INVESTIGACIÓN ORIGINAL
Análisis genotípico de 11 pacientes colombianos con Síndrome
de Apert
Genotypic analysis of 11 Colombian Apert syndrome patients
Harvy M. Velasco¹ • Diana Ramírez² • Tatiana Pineda³ • Lorena Piñeros4• Tatiana Vinasco5•
Gustavo Contreras6• Clara E. Arteaga7• Alejandro Giraldo8 Recibido: 13/01/2013 / Aceptado: 25/03/2013
¹ Profesor asistente, Facultad de Medicina, Universidad Nacional. Grupo de investigación en Genética Clínica. ² Médico interno, Facultad de Salud, Universidad del Valle. Grupo de investigación en Genética Clínica. ³ Médico interno, Facultad de Salud, Universidad del Valle.
4 Estudiante Maestría en genética humana, Facultad de Medicina, Universidad Nacional*. Grupo de investigación en
Genética Clínica.
5 Estudiante Maestría en genética humana, Facultad de Medicina, Universidad Nacional*. Grupo de investigación en
Genética Clínica.
6 Profesor Asistente, Facultad de Salud, Universidad Industrial de Santander.
7 Profesor asociado, Facultad de Medicina, Universidad Nacional. Grupo de investigación en Genética Clínica. 8 Profesor asociado, Facultad de Medicina, Universidad Nacional. Grupo de investigación en Genética Clínica.
Correspondencia: [email protected]
| Resumen |
Antecedentes. El síndrome de Apert (SA) es una de las cra-neosinostosis sindrómicas más severas que afecta el neuro y viscerocraneo y además presenta alteraciones multisistémi-cas con repercusiones en aspectos físicos (aspecto general y talla baja), sensoriales (hipoacusia y trastornos visuales), cognoscitivos (retardo mental o trastornos del aprendizaje) y de inclusión laboral (sindactilia severa en manos y pies). Su etiología es la mutación del receptor 2 del factor de
crecimien-to fibroblástico (FGFR2) y se hereda de forma aucrecimien-tosómica
dominante.
Materiales y métodos. Se analizaron clínica y molecular-mente 11 pacientes con sospecha de SA. Se realizó estudio mutacional mediante RFLP para el gen FGFR2.
Resultados. Se confirmaron molecularmente los 11 pacientes
con SA, cuyas edades oscilaron desde los 0 a 32 años. Todos los pacientes presentaron el fenotipo clásico. Se encontró un 63.6% de pacientes con la mutación S252W y 36.4% con P253R.
Discusión. De los pacientes analizados, llamo la atención la presencia de talla baja y RM/RGD en algunos de ellos. Desde
el punto de vista genotípico, las frecuencias mutacionales para S252W y P253R no mostraron diferencias con relación a lo reportado mundialmente. Aunque no se disponen de datos de la incidencia de esta patología a nivel local, este estudio podría ser
el primer acercamiento para fines epidemiológicos en Colombia.
Palabras clave: Síndrome Apert, Colombia, S252W, P253R (DeCS).
Velasco HM, Ramírez D, Pineda T, Piñeros L, Vinasco T, Contreras G, Arteaga CE, Giraldo A. Análisis genotípico de 11 pacientes colombianos con Síndrome de Apert. Rev. Fac. Med. 2013; 61: 35-40.
Summary
Background. Apert Syndrome (AS) is one of the most severe syndromic craniosynostosis affecting neuro and vis-cerocranium and presenting with multisystemic anomalies altering physical aspects (general looks and short stature), sensorineural aspects (deafness and visual problems), cog-nitive development (mental retardation or trouble learning) and work inclusion (severe syndactyly in hands and feet). Its
aetiology relies on mutation of the Fibroblast Growth Factor Receptor type 2 (FGFR2) gene, inherited by an autosomal dominant path.
Materials and methods. 11 patients with suspicion of AS were clinically evaluated and molecularly tested for mutations in FGFR2 by RFLP.
