I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H

mTNF-alpha ELISA

Inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa de factor

de necrosis tumoral-alpha ratón (mTNF-alpha) en sobrenadantes de

cultivo celular, suero y plasma ratón.

BE45291

96

2-8°C

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INFORMACIÓN Y MANUAL DEL PRODUCTO

1.

USO PROPUESTO

2

2.

RESUMEN

2

3.

PRINCIPIO DEL ENSAYO

3

4.

REACTIVOS SUMINISTRADOS

4

5.

INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO

4

6.

TOMA DE LAS MUESTRAS Y INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO

4

7.

MATERIAL REQUIRIDO PERO NO SUMINISTRADO

5

8.

PRECAUCIONES DE USO

5

9.

PREPARACIÓN DE REACTIVOS

6

10. PROTOCOLO DE ENSAYO

9

11. CALCULO DE RESULTADOS

11

12. LÍMITES

12

13. PRUEBAS FUNCIONALES

13

14. INFORMACIÓN DE PEDIDOS

15

15. RESUMEN PREPARACIÓN DE REACTIVOS

16

1.

Uso Propuesto

El ELISA TNF-α ratón total es un inmunoensayo enzimático para la detección cuantitativa del TNF-α ratón.

El ELISA TNF-α ratón es para uso exclusivo en investigación. No debe utilizarse en los procedimientos diagnóstico o terapéuticos.

2.

Resumen

TNF-α es una citocina multifuncional involucrada en distintos pasajes, en la homeostasis y en la patofisiología de los mamíferos. Puede demostrar efectos biológicos opuestos que sugieren mecanismos regulatorios complejos. TNF-α se detectó por primera vez como un factor citotóxico que produce la lisis de ciertas células tumorales. El gen de TNF-α es miembro 2 de la superfamilia de TNF (que consta de, al menos, 20 miembros distintos).

La liberación de TNF-α se desencadena, principalmente, por infecciones virales y endotoxinas, lipopolisacáridos u otros componentes bacterianos, mediante el daño del tejido, el daño del ADN y por IL-1, PDFG y el mismo TNF-α. Se expresa, principalmente, en los macrófagos, pero también en monocitos, neutrófilos, linfocitos citolíticos naturales, mastocitos, células endoteliales y linfocitos activados. La expresión de TNF-α en las células endoteliales y los fibroblastos puede ser producida por la IL-17.

La expresión de otras citocinas, quimiocinas, intermediarios reactivos de oxígeno, óxido de nitrógeno y prostaglandinas se estimula mediante TNF-α. TNF-α inicialmente unido por membrana se divide en forma enzimática mediante TACE (= ADAM17). Los monómeros solubles se suman a los homotrímeros y se secretan en la sangre y otros líquidos biológicos. La forma unida por membrana y la forma soluble son biológicamente activas y se unen a los receptores de TNF TNFR1 ( = TNFRSF1A, p55-60) y TNFR2 ( = TNFRSF1B, TNFBR2, p75-80).

Una vez unidos los ligandos, los receptores forman trímeros que producen cambios en su conformación, disociación de proteínas (SODD = silenciador de los dominios de muerte, BAG4, atanógeno 4 asociado a Bcl2) y asociación de proteínas (TRADD = la proteína del dominio de muerte asociada a TNF-R1) y que producen las siguientes actividades biológicas:

- transcripción de factores y proteínas anti-apoptósicos involucrados en la proliferación y la inflamación de las células a través de la unión de TRAF2 (factor 2 asociado a TNF-R) y RIPK1 (cinasa de serina-treonina 1 que interactúa con TNF-R) y activación del factor NF-κB de la transcripción.

- proliferación y diferenciación de las células, pero también apoptosis a través de la unión de TRAF2, la activación de cinasas, la activación de c-Jun y ATF2 (pasaje de JNK-MAPK).

- apoptosis a través de la unión de FADD (proteína asociada a Fas con el dominio de muerte) con TRADD y la activación de caspasas (incluida caspasa 8 = FLICE).

- necrosis, una muerte celular independiente de las caspasas, con mediación de oxidasas NADPH, que forman un complejo con TRADD y RIPK1, que produce la generación de especies de oxígeno.

3.

Principio de Ensayo

Los pocillos de la microplaca están recubiertos con anticuerpos anti-TNF-α ratón.

Figura 1

El TNF-α ratón presente en la muestra o el estándar se une a los anticuerpos adsorbidos en los micropocillos. Se añada un

anticuerpo anti-TNF-α ratón conjugado a biotina que se une al TNF-α ratón capturado por los primeros anticuerpos.

Figura 2

Después de la incubación se elimina el anticuerpo anti-TNF-α ratón conjugado a biotina no unido mediante una etapa de lavado. Se añada una solución de estreptavidina-HRP que se une al anticuerpo anti-TNF-α ratón conjugado a biotina.

