Multiplicación en sistema de inmersión temporal del cultivar híbrido ‘Fhia 21’ (aaab)

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(1)FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA DE LAS PLANTAS. TESIS PRESENTADA EN OPCION AL TITULO ACADEMICO DE MAGISTER SCIENTIAE EN BIOTECNOLOGIA VEGETAL. MULTIPLICACIÓN EN SISTEMA DE INMERSIÓN TEMPORAL DEL CULTIVAR HÍBRIDO ‘FHIA 21’ (AAAB). Autor: Ing. Milagros Basail Pérez. Tutor: Dr. Rafael Gómez Kosky. Ing. Victor R. Mederos Vega, MSc.. 2005. Santa Clara, CUBA..

(2) PENSAMIENTO.. ...La ciencia, en las cosas de los pueblos no es ahitar el cañón de la pluma de digestos extraños de otras sociedades y países, sino estudiar a pecho de hombre los elementos ásperos y lisos del país y acomodar al fin humano del bienestar en el decoro, los elementos peculiares de la patria... José Martí..

(3) DEDICATORIA. Si ustedes a mi sueño han dedicado lo mejor de sus vidas, entonces, todo lo bueno me hará recordarlos. A mis padres por la comprensión, la confianza y el apoyo en estos años. A mis amistades porque alimentaron la esperanza con la miel de la razón. A mi esposo Eriker porque no hay obra perfecta sin amor..

(4) AGRADECIMIENTOS. Son una parte amorosa y necesaria quines han contribuido a hacer realidad este sueño, son merecedores del mérito que significa este fruto y son principalmente los que hoy y siempre tendrán mi eterna gratitud. A mis tutores Dr. Rafael Gómez Kosky y al MSc. Victor Medero Vega porque con dedicación esmerada y talento han impulsado la idea hasta convertirla en obra. A mis familiares, hermano, esposo y amigos que dieron aliento a mis pasos. A las técnicas Marlenys Torres, Eneida Otero y Damisela Reynaldo por haber encontrado en ellas siempre su apoyo en la realización de los experimentos. A todos mis compañeros del grupo por el empeño en este trabajo y la preocupación constante, especialmente a Jorge López, a Arletys Santos, mi amiga, a Manuel Cabrera y a Julia Albert por la ayuda en los momentos precisos. A Jesús García (Chucho) por su trabajo de fotografía con tanta dedicación y paciencia. A las compañeras de la Biblioteca por su apoyo en las búsquedas bibliográficas: Raquel y Teresita. A la Ingeniera María Oliva y Reynaldo Quiñónez por su apoyo en la realización de los análisis estadísticos. A mi esposo por su gran apoyo brindado en la culminación del trabajo. A Aymé Rayas y Magaly García por su cooperación en la revisión e impresión de dichos resultados. A los trabajadores del INIVIT porque han cooperado con voluntad, talento y paciencia en el resultado que hoy puedo entregar.. A Todos Muchas Gracias..

(5) Glosario.. GLOSARIO. 6-BAP: 6 bencilaminopurina. AIA: Ácido indolacético. PBZ: Paclobutrazol. MS: Medio propuesto por Murashige y Skoog (1962). SIT: Sistema de Inmersión Temporal. AIA: ácido indolacético. cv: cultivar. FAO: Food and Agricultura Organization of the United Nations FHIA: Fundación Hondureña de Investigación Agrícola.. Tesis de Maestría..

(6) Síntesis. SINTESIS. El trabajo fue desarrollado en el Laboratorio de Biotecnología Vegetal del Instituto de Investigaciones en Viandas Tropicales (INIVIT) con el objetivo de establecer una metodología para la multiplicación en sistema de inmersión temporal (SIT) del cultivar híbrido ‘FHIA 21’ (AAAB). Se estudiaron diferentes tiempos y frecuencias de inmersión así como combinaciones de reguladores e inhibidor del crecimiento (6BAP, AIA y PBZ), volumen de medio de cultivo, momento de subcultivos, densidad de explantes por frasco para incrementar el coeficiente de multiplicación. Además, se evaluó la influencia de las condiciones de luz y el comportamiento de las vitroplantas obtenidas en la fase de aclimatización. En condiciones in vitro y ex vitro se realizaron un conjunto de evaluaciones para observar el comportamiento de las plantas. Los resultados obtenidos permitieron establecer una metodología para la micropropagación en los SIT del cv. híbrido ‘FHIA 21’ (AAAB), la cual consistió en utilizar un tiempo de inmersión de 10 minutos a una frecuencia de ocho veces por día. Para cada frasco de 10 L se inocularon 70 explantes y la renovación con 2800 ml de medio de cultivoy un tiempote cultivo de 18 días en condiciones de oscuridad permitió alcanzar la mayor productividad del material en fase de multiplicación. Además al utilizar las sales MS suplementadas con 2,0 mg.L-1 de 6-BAP; 0,65 mg.L-1 de AIA y 10,0 mg.L-1 de ácido ascórbico y 1,0 mg.L-1 de paclobutrazol, se logró disminuir el crecimiento innecesario de los tallos y hojas de los brotes en la fase de multiplicación y por lo tanto un mayor número de brotes por explantes inoculados sin la presencia de multiyemas e hiperhidricidad. En la fase de aclimatización las plantas procedentes del sistema de inmersión temporal tuvieron un comportamiento superior a las procedentes del medio de cultivo semisólido y sin la presencia de cambios fenotípicos.. Tesis de Maestría.. 1.

(7) Índice. INDICE.. Pág.. SINTESIS……………………………………………………………………………………...1 1. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………..2-4 2. REVISION BIBLIOGRAFICA………………………………………………………...5-24 2.1. Generalidades del cultivo……………………………………………………………5 2.1.1. Sistemática………………………………………………………………………….5 2.1.2. Origen y distribución…………………………………………………………….5-6 2.1.3. Anatomía y morfología……………………………………………………………. 6 2.1.4. Importancia del cultivo…………………………………………………………..7-8 2.1.5. Clasificación y características del híbrido ‘FHIA 21’ (AAAB)………………..7-8 2.2. Técnicas de cultivo de tejidos……………………………………………………….8 2.2.1. Micropropagación………………………………………………………………….8 2.2.1.1. Organogénesis. Aspectos generales…………………………………….9-10 2.2.1.2. Propagación in vitro vía organogénesis………………………………..10-13 2.2.1.3. Papel del Paclobutrazol………………………………………………….13-15 2.3. Empleo de medios líquidos. Ventajas y desventajas………………………15-16 2.4. Automatización de la micropropagación……………………………………16-17 2.4.1. Sistemas automatizados en la propagación in vitro: Biorreactores……...17-18 2.4.2. Sistemas semi-automatizados en la propagación in vitro: sistemas de inmersión temporal……………………………………………......................18-22 2.4.3. Resultados. obtenidos. en. los. sistemas. de. inmersión. temporal………………………………………………………………………..22-24 3. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………………....25-33 Procedimientos generales……………………………………………………………...25 Medios de cultivo………………………………………………………………………..25 Tesis de Maestría..

