AVANCE DEL PROYECTO SIP 20070396 RESULTADOS
• Preparación del inóculo
La cepa Aspergillus níger (ATCC 1015) se adquirió en tubos de ensaye en agar de dextrosa y papa (PDA), por tal motivo fue resembrada para obtener una cantidad suficiente tal que se pudiera emplear en las fermentaciones a realizar. La resiembra se realizó en agar Sabouraud el cual fue preparado, esterilizado y vaciado en cajas petri las cuales fueron resembradas por picadura, dichas cajas se mantuvieron a temperatura ambiente y cubiertas con papel aluminio por una semana para obtener un optimo crecimiento del microorganismo el cual comenzó a crecer desde el primer día y alcanzo su optimo a los 8 días de haberse sembrado. Este procedimiento se realizó mensualmente a manera de conservar la cepa.
Para la obtención del inoculo a emplear en cada fermentación se preparó para cada ensayo y en el momento del inicio de la fermentación una solución que contenía 9 x 108 esporas/ml por medio de turbidimetria utilizando una escala de MacFarland previamente preparada.
• Crecimiento del microorganismo en diferentes sustratos
Cada fermentación se realizó por duplicado en matraces de 1L los cuales contenían 500 ml de caldo previamente preparado y esterilizado y fueron inoculados con 900 x 106 esporas/ml e incubados por un periodo de 8 días a 30°C, con agitación de 100rpm.
Las fermentaciones realizadas se muestran a continuación:
Naringina:
Para conocer la producción de la naringinasa a partir de la fuente de carbono se evaluaron dos concentraciones diferentes (0.1% y 0.2%), así mismo con la finalidad de evaluar el efecto del CaCO3 y del MgCO3 en el crecimiento del microorganismo se
realizaron diferentes fermentaciones en presencia y ausencia de estas sustancias.
Matraz # Fuente de Carbono CaCO3 1mM MgCO3 1mM 1 0.1% Si Si 2 0.1% No No 3 0.2% Si Si 4 0.2% No No
Nota: La fuente de carbono que originalmente se pondría en base a la bibliografía era de 1 y 2% sin embargo debido a que no contamos con los recursos para obtener esas cantidades se redujo a 0.1 y 0.2%.
Observaciones:
El crecimiento del microorganismo en el caldo se observo única mente en los matraces que no contenían CaCO3 y MgCO3 tanto en 0.1% como en 0.2%, es decir no se observo
crecimiento a lo largo del periodo de incubación en los matraces 1 y 3 así como en sus duplicados; lo cual pudo ser por tres razones :1) que el CaCO3 y MgCO3 inhibieran el
crecimiento del microorganismo y por tanto la producción de la enzima, lo cual no era posible debido a que en la bibliografía se reporta que ambos favorecen el crecimiento del microorganismo; 2) que la presencia de los dos al mismo tiempo tuviera un efecto inhibitorio del crecimiento del microorganismo y así de la producción de naringinasa; o 3) que la concentración en la cual habían sido adicionados fuera muy elevada. En base a estas consideraciones fueron planeadas las siguientes fermentaciones antes de continuar con la siguiente fuente de carbono. Es importante resaltar que aunque no se observo crecimiento del microorganismo se tomo una alícuota de 20ml durante cada día del periodo de incubación.
En los matraces 2 y 4 se observo crecimiento del microorganismo desde el día después del inicio de la fermentación. Sin embargo para saber si hubo o no producción de la naringinasa es necesario realizar la cuantificación de azucares totales, reductores y proteína así como la identificación de la proteína por SDS; para todas estas determinaciones se tomo una alícuota homogénea de 20 ml de caldo de cada uno de los matraces y sus duplicados cada día que duró la fermentación exceptuando los días que cayeron en fin de semana, en base a esta alícuota se determino el crecimiento del microorganismo, cada alícuota fue filtrada en papel filtro de poro pequeño y este fue secado en un horno así se cuantifico el peso del micelio por diferencia a continuación se muestran los resultados.