Figura 3

Después de la incubación se elimina la estreptavidina-HRP no unida mediante una etapa de lavado y se agrega una solución de Sustrato reactiva a la enzima peroxidasa a los pocillos.

Figura 4

Se forma un producto de color proporcional a la cantidad del TNF-α presente en la muestra o el estándar. La reacción es terminada por la adición de ácido y la absorbancia se mide a 450 nm. Se prepara una curva estándar a partir de 7 diluciones estándar de TNF-α ratón y se determina la concentración de TNF-α ratón en la muestra. Figura 5 Sustrato Tercera Incubación Estreptavidina-HRP _- Segunda Incubación Estándar o Muestra Conjugado Biotina Primera Incubación Micropocillos Recubiertos Anticuerpo de Recubrimiento Sustrato Reaccionado

4.

Reactivos Suministrados

1 bolsa de aluminio con una Placa de Micropocillos recubiertos con anticuerpos polyclonales anti-TNF-α ratón.

1 vial (70 µL) de Conjugado de Biotina (anticuerpos policlonales anti-TNF-α ratón) 1 vial (150 µL) con Estreptavidina-HRP

2 viales de Estándar TNF-α ratón liofilizados, 2 ng/mL después de la reconstitución 1 vial (5 mL) de Diluyente de Estándares

1 vial (12 mL) de Diluyente de Muestras

1 vial (5 mL) de Solución Buffer de Ensayo Concentrado 20x (PBS con 1 % de Tween 20 y BSA al 10 %)

1 frasco (50 mL) de Solución Buffer de Lavado Concentrado 20x (PBS con 1 % de Tween 20)

1 vial (15 mL) de Solución de Sustrato (tetrametil-benzidina) 1 vial (15 mL) de Solución de Parada (1M Ácido Fosfórico) 1 vial (0.4 mL) de Colorante Azul

1 vial (0.4 mL) de Colorante Verde 1 vial (0.4 mL) de Colorante Rojo 4 Tapas adhesivas para placas

5.

Instrucciones de Almacenamiento

Conservar los reactivos del juego de reactivos a una temperatura comprendida entre 2 °C y 8 °C. Inmediatamente después de utilizarlos deberá volver a conservar los reactivos a dicha temperatura fría (2 °C - 8 °C). En las etiquetas están las fechas de caducidad del juego de reactivos y de los reactivos. Sólo se podrá garantizar la fecha de caducidad de los componentes del juego de reactivos si se le conservan adecuadamente y si, en caso de uso reiterado de un mismo componente, el reactivo no queda contaminado en la primera manipulación.

6.

Toma de las Muestras y Instrucciones de Almacenamiento

Se analizaron sobrenadantes de cultivos celulares, suero y plasma (EDTA, citrato) con este ensayo. Otras muestras biológicas pueden ser adecuadas para su uso en el ensayo. Separe el suero o plasma del coágulo o de las células lo más pronto posible después de la coagulación y separación.

Las muestras que contienen un precipitado visible deben ser aclararadas antes de su uso en el ensayo. No utilize muestras altamente hemolizadas o lipémicas.

Las muestras deben ser alícuotadas y se debe congelar a -20 °C para evitar la pérdida de TNF-α ratón bioactivo. Si se van a usar las muestras dentro de las 24 horas, se puede almacenar ente 2 °C y 8 °C (para la estabilidad de la muestra consulte el cápitulo 13.5).

Evite ciclos repetidos de congelación-descongelación. Antes del ensayo, la muestra congelada debe alcanzar lentamente la temperatura ambiente y ser mezclada suavemente.

7.

Material Requirido Pero No Suministrado

- Pipetas graduadas de 5 mL y 10 mL

- Micropipetas monocanales de 5 µL a 1000 µL con puntas desechables - Micropipetas multicanales de 50 µL a 300 µL con puntas desechables - Depósito para micropipetas multicanales

- Vasos de precipitados, matraz, probeta, necesarios para la preparación de reactivos

- Frasco lavador, sistema automatizado o semi-automatizado de lavado de placas de microtitulación - Fotómetro para placas de microtitulación capaz de leer absorbancias a 450 nm

(opcional: 620 nm longitud de onda de referencia) - Agua bidestilada o deionizada en un recipiente de vidrio

- Programa estadístico informático para llevar a cabo un análisis de regresión

8.

Precauciones de Uso

- Todos los productos químicos deben considerarse potencialmente peligrosos. Por lo tanto, recomendamos que este producto sea manipulado únicamente por aquellas personas que hayan sido entrenadas en técnicas de laboratorio y que sea usado de acuerdo con los principios de buenas prácticas de laboratorio. Se debe llevar ropa de protección apropiada como puedan ser las batas de laboratorio, gafas de seguridad y guantes. Se debe trabajar con cuidado para evitar cualquier contacto con piel y ojos. En el caso de que tenga lugar un contacto con piel u ojos, proceder de forma inmediata a lavar la parte afectada con abundante agua. Véase la(s) hoja(s) de seguridad y/o declaraciones de seguridad para recomendaciones específicas.

