Efecto in vitro de diferentes extractos de Neem (Azadirachta indica) sobre la garrapata marrón del perro (Rhipicephalus sanguineus)

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(1)“Efecto in vitro de diferentes extractos de Neem (Azadirachta indica) sobre la garrapata marrón del perro (Rhipicephalus sanguineus).”. Por: Elizabeth Marín Quintero; Paula Andrea Vargas García. UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE PEREIRA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD PROGRAMA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA PEREIRA - 2017 1.

(2) “Efecto in vitro de diferentes extractos de Neem (Azadirachta indica) sobre la garrapata marrón del perro (Rhipicephalus sanguineus).”. Por: Elizabeth Marín Quintero; Paula Andrea Vargas García. Trabajo de grado presentado como requisito para optar al título Médico Veterinario y Zootecnista. Asesor: Juan Carlos Gonzales Corrales Juan Carlos Rincón. UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE PEREIRA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD PROGRAMA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA. 2.

(3) PEREIRA – 2017 AGRADECIMIENTOS. Queremos expresar nuestro más profundo y sincero agradecimiento a todas aquellas personas que con su ayuda han colaborado en la realización del presente trabajo, en especial a los docentes Juan Carlos Gonzales Corrales y Juan Carlos Rincón Flórez, quienes nos acogieron, nos brindaron su orientación y la supervisión continúa, pero sobre todo por la motivación y el apoyo recibido a durante la elaboración. Les queremos dar especial reconocimiento a nuestras familias y amigos los cuales nos apoyaron durante todo el trascurso de la elaboración del presente proyecto de investigación.. 3.

(4) Tabla de contenido “Efecto in vitro de diferentes extractos de Neem (Azadirachta indica) sobre la garrapata marrón del perro (Rhipicephalus sanguineus).”…………………………………………….5 Resumen…………………………………………...…………………………………………5 1. Introducción……………………………………………………………………………..6. 2. Materiales y métodos.………………………………………………………………….7 2.1 Preparación del extracto acuoso y extracto etanolico del Neem.…………….8 2.2 Exposición de las garrapatas a los tratamientos…...….……………………….9 3. Resultados……………………………………………………………………………....9 4. Discusiones…………….……………………………...……………………………….15 5. Conclusiones..………………………………………………………………………….16 6. Referencias bibliográficas…………………………………………………………….16. 4.

(5) Efecto in vitro de diferentes extractos de Neem (Azadirachta indica) sobre la garrapata marrón del perro (Rhipicephalus sanguineus). Elizabeth Marín Quintero1; Paula Andrea Vargas García2 Resumen La búsqueda creciente en el control y erradicación de las garrapatas como uno de los ectoparásitos que más afectan la salud y el bienestar de los animales domésticos como los caninos, han conllevado a la utilización de sustancias de diferentes composiciones y entre ellas encontramos el Neem (Azadirachta indica) el cual por la diversidad en sus componentes, su efecto ixodicida, además, de no presentar toxicidad ni daño a la salud animal y ser biodegradable ha llevado a un aumento en su estudio y utilización. El objetivo del presente trabajo es analizar el efecto in vitro de diferentes extractos del Neem. para el control de la Rhipicephalus sanguineus en caninos, en el cual se. utilizaron un total de 150 garrapatas las cuales se asignaron aleatoriamente a diferentes grupos, los cuales incluyen control negativo, control positivo a base de un producto comercial y tratamientos de extractos puros y diluidos de semillas de Neem. Cada tratamiento tuvo tres repeticiones y se analizaron las tasas de mortalidad de cada uno y al final se compararon la efectividad de cada tratamiento. Siendo el extracto etanolico sin diluciones el más efectivo con mortalidad del 100%, también se encontró efecto ixodicida en el extracto etanolico al 75% y acuoso pero con menor efectividad. Por lo tanto el mejor efecto ixodicida con el uso de semillas de Neem es con el extracto etanolico puro. Palabras claves: Azadirachta indica, extracto acuoso, extracto etanolico, caninos, hojas de Neem, semillas de Neem, efecto acaricida, Rhipicephalus sanguineus. Abstract The growing search for control and eradication of ticks as one of the ectoparasites that affect the most the health and welfare of domestic animals such as canines have led to the use of substances of different compositions and among them we find Neem. 5.