(8) Índice. Condiciones de cultivo in vitro…………………………………………………………25 Componentes del sistema de inmersión temporal…………………………………..26 Procesamiento estadístico……………………………………………………………..26 Material vegetal……………………………………………………………………...26-27 Establecimiento in vitro…………………………………………………………………27 Cosecha de los explantes en el sistema de inmersión temporal……………....27-28 3.1. Determinación del tiempo y la frecuencia en el sistema de inmersión temporal……………………………………………………………………………….28 3.1.1 Determinación del tiempo de inmersión………………………………….28-29 3.1.2. Efecto de la frecuencia de inmersión…………………………………………..29 3.2. Efecto de diferentes combinaciones de reguladores e inhibidor del crecimiento………………………………………………………………………..29-30 3.2.1. Efecto del paclobutrazol (inhibidor del crecimiento) sobre la formación de brotes axilares……………………………………………………………………..30 3.3. Determinación del volumen de medio de cultivo en el sistema de inmersión temporal…………………………………………………………………………...30-31 3.4. Determinación del momento de subcultivo en el sistema de inmersión temporal……………………………………………………………………………….31 3.5. Determinación de la densidad de explantes por frasco……………………...31 3.6. Influencia de las condiciones de luz en la multiplicación en sistema de inmersión temporal………………………………………………………………….31 3.7. Multiplicación del cv. híbrido ‘FHIA 21’ (AAAB) en el sistema de inmersión temporal……………………………………………………………………………….32 3.8. Comportamiento de las plantas en la fase de aclimatización……………32-33. Tesis de Maestría..

(9) Índice. 4.0. RESULTADOS Y DISCUSION…………………………………………………..34-57 4.1. Determinación del tiempo y la frecuencia en el sistema de inmersión temporal……………………………………………………………………………….34 4.1.1 Determinación del tiempo de inmersión…………………………………….34-36 4.1.2. Efecto de la frecuencia de inmersión……………………………………….36-38 4.2. Efecto de diferentes combinaciones de reguladores e inhibidor del crecimiento………………………………………………………………………..38-41 4.2.1. Efecto del paclobutrazol (inhibidor del crecimiento) sobre la formación de brotes axilares…………………………………………………………………41-44 4.3. Determinación del volumen de medio de cultivo en el sistema de inmersión temporal…………………………………………………………………………...45-48 4.4. Determinación del momento de subcultivo en el sistema de inmersión temporal…………………………………………………………………………...48-49 4.5. Determinación de la densidad de explantes por frasco…………………..49-51 4.6. Influencia de las condiciones de luz en la multiplicación en sistema de inmersión temporal……………………………………………………………...51-52 4.7. Multiplicación del cv. híbrido ‘FHIA 21’ (AAAB) en el sistema de inmersión temporal…………………………………………………………………………...52-56 4.8. Comportamiento de las plantas en la fase de aclimatización……………56-57 5.0. CONCLUSIONES……………………………………………………………………...58 6.0. RECOMENDACIONES………………………………………………………………..59 7.0. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS…………………………………………….60-75. Tesis de Maestría..

(10) Índice.. Tesis de Maestría..

(11) Introducción. 1. INTRODUCCIÓN. El cultivo del plátano (Musa spp) es una importante fuente de alimento para una gran parte de la población mundial, localizada principalmente en países subdesarrollados de Asia, África, América Central y del Sur, la producción anual se estimó en 32,7 millones de toneladas y los rendimientos en 63,04 ton.ha (FAO, 2004). En Cuba los plátanos tipo vianda constituyen un cultivo estratégico de elevada prioridad dentro del programa alimentario nacional debido a su capacidad de producir todos los meses del año, su elevado potencial de rendimiento, arraigados hábitos de consumo y diversidad de usos (Rodríguez, 2000). A pesar de ocupar el cuarto lugar entre las principales fuentes de alimentos (después del arroz, la leche y el trigo), son fuente importante de carbohidratos (35%), proteínas (1,2%) y fibras (6-7%); adicionalmente aportan potasio, magnesio, fósforo, calcio y vitamina A y C (Novak, 1992; Kodym y Zapata, 1999). En 1988 las áreas cultivadas con Musa spp en Cuba tenían la siguiente composición clonal: plátanos tipo vianda AAB (59,5%), plátanos burros ABB (1,5%) y plátanos fruta AAA (39,0%). Sin embargo, con la aparición de la enfermedad de la Sigatoka negra (Mycosphaerella fijiensis, Morelet) en noviembre de 1990, lo cual afectó grandemente los plátanos de tipo vianda, se redujeron considerablemente los rendimientos, provocando la desaparición de la producción en las grandes empresas (Orellana, 1994). La solución mas adecuada para reducir los daños de esta devastadora enfermedad, es el desarrollo de variedades resistentes. Desde 1984 la FHIA (Federación Hondureña de Investigaciones Agrícolas) ha venido desarrollando un amplio programa para la búsqueda de híbridos resistentes a la Sigatoka, entre ellos el híbrido ‘FHIA 21’ (AAAB), tipo French (hembra), de alto potencial de rendimiento, buena calidad y tamaño de los frutos, resistente a Fusarium oxysporum (Álvarez, 1997; Ramírez et al., 2004). Dentro de las técnicas de cultivo de tejidos, la micropropagación es una alternativa desarrollada para la producción a gran escala de plantas, que ha sido utilizada con. Tesis de Maestría.. 2.

(12) Introducción. éxito desde los años 60 del siglo pasado. La principal ventaja de esta técnica estriba en la multiplicación rápida del material clonal libre de enfermedades, fisiológicamente uniforme y con un desarrollo normal. Estas características han servido para introducir rápidamente en el mercado nuevas variedades de plantas obtenidas mediante la selección, mutación, programas de mejora y manipulación genética (Cañal, 1999). En general la micropropagación de plantas presenta algunas desventajas como son: bajos coeficientes de multiplicación, alto costo por mano de obra y la escasa posibilidad de automatización que brinda el proceso (Kitto, 1997). En los últimos tiempos se han desarrollado investigaciones sobre la automatización en la propagación de plantas, que incluyen el diseño de nuevos sistemas para la micropropagación, ya que reducen el costo por explantes, permiten una mayor optimización biológica por los altos coeficientes de multiplicación que se obtienen y un mejor comportamiento de las vitroplantas ex vitro por mayor metabolismo autotrófico durante la fase in vitro (Simontol y Robacker, 1991; Aitcken-Christie et al., 1995). Los sistemas de inmersión temporal (SIT) además de solucionar las dificultades de los cultivos en medios líquidos estáticos, abren la posibilidad de semiautomatizar algunas etapas del cultivo in vitro (Alvard et al., 1993), permiten mayor facilidad de escalado y aumentan la eficiencia biológica y productiva del material propagado (Escalona et al., 1997; Lorenzo et al., 1998; Ventura et al., 1998; Jiménez et al., 1999; Castro, 2001). Al mismo tiempo la morfología y el comportamiento fisiológico de los cultivos en los sistemas de inmersión temporal son muy semejantes a los que presentan las plantas en condiciones ex vitro, lo que permite una mayor tasa de supervivencia (Teisson y Alvard, 1994; Escalona et al., 1999). De esta forma, el cultivo en inmersión temporal puede constituir una vía alternativa de micropropagación a corto plazo, mientras, a largo plazo se venzan obstáculos biológicos que permitan la obtención eficiente de plantas y embriones somáticos en biorreactores (Escalona et al., 1999). Partiendo de la problemática anteriormente planteada y teniendo en cuenta la necesidad de desarrollar métodos de propagación más eficientes que permita. Tesis de Maestría.. 3.

(13) Introducción. incrementar el coeficiente de multiplicación en el cultivar híbrido ‘FHIA 21’ (AAAB) de plátano vianda es que se plantea la hipótesis: El empleo del sistema de inmersión temporal permitirá incrementar la formación de brotes en la fase de multiplicación in vitro del cultivar híbrido de plátano vianda ‘FHIA 21’ (AAAB). Para dar cumplimiento a esta hipótesis se proponen los siguientes objetivos: 1- Establecer las condiciones de cultivo en el sistema de inmersión temporal para el híbrido de plátano ‘FHIA 21’ (AAAB). 2- Evaluar el comportamiento de las plantas obtenidas en fase de aclimatización.. Tesis de Maestría.. 4.