- Los reactivos están destinados para un uso en diagnóstico in vitro y no se deben usar en procedimientos diagnósticos o terapéuticos.

- No mezcle o sustituir los reactivos por los equivalentes de otros lotes u otras fuentes. - No use reactivos caducados.

- No exponga los reactivos del kit a una luz intensa durante su almacenamiento o incubación. - No pipetee con la boca.

- No se recomienda comer o fumar en las zonas donde se manipulen muestras o reactivos. - Evite el contacto de los reactivos del kit o de las muestras con piel o mucosas.

- Se recomienda el uso de guantes desechables de goma o látex durante la manipulación de las muestras y reactivos.

- Evite el contacto de la solución de sustrato con agentes oxidantes y metales. - Evite salpicaduras y la generación de aerosoles.

- Con el propósito de evitar una contaminación microbiológica o contaminaciones cruzadas de reactivos y muestras que puedan invalidar el test se recomienda el uso de pipetas y/o puntas de pipetas de un solo uso.

- Use recipientes limpios y específicos de reactivos para la dispensación de reactivos de sustrato. - La exposición a los ácidos inactiva el conjugado.

- Se debe usar agua destilada o desionizada en la preparación de los reactivos. - La solución de sustrato debe de estar a temperatura ambiente antes de su uso.

- Descontaminar y disponer las muestras y todos los materiales potencialmente contaminados como si pudieran contener agentes infecciosos. El método preferente de descontaminación es un autoclavado durante un mínimo de 1 hora a 121.5 °C.

- Los residuos líquidos que no contengan ácido y los residuos neutralizados pueden ser mezclados con hipoclorito sódico en volúmenes tales que la mezcla final contenga 1.0 % de hipoclorito sódico. Dejar actuar durante 30 minutos para una efectiva descontaminación. Los residuos líquidos que contengan ácido deben ser neutralizados previamente a la adición de hipoclorito sódico.

9.

Preparación de los Reactivos

Las Soluciónes de Buffer Concentradas deben de alcanzar la temperatura ambiente y ser diluídas antes de iniciar el procedimiento del ensayo. Si en las Soluciónes de Buffer Concentradas se han formado cristales, caliente suavemente hasta su completa disolución.

9.1. Solución Buffer de Lavado (1x)

Vierta todo el contenido (50 mL) de la Solución Buffer de Lavado Concentrada (20x) en un matraz aforado de 1000 mL limpio. Rellene el matraz con agua destilada o desionizada. Mezcle suavemente para evitar la formación de espuma.

Transfiera la solución a un frasco de lavado limpio y consérvela a una temperatura entre 2 °C y 25 °C. La Solución Buffer de Lavado (1x) permanece estable durante 30 días

En función de la cantidad que vaya a necesitar, prepare la Solución Buffer de Lavado (1x) según la siguiente tabla:

Número de Tiras Solución Buffer de Lavado Concentrada (20x) (mL) Agua Destilada (mL) 1 - 6 25 475

1 - 12 50 950

9.2. Solución Buffer de Ensayo (1x)

Vierta todo el contenido (5 mL) de la Solución Buffer de Ensayo Concentrada (20x) en un matraz limpio aforado de 100 mL. Rellene el matraz con agua destilada o desionizada a un volumen final de 100 mL. Mezcle suavemente para evitar la formación de espuma.

Conserve la solución a una temperatura de entre 2 °C y 8 °C. La Solución Buffer de Ensayo permanece estable durante 30 días.

En función de la cantidad que vaya a necesitar, prepare la Solución Buffer de Ensayo (1x) según la siguiente tabla:

Número de Tiras Solución Buffer de Ensayo Concentrada (20x) (mL) Agua Destilada (mL) 1 - 6 2.5 47.5

1 - 12 5.0 95.0

9.3. Conjugado de Biotina

Utilice el Conjugado de Biotina dentro de 30 minutos después de su dilución.

Para el suero y la plasma prepare una dilución con una proporción de 1:100 del Conjugado de Biotina concentrado con la Solución Buffer de Ensayo (1x) en un tubo de ensayo de plástico limpio según la siguiente tabla:

Número de Tiras Conjugado de Biotina (mL) Solución Buffer de Ensayo (1x) (mL) 1 - 6 0.03 2.97

1 - 12 0.06 5.94

Para sobrenadantes de cultivo celular prepare una dilución con una proporción de 1:200 del Conjugado de

Biotina concentrado con la Solución Buffer de Ensayo (1x) en un tubo de ensayo de plástico limpio según la siguiente tabla:

Número de Tiras Conjugado de Biotina (mL) Solución Buffer de Ensayo (1x) (mL) 1 - 6 0.015 2.985

1 - 12 0.03 5.97

9.4. Estreptavidina-HRP

Utilice la Estreptavidina-HRP dentro de 30 minutos después de su dilución.

