Análisis discriminante de la determinación del punto de corte en pruebas serológicas

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(1)ESTADISTICA ANALISIS DISCRIMINANTE EN LA DETERMINACION DEL PUNTO DE CORTE EN PRUEBAS SEROLOGICAS. Astrid de Gerardino: Orlando Martinez W .*. R ES U M EN. En las pruebas serologicas, un problema importante es Ia determinaciôn de un punto de code que separe una observación como positiva o negativa, o clasifique a un individuo como protegido contra una enfermedad dada. En este trabajo se ilustra Ia aplicaciOn del análisis discriminante para determinar el valor del punto de code positivo/negativo en Ia técnica de microneutralizaciôn (MN) para el virus de Ia fiebre aftosa, teniendo como referencia Ia prueba de descarga del virus y se compara con los obtenidos por otras metodologias estadIsticas. Se discuten las ventajas y Ia precisiOn de este análisis. Palabras Claves Adicionales: Análisis multivariaclo, clasificaciOn matemática, funciOn discrirninante.. ABSTRACT. Discriminant Analysis to Determine the Cut-off Value in Serological Assays. An important problem in serological assays is the determination of a cut-oft value that separates an observation as positive or negative, or classifies an individual as protected or non-protected against a given disease. In this paper, the use of discriminant analysis is ilustrated to determine the positive/negative cut-oft value for the Microneutralization technique with Foot-and-Mouth virus, having as reference the virus-Challenge test, and compared with the values obtained by other statistical methods. The advantages and precision of the analysis are discussed. Additional Index Words: Multivariate analysis, mathematical classification, discriminant function. Se han desarrollado diferentes procedimientos estadIsticos aplicables en Ia experimentación biolOgica, dependiendo de la finalidad con Ia cual se ha disenado Ia irlvestigacion. Esto, con elfin de hacer uso eficiente de los recursos disponibles y obtener resultados confiables que permitan tomar decisiones en momentos de incertidumbre. *. En las pruebas serolOgicas, diseñadas para cuantificar anticuerpos contra determinadas enfermedades.tales como Ia fijaciOn del complemento, inhibiciôn de Ia hemaglutinaciOn, neutralizaciOn, inmuno-ensayo y las pruebas inmunoenzimaticas. un problema importante es Ia determinaciOn de tin punto de corte que clasifique una ob-. Microbiologa, M.S.; l.A., Ph.D. Sección Estadistica y Biometria. ICA. A.A. 151123 ElDorado, Bogota.. 131.

(2) RE VISTA ICA, Vol. 24, Abril - Junio 1989. servaciOn como positiva o negativa, 0 un individuo como protegido o no protegido. Para tal efecto se puede contar con sueros de referencia negativos o positivos, confirmados por medio de pruebas altamente sensibles, o con una prUeba de ensayo biolOgico de referencia que permita establecer los dos grupos. Es asi como se han determiriado no solo los puntos de corte en pruebas inmunoenzimáticas, entre otras para el sarampión (6) y la leucemia bovina (8), sino también las expectativas porcentuales de protección (EPP) (7) y el punto decode para Ia fiebre aftosa, mediante. el esquema de clasificaciOn (1). Entre los métodos utilizados para determinar el punto de code se cuentan: 1) El método de Ia "normal", que estima el valor promedio del grupo de referencia negativo más dos o tres desviaciones estndar ; 2) El método "umbral", que asigna el valor del punto de code a Ia