(14) Revisión bibliográfica. 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. 2.1. Generalidades del cultivo. 2.1.1. Sistemática. La primera clasificación científica de los plátanos y bananos (Musa spp.) fue realizada por Linneo en 1783, citado por Robinson (1996) nombrando Musa sapientium a todos los bananos de postre, caracterizados por tener frutos dulces en su estado maduro y su consumo fresco; aunque esta clasificación no fue utilizada para diferenciarlos del grupo de los plátanos. La clasificación actual de los plátanos fue propuesta por Cronquist en 1988 (citado por Sandoval y Müller, 1999) de la manera siguiente: Clase: Monocotiledoneas Orden: Zingiberales Familia: Musaceae. Género: Musa Sección: EuMusa Especies: Musa acuminata y Musa balbisiana El género Musa está dividido en cuatro secciones, CalliMusa, AustraliMusa, EuMusa y Rhodochlamys. Todos los cultivares de bananos y plátanos han surgido de las especies de la sección EuMusa, que a su vez es la mayor y la más ampliamente distribuida geográficamente del género. La sección contiene once especies pero la mayoría de los cultivares son derivados de Musa acuminata (genoma A) y Musa balbisiana (genoma B). Los frutos maduros comestibles del diploide Musa acuminata (AA) surgen como resultado de mutaciones espontáneas. El cruzamiento espontáneo entre estos diploides comestibles y los parentales silvestres provocaron la formación de la esterilidad, híbridos comestibles, con el genoma AB, AAB, ABB, AAAB, etc. Estos grupos genómicos diferentes contribuyeron a la diversidad de los bananos comestibles, en existencia hoy (MusaDoc, 2000). 2.1.2. Origen y distribución. La península de Malaya en Asia es considerada como probable centro de origen primario del género Musa, tanto de Musa balbisiana como de Musa acuminata cuyos. Tesis de Maestría.. 5.

(15) Revisión bibliográfica. cruzamientos dieron lugar a todas las variedades comestibles conocidas en América (Belalcázar, 1991). La distribución de los plátanos y bananos comestibles fuera de Asia se cree que pudiera haber sido desde Indonesia cruzando el Océano Indico hasta Madagascar, posteriormente introducido al Este de África, Zaire y Oeste de África, donde obviamente ocurrieron mutaciones, resultando un gran número de clones. Los Portugueses transportaron los bananos del Oeste de África hasta Islas Canarias (Robinson, 1996). En cuanto a la introducción a América, el cronista Oviedo sostiene que el plátano fue llevado desde la Gran Canaria a Santo Domingo por Fray de Berlanga en 1516 y de ahí a Cuba (López, 1989). 2.1.3. Anatomía y morfología. El plátano es una planta herbácea perenne, caracterizada por un pseudotallo aéreo formado de vainas foliares. El meristemo apical emite las hojas de forma helicoidal y su morfología varía según el desarrollo de la planta; en su estado adulto posee cuatro partes: limbo, pseudopecíolo, vaina y nervadura central. El número de hojas totales de la planta depende de la edad y el cultivar (Sandoval y Müller, 1999). El cormo es un eje constituido por la raíz y el vástago que se diferencia en tallo y hojas; y entre las bases foliares circundantes del cormo se encuentra en una depresión encerrada el meristemo apical. Su sistema radical es adventicio, con raíces de primero, segundo y tercer orden; su diámetro puede variar de 5 a 10 mm, y su longitud de 3 a 5 m dependiendo del cultivar. En los extremos de las raíces del segundo orden hay considerable cantidad de pelos absorbentes (Sandoval y Müller, 1999). La inflorescencia emerge por el centro del pseudotallo y una vez desarrollada es posible distinguir tres tipos de flores: pistiladas, hermafroditas y estaminadas. Los primordios foliares se agrupan en racimos o manos, que comprenden a las flores femeninas y masculinas atrofiadas; su número depende del cultivar y el conjunto de manos conforman el racimo. El fruto es una baya que se desarrolla por partenocarpia y su forma depende del genotipo; la parte comestible es una masa de parénquima que contiene azúcar y almidón (Sandoval y Müller, 1999).. Tesis de Maestría.. 6.

(16) Revisión bibliográfica. 2.1.4. Importancia del cultivo. Los plátanos y bananos están considerados dentro de los cultivos de mayor producción mundial (Novak, et al., 1989; Roux; 1997), y sus productos constituyen el cuarto alimento más importante después del arroz, trigo y maíz en valores de toneladas producidas (Afza et al., 1996). Mientras que el plátano ocupa el segundo lugar en toneladas después de la naranja (MusaDoc, 2000). Sin embargo, los plátanos han alcanzado mayor importancia como cultivo comercial y de subsistencia en regiones lejanas de su centro de origen primario (Robinson, 1996); específicamente en los países del trópico y subtrópico, ya que se han convertido en el principal producto para la alimentación de sus habitantes y de centenares de millones de personas en países en desarrollo (Afza et al., 1996; Van Duren et al., 1996 y Crouch et al., 1998). La industria del plátano, además de generar empleo directo e indirecto en las comunidades involucradas en la producción y comercialización; ha sido un factor importante para el comercio y la exportación, no sólo en los países tradicionales del Caribe y América latina; si no también en algunos países de Asia y África que le han permitido mejorar la economía de sus naciones (Novak, 1992). En China el consumo del plátano por persona por año es alrededor de 1.5 Kg; mientras que en Oceanía es de 60 Kg y en el oriente de África superan los 250 Kg, principalmente cocinado o en cerveza (MusaDoc, 2000). En la alimentación, los bananos y plátanos son fuente importante de carbohidratos (35%), proteínas (1,2%) y fibras (6-7%); adicionalmente aportan potasio, magnesio, fósforo, calcio y vitamina A y C (Novak, 1992; Kodym y Zapata, 1999). Específicamente el consumo de bananos aporta 92 kilocalorías (USDA, 2000). Es considerado una buena fuente de vitaminas A, B1, B2 y C, por el alto contenido de Vitamina B6 ayuda a aliviar el estrés y la ansiedad. Además son utilizados para brindar sombra a grupos de cultivos, incluyendo el cacao y el café (MusaDoc, 2000). 2.1.5. Clasificación y características del híbrido ‘FHIA 21’ (AAAB). El ‘FHIA 21’ es un cultivar tetraploide ya que el conteo cromosómico de las células presenta 2n=44 cromosomas. Según Aguilar (2002) estos clones son considerados tetraploides del tipo AAAB.. Tesis de Maestría.. 7.

(17) Revisión bibliográfica. Daniells (2000) plantea que el grupo genómico del clon donante de ‘FHIA 21’ es AAAB, por lo que a partir de los tamaños diferenciales de los cromosomas de los grupos genómicos A y B según Lysák et al. (1999) pudiera explicarse la pérdida de un juego de cromosomas y la reversión del nivel de ploidía al ser sometido a las condiciones del cultivo in vitro. Según González (2005) el tipo de raquis presente tiene una forma intermedia de la yema masculina, el ápice de las brácteas ligeramente puntiagudo, lobos de color amarillo verdoso sin signos visibles de pigmentación, resultados estos que reafirman sus relaciones fitogenéticas, así como su ubicación dentro de los híbridos tetraploides. Por otra parte Álvarez (2004) y Hernández et al. (2004) plantean que los tetraploides son clones de altos rendimientos que presentan racimos con un elevado número de manos y frutos y son tolerantes a las principales plagas y enfermedades que afectan a este cultivo. Motivado por la alta productividad de los mismos, en muchas zonas de nuestro país se han sustituido los plátanos triploides por este material, con una buena aceptación por parte de la población cubana. 2.2. Técnicas de cultivo de tejidos. 2.2.1. Micropropagación. Originalmente la micropropagación se definió como “cualquier” procedimiento aséptico que comprenda la manipulación, en las plantas, de órganos, tejidos o células que produzcan poblaciones de plántulas y que permitan el desvío tanto del proceso sexual normal como de la propagación vegetativa no aséptica que se practica convencionalmente. La micropropagación clonal implica que cada una de las plántulas que se produce pueda crecer y ser fenotípica y genotípicamente idéntica a la planta original de la que se deriva (Krikorian, 1991; Villalobos, 1991; Pérez, 1997). Kitto (1997) plantea que la micropropagación constituye una industria joven con un excelente futuro, pero su incremento dependerá de desarrollo de nuevas técnicas para la automatización de los procesos y del mejoramiento de los sistemas de aclimatización de las plantas.. Tesis de Maestría.. 8.