Prepare una dilución con una proporción de 1:100 de la Estreptavidina-HRP concentrada con la Solución Buffer de Ensayo (1x) en un tubo de ensayo de plástico limpio. En función de la cantidad que vaya a necesitar, prepare la Estreptavidina-HRP según la siguiente tabla:

Número de Tiras Estreptavidina-HRP (mL) Solución Buffer de Ensayo (1x) (mL) 1 – 6 0.06 5.94

9.5. Estándar TNF-α Ratón

Reconstituya el Estándar TNF-α ratón añadiendo Diluyente de Estándares (para la medición posterior de las muestras de suero o plasma) o Diluyente de Muestras (para la medición posterior de sobrenadantes

de cultivo celular).

El volumen de reconstitución está indicado en la etiqueta del vial del estándar. Gire o mezcle cuidadosamente para garantizar una solubilización completa y homogénea (concentración del estándar reconstituido = 2 ng/mL). Permita que el estándar se reconstituye durante 10-30 minutos. Mezcle bien previamente a hacer las diluciones.

Después de usar los estándares los restos no se puede almacenar y se debe desecharlos.

9.5.1.

Etiqueta 6 tubos, uno para cada curva estándar. S2, S3, S4, S5, S6, S7.

El estándar reconstuido sirve como S1.

Acto seguido, prepare diluciones en serie 1:2 para la curva estándar como sigue:

Pipetee 130 µL del Diluyente de Estándares (para la medición posterior de las muestras de suero o plasma) o Diluyente de Muestras Muestras (para la medición posterior de sobrenadantes de cultivo celular) en dasa tubo.

Pipetear 130 µL de estándar reconstituido (S1 = 2 ng/mL) en un tubo, etiquetado como S2, y mezcle (concentración del estándar S2 = 1 ng/mL).

Pipetee 130 µL de esta dilución en el segundo tubo, etiquetado como S3, y mezcle completamente antes de la siguiente transferencia. Repita la serie de diluciones 4 veces más de manera que se obtengan los diferentes puntos de la curva estándar (véase Figura 6).

Figura 6 Transfiera 130 µL TNF-α Ratón Estándar Reconstituido (S1) S1 S2 S3 S4 - S7 Desecha 130 µL Diluyente de Estándares

(para muestras de suero o plasma)

Diluyente de Muestras

(para sobrenadantes de cultivo celular)

9.6. Adición de Reactivos Colorantes: Colorante Azul, Colorante Verde,

Colorante Rojo

Para ayudar a nuestros clientes a evitar errores durante el pipeteado de los ELISA de IBL, ofrecemos una nueva herramienta para supervisar la adición de volúmenes de una solución incluso muy pequeños al pocillo de reacción al dotar de un color diferente a cada etapa del procedimiento ELISA.

Este procedimiento es opcional y no interfiere a ningún modo con los resultados del ensayo. Está diseñada para ayudar al cliente a realizar dicho ensayo aunque es un método omisible y cabe la posibilidad de seguir simplemente las instrucciones expuestas en el manual.

Como alternativa, se puede añadir a los reactivos las soluciones colorantes obtenidas de los materiales iniciales suministrados (colorante azul, colorante verde, colorante rojo), conforme a las siguientes pautas:

1. Diluyente: Antes de diluir el estándar y la muestra, añada el Colorante Azul diludo en proporción 1:250 (véase la tabla siguiente) al diluyente apropriado (1x) consiguiente de acuerdo con el protocolo. Después de añadir el Colorante

Azul, segun las instrucciones del manual.

5 mL Diluyente de Muestras 20 µL Colorante Azul 12 mL Diluyente de Muestras 48 µL Colorante Azul 50 mL Diluyente de Muestras 200 µL Colorante Azul

2. Conjugado de Biotina: Antes de diluir el Conjugado concentrado, añada el Colorante Verde diluido en una proporción de 1:100 (véase la tabla siguiente) a la Solución Buffer de Ensayo (1x) utilizado para la dilución final del conjugado. Después de añadir el Colorante Verde, siga las instrucciones del manual (Conjugado de Biotina).

3 mL Solución Buffer de Ensayo (1x) 30 µL Colorante Verde 6 mL Solución Buffer de Ensayo (1x) 60 µL Colorante Verde 12 mL Solución Buffer de Ensayo (1x) 120 µL Colorante Verde

3. Estreptavidina-HRP: Antes de diluir la Estrepavidina-HRP concentrada, añada el Colorante Rojo diluido en una proporción de 1:250 (véase la tabla siguiente) a la Solución Buffer de Ensayo (1x) utilizado para la dilución final del conjugado. Después de añadir el Colorante Rojo, siga las instrucciones del manual (Estreptavidina-HRP).

