MANUAL DE PRÁCTICAS
AUTOR:
MSc. Biólogo Microbiólogo MIGUEL ANGEL RUIZ BARRUETO
PIURA – PERÚ
2017
U
NIVERSIDAD
C
ÉSAR
V
ALLEJO
DATOS DEL ESTUDIANTE
APELLIDOS Y NOMBRES: CÓDIGO DE ESTUDIANTE: DIRECCIÓN: PERSONAL: INSTITUCIONAL: FACULTAD: ESCUELA PROFESIONAL:
SEMESTRE ACADÉMICO: CICLO: SECCIÓN: No DE MESA:
MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA
PRIMERA EDICIÓN 2017
AUTORIDADES ACADÉMICAS DE LA UNIVERSIDAD CÉSAR VALLEJO – Filial Piura
DIRECTOR GENERAL:
Dr. Alcibíades Sime Marques
DECANA DE LA FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS
Dra.Amalia Guadalupe Vega Fernández
DIRECTORA DE ESCUELA DE ESTOMATOLOGÍA
Dra. Erika Raquel Enoki Miñano
SECRETARIO ACADÉMICO
Mg. CD. Wilfredo Terrones Campos
AUTORES DEL PRESENTE MANUAL
M.Sc. Mblgo. Miguel Angel Ruiz Barrueto.
Coordinador de Investigación DTC - Escuela de Estomatología.
Piura, agosto de 2017.
U
NIVERSIDAD
C
ÉSAR
V
ALLEJO
F
ACULTAD DE
C
IENCIAS
M
ÉDICAS
Escuela de Estomatología
1. El alumno deberá portar su MANUAL DE PRÁCTICAS desde el primer día de clases. En caso contrario no podrá ingresar al laboratorio.
2. Deberá leer previamente la práctica correspondiente antes de ingresar al laboratorio. 3. El docente haciendo uso de un instrumento de evaluación evaluará a los estudiantes en
todo lo concerniente a la práctica que corresponde, la evaluación se realizará de la información proporcionada en el presente manual de prácticas.
4. Antes de iniciada la práctica el docente cuestionará a los estudiantes de forma verbal sobre el tema que corresponda a fin de corroborar la lectura realizada por ellos.
5. Al inicio de la práctica el docente explicará la metodología de trabajo y el protocolo de la práctica en la pizarra o mediante una presentación PowerPoint.
6. Posterior a la explicación los estudiantes que conformen cada grupo colocarán sobre la mesa de trabajo los materiales solicitados para el desarrollo de la práctica y que consta detalladamente en cada práctica. No se permitirá el intercambio de materiales dentro del laboratorio. La falta de algún material solicitado influirá en la nota final de la sesión práctica.
7. El estudiante deberá anotar sus resultados, en su manual, en los espacios designados para ello.
8. Al finalizar la práctica se analizarán y discutirán los resultados obtenidos. El estudiante podrá realizar preguntas relacionadas al tema en cualquier momento del desarrollo de la práctica.
9. Cada alumno es responsable de la información que coloca en su Manual de Prácticas. Cada práctica desarrollada será revisada en la semana siguiente a su realización. En el caso que se encontrara duplicidad de prácticas, copias de respuestas de cuestionario, fotocopia de resultados o cualquier otro indicador de plagio este será calificado con nota cero, tanto para el que prestó el Manual como para el que plagió. Intentamos formar estudiantes con valores y respetuosos del esfuerzo de cada uno.
PRESENTACIÓN
EL AUTOR
El manual de Microbiología para los estudiantes de la EAP de Estomatología se ha elaborado teniendo en cuenta las competencias académicas que el futuro Cirujano Dentista debe adquirir durante el desarrollo del presente curso. La Microbiología es la ciencia que estudia los microorganismos, de su biología, su ecología y su relación con el hombre. Esta definición hace necesaria la de tres conceptos que se incluyen en ella: microorganismo, biología y ecología. El conocimiento de la biología y la ecología microbiana son imprescindibles para poder comprender de qué forma los microorganismos interaccionan con los seres humanos y qué tipos de relaciones establecen con ellos.
Por microorganismo entendemos cualquier organismo vivo que no sea visible a simple vista. Esta definición operativa no incluye los hongos, tanto inferiores como superiores, ni las algas aunque ambos grupos son considerados microorganismos porque su organización es esencialmente unicelular (las células que los constituyen mantienen un alto grado de autonomía entre sí). Por otra parte, organismos pluricelulares pueden ser de tamaño tan pequeño que entren dentro de la definición anterior sin dejar por ello de ser estructuralmente tan complejos como cualquier animal superior. En nuestro curso nos centraremos en bacterias, virus, hongos y parásitos de interés clínico para el ser humano.