(18) Revisión bibliográfica. 2.2.1.1. Organogénesis. Aspectos generales. La organogénesis es un evento morfogenético que se caracteriza por su desarrollo unipolar, en otras palabras, es la formación de un primordio unipolar a partir de una yema con el subsecuente desarrollo de éste en un brote vegetativo, existiendo siempre una conexión entre los nuevos brotes y el tejido paterno. Estos brotes vegetativos son posteriormente puestos a enraizar en otra etapa, vía formación de primordios de raíces y el subsecuente enraizamiento final. Los brotes pueden formarse directamente del explante (organogénesis directa) o indirectamente a partir de callos. En contraste con la embriogénesis somática, en la vía organogénica para lograr la formación de una planta completa, ya sea por la vía directa o indirectamente, se requiere de una secuencia de medios de cultivo, ya que favorecen el desarrollo de los brotes, la formación de raíces y viceversa (Jiménez, 1998). La organogénesis ha sido la base fundamental de la multiplicación vegetativa y dentro de ella pueden diferenciarse dos vías: la formación de yemas axilares y la formación de yemas adventicias 1. Formación de yemas axilares. Esta técnica se basa en la formación de brotes a partir de las yemas que se encuentran en las axilas de las hojas o primordios de hojas, los cuales son divididos y subcultivados respectivamente (Hu y Wang, 1983). Este método ha sido el más utilizado para la propagación comercial debido a la facilidad con que se ha establecido en la mayoría de las especies y a la estabilidad genética de las plantas regeneradas, siendo el sistema de regeneración en el cual se obtienen los menores índices de variación genética (Prakash, 1994; Kitto, 1997). 2. Formación de yemas adventicias. Esta técnica se basa en la formación de novo de yemas a partir de meristemos preexistentes o tejidos no meristemáticos, los cuales se originan de una o un pequeño grupo de células, cuando se cultivan los explantes en medios con concentraciones elevadas de citoquininas (Vulysteke y de Langhe, 1985). Con esta técnica es posible producir un mayor número de plantas por unidad de tiempo en comparación con el método de yemas axilares y a la vez presenta. Tesis de Maestría.. 9.

(19) Revisión bibliográfica. mayores posibilidades de mecanización-automatización, existiendo ya varios ejemplos de utilización de biorreactores para su producción (Akita et al., 1994). Sin embargo, al igual que el método de yemas axilares tiene la limitante de que el proceso productivo es realizado en dos etapas: producción de brotes y crecimientoenraizamiento, adicionalmente tiene el inconveniente de que puede ser una fuente de variación genética debido al propio origen unicelular de las yemas adventicias (Reuveni et al., 1985). 2.2.1.2. Propagación in vitro vía organogénesis. Los. métodos de propagación in vitro vía organogénesis, están basados. fundamentalmente en la proliferación de brotes axilares a partir de la formación de una plántula, mediante el cultivo aséptico de un ápice o meristemo (Vasil, 1994). Esta técnica constituye la base de la propagación masiva de plátanos y bananos, con actual vigencia en muchos países para propagar y distribuir de forma comercial y a gran escala, plantas libres de enfermedades (Afza et al., 1996). La obtención de plantas libres de patógenos mediante el cultivo de meristemos se basa en la irregularidad de la ubicación y distribución de los microorganismos dentro de los tejidos de las plantas infectadas. La concentración de virus, bacterias y micoplasmas; tiende a disminuir progresivamente hacia el ápice del tallo, razón por la cual, la posibilidad de que las células del meristemo posean menor cantidad de microorganismos o estén libres de ellos; es mayor que en tejidos más diferenciados de una misma planta (Hernández, 1997; citado por Jiménez, 1998a). Los ápices meristemáticos de plátanos y bananos, en dependencia del genotipo y/o cultivar, presentan diferentes respuestas en la formación de plantas durante el establecimiento in vitro; y posterior índice de multiplicación en la fase de multiplicación (García y Noa, 1998). La fase de multiplicación, tiene como objetivo principal la producción del mayor número posible de propágulos a partir de explantes introducidos in vitro, sin comprometer la calidad genética de las plantas generadas; esta fase es la que determina la eficiencia del proceso, Pérez et al., (1998a). La proliferación de explantes puede lograrse con la incorporación de citoquininas en el medio de cultivo, la más empleada en la mayoría de las especies es la. Tesis de Maestría.. 10.

(20) Revisión bibliográfica. 6 benzilaminopurina (6-BAP), y es casi exclusiva en la micropropagación de plátanos y bananos (Orellana, 1998a). Domínguez et al. (1995), señalaron que existen muchas controversias en las concentraciones de 6-BAP recomendadas para la multiplicación de Musa desde 0,5-10,0 mg.L-1, sin embargo, como resultados de sus investigaciones recomiendan una concentración de 2,5 mg.L-1 en la variedad Maçã (AAB). A escala comercial se han encontrado algunas desventajas que elevan los costos finales de las plantas, dentro de los cuales tenemos el gran número de operaciones manuales y su alto costo por mano de obra, el cual está comprendido entre el 80 y 90% del costo final de las plantas (Ziv, 1989) y entre un 50 y 80%, según Pérez et al. (2000). Otros aspectos lo constituyen el elevado gasto por energía eléctrica, el uso de agar como agente gelificante en el medio de cultivo y los frascos de capacidad limitada. Además, esta técnica presenta restricciones desde el punto de vista biológico, ya que en la mayoría de las especies micropropagadas los coeficientes de multiplicación son bajos, lo cual también incrementa los costos de producción y disminuye la eficiencia en el proceso; siempre que sea considerada la eficiencia como el número de plantas generadas por unidad de tiempo (Villalobos y Thorpe, 1991; citados por Jiménez y de Feria, 1998). Razón por la cual Pérez et al. (1998), demostraron que la eficiencia del proceso está determinada por la fase de multiplicación y su parámetro fundamental es el coeficiente de multiplicación; indicando que por cada unidad de aumento en el mismo, disminuyen los costos en un 10%. Por otra parte, existen diferencias en el crecimiento y multiplicación de los explantes en dependencia del estado físico del medio de cultivo. Razones por las cuales los medios en estado líquido se han propuesto en muchos casos para sustituir los medios semisólidos (Orellana, 1998a). Sus principales ventajas incluyen corto tiempo para manipular los explantes, mayor rapidez de absorción de nutrientes, cambio de la composición del medio por simple transferencia y la esterilización puede realizarse por ultra filtración o autoclave (Alvard et al., 1993). A pesar de las amplias ventajas de los medios de cultivos líquidos, tienen la limitante que no en todas las especies y genotipos responden de igual manera y se ha. Tesis de Maestría.. 11.