6 mL Solución Buffer de Ensayo (1x) 24 µL Colorante Rojo 12 mL Solución Buffer de Ensayo (1x) 48 µL Colorante Rojo

10. Protocolo de Ensayo

a) Determine el número de tiras necesarias para analizar el número deseado de muestras y además añada las tiras para blancos y estándares (de color). Cada muestra, estándar, blanco y la muestra de control opcional deben ser analizadas por duplicado. Retire del soporte las tiras adicionales y consérvelas, junto con el desecante suministrado en una bolsa metalizada y cerrada herméticamente, a una temperatura de 2-8 °C.

b) Prepare el Conjugado de Biotina (véase 9.3)

c) Lave las tiras 2 veces con aproximadamente 400 µL de Solución Buffer de Lavado por cada pocillo, aspirando completamente el contenido de los pocillos entre cada lavado. Permitir que la Solución Buffer de Lavado permanezca en los pocillos durante 10-15 segundos antes de su aspiración. Evite rayar la superficie de los pocillos.

Después del último lavado, golpee suavemente las tiras contra un papel absorbente o una toallita de papel para eliminar el exceso de tampón de lavado. Utilice las tiras inmediatamente después de lavadas o bien colóquelas boca abajo sobre un papel absorbente húmedo durante como máximo 15 minutos.

No deje secar los pocillos.

d) Añada 50 µL de Diluyente de Muestras por duplicado a todos los pocillos.

e) Pipetee 50 µL de los estándares diluidos (véase Preparación del Estándar 9.5.1) por duplicado en los pocillos correspondientes (véase Tabla 1).

f) Añada 50 µL de cada muestra por duplicado a los pocillos (Tabla 1).

g) Añada 50 µL del Diluyente de Estándares (para las muestras de suero o plasma) o Diluyente de

Muestras (para sobrenadantes de cultivo celular) por duplicado en los pocillos blancos. h) Añada 50 µL del Conjugado de Biotina a todos los pocillos, incluidos los pocillos blancos. Tabla 1

Tabla describiendo un ejemplo de la disposición de los blancos, estándares y muestras en las tiras de los micropocillos

1 2 3 4

A _{(2000 pg/mL)} Estándar 1 _{(2000 pg/mL)} Estándar 1 Muestra 1 Muestra 1

B _{(1000 pg/mL)} Estándar 2 _{(1000 pg/mL)} Estándar 2 Muestra 2 Muestra 2

C _{(500 pg/mL)} Estándar 3 _{(500 pg/mL)} Estándar 3 Muestra 3 Muestra 3

D _{(250 pg/mL)} Estándar 4 _{(250 pg/mL)} Estándar 4 Muestra 4 Muestra 4

E _{(125.0 pg/mL)} Estándar 5 _{(125.0 pg/mL)} Estándar 5 Muestra 5 Muestra 5

F _{(62.5 pg/mL)} Estándar 6 _{(62.5 pg/mL)} Estándar 6 Muestra 6 Muestra 6

G _{(31.3 pg/mL)} Estándar 7 _{(31.3 pg/mL)} Estándar 7 Muestra 7 Muestra 7

H Blanco Blanco Muestra 8 Muestra 8

i) Cubra la placa con una tapa e incúbela a temperatura ambiente (18-25 °C) durante 2 horas en un agitador mecánico a 400 rpm, si es posible.

(¡Girar es absolutamente necesario para obtener resultados óptimos!)

k) Retire la tapa y vacíe los pocillos. Lave los micropocillos de las tiras 6 veces según el punto b) del protocolo del test. Prosigue inmediatamente al próximo paso.

l) Añada 100 µL de Estreptavidina-HRP diluida a todos los pocillos, incluidos los del blanco.

m) Cubra la placa con una tapa e incúbela a temperatura ambiente (18-25 °C) durante 1 hora en un agitador mecánico a 400 rpm, si es posible.

n) Retire la tapa y vacíe los pocillos. Lave los micropocillos de las tiras 6 veces de según el punto b) del protocolo del test. Prosigue inmediatamente al próximo paso.

o) Pipetee 100 µL de Solución de Sustrato TMB a todos los pocillos.

p) Incube las tiras de microtitración a temperatura ambiente (18-25 °C) durante aproximadamente 30 minutos. Evite la exposición directa a la luz intensa.

Deben monitorizarse los valores DO de la placa para detener la reacción del sustrato (véase el siguiente punto de este protocolo) antes de que sea imposible registrar los pocillos positivos correctamente.

La determinación del tiempo adecuado para el desarrollo del color debe realizarse de individualmente para cada ensayo.