lectura más alta del grupo control de referencia negativo; 3) El método de Ia "tasa o proporciOn", que multiplica el valor promedio estimado del grupo negativo de referencia por el factor dos o tres; 4) El método "probit", que establece una curva de respUesta con el porcentaje de positividad o protecciOn y los puntos medios del intervalo en el titulo de anticuerpos; 5) El "análisis discriminante", aplicable a observaciones univariadas o multivariadas y diseñado para evitar parcialidad y aumentar Ia confiabilidad en Ia selección de un punto de code que defina dos o más poblaciones (3, 5). Es este Ultimo procedimiento que se discute e ilustra en este tràbajo, por su precisiOn y confiabilidad, por cuanto permite analizar Ia totalidad de las observaciones, teniendo como referencia los resultados de un ensayo biolOgico con respuesta dicotOmica. Asi mismo, se establecen los supuestos y Ia justificaciOn matemätica, como también las ventajas sobre los otros métodos domUnmente utilizados.. Se considerO el tItulo microneutralizante 50% (TMN) correspondiente al logaritmo del reciproco de Ia diluciOn del virus que neutraliza 100 dosis infectantes del virus y Ia condiciOn de protegido (P) o no protegido (NP) a Ia descarga del virus tipo 01Colombia, 21 dias después de Ia vacunación (2, 4). Análisis Discriminante La funciOn lineal discriminante en su forma básica se utiliza cuando se desea localizar un individuo (X0) en una u otra de las poblaciones 7r1 ir2 ) en base a p-variables continuas y normales que se evalüan u observan simultáneamente en tal individuo. En términos estadIsticos, lo que se plantean son dos poblaciones con distribuciOn multivariada p-dimensional y varianza comün Z asi: 7 ri con Np ( p, Z ) y 72.con Np ( / 2 , ) y se desea saber si el individuo X0 pertenece a iT1 ° Fisher (3) dio soluciOn al problema mediante lo que se conoce como Ia funciOn discriminante y su idea fue transformar Ia observaciOn X0 de dimension p a una dimensiOn unitaria, ya que asi el manejo matemático seria más sencillo; por lo tanto, creO Ia combinaciOn lineal aX0 y maximizO Ia distancia entre las poblaciones 7r1 y 7n2 con respecto a su variabilidad el procedimiento estadistico consiste en optimizar Ia siguiente fun(a'5)2 ciOn: iiax donde: = 42 = a'a Fisher demostrO que a = (p, - 92)' También demostrO que mediante un desarro110 matemático más elaborado se Ilega a la siguiente regla de decisiOn: Asigne X0 a ITI Si (p Asigne X0 a 2 S (p Donde: rn = _L. MATERIALES V METODOS. Con el propOsito ilustrativo de una técnica estadistica, se tomaron los resultados de las pruebas de microneutralizaciOn y descarga del virus a animales vacunados con vacuna antiaftosa, previa autorizaciOn del Laboratorio Nacional de lnsumos Pecuarios del ICA. 132. x0. - 92) - 92). (Pi -. rn. x0' m. ( + 92). P2). Para el presente trabajo, lo que se necesita encontrar es el punto de code (Xe) que define si a sero-muestra proviene de un animal protegido o no contra Ia enfermedad. Por lo tanto, el punto de code X está dado por: Proteg ido. x. 0.