(21) Revisión bibliográfica. observado una tendencia a la reducción del coeficiente de multiplicación a medida que se dan subcultivos continuos en medio de cultivo líquido estático. Al respecto Orellana (1998a), señala que en subcultivos continuos la influencia del medio de cultivo líquido estático fue superior al efecto de cambios en las concentraciones de reguladores del crecimiento en cuanto al coeficiente de multiplicación de la variedad Gran Enano (AAA), obteniéndose en el segundo subcultivo una menor tasa de multiplicación. Esto se debe a la menor oxigenación de los tejidos, con lo cual se reduce o elimina la formación de nuevas yemas axilares en los explantes, reafirmándose en cada subcultivo. Esta falta de oxigenación en los medios de cultivo, fue reafirmada por Dominguez et al. (1995), quienes obtuvieron diferentes tasas de multiplicación al comparar el medio semisólido, líquido estático y con agitación, en la variedad Maçã; encontrando mayor tasa de multiplicación en medios de cultivos líquidos, pero en continua agitación que permite una mayor aireación del medio. Al igual Bhagyalakshmi y Singh (1995) encontraron una mejor tasa de multiplicación en medios de cultivo líquido en agitación que en medios de cultivo semisólido, en varios cultivares de bananos (Cavendish AAA, Bluggoe ABB y Silk AAB). Aunque, reportaron mejor tasa de supervivencia ex vitro en explantes procedentes del medio semisólido. El mecanismo fisiológico por el cual se promueve un incremento de la productividad de los brotes en medios de cultivo líquidos con agitación no ha sido exactamente dilucidado; sin embargo, la continua difusión y mezcla en medios de cultivo líquidos agitados, reduce la acumulación de sustancias tóxicas y el agotamiento de los nutrientes cercanos a los explantes, contrario en medios de cultivos solidificados donde la disponibilidad de nutrientes se encuentra reprimida (Harris y Mason, 1983). Por otra parte, el manejo de los explantes no es el mismo cuando se utilizan medios de cultivo en estado semisólido que en estado líquido, en los primeros, los explantes pueden ser más pequeños, generalmente brotes individuales, incluso en el genero Musa spp es posible el seccionado total o parcial, así como el decapitado con la finalidad de inhibir la dominancia de la yema apical y propiciar el desarrollo de las yemas axilares. Mientras que en medios de cultivo en estado líquido estáticos, los. Tesis de Maestría.. 12.

(22) Revisión bibliográfica. brotes pequeños no pueden ser individualizados y se requiere su manejo en forma de clusters (2 a 3 unidos) para evitar su muerte por inmersión (Orellana,1998a). Además, Pérez (1998), señala que el seccionado de los explantes en pequeños segmentos estimula la formación de yemas adventicias y los medios de cultivo líquido inhiben la formación de éstas. La multiplicación in vitro de las diferentes especies vegetales, requiere la transferencia periódica del cultivo a medio fresco debido al agotamiento y alteración de los nutrientes, así como, al crecimiento o proliferación continua del tejido (Debergh et al., 1996). Por ello, los explantes son divididos en condiciones asépticas y cultivados nuevamente en medio fresco, para obtener nuevos brotes; operación que se repite hasta lograr la cantidad de brotes de un tamaño adecuado para la fase de enraizamiento o que permita su traslado directo a la fase de aclimatización. No obstante, a pesar de las limitaciones, esta técnica posee un gran número de ventajas; motivo por el cual un notable número de investigadores consideran que es posible su aplicación a escala comercial logrando hacerla más eficiente mediante la automatización, cambios tecnológicos, medidas organizativas y de control (Vasil, 1994; Pérez et al., 1998). El aumento de la eficiencia en la micropropagación convencional esta muy relacionado con el perfeccionamiento de las técnicas in vitro para incrementar los coeficientes de multiplicación y el volumen de material por área de cuarto de cultivo; y si es posible la automatización o semiautomatización de algunas etapas de la micropropagación, con énfasis en aquellas que mayor consumo de mano de obra implican (Orellana, 1998a; Pérez et al., 1998). 2.2.1.3. Papel del Paclobutrazol. Los inhibidores del crecimiento han tenido un amplio uso en la agricultura para el control del crecimiento (Early y Martín, 1988). El paclobutrazol es uno de los fungicidas triazólicos, inhibidores de la síntesis de las giberelinas (Hedden y Graebe, 1985; Grossman, 1999). Los efectos de este retardante sobre el metabolismo de las plantas incluyen la biosíntesis de esteroles, ácido abscícico y citoquininas (Pinhero y Flecher, 1994). El efecto de este inhibidor sobre la regeneración se atribuye a su interacción con el metabolismo de las citoquininas (Werbrouck y Debergh, 1995).. Tesis de Maestría.. 13.

(23) Revisión bibliográfica. La adición de este inhibidor al medio de cultivo, incrementó el porcentaje de regeneración de nuevas yemas en los segmentos internodales de Solanum tuberosum (Opatrná et al., 1997). El paclobutrazol reduce la elongación de los brotes y el área foliar, además, incrementa el contenido de cloroplastos y mejora la resistencia al estrés (Ziv, 1995). También se ha encontrado que aumenta la resistencia a la desecación en plantas de Chrysanthemun, rosa y uva provenientes de la micropropagación (Smith et al., 1990). Los inhibidores del crecimiento y de la biosíntesis de las giberelinas han sido usados exitosamente en la micropropagación de papa, ñame, bromelias, gladiolos, helechos, bananos, piña, Asparagus, Lilium, Chrysanthemum, Philodendron, Spatiphynum y Ornithogallum (Khunachak et al., 1987; Roberts y Matthews, 1995; Opatrná et al., 1997; Ziv, 1998; García et al., 1999; Daquinta et al., 1999; Escalona, 1999; Ziv, 1999). En el cultivo del ñame (Dioscorea alata L.) en medios de cultivos líquidos el alargamiento excesivo del tallo determina bajos coeficientes de multiplicación, sin embargo García et al. (1999), proponen utilizar 1,0 mg.L-1 de PBZ para obtener tallos más cortos con mayor número de nudos. Además, las plantas tratadas con PBZ mostraron mayor resistencia a la desecación en la etapa de aclimatización. Al igual que Meneses et al. (2000), encontraron que el retardante (1,0 mg.L-1 de PBZ) inhibió el crecimiento en longitud e indujo la formación de brotes multifoliados en los puntos de ramificación y las plántulas tratadas mostraron un menor índice de desecación que el control. Opatrná et al. (1997), lograron inhibir el crecimiento del segmento entrenodal entre un 10 y 60% en 10 cultivares de papa (Solanum tuberosum L.) con una dosis de 3,0 mg.L-1 de PBZ; y observaron un incremento en el porcentaje de nuevos brotes generados en el segmento entrenodal del tallo, así como, el número total de brotes por explantes, en comparación con el testigo. Daquinta et al. (1999) establecieron el uso del PBZ (0,12 mg.L-1) en fase de multiplicación en SIT para estimular la formación de clusters de brotes compactos en algunas bromelias (Aechmea fasciata, Aechmea ketez, Aechmea blumenaoil, Neoreglia carolina, Crypplanthus bromelioide y Ananas nanus); alcanzando un alto. Tesis de Maestría.. 14.