(6) (Azadirachta Indica) that due to the diversity of its components, its ixodicide effect, in addition, of not presenting toxicity or damage to animal health and being biodegradable has led to an increase in its study and use. The objective of the present work is to analyze the in vitro effect of different Neem extracts for the control of the Rhipicephalus sanguineus in canines, in which a total of 150 ticks were used, which were assigned randomly to different groups, which included negative control, Positive control based on a commercial product and treatments of pure and diluted extracts of Neem seeds. Each treatment had three replicates and the mortality rates of each were analyzed and in the end the effectiveness of each treatment was compared. As the ethanol extract without dilutions was the most effective with 100% mortality, ixodicide was also found in the ethanol extract at 75% and aqueous but less effective. Therefore the best ixodicide effect with the use of Neem seeds is with pure ethanol extract. Keywords: Azadirachta indica, Aqueous extract, ethanol extract, canines, Neem leaves, Neem seeds, acaricidal effect Rhipicephalus sanguineus. Introducción Un problema común que se ha venido aumentando en los últimos años es la infestación de garrapatas como la Rhipicephalus sanguineus, también llamada garrapata marrón del perro, siendo el principal vector de múltiples organismo patógenos que afectan el bienestar y la salud de los animales domésticos y los seres humanos(1,2). Es importante tener en cuenta que el ciclo de vida de esta garrapata consta de 3 huéspedes por tal motivo su control se dificulta aún más (3), llevando así a la mala utilización y mal manejo de los insecticidas sintéticos para el control de la misma, lo cual ha llevado al deterioro del medio ambiente por el efecto residual que poseen(4). Estos productos también han obtenido poca eficacia en la eliminación de los parásitos ya que con su uso indiscriminado ha permitido la aparición de cepas resistente a sus compuestos (5,6). Por lo tanto, se hizo necesario la búsqueda de nuevos productos naturales que posean características acaricidas, y sean más seguros de manipular y menos agresivos para el medio ambiente (7–9). 6.

(7) El árbol de Neem (Azadirachta indica) es originario de la india donde también es conocido como “lila india y margosa” pertenece a la familia de las Meliaceae, su desarrollo se da mejor en climas tropicales y subtropicales (2,8,10). Las investigaciones sobre este árbol se han aumentado ya que posee una variedad de componentes, presentes en gran cantidad de sus partes, principalmente en su semilla, pero también en sus hojas, corteza y frutos(11).Resaltando como su componente principal la azadirachtina la cual no permite que se desarrolle la quitina en los parásitos, produciendo daños en la muda ya que su composición se asemeja a la hormona ecdisona (9,12), como también cambios en la reproducción de las garrapatas hembra ya que ayuda a la inhibición de la ovoposición.(2) Se ha observado que el árbol del Neem es un insecticida natural que tiene mucha eficacia en el manejo de los parásitos, insectos y otros. Por esta razón se pretende analizar el efecto in vitro del extracto acuoso y etanolico de las semillas de Neem (Azadirachta indica) para el control de Rhipicephalus sanguineus de caninos. Materiales y Métodos Esta investigación se realizó en los laboratorios del programa de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Tecnológica de Pereira ubicados en la sede de la Julita en el municipio de Risaralda, de la siguiente manera: Se realizó una prueba preliminar en la cual se utilizaron garrapatas Rhipicephalus sanguineus y Rhipicephalus microoplus, las cuales fueron clasificadas por especie y sexo. Estas fueron asignadas aleatoriamente a los tratamientos de la siguiente manera: 7 hembras Rhipicephalus microoplus se asignaron aleatoriamente al tratamiento con extracto etanolico al 75%. Además se asignaron de manera aleatoria 4 hembras y 3 machos Rhipicephalus sanguineus, en los siguientes grupos: grupo 1 (extracto etanolico 75%), grupo 2 (extracto etanolico 50%) y grupo 3 (extracto acuoso 75%), esto se realizó con el fin de determinar la tasa de mortalidad de los extractos en concentraciones menores a 100%.. 7.