(3) GERARDINO, A. DE; MARTINEZ W., 0. Análisis discriminante en pruebas serológicas.. una extensiOn de Ia funciOn discriminante de Fisher y que dice:. No protegido m. xc <. yX0 €1r2. (P - bL). —1. Vro S 1 o -j 1-2YS'r1+12 L _j_j_•j)) (;. L l. Estas dos ültimas operaciones son válidas ünicarnente en este caso, donde Ia funciOn discriminante corresponde a su forrna básica y dimensiOn unitaria, es decir, dos poblaciones y una variable en X0.. Asigne Ia observaciOn X0 a Ia población de Ia contraria, a 7r2. P es Ia probabilidad preliminar de que el mdividuo pertenezca a la poblaciOn i, y C(i I j) es el costo de clasificar errOneamente una observaciOn de Ia poblaciOn j a Ia poblaciOn I.. La soluciOn anterior está en términos de las y su VariaflZa medias poblacionales /i , P2 por Ia tanto, se necesitan estimarlos comUn y para el caso univariado que nos ocupa, se tiene 9 so los promedios y vaque X1, X2, S , n rianzas muestrales de 7ri y 7T2 con varianza comOn S2 definida por Ia siguiente expresiOn:. Comparando esta regla con Ia de Fisher, los dos procedimientos son iguales cuando. 1(ciI_2)21 (n-1) S2 +(n2 -1) S2C = -. = L. L..c(2 I 1))Pi)j. S2. (n 1 +n2 -2) (X1 - X2). 7T 1. 1. por cuanto L(1) = 0, es decir, cuando los costos de una clasificaciOn errOnea son iguales 0 cuando estos son descanocidos.. L ( + <2). 2 RESULTADOS V DISCUSION AsI que el punto de corte estimado X. está dada por Ia siguiente desigualdad:. Los valores promedios del tItulo de anticuerpos, desviación estandard, coeficiente de variadOn y limites de confianzapara Ia media, en los animales que resultaron protegidos o no protegidos contra Ia enfermedad a Ia descarga del virus, aparecen en Ia Tabla 1. Para estimar los porcentajes esperados de protecciOn (PEP), las observaciones se clasificaron en intervalos de amplitud 0.25 determinando el punta media del intervalo y el porcentaje de respuesta, que transformado a probits", permite establecer el comportamiento de Ia variable Y (porcentaje de respuesta), de acuerdo con las variaciones de X (tItulos neutra-. A. in S. A. x,. Protegido. X0 6 IT1. (X1 -X2 ). A. rfl. xc <. S. y. X0 6 it 2. No protegido. (X1 - X2 ) Cuando el costa a gravedad, debido a una clasificación errOnea se puede cuantificar, se utiliza Ia regla de decisiOn de Anderson (5) que es. TAB LA 1. Valores promed los de los TN en animeles vecunados contra Fiebre Aftosa, agrupados seg)n el estedo Inmunitarlo a Is prueba do descerge ol virus Oi ColombIa. Estado jnmunitario. n. X. S2. CV. Intervalo ds confianza 95%. % Protegldos No protegldos. TN:. 72 22. 1.97 1.40. 0.064. 12.7. [isi. 2.03]. 0.080. 20.0. 11.28. 1.52]. T(tulo neutralizante (microplac.) correspondlente a Ia reciproca del log. dllucIón suero qua neutreliza 10001076 del virus.. 133.

(4) REVISTA ICA, Vol. 24, Abril - Junio 1989. lizantes - TNSO%). En Ia Tabla 2 se detallan los PEP, sus correspondientes TN y los lImites de confianza al 95% para los mismos. A un PEP de 75% corresponde un TMN de 1.67. Los valores de los puntos de corte obtenidos con Ia metodologia que utiliza los sueros negativos (animales no protegidos) ünicamente, y los obtenidos con el probit y el análisis discriminante se consgnan en (a Tabla 3. Los puntos de corte. obtenidos con (a primera (2.25; 2.80; 1 .96; 2.24) son más altos que los obtenidos con el análisis probit (1.67) y con (a funciOn lineal discriminante, cuyo valor fue de 1.68 (Tabla 4). El análisis discriminante, con un mayor fundamento matemático, utiliza todas las observaciones simultáneamente, 10 cual aumenta su confiabilidad. La frecuencia del titulo de anticuerpos (TN50), agrupados segUn el estado inmunitario de los animales se detalia en Ia Figura 1.. TAB LA 2. Porconta)e .sperado di protecclôn (PEP). Intervalo di confianza - Anliala Problt.. %. TN'. %. %. TN. IC 95%. 01. 0.91. 0.56. 1.14. 55. 1.54. 02. 1.01. 0.66. 1.19. 60. 1.57. [1.42 1.46. 03. 