(24) Revisión bibliográfica. número de plantas uniformes y competentes para la adaptación a condiciones ex vitro. Marrero et al. (1999) establecieron un protocolo para la micropropagación de caña de azúcar en la variedad C1051-73 a través de los sistemas de inmersión temporal logrando la formación de nuevos brotes con 50,0 ml/explante de medio de cultivo y 1,0 mg. L-1 de Paclobrutazol (PBZ). Escalona (1999), en el cultivo de la piña desarrolló un sistema automatizado eficiente que la micropropagación convencional basado en el uso de PBZ en SIT, el cual reduce los costos de producción en un 66,7%. Además, las plantas mostraron un mayor crecimiento y desarrollo en condiciones ex vitro comparadas con las plantas obtenidas por la micropropagación convencional y no se encontraron diferencias fenotípicas con las plantas provenientes de la propagación vegetativa tradicional. Albany (2001), reporta el uso de sistemas de inmersión temporal a los que se les incorpora 2,5 mg. L-1 de PBZ, lo que permite disminuir el crecimiento innecesario de los tallos y hojas de los brotes del cultivar ´Gran Enano´ (AAA) en la fase de multiplicación, obteniéndose un mayor número de brotes por explante inoculado. La inoculación de 25 explantes en los SIT y la renovación con 1000 mL de medio de cultivo a los 15 días, permitió obtener los mejores valores de productividad reflejados en el número de brotes por explantes. Estos resultados permitieron establecer vías alternativas para la incorporación de los brotes producidos en los SIT a las técnicas y manejos convencionales para la micropropagación en este cultivar. 2.3. Empleo de medios líquidos. Ventajas y desventajas. El empleo de los medios de cultivo en estado líquido es un aspecto primordial en la automatización de la micropropagación (Aitken-Christie et al., 1995; Ziv, 1995) y el desarrollo de técnicas para la producción a gran escala, empleados éxitosamente en Spathiphyllum spp (Simonton et al., 1991), Musa spp (Alvard et al., 1993; Albany, 2001), Stevia rebaudiana (Akita et al., 1994), Hevea brasilensis (Teisson y Alvard, 1994a y Teisson y Alvard et al., 1994b; Jiménez et al., 1999), Saccharum spp (Lorenzo et al., 1998) y Ananas comosus (Escalona, 1999), Para la micropropagación de plátanos y bananos se han empleado los medios de cultivo en estado líquido aunque el estado semisólido ha sido el mayormente. Tesis de Maestría.. 15.

(25) Revisión bibliográfica. empleado. Sus ventajas incluyen la facilidad de preparación, esterilización y manipulación, mayor rapidez en la absorción de sustancias nutritivas y la difusión de sustancias tóxicas producidas por el metabolismo de las plantas. Además, el cambio en la composición del medio puede efectuarse por simple transferencia, brinda grandes posibilidades para la automatización y la reducción de los costos por producción (Orellana, 1998). Sin embargo, en condiciones estáticas provoca un efecto depresivo sobre el crecimiento del tejido en el cultivo in vitro, ya sea por hipoxia o por hiperhidricidad (Debergh, 1983; Alvard et al., 1993; Ziv et al., 1998; Etienne y Berthouly, 2002). Para evitar este problema se han diseñado nuevos tipos de biorreactores y sistemas semiautomatizados de cultivo líquido basados en la inmersión parcial y temporal de los explantes (Simontol et al., 1991; Ziv y Shemesh, 1995; Teisson et al., 1996, Yu et al., 2000). 2.4. Automatización de la micropropagación. La automatización del proceso de propagación in vitro es una necesidad para la reducción de los costos en la industria de la micropropagación. Según Debergh (1988); citado por Pérez et al. (1998a); el uso de medios de cultivos líquidos es un aspecto primordial para la automatización de la propagación in vitro. Además, es considerada como la técnica ideal para la propagación masiva de plantas, ya que disminuye la manipulación y permite reducir los costos del medio de cultivo (Jeong et al., 1995; Aitken-Christie et al., 1995; Teisson et al., 1996). Su principal desventaja radica en el efecto negativo que provoca sobre los tejidos de los brotes, bien sea por hiperhidricidad o hipoxia (Debergh, 1983; Alvard et al., 1993; Ziv, 1998). La hipoxia es causada por una baja disponibilidad de oxígeno, necesaria para el desarrollo de los tejidos, que le producen serias afectaciones en el crecimiento de los explantes (Orellana, 1998a). Mientras que la hiperhidricidad ha sido reportada con mayor frecuencia y descrita como un severo desorden fisiológico común en muchas plantas; este desorden, según Ziv, (1995) es causado por la presencia de grandes cantidades de agua residual en los espacios apoplásticos de los tejidos. Las plantas hiperhídricas muestran una apariencia turgente y superficie acuosa, sus órganos son de cierto modo translúcidos, menos verdes y se quiebran con facilidad (Pérez, 1998).. Tesis de Maestría.. 16.

(26) Revisión bibliográfica. Varios investigadores, han demostrado que este desorden fisiológico es eliminado o minimizado mediante la agitación del medio de cultivo líquido o sistemas de cultivo que permiten la aireación parcial o continua del medio de cultivo. Al respecto, Harris y Mason (1983), emplearon una máquina prototipo para lograr la agitación del medio de cultivo líquido en brotes de Vitis vinifera, Fuchsia, Amelanchier alnifolia y A. Nicotiana; obteniendo un mayor crecimiento de los brotes que en el medio de cultivo solidificado con agar, al cabo de 90 días. Mientras que Alvard et al. (1993), estudiaron cinco sistemas de cultivo en medio líquido (inmersión permanente con y sin burbujear, inmersión parcial, medio de cultivo líquido con soporte de celulosa e inmersión temporal) en comparación con el cultivo en medio semisólido en la propagación de meristemos de bananos (cv. Gran Enano, AAA). La inmersión temporal produjo los mejores resultados en cuanto a la tasa de multiplicación y aumento de peso seco sin efectos de hiperhidricidad en los tejidos. 2.4.1. Sistemas automatizados en la propagación in vitro: Biorreactores. Los sistemas de micropropagación alternativos con el empleo de medio de cultivo líquido se han desarrollado con el propósito de automatizar, al menos las fases que requieran mayor manipulación del proceso in vitro y con ello, la consiguiente reducción de los costos de producción (Escalona, 1999). Los biorreactores empleados en la fermentación microbiana han sido modificados para el cultivo in vitro de plantas y utilizados en el escalado de la propagación vía organogénica o embriogénica; ya que tienen la posibilidad de producir grandes volúmenes de plantas bajo un sistema computarizado que permite definir los requerimientos para el desarrollo de las células y la regeneración de plantas de una forma más precisa que las técnicas convencionales in vitro (Jiménez y de Feria, 1998). El uso de biorreactores, es idóneo para eliminar los efectos de hiperhidricidad debido que es posible monitorear y controlar no sólo el sistema de aireación, sino también otros parámetros ambientales del cultivo in vitro (temperatura, velocidad del agitador, pH, etc.). Se ha empleado con éxito en la micropropagación de gladiolos (Gladiolus nanus cv.. Ronit. y Eurovision), helecho. (Nephrolepis. exaltata. schoot. cv.. Bostoniensis), papa (Solanum tuberosum var. Desirré) y bananos (cv. Williams, AAA. Tesis de Maestría.. 17.

(27) Revisión bibliográfica. y Gran Enano, AAA); utilizando retardantes del crecimiento, que estimulan el desarrollo de clusters durante los estados de proliferación, y con ello reducen el crecimiento y desarrollo de tallos y hojas evitando la hiperhidricidad de los mismos (Ziv, 1995; 1999). Según Jiménez y de Feria (1998), el empleo de biorreactores para la producción masiva de brotes vía organogénica fue obtenido por primera vez en Begonias por Takayama y Mizawa (1981); desde entonces se han empleado para la producción de brotes, bulbos, microtubérculos y cormos de una infinidad de especies. Akita y Takayama (1994), lograron la producción masiva de microtubérculos de papa (Solanum tuberosum) con el empleo de un biorreactor, facilitando la manipulación directa para su trasplante al campo. Mientras que Levin et al. (1988), describieron un sistema automatizado para la propagación masiva de 14 especies utilizando un biorreactor para la producción de propágulos, un bioprocesador para la separación con distribución a los recipientes de cultivo y una máquina transplantadora, logrando reducir los costos hasta un 60% en comparación con las técnicas convencionales del cultivo in vitro. Para la propagación masiva de plantas, los biorreactores facilitan la automatización y escalado de la producción, lo que permite reducir los costos por planta. Sin embargo estos beneficios deben ser balanceados con las dificultades que implica esta tecnología para la propagación comercial, principalmente el alto costo de la inversión y mantenimiento del equipo, así como también las dificultades de la aclimatización de las plantas al ambiente ex vitro (Leathers et al., 1995; citados por Escalona, 1999). Razón por la cual otros sistemas se han desarrollado con la finalidad de disminuir los costos de producción, sin incurrir en grandes inversiones en equipos sofisticados. 2.4.2. Sistemas semi-automatizados en la propagación in vitro: sistemas de inmersión temporal. Alvard et al. (1993), en un trabajo de micropropagación de bananos demostraron que con un sistema de propagación basado en el contacto intermitente del medio de cultivo líquido con los explantes por un corto período de tiempo y la consecuente renovación de la atmósfera gaseosa, se podía evitar la hiperhidricidad de los tejidos y. Tesis de Maestría.. 18.