Se recomienda añadir la solución de parada cuando el estándar más alto presente un color azul oscuro. Alternativamente el desarrollo de color puede ser monitorizado con un lector de placas de ELISA a 620 nm. La reacción del sustrato debería ser parada cuando el Estándar 1 alcance una DO entre 0.9 y 0.95. q) Detenga la reacción enzimática pipeteando rápidamente 100 µL de la Solución de Parada en cada

pocillo. Es importante dispensar la Solución de Parada de forma rápida y uniforme en todos los pocillos para inactivar la enzima totalmente. Se debe leer los resultados inmediatamente después de añadir la Solución de Parada o, como máximo, dentro de una hora si las tiras se conservan a una temperatura entre 2-8 °C en un lugar oscuro.

r) Lea la absorbancia de cada pocillo en un espectrofotómetro utilizando 450 nm como longitud de onda principal (opcionalmente 620 nm como longitud de onda de referencia; valores entre 610 nm y 650 nm son aceptables). Utilize los pocillos de blanco para tarar el blanco del lector de placas según las instrucciones del fabricante. Determine las absorbancias de las muestras y de los estándares.

Nota: ¡Girar es absoultamente necesario para obtener resultados óptimos!

Nota: Si siguió los instrucciones del protocolo, las muestras no son diluidas. La concentración leída de la curva estándar no debe ser multiplicada con un factor de dilución.

11. CÁLCULO DE RESULTADOS

- Calcule los valores de absorbancia media para cada conjunto de duplicados de los estándares y muestras. Los duplicados deben estar dentro del 20 por ciento del valor medio.

- Construya una curva estándar marcando la absorbancia media para cada estándar en el eje-y y la concentración del TNF-α ratón en el eje-x. Trace una curva con mejor ajuste (una curva con 5 parámetros es recomendada).

- Para determinar la concentración de la TNF-α ratón circulante para cada muestra, primeramente encuentre el valor de absorbancia media en la ordenada y extienda una línea horizontal a la curva estándar. En el punto de intersección, extienda una línea vertical al eje-x y lea la concentración del TNF-α ratón.

- Cálculo de las muestras con una concentración superior del estándar 1 puede resultar en

concentraciones de TNF-α ratón incorrectas y bajas. Estas muestras requieren más predilución externa según los valores esperados de TNF-α ratón con el Diluyente de Muestras para cuantificar con precisión la concentración real de TNF-α ratón.

- Se recomienda que cada centro de pruebas establece una muestra de control con concentraciones conocidas de TNF-α ratón y se ejecuta este control adicional con cada ensayo. Si los valores obtenidos no están dentro del intervalo esperado del control, los resultados del análisis pueden ser no válidos. - En la figura 7 se muestra una representativa curva estándar. Esta curva no se puede utilizar para

obtener resultados de las pruebas. Cada laboratorio debe preparar una curva estándar por cada grupo de tiras ensayadas.

Figura 7

Representativa curva estándar para el ELISA TNF-α ratón. Se diluyó el TNF-α ratón en serie de 2 etapas en la Diluyente de Muestras. No use esta curva estándar para obtener resultados de las pruebas. Se debe ejecutar una curva estándar para cada grupo de tiras ensayadas.

Concentración (pg/mL) A bs or ci ón 4 50 n m

Tabla 2

Datos típicos del ELISA TNF-α ratón Longitud de onda: 450 nm

Longitud de onda de referencia: 620 nm

Estándar Concentración TNF-α ratón (pg/mL) D.O. (450 nm) Media D.O. C.V. (%) 1 2000.0 2.492 _2.560 2.526 1.4 2 1000.0 1.998 _1.960 1.979 1.0 3 500.0 1.521 _1.580 1.551 1.9 4 250.0 1.018 _1.031 1.024 0.6 5 125.0 0.657 _0.695 0.676 2.8 6 62.2 0.424 _0.427 0.426 0.3 7 31.1 0.320 _0.306 0.313 2.2 Blanco 0 0.071 _0.074 0.073 2.4

Los valores de DO de la curva estándar pueden variar según las condiciones de la realización del ensayo (por ejemplo operador, técnica de pipeteo, técnica de lavado o efectos de la temperatura). Por otra parte el almacenamiento del kit puede afectar la actividad enzimática y por tanto la intensidad del color. Los valores medidos siguen siendo válidos.

12. LÍMITES

- Dado que las condiciones exactas pueden variar de un ensayo a otro ensayo, se debe crear una curva estándar para cada prueba.

- La contaminación de las muestras o los reactivos por bacterias o hongos, o una contaminación cruzada entre los reactivos puede dar resultados falsos.

- Se debe utilizar puntas de pipeta desechables, matraz de vidrio o frascos de vidrio. Los frascos de vidrio reutilizables deben ser lavados antes de su uso.