(8) Para el ensayo final se clasificaron las garrapatas del tipo Rhipicephalus sanguineus, según sus características taxonómicas y separadas por sexo. Posteriormente se eliminaron las garrapatas que presenten alteraciones físicas y solo se dejaron las garrapatas que presentaron vitalidad y movimiento al momento de iniciar el tratamiento. Se asignaron las garrapatas aleatoriamente a los tratamientos, en cajas de Petri con 3 repeticiones. cada. uno.. Se. utilizó. el. siguiente. diseño:. Preparación del extracto acuoso y extracto etanolico del Neem Este se realizó en el Laboratorio del programa de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Tecnológica de Pereira. Las semillas de Neem (Azadirachta indica) fueron lavadas con agua limpia y secadas al sol, y fueron cortadas en trozos pequeños. Posteriormente se pesaron las semillas en una balanza analítica y se depositaron en recipientes cerrados (13). Se utilizó una proporción de 3:1 (solvente: muestra); como solvente extractor de las mismas se utilizó agua destilada para el extracto acuoso y el solvente para el extracto etanolico fue alcohol etílico (70%), se maceraron y se dejaron reposar por un periodo de 24 horas (11), posterior se realizó una filtración del material vegetal obteniendo los extracto. El extracto etanolico se llevó a punto de ebullición para la evaporación del alcohol. Se realizó una dilución en el extracto etanolico y se obtuvo una concentración del 75% para extracto etanolico.. 8.

(9) Exposición de las garrapatas a los tratamientos Las garrapatas fueron expuestas a una prueba de aspersión, dependiendo del grupo experimental en el que fueron ubicadas, así: Se tomaron (n=10) garrapatas 3 hembras y 7 machos en iguales proporciones por cada caja de Petri con tres repeticiones según el tratamiento al que fueron asignadas aleatoriamente, para un total de (n=150) garrapatas. Para el grupo control negativo sólo se les agrego agua destilada. Al grupo control positivo se añadió un garrapaticida comercial (Amitraz al 12,5%). A los grupos cuyas garrapatas estuvieron bajo el efecto del extracto acuoso de Neem se evaluó en concentraciones de 100%. Y para el grupo en el cual las garrapatas tuvieron el efecto del extracto etanolico del Neem se evaluó concentraciones de 75% y 100%. Todos los tratamientos tuvieron una duración de 30 minutos, una vez transcurrido este tiempo se verifico la mortalidad presentada por cada tratamiento y se volvió a verificar transcurridas 24 horas; se verifico la mortalidad de cada grupo con base al implemento de una fuente de calor y las garrapatas que no presentaron ningún movimiento de las extremidades se dieron por muertas (14). Posterior a la obtención de los resultados se realizó un análisis no paramétrico prueba de Kruskal-Wallis, teniendo en cuenta la mortalidad en relación al tratamiento y un análisis paramétrico modelo lineal, teniendo en cuenta la mortalidad en relación al tratamiento y al tiempo, determinando la diferencia entre los tratamientos con el test de Wilcoxon (P<0.05) demostrada por medio graficas de cajas y bigotes, mediante el softwar R (R core team) (15). Resultados En la prueba preliminar se obtuvo resultados que permitieron descartar los tratamientos que tuvieron un comportamiento bajo en mortalidad. Dejando solo el extracto etanolico al 75% con un porcentaje de mortalidad de 71,4% quien en esta prueba mostro la mayor tasa de mortalidad (tabla 1).. 9.