Debido a las que las referencias científicas que el CaCO3 y el MgCO3 influyen en el
crecimiento del hongo, se prosiguió a preparar las siguientes fermentaciones:
Matraz # Fuente de Carbono CaCO3 0.1mM MgCO3 0.1mM 5 0.1% Si Si Matraz # Fuente de Carbono CaCO3 0.01mM MgCO3 0.01mM 6 0.1% Si No 7 0.1% No Si
El matraz numero 5 contenía Naringina como fuente de carbono, CaCO3 y MgCO3 en
concentración de 0.1mM a manera de evaluar si la anterior concentración (1mM) era tan alta que no permitía el crecimiento del microorganismo, sin embargo de igual manera no se observo crecimiento del microorganismo a la concentración empleada. El siguiente matraz (numero 6) contenía Naringina como fuente de carbono y CaCO3 en
concentración de 0.01mM donde si se observo crecimiento del microorganismo sucediendo lo mismo en el matraz número 7 que contenía Naringina como fuente de carbono y MgCO3 en concentración de 0.01mM, por lo cual la concentración adecuada
para que el microorganismo empleado se a capaz de crecer es de 0.01mM tanto de CaCO3 como de MgCO3 por tanto para evaluar si la presencia de ambos al mismo
tiempo tiene un efecto inhibitorio se sugiere realizar una fermentación empleando Naringina como fuente de carbono así como CaCO3 y MgCO3 al mismo tiempo en
concentración de 0.01mM. De igual manera para las fermentaciones 5, 6 y 7 se tomo una alícuota homogénea de 20 ml de caldo así como a sus duplicados cada día que duró la fermentación exceptuando los días que cayeron en fin de, en base a esta alícuota se determino el crecimiento del microorganismo, cada alícuota fue filtrada en papel filtro de poro pequeño y este fue secado en un horno así se cuantifico el peso del micelio por diferencia a continuación se muestran los resultados de los matraces 6 y 7 donde si se observo crecimiento del microorganismo.
Melaza:
Para conocer la producción de la naringinasa a partir de esta fuente de carbono se evaluaron dos cantidades diferentes de melaza (5g y 10g ), así mismo con la finalidad de evaluar el efecto del CaCO3 y del MgCO3 en presencia de esta fuente de carbono en el
crecimiento del microorganismo y sabiendo que la concentración de 1mM es excesiva y no permite el crecimiento del microorganismo se utilizó una concentración de 0.1mM así se realizaron diferentes fermentaciones en presencia y ausencia de estas sustancias las cuales se muestran a continuación.
Matraz # Fuente de Carbono (g) CaCO3 0.1mM MgCO3 0.1mM 1 5 No No 2 5 Si Si 3 10 No No 4 10 Si Si Matraz # Fuente de Carbono (g) CaCO3 0.01mM MgCO3 0.01mM 5 5 Si No 6 5 No Si Observaciones:
El crecimiento del microorganismo en el caldo se observo única mente en los matraces que no contenían CaCO3 y MgCO3 tanto en 5g como en 10g, es decir no se observo
crecimiento a lo largo del periodo de incubación en los matraces 2 y 4 así como en sus duplicados, lo cual seguramente es debido que al igual que en el caso de la Naringina como fuente de carbono la concentración de 0.1mM aun es demasiado alta y en lugar de permitir el crecimiento del microorganismo lo desfavorece. Es importante resaltar que aunque no se observo crecimiento del microorganismo se tomo una alícuota de 20ml durante cada día del periodo de incubación.
En los matraces 1 y 3 se observo crecimiento del microorganismo desde el día después del inicio de la fermentación, para todas estas determinaciones se tomo una alícuota homogénea de 20 ml de caldo de cada uno de los matraces y sus duplicados cada día que duró la fermentación exceptuando los días que cayeron en fin de semana, en base a esta alícuota se determino el crecimiento del microorganismo, cada alícuota fue filtrada en papel filtro de poro pequeño y este fue secado en un horno así se cuantifico el peso del micelio por diferencia a continuación se muestran los resultados.