(28) Revisión bibliográfica. la acumulación de gases tóxicos; el cual fue denominado como: “Sistema de Inmersión Temporal”. Desde entonces este sistema ha sido ampliamente utilizado y reportado en la literatura por su efectividad en la propagación vía embriogénesis u organogénesis (Teisson et al. 1996, Jiménez y de Feria, 1998). Los Sistemas de Inmersión Temporal (SIT) pueden ser utilizados para la producción de brotes vía organogénesis a escala masiva, brindando la posibilidad de automatizar algunas etapas del proceso de micropropagación (Alvard et al., 1993). Además, ha sido demostrado que los sistemas de inmersión temporal ofrecen mayor facilidad de escalado, con la finalidad de producir grandes volúmenes de plantas (Jiménez y de Feria, 1998). Teisson et al. (1996) desarrollaron un SIT empleando unidades de filtración comerciales “Nalgene Co” de 250 ml de capacidad; las cuales fueron modificadas al conectar el compartimento superior e inferior de la unidad de filtración a través de un tubo de silicona. El medio de cultivo se colocó en el compartimento inferior y los explantes en el superior junto con una malla en el fondo, para impedir que los explantes pasaran a la parte inferior. El contacto de los explantes con el medio de cultivo se logró al aplicar una presión de aire en la parte inferior, obligando al medio líquido a subir por el tubo de conexión hasta el compartimento superior, el medio retorna a la porción inferior por gravedad y un reloj de tiempo programable controla periódicamente el proceso. Los recipientes de inmersión temporal automatizados, comercialmente denominados “RITA” fueron diseñados a partir del principio desarrollado por Teisson et al. (1996) en el laboratorio Biotrop del CIRAD en Montpellier; y han sido utilizados exitosamente en bananos, cítricos, café, piña, árbol de caucho y papa; en diferentes sistemas de multiplicación (proliferación de meristemos, cultivo de microestacas, desarrollo de embriones a partir de callos, germinación y conversión de embriones somáticos) (Pérez et al., 1998a; Escalona, 1999). Varios autores señalaron un aumento de la eficiencia biológica y productiva del material propagado en los SIT, debido al aumento de los coeficientes de multiplicación, la obtención de plantas de mayor calidad, mayores rendimientos en. Tesis de Maestría.. 19.

(29) Revisión bibliográfica. comparación con el empleo de medios de cultivos líquidos o semisólidos y la reducción de los costos de producción (Teisson y Alvard, 1994; de Feria et al., 1998; Escalona et al., 1998; Lorenzo et al., 1998; Ventura et al., 1998; Escalona, 1999; Jiménez et al., 1999). Alvard et al. (1993), señalaron que los SIT les permitió obtener los mejores resultados en cuanto aumento de peso seco y tasa de multiplicación; entre cinco sistemas de cultivos en medio de cultivo líquido para el cv. Gran Enano (AAA). Mientras que Ventura et al. (1998), emplearon los SIT en el clon de banano FHIA 18 (AAAB), determinando mayor coeficiente de multiplicación (15,30) que en medios de propagación convencional (3,70). Según Pérez et al. (1998) las ventajas de los SIT sobre la multiplicación tradicional en medios de cultivo semisólidos parecen ser el resultado de las condiciones físicas creadas en el recipiente de cultivo, entre ellas se pueden citar: El contacto directo con el medio de cultivo renovado durante cada inmersión garantiza una forma más eficiente de suministro de los nutrientes en comparación con la forma estática en que se toman los mismos en el cultivo convencional (semisólido ó líquido). Los tiempos de inmersión son cortos, la mayoría del tiempo los explantes están solamente recubiertos de una película de medio de cultivo líquido y de esta forma se evita la desecación de los mismos. La resistencia a la difusión de gases es baja y existe una mínima ruptura del intercambio gaseoso entre los tejidos y la atmósfera, por tal razón está dentro del vaso de cultivo se renueva en intervalos regulares de tiempo. La agitación por el flujo de aire durante la fase de inmersión causa expansión de los tejidos y se facilita un mayor contacto de estos con el medio de cultivo (Teisson y Alvard, 1995). Mayor optimización biológica por los altos coeficientes de multiplicación que se obtienen. Reducción importante de los costos por vitroplantas. Reducción del número de frascos y estantes en las cámaras de cultivo y por tanto mayor producción por metro cuadrado de cámara.. Tesis de Maestría.. 20.

(30) Revisión bibliográfica. Eliminación de la fase de enraizamiento in vitro. Mejor comportamiento de las vitroplantas ex vitro por mayor metabolismo autotrófico durante la fase in vitro. La frecuencia y el tiempo de duración de la inmersión son factores muy importantes en la respuesta morfogenética entre las diferentes especies de plantas. En la multiplicación axilar de brotes de café (Coffea arábica) se lograron coeficientes de multiplicación de 6 a 7 en sólo 5 semanas con el empleo de un tiempo y frecuencia de inmersión de 15 minutos cada 6 horas. En estudios de la embriogénesis somática, dicho factor ha tenido un efecto directo en el desarrollo del embrión. Cuando se empleo una inmersión de agregados embriogénicos, en ese mismo tiempo las células no embriogénicas murieron y se eliminaron del medio de cultivo. Cuando se utilizaron tiempos de inmersión de 15 minutos cada 6 horas se alcanzó el desarrollo de los proembriones (Teisson y Alvard, 1995). En Hevea brasiliensis, el empleo del sistema de inmersión temporal de un minuto cada doce horas indujo la producción intensa y sincronizada de embriones somáticos. En la proliferación de embriones de bananos el empleo de un minuto cada seis horas en presencia de picloran estimuló la producción de embriones adventicios; mientras que en la maduración, germinación y conversión de los embriones de caucho, los mayores resultados se obtuvieron en un período extremadamente breve de inmersión de un minuto una vez por semana (Etienne et al., 1997). La frecuencia y duración óptima de la inmersión varía considerablemente de una especie a otra. Sin embargo, parece que algunas especies mientras mayor sean los fragmentos de tejidos deben lograrse mayores frecuencias para evitar la desecación del mismo. En el caso del embrión somático se requiere de períodos extremadamente cortos de inmersión los cuales conducen a la desecación del tejido y por tanto se estimula la embriogénesis (Etienne et al., 1993). Otro factor que influyó notablemente sobre la producción de los brotes fue la frecuencia de renovación del medio de cultivo. Siempre que se realizó renovación del medio de cultivo la producción total de brotes por unidad de SIT fue superior, lográndose hasta 520 brotes y con un coeficiente de multiplicación de 13,0 cuando el. Tesis de Maestría.. 21.