(10) Tabla 1. Porcentaje de mortalidad resultado de la prueba preliminar de los extractos etanolico y acuoso en garrapatas Rhipicephalus sanguineus y Rhipicephalus microplus. Tratamiento Extracto Etanolico 75% Extracto Etanolico 50% Extracto Acuoso 75% Extracto Etanolico 75%. Especie Rhipicephalus sanguineus Rhipicephalus sanguineus Rhipicephalus sanguineus Rhipicephalus microplus. N° Animales 7. % Mortalidad 71,4%. 7. 28,6%. 7. 14.2%. 7. 57,1%. Fórmula aplicada %Mortalidad = Total de garrapatas muertas / Total garrapatas expuestas x 100 (4).. La tasa de mortalidad total de los tratamientos planteados en este estudio oscilo entre 0 y 100% (Tabla 2 - Grafica 1), donde se encontraron diferencias estadísticamente significativas (p< 0,05) entre el grupo expuesto a extracto etanolico puro con respecto al grupo control negativo, como también entre el grupo control positivo y el grupo control negativo, no se encontró diferencia estadísticamente significativa con los otros tratamientos, como tampoco variabilidad entre los tiempo evaluados (Tabla 3). Tabla 2. Medidas descriptivas de la mortalidad de los diferentes tratamientos sobre garrapatas evaluadas por sexo y tiempo post aplicación.. 10.

(11) Grafica 1. Diagrama de Cajas y Bigotes de la mortalidad total encontrada a los 30 minutos y 24 horas post administración de los diferentes tratamientos.. Tabla 3. Post- hoc teste de Wilcoxon de los diferentes tratamientos con diferencias estadísticamente significativas y no significativas, evaluando la mortalidad total en dos tiempos.. Resultados menores a p<0.05 son representados por *. T1: mortalidad a los 30 minutos y T2: mortalidad a las 24 horas.. Observando mortalidad del 100% en machos con el extracto etanolico puro y el control positivo. sin. variación. en. los. tiempos. evaluados.. Obteniendo. diferencias. 11.

(12) estadísticamente significativas en relación con control negativo en el que no se encontró mortalidad en ninguno de los tiempos. Con el extracto acuoso y el extracto etanolico al 75% no se pudo observar diferencias estadísticamente significativas de mortalidad de machos (Grafica 2, tabla 4). Grafica 2. Diagrama de Cajas y Bigotes de la mortalidad de machos encontrada a los 30 minutos y 24 horas post administración de los diferentes tratamientos.. Tabla 3. Post- hoc teste de Wilcoxon de los diferentes tratamientos con diferencias estadísticamente significativas y no significativas, evaluando la mortalidad machos en dos tiempos.. 12.

(13) Resultados menores a p<0.05 son representados por *. T1: mortalidad a los 30 minutos y T2: mortalidad a las 24 horas.. La mortalidad de las hembras obtuvo diferencia estadísticamente significativa (p<0.05) entre los tratamientos de extracto etanolico puro con respecto al tratamiento de extracto acuoso puro, y el extracto etanolico puro con relación al control negativo, como también se observaron diferencias estadísticamente significativas (p<0.05) entre el control positivo y el extracto acuoso puro, y entre el control positivo con respecto al control negativo ya que tanto el extracto etanolico puro y el control positivo obtuvieron mortalidad del 100%, el control negativo y el extracto acuoso no obtuvieron mortalidad de las hembras en ninguno de los tiempos evaluados (Grafica 3, tabla 5). Grafica 3. Diagrama de Cajas y Bigotes de la mortalidad de hembras encontrada a los 30 minutos y 24 horas post administración de los diferentes tratamientos.. 13.

(14) Tabla 5. Post- hoc teste de Wilcoxon de los diferentes tratamientos con diferencias estadísticamente significativas y no significativas, evaluando la mortalidad de hembras en dos tiempos.. Resultados menores a p<0.05 son representados por *. T1: mortalidad a los 30 minutos y T2: mortalidad a las 24 horas.. En el modelo lineal realizado se encontró diferencia estadísticamente significativa solo en los tratamientos control positivo, control negativo y extracto etanolico puro. No se encontró diferencia estadísticamente significativa ni en el grupo con extracto etanolico 75%, extracto acuoso y tampoco en el tiempo evaluado. También se puede ver diferencia en la mortalidad entre machos y hembras en los tratamientos con extracto. 14.