1.05. 0.72. 1.23. 65. 1.60. 1.50. 1.70. 04. 1.09. 0.76. 1.25. 70. 1.64. 1.54. 1.73. 05. 1.11. 0.80. 1,27. 75. 1.67. 1.58. 1.78. 06. 1.13. 0.84. 1.29. 80. 1.71. 1.62. 1.82. 07. 1.15. 0.86. 1.30. 85. 1.76. 1.67. 1.89. 08. 1.17. 0.89. 1.32. 90. 1.81. 1,72. 1.97. 09. 1.18. 0.91. 1.33. 91. 1.83. 1.73. 1.99. 10 15. 1.20. 0.94. 1.34. 92. 1.85. 1.75. 2.00. 1,26. 1.02. 1.39. 93. 1.86. 1.76. 2.03. 20. 1.31. 1.09. 1.42. 94. 1.88. 1.78. 2.06. 25. 1.35. 1.15. 1.46. 95. 1.91. 1.80. 2.09. 30. 1.38. 1.20. 1.49. 96. 1.93. 1.82. 2.12. 35. 1.42. 1.25. 1.52. 97. 1,96. 1.84. 2,17. 1,63 1.66. 40. 1.45. 1.30. 1,55. 98. 2.00. 1.88. 2.23. 45. 1.48. 1.57. 99. 2.07. 11.93. 2.33. 50. 1.51. 1.34 1.38. 1.60. Anlious probit - Paqueto estad (stico SAS.. 35. TN - Trtulo neutrallz.nte5O% (microp(aca(.. 30. IC 95% Intervalo de confianza 957Q. 25 20 15 10. TA8LA 3. Valores de los puntos de corte an la prueba de neutrallzaclón, obtenidos pot diferentes meto. dologtas estad (sticas.. 1 0. 10 Metodo log Is .stad(stica. Punto de corte. 15. (TN). 20. Valor mhxlmo do sueros ne9ut(vos (no proteldos) Sueros negativos x 2 (no prptegldoa) X Sueros rsegativos ± 2 DE Sueros negetivos ±3 DE Anâlisis Probit (PEP igual a 75) AnIisis discriminante. DE PEP TN. 134. Media Aritmt ice. Desviacjón Estnderd. Porcentaje esperado de Protección, T(tulo Neutralizante so% (microplaca),. 25 2.25 2.80 1,96 2.24 1.67 1.68. 30 35. 0000000 o 0 LO 0 LO 0 tO 0 tOO 0 C') LO 00 0 C ul co -. '- C'J C'J C'J C'1 0 'Titu(o neutralizarite (TN50). FIGURA1. Frecuencla de los titulos neutralizantes (TN50) agrupados segUn el estado inmunita-. rio de los animales..

(5) GERARDINO, A. DE; MARTINEZ W., 0. Análisis discriminante en pruebas serologicas.. TABLA 4. Anljjs dlscrl,njrnonte en Is doterminaciôn del punto cia corte positivo/negativo an In pruebi do nelltralicaclOn. Poblaciàn no protegidos. Población protegidos. = 1.40. - 1.97. s2. S . = 0.064. = 0.080. 2. = 72. = 22 (ni - 1) S2 t- (n2 —1) S2 2 1. = -. s2C. (3'1. m -. = 0.068. (n1+n2-2) +. t2). 2. S2 C. 14.12 Punto do corte =. 1. -. X. .-14.12. S2 C. X. IRegla. 0. 1.68. ci. decisIon: Asigne X. o. a ir. si X. 7t. Asigne X . a. 2. ' SI i. 0. 1.68. X. ( 1.68. Ia prueba o capacidad para detectar los animales no protegidos es del 91% y la especificidad o capacidad para detectar los animales protegidos es del 83%. Al compararlo con los valores 1.96 y 2.24, obtenidos con el suero negativo más 2 y 3 DE respectivamente, existe un ligero aumento en Ia sensibilidad (95.45%) y un notable decrecimiento en Ia especificidad (34.72 y 19.44). Consi-. Para estimar Ia probabilidad posterior de ciasificaciOn en cada grupo, asi como Ia estimaciOn de la sensibilidad y especificidad de Ia técnica de microneutralizaciOn, las observaciones se clasificaron teniendo en cuenta el valor 1.68 como punto de corte (Tabla 5). Existe una relaciOn altamente significativa (P < 0.01) entre el estado inmunitario y el tItulo MN. Con este valor, Ia sensibilidad de. TAB LA 5.. y. N(imero porcentaje de observaciones, clasificedos como protegidos lisis discnrninante.. y. no protegidos segn el punto de corte del an-. Estado inmunitario TN. K. 1,68. Protegido. 0. 1. 20 90.91. 1,68. Total. =. No protegido. 38.13". Sensibilidad Especificidad. =. 90.91% 83.33%. Total. 12. 32 34.04. 16.67. 2. 60. 62. 9,09. 83.33. 65.96. 22 100.00. 72. 94. 100.00. 100.00. % Real protegidos % Protegidos predecible. 63.83. Djferencia. 12.76. Probabilidad preliminar. 0.5. 0.5. 76.59. 135.