(31) Revisión bibliográfica. cambio de medio de cultivo se realizó a los 15 días de cultivo. Sin embargo, cuando el ritmo de medio es mayor la producción de biomasa por frasco aumenta, así como el peso promedio por brote, pero no hay incrementos en el coeficiente de multiplicación (William, 1995). Sin embargo, escasamente es reportado, que estas condiciones físicas mejoradas en los SIT y el eminente aprovechamiento de los nutrientes del medio de cultivo, en muchos casos; conllevan a un crecimiento excesivo de tallos y hojas que no tienen utilidad en la fase de multiplicación de los explantes; y por el contrario además de dificultar su manipulación, también disminuye el aprovechamiento efectivo de la capacidad de los recipientes de cultivo (Boxus et al. (1995). Varios investigadores proponen la incorporación de retardantes o inhibidores del crecimiento en los medios de cultivos líquidos en la fase de multiplicación, ya que éstos, inhiben la síntesis de las giberelinas y ocasionan una notable disminución en el crecimiento innecesario de tallos y hojas mediante la formación de clusters o conglomerados de brotes y meristemos; que además de eliminar los efectos de hiperhidricidad; aumentan los coeficientes de multiplicación, permiten explotar al máximo la capacidad de los recipientes de cultivo, promueven brotes y raíces vigorosas, facilitan manipulación y mecanización de los brotes e incrementan la tasa de supervivencia en condiciones ex vitro (Khunachak et al., 1987; Ziv, 1989; Smith, 1991; Ziv et al., 1998; Daquinta et al., 1999; Escalona et al., 1999a; García et al., 1999; Ziv, 1999, Etienne y Berthouly, 2002). 2.4.3. Resultados obtenidos en los sistemas de inmersión temporal. El sistema de inmersión temporal ha sido utilizado exitosamente en diferentes especies de plantas cultivadas, entre ellas: bananos, cítricos, café, piña, papa, malanga, yuca, etc.; respecto a las distintas técnicas de cultivo de tejidos como proliferación de meristemos, cultivo de microestacas, desarrollo de embriones a partir de callos, germinación y conversión de embriones somáticos a planta, etc. (Medero et al., 1997; Pérez et al., 1998a; Escalona, 1999; Medero et al., 2000). Un número considerable de autores lograron un aumento de la eficiencia biológica y productiva del material propagado en los sistemas de inmersión temporal (SIT); debido, entre otros aspectos, al incremento de los coeficientes de multiplicación y la. Tesis de Maestría.. 22.

(32) Revisión bibliográfica. obtención de plantas de mayor calidad en comparación con el empleo del medio de cultivo en estado líquido o semisólido, así como la reducción de los costos de producción (Teisson y Alvard, 1994; Medero et al., 1997; de Feria et al., 1998; Escalona et al., 1998; Lorenzo et al., 1998; Ventura et al., 1998; Escalona, 1999; Jiménez et al., 1999, Medero et al., 2000), producidos en estos sistemas con respecto a los métodos convencionales. Alvard et al. (1993), usaron como material inicial yemas axilares del cultivar de banano ‘Gran Enano’ (AAA) para la comparación de cinco medios de cultivo líquido (inmersión permanente con o sin burbuja; inmersión parcial; soporte de celulosa; e inmersión temporal) con medio de cultivo semisólido, donde este método produjo los mejores resultados en cuanto aumento de peso seco y tasa de multiplicación. Dottin (2000), plantea que el sistema de inmersión temporal para airear los tejidos de los brotes de malanga (Xanthosoma spp), unido al contacto completo de los mismos con el medio de cultivo líquido probablemente facilitó una mayor incorporación y asimilación de los nutrientes por los tejidos y como consecuencia aumentó el coeficiente de multiplicación y la calidad de los brotes. Pérez (2001), permitió reducir el trabajo manual e incrementaron la producción, así como una mayor calidad de las plantas y los tubérculos in vitro. Pérez et al. (1998a), en la propagación masiva de caña de azúcar lograron mayor número de brotes por unidad del SIT (437 vitroplantas), con una producción total de biomasa de 251 g; mientras que para la variedad C-1051-73, se reportó un nuevo protocolo para la multiplicación en sistema de inmersión temporal que utiliza 50 ml de medio/explante con paclobutrazol (1,0 mg.L-1) por 30 días; seguido de una fase de elongación con 1,0 mg.L-1 de AG3 que permitió duplicar la tasa de multiplicación y la altura de los brotes, en comparación con la micropropagación convencional; permitiendo reducir los costos en un 46% (Lorenzo et al., 1998). En Cuba, (Borroto, 1999), señaló los resultados de un sistema automatizado para la propagación masiva de plantas, que ha sido usado con resultados altamente beneficiosos en piña, caña de azúcar, bananos, Syngonium, Dasheen y Scheflera con incrementos significativos para el coeficiente de multiplicación de 20 hasta 70 en dependencia del genotipo.. Tesis de Maestría.. 23.

(33) Revisión bibliográfica. Con la aplicación del sistema de inmersión temporal se estableció una tecnología para la propagación in vitro de la piña (Cayena lisa) más eficiente que la micropropagación convencional. Se obtuvo un coeficiente de multiplicación de 68,6 con el medio MS suplementado con 2,1 mg.L-1 BAP; 0,3 mg.L-1 ANA y 1,0 mg.L-1 de paclobutrazol en 7 semanas de cultivo y se logró reducir los costos de producción en un 66,7% (Escalona, 1999). Jiménez et al. (1999), demostraron la superioridad de los SIT ante los métodos convencionales de micropropagación en papa tanto en la variedad Desiree como Atlantic; reportando un incremento en la altura de las plantas y el número de entrenudos hasta 22,5 cm y 11,5 entrenudos por planta en comparación con 6,5 cm de altura y 4,5 entrenudos por planta en la propagación en medios de cultivo solidificados con agar. Para la etapa de inducción de tubérculos, en el SIT se incrementaron de 1,15 a 3 tubérculos por planta comparados con los frascos tradicionales de cultivo y el peso promedio de los tubérculos aumentó de 160 mg a 1,04 g, obteniéndose una proporción de más de 60% de los tubérculos con calibre mayor de 7,0 mm.. Tesis de Maestría.. 24.

(34) Materiales y Métodos.. 3. MATERIALES Y MÉTODOS. La presente investigación se desarrolló en el Laboratorio de Biotecnología del Instituto de Investigaciones en Viandas Tropicales (INIVIT); durante el período comprendido entre enero del 2004 a diciembre del 2005. Procedimientos generales. Los medios y frascos de cultivo fueron esterilizados en autoclave a 121oC de temperatura y 1,2 Kg.cm-2 de presión, el tiempo de esterilización varió en dependencia del volumen de medio de cultivo a esterilizar, según información técnica de SIGMA (1991). El instrumental utilizado más placas de Petri (80x15 mm) para el manejo de los explantes fueron esterilizadas en estufa a 180oC durante dos horas. El pH de los medios de cultivo fue ajustado antes de la esterilización con NaOH 1,0 N ó HCL 1,0 N. El manejo de los explantes se realizó en condiciones de esterilidad en una cámara de flujo laminar horizontal. Medios de cultivo. Para la preparación de los medios de cultivo se emplearon las sales propuestas por Murashige y Skoog (1962) MS. La composición específica de los diferentes medios de cultivo se define en cada acápite según el tema objeto de estudio. Para las etapas de iniciación y multiplicación de los explantes se utilizó como agente gelificante el agar-agar a razón de 4.5 g.L-1. En los frascos de cultivo de capacidad 200 ml de volumen total se dosificó un volumen de 30 ml de medio de cultivo semisólido y en los sistemas de inmersión temporal el volumen de medio de cultivo cambio acorde al diseño de los distintos experimentos. Condiciones de cultivo in vitro. Luz artificial: se utilizó un fotoperíodo de 16 horas de luz y una densidad de flujo de fotones fotosintéticos (DFFF) de 62-68 µmol m-2 s-1, temperatura 27 2 C. Oscuridad continua, temperatura de 27 2 C.. Tesis de Maestría.. 25.