y gas de colisión. La energía de colisión se. IO. estableció en 35 eV. Los espectros HRESIMS y MS/MS se adquirieron en un. BI BL. rango m/z de 200 a 2000 u.m.a.. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2.11. Análisis de Datos La cantidad de compuestos fenólicos y el factor de protección solar de los extractos liofilizados y purificados se sometieron a un análisis de varianza (ANOVA) para verificar la diferencia entre algunos de los grupos, luego se realizó la comparación múltiple (Test de Tukey) utilizando un nivel de significancia del 95% (p<0,05); además se usó la prueba de Pearson para evaluar la existencia de correlación entre el contenido de compuestos fenólicos y el factor de protección solar de los extractos liofilizados y. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. purificados de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del toro”.. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. III.. RESULTADOS. Tabla 1. Contenido de compuestos fenólicos de los liofilizados de extractos hidroetanólicos, infuso y decocto de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del toro” Compuestos fenólicos (mg EAG/g). Decocto. 358,94 ± 10,71†. Infuso. 321,90 ± 11,31‡. Etanólico de 45° G.L.. 379,66 ± 6,76 Φ. Etanólico de 70° G.L.. 411,58 ± 12,16Ψ. O. Q. UI M. IC A. Extracto. 395,74 ± 4,38*. Y. †, ‡, Φ, Ψ,*. BI. Etanólico de 96° G.L.. Existe diferencia significativa entre los 5 grupos (n=3, p<0,05), G.L.: Gay-. FA. RM. AC. IA. Lussac. DE. Tabla 2. Factor de protección solar de los liofilizados de extractos hidroetanólicos,. CA. infuso y decocto de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del toro” FPS. IO. TE. Extracto. 19,00 ± 0,35†. Infuso. 15,89 ± 0,05‡. Etanólico de 45° G.L.. 20,83 ± 0,70Φ. Etanólico de 70° G.L.. 24,54 ± 0,29*. Etanólico de 96° G.L.. 23,44 ± 0,69*. BI BL. Decocto. †, ‡, Φ,*. Existe diferencia significativa entre 4 grupos (n=3, p<0,05), G.L.: Gay- Lussac. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 3. Rendimiento de purificación de compuestos fenólicos de los liofilizados de extractos hidroetanólicos, infuso y decocto de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del. Rendimiento (%). Decocto. 32,08. Infuso. 28,30. Etanólico de 45° G.L.. 26,08. Etanólico de 70° G.L.. 22,47. Etanólico de 96° G.L.. IC A. Extracto. UI M. toro”. IA. Y. BI. O. Q. 29,83. AC. Tabla 4. Contenido de compuestos fenólicos de los purificados de extractos. FA. RM. hidroetanólicos, infuso y decocto de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del toro”. 642,85 ± 15,32‡. IO. TE. Infuso. 645,78 ± 6,23†. CA. Decocto. 686,72 ± 10,56*. BI BL. Etanólico de 45° G.L.. †, ‡, Φ,*. Compuestos fenólicos (mg EAG/g). DE. Extracto. Etanólico de 70° G.L.. 670,63 ± 14,22 Φ. Etanólico de 96° G.L.. 684,53 ± 13,39*. Existe diferencia significativa entre 4 grupos (n=3, p<0,05), G.L.: Gay- Lussac. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 5. Factor de protección solar de los purificados de extractos hidroetanólicos, infuso y decocto de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del toro”. Decocto. 28,02 ± 0,47*. Infuso. 29,12 ± 0,07†. Etanólico de 45° G.L.. 28,06 ± 0,09*. Etanólico de 70° G.L.. 29,90 ± 0,02‡. Etanólico de 96° G.L.. 27,29 ± 0,31Φ. UI M. IC A. FPS. Q. Existe diferencia significativa entre 4 grupos (n=3, p<0,05), G.L.: Gay- Lussac. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. †, ‡, Φ,*. Extracto. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(28) BI B. LI O. TE CA. DE. FA RM. AC IA. Y. BI. O. Q. UI. M. IC. A. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Figura 1. Perfil cromatográfico a 254 y 330 nm del extracto etanólico de 96° G.L. de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del toro” purificado con Amberlite® XAD-7HP. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 6. Tiempos de retención del extracto etanólico de 96° G.L. de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del toro” purificado con Amberlite® XAD-7HP analizados por UHPLC en modo de ión negativo y modo de ión positivo. BI BL. IO. TE. Q. O. BI. Y. IA AC RM. CA. DE. Negativo. Positivo. Tiempo de Retención (min.) 0,88 1,08 3,10 8,03 12,12 13,63 14,27 14,87 15,59 19,21 20,39 20,69 21,01 23,51 28,32 28,97 34,19 35,54 39,24 39,92 41,67 1,09 3,11 4,94 8,61 9,32 9,47 13,62 14,28 14,90 15,60 16,25 17,32 20,40 21,18 23,71 29,50 31,92 34,39 34,65 39,49 39,91. IC A. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21. Abundancia Relativa 10 10 5 10 10 25 45 85 25 10 20 75 25 20 15 10 10 40 10 20 35 45 0,3 0,5 0,7 13 30 33 60 99,8 25 15 5 25 10 5 5 5 10 10 10 55. UI M. Pico. FA. Modo de Ión. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(30) BI B. LI O. TE CA. DE. FA RM. AC IA. Y. BI. O. Q. UI. M. IC. A. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Figura 2. Espectrograma ESI-MS/MS del pico con tiempo de retención 14,89 minutos del cromatograma de UHPLC. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 7. Compuestos fenólicos con factor de protección solar del extracto etanólico de 96° G.L. de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del toro” purificado con Amberlite® XAD-7HP por MS y MS/MS data [M-H]+ m/z. Fórmula. Δ ppm. 1. 14,89. 479,07980. C21 H19O13. -4,628. Fragmentos de MS m/z (Intensidad). A. RT (min.). Compuesto. Q. UI. M. IC. N°. BI B. LI O. TE CA. DE. FA RM. AC IA. Y. BI. O. 303,04849 (100%). 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/. Tipo de glucurónido de quercetina: Tiene una pérdida neutra de 176..

(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. IV. Los. compuestos. fenólicos. DISCUSIÓN. usualmente. se. determinan. mediante. el. método. espectrofotométrico de Folin - Ciocalteu que es una reacción colorimétrica de óxido reducción, usando principalmente el ácido gálico como material de referencia para cuantificar el contenido total de compuestos fenólicos en una muestra. Este método se basa en la capacidad que tienen los compuestos fenólicos para reaccionar con agentes oxidantes, lo que produce al final de la reacción la formación de un cromóforo de color. IC A. azul que es medible a una longitud de onda de 760 nm. Los resultados obtenidos (Tabla. UI M. 1) muestra los valores del contenido de compuestos fenólicos de los liofilizados de extractos hidroetanólicos, decocto e infuso expresados en miligramos equivalentes de. Q. ácido gálico por gramo de muestra (mg EAG/g). Los valores obtenidos de compuestos. BI. O. fenólicos oscilan entre 321,90 mg EAG/g para el infuso y 411,58 mg EAG/g para el. Y. extracto etanólico de 70° G.L., esto debido a que los sistemas de mediana polaridad. IA. como el extracto etanólico de 70° G.L. logran una alta eficiencia a la hora de extraer. AC. este tipo de compuestos ya que la mayoría de los compuestos de esta familia de. RM. metabolitos secundarios interaccionan con los grupos semipolares de los sistemas de. FA. electrones conjugados, además debe mencionarse que en los procesos de extracción las. DE. temperaturas elevadas usualmente alteran la composición del extracto final [11,27-31].. CA. En la evaluación del factor de protección solar mayormente se utiliza la. TE. espectrofotometría UV que es el método in vitro con mejor aplicabilidad para la. IO. evaluación inicial de sustancias con características de filtro solar, porque este método es. BI BL. rápido, simple, rentable y libre de riesgos, además de su gran precisión y sensibilidad. El FPS de los liofilizados de extractos hidroetanólicos, infuso y decocto (Tabla 2), oscilan entre 15,89 ± 0,05 y 24,54 ± 0,29 para el caso del infuso y para el extracto etanólico de 70° G.L. respectivamente. Estos valores están correlacionados directamente (Anexo 6) con el contenido de compuestos fenólicos totales dado que este tipo de compuestos son los responsables de la absorción de radiación ultravioleta gracias a su elevada deslocalización electrónica que les confiere sus enlaces pi (π) deslocalizados. Los protectores solares en la actualidad requieren de elevada concentración y/o combinación de filtros químicos y físicos para alcanzar un elevado porcentaje de protección solar, por lo cual en las personas de piel sensible (tipo I y II) los efectos alérgicos son considerables al punto de evitar el uso de estos protectores, así 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. también en los protectores solares para niños el uso de filtros químicos se encuentra restringido por los mismos efectos antes mencionados [32]. La purificación de extractos a partir de productos naturales como las plantas medicinales requieren de metodologías específicas para lograr la obtención adecuada de los productos de interés para determinado fin, por ello es necesario conocer el rendimiento de dichas metodologías, debido a que la mayoría de metodologías empleadas en investigación no suelen ser las mimas que se utilizan a nivel industrial. La purificación se realizó con Amberlite® XAD-7HP que es una resina moderadamente. IC A. polar que absorbe compuestos relativamente polares de medios acuosos. El tamaño de. UI M. partícula de esta resina oscila entre 20-60 mesh, tamaño de poro de 90 Å lo cual brinda una superficie de contacto de 450 m2/g. El mayor porcentaje de rendimiento (Tabla 3). O. Q. de la purificación