Results. Patients with AS from 0 to 32 years old were analized for mutations in FGFR2 gene. All of them had the classical phenotype of the disease. 63.6% of the patients had the S252W mutation while 36.4% had the P253R mutation.
Discussion. Of all patients enrolled in this study it is not-wworthy that some of them had short stature, while others had mental retardation or global development delay. Mutational frequencies for S252W and P253R did not show difference ac-cording to what has been reported worldwide. Although there is no data about the incidence of this disease locally, this study
could be a first approach to its epidemiology in Colombia.
Key words: Apert Syndrome, Colombia, FGFR2, S252W, P253R (MeSH).
Velasco HM, Ramírez D, Pineda T, Piñeros L, Vinasco T, Contreras G, Arteaga CE, Giraldo A. Genotypic analysis of 11 Colombian Apert syndrome patients. Rev. Fac. Med. 2013; 61: 35-40.
Introducción
El Síndrome de Apert (SA) o Acrocefalosindactilia tipo I (MIM #101200) es un desorden congénito, de origen genético, con herencia autosómica dominante, descrito por primera vez por Eugene Apert y caracterizado por craneosinostosis coronal, sindactilia simétrica de las cuatro extremidades y mal-formaciones craneofaciales (1). Este síndrome es considerado como una de las formas más severas de craneosinostosis, dado su compromiso multisistémico, que incluye anomalías en Sis-tema Nervioso Central, alteraciones esqueléticas y viscerales.
Es causado por las mutaciones recurrentes S252W y P253Ren el gen del Receptor 2 del Factor de Crecimiento de Fibroblastos (FGFR2), las cuales se ubican en dos aminoáci-dos adyacentes del dominio extracelular de unión al ligando (FGFs), produciendo una ganancia de función de la vía, lo cual promueveuna aberrante diferenciación y proliferación a nivel de los osteblastos de las suturas craneales (2,3).
Este síndrome representa el 4,5% de todas las craneosinos-tosis sindrómicas y tiene una incidencia calculada en 1:60.000 recién nacidos vivos, siendo más común en ciertas regiones
geográficas como Asia, con incidencias de hasta 2:10.000.
(4,5). En Colombia no existen estadísticas formales acerca de la incidencia o prevalencia de este síndrome en la población. A continuación se presenta el análisis genotípico de una muestra de 11 pacientes no relacionados remitidos al Instituto de Genética de la Universidad Nacional con diagnostico clínico de esta entidad. Material y métodos
Previa firma del consentimiento informado, el cual fue
aprobado por el comité de ética de la Universidad Nacional, se incluyeron 11 pacientes no relacionados con sospecha clínica de SA. Luego de una revisión clínica por parte de especialis-tas, se procedió a la toma de muestra de sangre periférica. Se realizó extracción de ADN mediante Kit Mo Bio y luego se
realizó cuantificación de ADN mediante Nano drop. Se pro
-cedió a la amplificación de 467 pb del exón 7 empleando los
primeros F5´- TGACAGCCTCTGACAACACAAC-3´ y R 5´-GGAAATCAAAGAACCTGTGGC-3´ bajo las siguientes condiciones de PCR: un ciclo de denaturación inicial a 95 °C por 5 min; 35 ciclos de denaturación a 35 °C por 30 segun-dos; anealling a 62 °C por 45 segundos y extensión a 72 °C
por 45 segundos y un ciclo de extensión final a 72 °C por 10 minutos. El volumen de reacción fue de 25 μl ADN genómico a 50ng/25μl, Buffer 1X; 2mM MgCl2 , 200μM dNTPs, 0.4µM
primers F y R y 1.25U Taq ADN Polimerasa® (INVITROGEN). La visualización se realizó en geles de agarosa al 1.4% teñidos con SYBRsafe (INVITROGEN).
Para el análisis mutacional se emplearon las enzimas de res-tricción de la casa comercial Fermentas® (MboI para S252w y BglI para P253R) bajo las siguientes condiciones: Volumen de
reacción de 15µl, Buffer 1X, 6µl de amplificado de PCR y 3U
de enzima para incubación a 37°C a por 80 minutos. El revelado se llevo a cabo con geles de poliacrilamida al 9%, teñidos con SYBRsafe (INVITROGEN) y empleando el Hyperladder de 25bp (FERMENTAS).