(15) acuoso y etanolico al 75%, donde se ve observo diferencia en la mortalidad, machos entre 60 -70% que en hembras de 0% - 10%(Tabla 2). Discusiones En un estudio la eficacia del control de las garrapatas con extracto de Neem concluyo que el extracto posee una efectividad similar que lo encontrado con el uso de un producto comercial (1); similar resultado se observó en el presente estudio donde el extracto etanolico puro de las semillas de Neem arrojo iguales resultados que el producto comercial utilizado como control positivo que en ambos casos fue el amitraz. La efectividad del extracto del Neem puede depender del método de extracción que se aplica para la obtención de los metabolitos del material vegetal, donde también la concentración de su componente activo (azaridachtina) posee una relación directa con los resultados esperados posterior a la implementación del extracto en los sujetos de investigación, a mayor concentración mayor serán los efectos ixodicidas (7,10,16,17), lo que podemos ver en un estudio donde fue utilizado el extracto hexánico de semillas de A. indica tuvo una eficiencia de 50%, logrando una mortalidad total de 65% de las garrapatas hembras (11), contrario a lo encontrado en este estudio donde se utilizó extracto etanolico puro en el cual la mortalidad obtuvo. resultados. 100%. En otro. estudio donde el material vegetal utilizado fueron las hojas del Neem con extracto etanolico obtuvieron una mortalidad del 24% y reportan una eficiencia baja, contrario a lo encontrado en este estudio donde se utilizó las semillas como material vegetal para la extracción del compuesto activo, ya que en las semillas se encuentra en mayor concentración, dando resultados eficaces en la mortalidad de las garrapatas estudiadas. Puede resultar importante destacar que en ese estudio reportan mayor mortalidad con el extracto etanolico que en el acuoso (4), semejante a lo reportado en este estudio donde el extracto etanolico obtuvo un mejor comportamiento en la mortalidad que el extracto acuoso.. 15.

(16) En el presente estudio no se obtuvo una variabilidad significativa en los tiempos de evaluación, contrario a lo encontrado en otro estudio donde se obtuvo mortalidad total en todos los grupos evaluados posterior a 27 horas de exposición (10). Conclusiones Se puede concluir que las semillas de Neem (Azadirachta indica), pueden ser utilizadas con éxito en estudios in-vitro en el control de la garrapata marrón del perro (Rhipicephalus sanguineus). Cuando se emplean semillas en extractos etanolico puro, tiene similar eficacia sobre el control de estos ectoparásitos que productos comerciales como el amitraz empleados para esta función. El empleo del etanol como solvente de semilla demostró tener más eficiencia que el agua destilada como solvente. Por lo tanto, la mejor forma de extracción de metabolitos en las semillas de Neem será con extracto etanolico puro. Bibliografía 1.. Pavon J. Efecto en el ecosistema del uso de acaricidas botánicos y químicos en control de las garrapatas. 2014;18(3):50–6.. 2.. Remedio RN, Nunes PH, Anholeto L a., Oliveira PR, Sá ICG, Camargo-Mathias MI. Morphological alterations in salivary glands of Rhipicephalus sanguineus ticks (Acari: Ixodidae) exposed to neem seed oil with known azadirachtin concentration. Micron. 2016;83:19–31.. 3.. Remedio, R.N; Nunes, P.H Anholeto, P.R; Camargo-Mathias M. Morphological effects of neem ( Azadirachta indica A . Juss ) seed oil with known azadirachtin concentrations on the oocytes of semi-engorged Rhipicephalus sanguineus ticks ( Acari : Ixodidae ). 2015;431–44.. 4.. Cruz, Anastasia; Moreno G. Evaluacion de efecto ixodicida de extractos de Azadirachta indica en diferentes tiempos de almacenamiento. Cult Cient. 2015;871–2.. 16.

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