- Un lavado incorrecto o inadecuado durante cada paso del procedimiento de ensayo puede conducir a resultados erróneos ya sea falsos positivos o falsos negativos. Vacíe los pocillos completamente antes de pipetear la Solución de Lavado fresca. Pipetee la Solución Buffer de Lavado en los pocillos como se especifica para cada ciclo de lavado y no deje que los pocillos estén no cubiertos durante mucho tiempo o que sequen.

13. Pruebas Funcionales

13.1. Sensibilidad

El límite de detección de TNF-α ratón definido como la concentración del analito resultando en una absorción significativamente más alta que la del medio de dilución (media más dos desviaciones estándar), se determinó de ser 3.7 pg/mL (media de 6 ensayos independientes).

13.2. Recuperación

13.2.1.

La recuperación del intra-ensayo se evaluó en tres experimentos independientes. Cada ensayo se llevó a cabo con 6 repeticiones de 7 muestras de suero que contienen diferentes concentraciones de TNF-α ratón. Se llevaron a cabo dos curvas de estándar en cada placa. Los datos en Tabla 3 muestran la concentración media de TNF-α ratón y el coeficiente de variación para cada muestra (ver Tabla 3). El coeficiente de variación intra-ensayo calculado total fue del 6.5 %.

Tabla 3

La concentración media de TNF-α ratón y el coeficiente de variación para cada muestra

Muestra Experimento Concentración Media de _{TNF-α ratón (pg/mL)} Coefficiente de Variación _(%) 1 1 2240 4.9 2 1950 3.4 3 2001 4.6 2 1 635 5.6 2 586 8.0 3 558 5.4 3 1 256 7.0 2 252 9.3 3 227 7.0 4 1 1503 5.2 2 1439 6.9 3 1465 5.5 5 1 768 4.9 2 774 9.7 3 775 4.4 6 1 581 5.2 2 512 8.0 3 535 6.0 7 1 363 6.8 2 310 7.6 3 300 8.7

13.2.2.

La recuperación inter-ensayo dentro de un laboratorio se evaluó en tres experimentos independientes. Cada ensayo se llevó a cabo con 6 repeticiones de 7 muestras de suero que contienen diferentes concentraciones de TNF-α ratón. Dos curvas de calibración se realizaron en cada placa. Los datos a continuación muestran la concentración media de TNF-α ratón y el coeficiente de variación calculado en 18 determinaciones de cada muestra (ver Tabla 4). El coeficiente de variación total calculado de inter-ensayo fue del 5.7 %

Tabla 4

La concentración media de TNF-α ratón y el coeficiente de variación para cada muestra Muestra Concentración Media de _{TNF-α ratón (pg/mL)} Coefficiente de Variación _(%)

1 2064 7.5 2 593 6.6 3 242 6.3 4 1469 2.2 5 773 0.5 6 538 6.5 7 326 10.3

13.3. Recuperación después del Enriquecimiento

La recuperación del enriquecimiento fue evaluada enriqueciendo tres niveles de TNF-α ratón en muestras combinadas de suero normal. Las recuperaciones se determinaron en tres experimentos independientes con 4 repeticiones cada uno. El suero no enriquecido fue sustraido de los valores del enriquecimiento. Para los datos de recuperación véase Tabla 5.

Tabla 5

Matriz de la Muestra Pico Máximo (%) Pico Medio (%) Pico Mínimo (%) Suero 113 106 85

Plasma (citrato) 120 109 100 Plasma (EDTA) 90 104 72 Sobrenadantes de cultivo celular 105 93 100

13.4. Dilución en Paralelo

Se analizaron muestras de suero, plasma y sobrenadantes de cultivo celular con concentraciones diferentes de TNF-α ratón mediante diluciones dobles en serie con 4 repeticiones cada uno.

Para los datos de recuperación véase Tabla 6.

Tabla 6

Recuperación de Valores Esperados Matriz de la muestra

Dilución Media (%) Intervalo (%) Suero 1:2 1:4 1:8 91 89 99 86 – 100 82 – 102 77 – 119 Plasma (citrato) 1:2 1:4 1:8 82 103 94 72 – 92 98 – 109 87 – 101 Plasma (EDTA) 1:2 1:4 1:8 99 90 113 - - - Sobrenadantes de cultivo celular 1:2 1:4 1:8 96 82 93 94 – 97 78 – 86 71 - 116

13.5. Estabilidad de Muestras

13.5.1.

Alícuotas de las muestras de suero (enriquecidas) fueron almacenadas a -20 °C y posteriormente descongeladas 5 veces y se determinó las concentraciones del TNF-α ratón. No se detectó una disminución significante de la inmunoreactividad de TNF-α ratón.

13.5.2.