(6) REVISTA ICA, Vol. 24, Abril - Junio 1989. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS. derando que Ia prevalencia real de protegido en Ia prueba de descarga fue del 76.59%, con el valor de 1.68 se puede clasificar el 63.83%, con una diferencia de 12.76% (Tabla 6). Astudillo et at (1), empleando el esquema de Ia clasificaciOn y con probabitidades distintas de clasificaciOn errOnea en ambos grupos, sugieren un valor de 1.2 para el punto de corte y determinan por este método que a un aumento de valor del punto de corte corresponde una disminuciôn de Ia sensibilidad y un aumento de Ia especificidad de los TN50 para predecir el estado inmunitario de los animates vacunados contra fiebre aftosa.. Astudillo, V.M.; Da Silva, A.J.M. 1984. Classification: optimun cut-off screen value for Foot and Mouth Disease (FMD) immunity evaluation. Preventive veterinary medicine (Netherlands). 2:791-799. Arbeláez, GA.; Bustos, O.M. de; Gerardino, G.A. de; Lobo, C.A.; Estupinán, J.A.; Barrera, V.J. 1979.. EstandarizaciOn de Ia técnica de microneutralizaciOn para anticuerpos del virus de Fiebre Aftosa. Rev. ICA. 1 6(2):87-92, Fisher, R.A. 1936. The use of multiple measurements in taxonomic problems. Ann-Eugen. 7:179-188.. Como el objetivo de este trabajo es Ia presentación de una metodologia estadistica para determinar y evaluar un punto de corte, no se pretende profundizar en consideraciones de tipo biolOgico acerca de cómo la cepa de virus, las dosis y las condiciones en las pruebas de MN y de descarga del virus inciden en el desarrollo y Ia detecciOn de anticuerpos neutralizantes. Se han planteado seis técnicas a procedimientos estadisticos y se ha discutido su bondad biolOgica y matemática, su facilidad de cOmputo y su rigurosidad cientifica. Aunque el porcentaje real de animates protegidos en la poblaciOn observada (76.6%) corresponde a Ia expectativa de protecciOn conferida por la vacuna antiaftosa, se sugiere aumentar el nümero de observaciones y escoger Ia metodologla estadIstica para obtener un punto de corte, que se ajuste mejor a los objetivos de Ia investigaciOn y a los requisitos de precisiOn de las estimaciones.. Gerardino, A. de. 1984. Métodos EstadIsticos para determinar las dosis mediana efectiva en ensayos biológicos. Rev. ICA. 19(4)437-449. Johnson, R.A.; Wichern, O.W. 1982. Applied multivariate statistical analysis. Prentice-Hall, Inc. (USA). Kramer, S.M.; Jewek, N.P.; Cremer, N.E. 1983. Discriminant analysis of data in enzime immunoassay. J. of Immunological methods (Holanda). 60:243-255. Sutmoller, 0. de Freitas Costa, K.; Gómez, I. 1980. Pruebas de seroneutralizaciOn por microtécnica para Fiebre Aftosa: Cálculo de Ia expectativa porcentual de protecciOn. Boletin Centro Panamericano Fiebre Aftosa. 39-40:3 1 -36. Marino, 0.C.; Bravo, M.M.; Fajardo, J.E. 1984. La técnica de Elisa en el diagnóstico serolOgico de Ia leucosis bovina en Colombia. Rev. ICA. 1 9(3):31 5-321.. TABLA 6. ComparaciOr, de la prueba do neutralización con tres diferentos puntos do corte. Punto de corte. X2. S. E. %. Real protegidos. %. Protegidos predecible. Diferencia (%). 1,68. 38.13". 1.96. 6.24". 2,24. 2,60NJS. Chi cuadrado;. 76.59. 95.45. 34.72. 76.59. 26.59. 50,00. 95.45. 1944. 76.59. 14.89. 61.70. S = Sonsibilidad;. C. Altamente sign ificativo (P ( u,oi). NS. 136. No significativo.. E = Espocificidad.. 63.83. 12.76. 83.33. 90.91.

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