En los matraces 5 y 6, donde se empleo una concentración de 0.01mM tanto de CaCO3
como de MgCO3, si se observo crecimiento del microorganismo desde el día después del
inicio de la fermentación, por lo que se sugiere se realice una fermentación empleando tanto CaCO3 y MgCO3 al mismo tiempo en una concentración de 0.01mM para conocer si
tienen un efecto inhibitorio sobre el crecimiento del microorganismo al estar presentes los dos al mismo tiempo durante la fermentación. A continuación se muestran los valores del peso del micelio a lo largo de la fermentación para cada uno de los matraces donde se observo crecimiento del microorganismo.
Se realizaron las curvas estándar para cuantificar el rendimiento de la fermentación por el método Fenol-Sulfúrico y el método DNS. Para la cuantificación de la proteína se realizó una curva estándar por el Método Lowry y el de Bradford.
Para llevar a cabo la identificación de la naringinasa producida por el microorganismo empleado es importante conocer el comportamiento de esta in vitro por tanto se elaboró una curva de naringinasa. Para la elaboración de la curva de naringinasa se preparo una solución de Naringina 0.005M en buffer de citratos 0.05 pH 4.5 de la cual siempre se adicionó 1.9 ml a cada tubo de ensayo, además de diferentes soluciones de naringinasa de 10, 30, 50 y 75 µg/ml; las cuales fueron elaboradas a partir de una solución concentrada de 1500 µg/ml, siendo siempre la alícuota de 0.1ml. Así el volumen total de cada tubo de ensayo fue de 2ml.Cada ensayo se incubó durante 15 minutos tiempo en el cual se llevaría a cabo la hidrólisis de la Naringina por la naringinasa y se obtendría glucosa como producto final ya que la cantidad de glucosa producida es directamente proporcional a la cantidad de naringenina producida por dicha hidrólisis. Después fue detenida la reacción con la adición de 4 ml de DNS y se calentó durante 5 minutos para revelar cada tubo, los cuales una vez fríos fueron leídos en el fotocolorímetro con filtro verde. Se encontró conforme aumenta la concentración de enzima adicionada se obtiene mayor cantidad de azucares reductores en un mismo tiempo debido al hecho del aumento de la concentración de la enzima en el medio obviamente se lleva a cabo más rápido la hidrólisis del sustrato todo en un mismo tiempo. Se encontró que como conforme aumentaba la concentración de la alícuota de enzima adicionada se obtiene mayor cantidad de hidrólisis por lo tanto de azucares reductores en un mismo tiempo el cual fue de 15 minutos debido al hecho de que al aumentar la concentración de la enzima adicionada en el medio obviamente se lleva a cabo más rápido la hidrólisis del sustrato todo en un mismo tiempo. A demás también se observo que el tiempo de incubación de 15 minutos era muy grande debido a que la hidrólisis se lleva a cabo en menor tiempo lo cual se evaluó más adelante. Por tanto el siguiente paso fue evaluar el efecto del tiempo sobre la velocidad de hidrólisis empleando diferentes tiempos los cuales fueron 5,10, 20, 30, 40, 50, 60 minutos adicionando a cada tubo de ensayo 1.9ml de Naringina y 0.1ml de Naringinasa en concentración de 50 µg/ml.
Para la elaboración de la grafica del efecto del tiempo en la velocidad de hidrólisis se mantuvo la concentración de la naringinasa constante. Se encontró que a mayor tiempo de incubación mayor grado de hidrólisis. Esto era de esperarse, sin embargo, el objetivo de realizar este experimento fue encontrar el tiempo adecuado al cual se llevarían a cabo los demás experimentos tomando en cuenta para su elección el que debe ser un tiempo den el cual la hidrólisis sea suficiente pero no excesiva para evitar subestimar o sobrestimar los resultados.
Se calculó la velocidad de hidrólisis y se realizaron las curvas de de Michaelis- Mentes, lineweaberburk, Eadi-Hoffsten y Agustinson. Nos encontramos que a del grafico de Michaelis no se podia conocer cuál era la Vmax ni la Km por que el grafico no presentó la
tendencia que generalmente se observa en el. Por lo tanto se grafico según Lineweaver-Burk, Eadi-Hoffsten y Agustinson. Fue en a partir de la grafica de Lineweaverburk que se pudo calcular la Vmax y la Km que es la afinidad de la enzima por el sustrato. También se