con Amberlite® XAD-7HP se registró en el decocto alcanzando un. BI. 32,08%, por lo que este sistema desde ya no supone ser el adecuado en términos de. Y. eficiencia comercial, sin embargo la eficiencia en la calidad de los compuestos. AC. IA. obtenidos si logran mejorar el producto final. Así mismo es importante resaltar que el. RM. porcentaje de rendimiento de la purificación está ligado directamente a la eficiencia de los procesos de extracción inicial por lo cual los resultados obtenidos no pueden seguir. DE. FA. un patrón homogéneo [33].. Los extractos iniciales no pueden ser valorados directamente por sistemas de alta. CA. especificidad debido a que la cantidad de interferentes hacen que los resultados sean. TE. erróneos, es por ello que se requiere de una separación adecuada entre las sustancias de. IO. interés y las sustancias interferentes para reducir el error a niveles adecuados que no. BI BL. comprometan la validez de las metodologías utilizadas. Para la identificación y cuantificación de los compuestos fenólicos de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del toro” fue necesaria la purificación de los extractos iniciales, la separación de los compuestos fenólicos se llevó acabo por medio de la resina Amberlite® XAD-7HP (Tabla 4). El análisis de compuestos fenólicos totales de los extractos recuperados luego de interaccionar con esta resina alcanzaron un elevado contenido de compuestos fenólicos totales, entre los cinco sistemas el extracto etanólico de 45° G.L. alcanzó el mayor valor con un total de 686,72 ± 10,56 mg EAG/g. La eliminación de las sustancias interferentes permitió mejorar el aspecto y el manejo de los cinco sistemas [11,27-31].. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. En el análisis del FPS de los extractos purificados (Tabla 5), se evidenció un aumento en todos los valores para los cinco sistemas respecto a su extracto inicial, se alcanzó un valor de 29,90 ± 0,02 para el extracto etanólico de 70° G.L., se pudo notar que en el infuso fue el que mejor resultado obtuvo en comparación al FPS de su extracto liofilizado alcanzando casi el doble de este valor (29,12 ± 0,07). En el análisis de Tukey para el FPS de los purificados (Anexo 8) nos permitió evidenciar una similitud entre el decocto y el extracto etanólico de 45° G.L., además el mismo análisis para el contenido de compuestos fenólicos de los purificados (Anexo 7) arrojó una similitud entre el. IC A. extracto etanólico de 45° G.L. y el extracto etanólico de 96° G.L., por lo que la correlación de Pearson (Anexo 9) fue negativa entre el contenido de compuestos. UI M. fenólicos totales y el FPS de los purificados [32].. O. Q. El análisis por HPLC de los purificados de los extractos de Cuphea ciliata Ruiz & Pav.. BI. “hierba del toro” se obtiene el perfil cromatográfico (figura 1) que corresponde al. Y. extracto etanólico de 96° G.L., se elige este extracto para seguir con los demás ensayos. AC. IA. porque es el extracto que presenta mejor resolución de los picos en el perfil. RM. cromatográfico; de igual manera, los demás extractos presentan el mismo patrón en su perfil cromatográfico. En este perfil cromatográfico se identifica 9 picos por ser los más. FA. definidos y mayoritarios, los cuales se identificaron por el tiempo de retención y el. DE. lambda máximo de sus espectros UV (Anexo 13) [14, 34, 35].. CA. El tiempo de retención y abundancia relativa de los picos (Tabla 6) que se encuentran en. TE. mayor abundancia en el modo de ión negativo fue de 14,87 minutos con una abundancia. IO. relativa de 85 en el pico ocho y en el modo de ión positivo fue de 14,90 minutos con. BI BL. una abundancia relativa de 99,8 en el pico nueve en el extracto etanólico de 96° G.L. de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del toro” purificado con Amberlite® XAD-7HP analizados por UHPLC. En el modo de ión negativo y en el modo de ión positivo se ha identificado una cantidad de veintiún picos en cada uno de los modos de ión ya que estos picos son señales de compuestos fenólicos, donde en el modo de ión negativo no se identifica los picos números 5 y 6 con tiempo de retención 9,32 minutos y 9,47 minutos que se identifica en el modo de ión positivo.. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(35) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Los compuestos fenólicos con factor de protección solar del extracto etanólico de 96° G.L. de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del toro” purificado con Amberlite® XAD-7HP por MS y MS/MS data, se ha identificado un compuesto que es un tipo de glucurónido de quercetina con 176 de pérdida neutra, el tiempo de retención de 14,89 minutos (figura 2), la relación masa/carga de este compuesto es 479,07980 m/z, su fórmula C21 H19O13 y su fragmento de masa es 303,04849 con una intensidad del 100% (Tabla 7). Los posibles tipos de glucurónidos de quercetina con el mismo peso molecular son la quercetina-4'-glucurónido, quercetina 7-glucurónido, quercetina 3-O-. IC A. beta-D-glucurónido y quercetina 5-glucurónido, donde uno de estos tipos de isómeros es el que se ha identificado por MS y MS/MS, según este método no se identifica qué. UI M. tipo de isómero es el que brinda esta actividad fotoprotectora por lo que se debe de. Q. realizar una resonancia magnética y poder saber cuál es este tipo de glucurónido de. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. quercetina.. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(36) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. V.. CONCLUSIONES. 1. En el extracto etanólico de 96° G.L. de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del toro” se encontró que uno de los compuestos fenólicos es el responsable del elevado poder de protección solar que tiene un peso molecular de 479,07980 m/z y con fórmula C21 H19O13.. 2. El contenido de compuestos fenólicos de los liofilizados fue mayor en el extracto etanólico de 70° G.L. (411,58 ± 12,16 mg EAG/g) y menor en el infuso. UI M. IC A. (321,90 ± 11,31 mg EAG/g) de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del toro”.. Q. 3. El factor de protección solar de los liofilizados fue mayor en el extracto. IA. Y. BI. Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del toro”.. O. etanólico de 70° G.L. (24,54 ± 0,29) y menor en el infuso (15,89 ± 0,05) de. AC. 4. El rendimiento de los compuestos fenólicos de los liofilizados purificados con. RM. Amberlite® XAD-7HP fue mayor en el decocto (32,08%) y menor en el extracto. FA. etanólico de 70° G.L. (22,47%) de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del toro”.. DE. 5. El contenido de compuestos fenólicos de los purificados fue mayor en el. CA. extracto etanólico de 45° G.L. (686,72 ± 10,56 mg EAG/g) y menor en el infuso. IO. TE. (642,85 ± 15,32 mg EAG/g) de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del toro”.. BI BL. 6. El factor de protección solar de los purificados fue mayor en el extracto etanólico de 70° G.L. (29,90 ± 0,02) y menor en el extracto etanólico de 96° G.L. (27,29 ± 0,31) de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del toro”.. 7. El perfil cromatográfico con mejor resolución de los compuestos fenólicos purificados con Amberlite® XAD-7HP de los liofilizados fue del extracto etanólico de 96° G.L. de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del toro”.. 8.. El compuesto fenólico con factor de protección solar de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. “hierba del toro”, que se identificó fue un tipo de glucurónido de quercetina. 28. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(37) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. VI.. [1]. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. Torres F. Etnobotánica y sustancias bioactivas de las principales especies no maderables con potenciales económico de los bosques de neblina del norte del Perú. Centro de Investigación y Promoción del Campesino. Perú; 2013.. [2]. Rzedwoski J. Análisis preliminar de la flora vascular de los bosques. IC A. mesófilos de montaña de México. Acta Botánica Mexicana 1996; 35:25-. Q. Montaigne F. Marcas Ecológicas: sin escape alguno. En: National. O. [3]. UI M. 44.. Y. BI. Geographic; 2004.. IA. Toledo T. Conabio. Diversitas 2009; 83:1-6.. RM. AC. [4]. [5] Sánchez I. Especies medicinales de Cajamarca I: contribución etnobotánica,. FA. morfológica y taxonómica. Universidad Privada Antonio Guillermo. Mostacero J, Castillo F, Mejía F, Gamarra O, Charcape J, Ramírez R.. TE. [6]. CA. DE. Urrelo, Cajamarca, Perú. Fondo Editorial Lumina Cooper 2011: 227.. IO. Plantas medicinales del Perú: Taxonomía, Ecogeografía, Fenología y. BI BL. Etnobotánica. Asamblea Nacional de Rectores, Instituto de estudios universitarios “José Antonio Encinas”. Fondo Editorial 2011: 218.. [7] Rodríguez O, Torrenegra R, Bustos D. Actividad antimicrobiana de Cuphea ciliata Ruiz & Pav. (Lythraceae). Scientia Et Technica, N°33 Universidad Tecnológica de Pereira, Colombia; 2007; 8: 259-260.. [8]. Edreva A, Kostoff D. The importance of nonphotosynthetic pigments and cinnamic acid derivatives in photoprotection. Agr Ecosys Env; 2005; 106:135–146.. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

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