Alícuotas de las muestras de suero (enriquecidas) fueron almacenadas a -20 °C, 2-8 °C, temperatura ambiente (TA) y a 37 °C, y la concentración de TNF-α ratón fue determinada después de las 24 horas. No se detectó una pérdida significante de la inmunoreactividad del TNF-α ratón durante el almacenamientoa -20 °C y a 2-8 °C.

13.6. Especificidad

El ensayo no solo detecta TNF-α ratón natural sino también TNF-α ratón recombinante. La interferencia de factores circulantes del sistema inmune fue evaluada por enriquecer estas proteínas a concentraciones fisiológicamente relevantes en un suero positivo de IL-10 ratón. No se detectaron interferencias.

14. INFORMACIÓN DE PEDIDOS

Para los pedidos póngase en contacto con:

Véase la última página.

Para preguntas técnicas comuníquese con:

e-mail: [email protected] www.IBL-International.com

15. Resumen: Preparación de Reactivos

15.1. Solución Buffer de Lavado (1x)

Añada 50 mL de la Solución Buffer de Lavado Concentrado (20x) a 950 mL de agua destilada. Número de

Tiras Solución Buffer de Lavado Concentrada (mL) Agua Destilada (mL) 1-6 25 475 1-12 50 950

15.2. Solución Buffer de Ensayo (1x)

Añada 5 mL Solución Buffer de Ensayo Concentrada (20x) a 95 mL de agua destilada. Número de

Tiras Solución Buffer de Ensayo Concentrada (mL) Agua Destilada (mL) 1-6 2.5 47.5 1-12 5.0 95.0

15.3. Conjugado de Biotina

Prepara una dilución 1:100 del Conjugado de Biotina en la Solución Buffer de Ensayo (1x) para muestras de suero o plasma:

Número de Tiras Conjugado de Biotina (mL) Solución Buffer de Ensayo (1x) (mL) 1-6 0.03 2.97

1-12 0.06 5.94 Prepara una dilución 1:200 del Conjugado de Biotina en la Solución Buffer de Ensayo (1x) para sobrenadantes de cultivo celular:

Número de Tiras Conjugado de Biotina (mL) Solución Buffer de Ensayo (1x) (mL) 1-6 0.015 2.985

1-12 0.03 5.97

15.4. Estreptavidina-HRP

Prepara una dilución 1:100 de la Estreptavidina-HRP en la Solución Buffer de Ensayo (1x):

Número de Tiras Estreptavidina-HRP (mL) Solución Buffer de Ensayo (1x) (mL) 1-6 0.06 5.94

1-12 0.12 11.88

15.5. Estándar TNF-α Ratón

Reconstituir el estándar liofilizado TNF-α ratón con Diluyente de Estándares (suero o plasma) o Diluyente de Muestras (sobrenadantes de cultivo celular).

16. Resumen de Protocolo de Ensayo

1. Determine el número necesario de tiras de la placa de microtitulación. 2. Prepara el Conjugado de Biotina.

3. Lave las tiras de la placa de microtitulación dos veces con Solución Buffer de Lavado. 4. Añada 50 µL de Diluyente de Muestras por duplicado a todos los pocillos.

5. Añada 50 µL de los estándares externamente diluidos por duplicado a todos los pocillos. 6. Añada 50 µL de muestras por duplicado a los pocillos respectivos.

7. Añada 50 µL de Diluyente de Estándares (para muestras de suero o plasma) o Diluyente de Muestras (para muestras de sobrenadantes de cultivo celular) por duplicado a los pocillos blancos. 8. Añada 50 µL de Conjugado de Biotina a todos los pocillos.

9. Cubra las tiras e incubar 2 horas a temperatura ambiente (18-25 °C). (¡Girar es absolutamente necesario para obtener resultados óptimos!) 10. Prepare Estreptavidina-HRP.

11. Vacíe y lave los pocillos 6 veces con Solución Buffer de Lavado. 12. Añada 100 µL de la Estreptavidina-HRP diluida a todos los pocillos. 13. Cubra las tiras e incubar 1 hora a temperatura ambiente (18-25 °C).

(¡Girar es absolutamente necesario para obtener resultados óptimos!) 14. Vacíe y lave los pocillos 6 veces con Solución Buffer de Lavado. 15. Añada 100 µL de Solución Sustrato TMB a todos los pocillos.

16. Incube las tiras para approximadamente 30 minutos a temperatura ambiente (18-25 °C). 17. Añada 100 µL de Solución de Parada a todos los pocillos.

18. Ajuste el fotómetro y mida la absorbancia a 450 nm.

Nota: Si siguió los instrucciones del protocolo las muestras no son diluidas. La concentración leída de la curva estándar no debe ser multiplicada con un factor de dilución.

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LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode –written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance

and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer’s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer

REF Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθµός-Κατ.:

LOT Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από:

No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων:

CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο

IVD

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Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.

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Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου.

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Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.

Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.

Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.

Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.