Resultados
Se confirmó la presencia de las 2 mutaciones en el gen
FGFR2 para SA del total de 11 pacientes no relacionados con sospecha clínica. Las edades de los 11 pacientes diagnosticados
oscilaron entre los 0 meses a 32 años y su distribución por géne-ro fue de 7 hombres y 4 mujeres. Con relación a las medidas antropométricas, ninguno presentó microcefalia (datos no mostrados) y 3 pacientes presentaron una talla baja o en el límite inferior de aparición postnatal.
En cuanto a su fenotipo, todos tuvieron craneosinostosis coronal y sindactilias simétricas moderadas a severas (Figura
1). Desde el punto de vista del neurodesarrollo, uno de ellos
tenía un diagnostico confirmado de retardo mental severo, tres
presentaban retardo mental leve, 4 no tenían antecedentes de RGD / RM y en los tres pacientes neonatos no se puedo evaluar dicho compromiso, aunque ninguno presentaba encefalopatía. Finalmente llama la atención el hallazgo de 6 pacientes con edades paternas mayores a los 33 años (Tabla 1).
Figura 1. Fenotipo de una paciente con SA incluida en el estudio: A nivel craneofacial: Tendencia al aplanamiento occipital, hipoplasia mediofacial, prognatismo. En extremidades: sindactilia simétrica. Nótese corrección quirúrgica nivel de manos y pulgares prominentes.
Tabla 1. Características clínicas y genotipicas de los pacientes.
Paciente Género Edad DSM Escolaridad Origen Edad
paterna Sindactilia (percentil)Talla Genotipificación
AP1 F 8 años Normal 2º grado Bogotá 33 años Presente 116 cm(p5) P253R
AP2 F 2 años 7m Normal NA Bogotá 36 años Presente 95 cm ( p50) P253R
AP3 M 30 años Normal Primaria Pasto 36 años Presente 158 cm (<p3) S252W
AP4 F 32 años Normal Técnico Bogotá 43 años Presente 150 cm (p3) S252W
AP5 M RN NA NA Bucaramanga Sin datos Presente 50 cm (p50) S252W
AP6 M 8 años RM leve Preescolar Villavicencio 38 años Presente 122 cm (p5) S252W
AP7 M 2 años RM leve NA Bucaramanga 25 años Presente 90 cm (p25) P253R
AP8 M RN NA NA Bogotá Sin datos Presente 51 cm (p50) S252W
AP9 M 3 años RM severo NA Ubaté 25 Presente 91cm (p7) P253R
AP10 M 5m RM leve NA Córdoba 41 Presente 61cm (<p3) S252W
AP11 F RN NA NA Bogotá 22 Presente 51 cm (p10) S252W
DSM: Desarrollo psicomotor, NA: No aplica, RM leve: Retardo del desarrollo leve. R severo: Retardo del desarrollo severo. Desde el punto de vista genotípico, 7 pacientes presentaron
Figura 3. Perfil de restricción en geles de poliacrilamida empleando la enzima BgII para la detección de la mutación P253R. Ladd: ladder; AP: código del paciente; N: ADN de una personal sin el síndrome; C-: control de contaminación. Los pacientes con la mutación (AP1, AP2, AP9, AP7) muestran una banda en la parte superior del carril de aproximadamente 300bp (pares de bases) en contraste con los pacientes negativos para esa mutación.
Discusión
Dentro de los hallazgos fenotípicos clásicos del SA se encuentra craneosinostosis coronal, compromiso facial
dismórfico, alteraciones acrales con sindactilias simétricas
en manos y pies y compromiso visceral (1,6). Los pacientes incluidos en este estudio mostraron perímetros cefálicos dentro
de los límites de la normalidad, pero todos con craneosinos-tosis coronal asociado a facies compatibles con SA. Llamó la atención en este grupo, una tendencia hacia la talla baja de origen postnatal, con cerca del 27% de los pacientes en percentiles 3 o menores, tal como lo menciona la literatura, ya que estos pacientes presentan una desaceleración primaria antes de la adolescencia, ubicándolos en los p5 a 50 y luego Figura 2. Perfil de restricción en geles de poliacrilamida empleando la enzima MboI para la detección de
la mutación S252W. Ladd: ladder (; AP: código del paciente; N: ADN de una personal sin el síndrome; C-: control de contaminación. Los pacientes con la mutación (AP3, AP4, AP5, AP6, AP8, AP10, AP11) muestran una banda en la parte superior del carril de aproximadamente 250bp (pares de bases) en contraste con los pacientes negativos para esa mutación.
una desaceleración secundaria, la cual es más pronunciada con una tendencia hacia la rizomelia en miembros inferiores (7).
Al evaluar el neurodesarrollo en los pacientes con SA, la literatura menciona una frecuencia relativamente alta de
déficit cognoscitivo, entre el 34-52% (8-10); en este estudio
se reportaron 4 pacientes con RM / RGD, correspondiente al 36.4% semejante a lo reportado, aunque hay que tener pre-cauciones con estos datos por el tamaño muestral y también por la presencia de Recién Nacidos en quien aun no se podía valorar dicho compromiso.
En 1995, un estudio con 40 pacientes con SA se en-contró la presencia de las dos mutaciones relacionadas, la S252W y la P253R (11). Ambas mutaciones involucran cambios en aminoácidos adyacentes a la región de unión del receptor, aunque la mutación S252W es más frecuente y se relaciona con paladar hendido (12). Por otro lado, la mutación P253R se relaciona con sindactilia más severa en pies (11), también encontrándose este fenotipo en mo-delos murinos (13). Para el caso de la mutación S252W la frecuencia reportada es el 71% y del 26% para la P253R, estando la primera más relacionada con paladar hendido (12) y la segunda con sindactilia más severa en pies (11). En este trabajo encontramos una frecuencia mutacional muy similar a lo descrito mundialmente: 63,6% de pacientes con la mutación S252W y un 36,4% de pacientes con P253R.
Cuando alguna de las dos mutaciones están presentes, la 755C>G (S252W) o 758 C>G (P253R), los aminoácidos alternativos adyacentes a la región de unión del receptor favorecen el splicing alternativo del gen hacia la isoforma
C (originalmente debería amplificarse la isoforma B) (14), modificando su afinidad hacia una mayor promiscuidad
por sus FGFs (15-17). Esto lleva a un incremento en la
afinidad de unión del receptor a determinados ligandos, de
modo que esta vía incrementa su actividad basal, estimu-lando la activación trancripcional de genes de proliferación
(PI3K, ERK) y de diferenciación ósea (p38, ERK, RUNX2)
(18,19).
Finalmente, encontramos en más de la mitad de los casos, una edad paterna mayor a 30 años, tal como lo menciona la literatura, donde este hallazgo es frecuente en esta pa-tología (20,21).
Con este primer estudio en pacientes colombianos con SA, se pudo establecer el diagnostico molecular de forma rápida y efectiva y por otro lado, se logró describir las frecuencias mutacionales para FGFR2, las cuales fueron semejantes a las reportadas mundialmente. Se recomienda emplear herramientas moleculares como las acá descritas
para la realización de diagnósticos confirmatorios de mane -ra oportuna que redunden en un manejo clínico adecuando y en un completo asesoramiento genético.
Conflicto de interés
Ninguno declarado por los autores. Financiación
Dirección Nacional de Investigaciones (DIB) de la Uni-versidad Nacional de Colombia – Sede Bogotá
Agradecimientos
A la Dirección Nacional de Investigaciones (DIB) de la Universidad Nacional de Colombia – Sede Bogotá, por la
financiación del proyecto y a la Dra. Angela María Castro por
su aporte en la consecución algunos de los pacientes. Referencias
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