Como estudiantes que inician su experiencia en el manejo de microorganismos, se les darán las indicaciones básicas de conducta que deben cumplir en un laboratorio de microbiología a fin de que pueda realizar un trabajo seguro y eficiente. Este manual inicia con la práctica de Bioseguridad, con los antecedentes y reglas de seguridad más importantes que deberán conocer y practicar siempre. Las prácticas propuestas tratan sobre el manejo de bacterias, hongos y parásitos, porque son los grupos microbianos más abundantes y porque muchos representantes de ellos tienen importancia clínica debido a su capacidad de causar enfermedad en seres humanos.
Cada práctica comienza con el título, la Introducción y luego las competencias para facilitar la comprensión de los fundamentos de las prácticas. Seguidamente se indican los materiales que se requieren y los procedimientos a realizar en forma de instrucciones numeradas. Al final de cada práctica se proponen cuadros o figuras de recopilación de resultados y un espacio para que el alumno redacte una breve discusión de sus resultados. Los invitamos a consultar este manual y sobre todo a realizar los experimentos propuestos con interés y entusiasmo para adquirir los conocimientos y habilidades de trabajo que se requiere en un futuro Cirujano Dentista.
Es nuestro deseo que el presente manual pueda ayudar al estudiante en la comprensión teórica y ejecución práctica de la asignatura y en la apertura de investigaciones básicas en el campo de la Microbiología oral. Se espera que el esfuerzo desplegado, cumpla su cometido en bien de una óptima formación profesional y una mejor comprensión del papel importante que cumple el estudio de la MICROBIOLOGÍA en las Ciencias Médicas. Así mismo se esperan las valiosas sugerencias de colegas y estudiantes que permitan el perfeccionamiento de este manual en ediciones futuras.
NORMAS, RECOMENDACIONES Y PRECAUCIONES PARA EL
TRABAJO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
El trabajo en el laboratorio requiere la observación de una serie de normas de bioseguridad, a fin de evitar posibles accidentes debido a desconocimiento de lo que se está haciendo o a una posible negligencia. Quien trabaja en el laboratorio está expuesto a muchos riesgos, pues hay productos químicos que son tóxicos, inflamables, explosivos, corrosivos, carcinogénicos, agentes microbianos patógenos y, a veces, existe el peligro derivado del uso de altos voltajes, de luz ultravioleta y otras radiaciones.
I. NORMAS PERSONALES
1. Seguir las instrucciones y recomendaciones dadas por el docente para cada sesión práctica. No
manipule muestras, materiales, instrumentos o equipos por su cuenta.
2. Procure ingresar al laboratorio a la hora señalada, con el guardapolvo puesto y con el material de
trabajo previamente solicitado.
3. En el laboratorio es obligatoria la utilización de guardapolvo (mandil) para evitar que posibles
sustancias químicas lleguen a la piel o deterioren las prendes de vestir. El guardapolvo debe ser de color blanco, bordado con nombre y apellido del estudiante y el logro de la escuela de Estomatología UCV. Es de uso exclusivo dentro del laboratorio, hay que sacárselo si se va abandonar el mismo.
4. Si se tiene el cabello largo, es conveniente llevarlo recogido.
5. Durante su permanencia en el laboratorio aproveche y use adecuadamente el tiempo, materiales de
trabajo, agua, corriente eléctrica, gas, mobiliario y espacio.
6. No arroje desechos a los lavaderos ni al piso. Procure colocarlos en los tachos correspondientes para
que sean descartados una vez finalizada la práctica. En el tacho con bolsa ROJA, se desechan los residuos de materiales biológico (restos vegetales y animales, material contaminado con sangre); en el tacho con bolsa NEGRA se arrojan los desperdicios comunes no contaminados (papeles, etc.).
7. Está estrictamente prohibido comer, beber y fumar dentro del laboratorio.
8. Sobre la mesa de trabajo del laboratorio debe de tener solamente el material solicitado y el Manual de
Prácticas de Biología. Coloque las carteras, mochilas, libros y otros en los casilleros o en los lugares destinados para ellos.
9. Durante el desarrollo de la práctica observe y grafique con detalle los diversos experimentos,
protocolos u observaciones microscópicas; intercambie conceptos, ideas y puntos de vista con sus compañeros y profesor.
10. Al término de la práctica el estudiante debe limpiar su mesa de trabajo, lavar el material de vidrio
utilizado, lavarse cuidadosamente las manos, despojarse del guardapolvo y retirarse ordenadamente.
II. NORMAS DE UTILIZACIÓN DE PRODUCTOS QUÍMICOS
1. Antes de utilizar un compuesto químico, asegurarse de que es el que se necesita.
2. No devolver a los frascos de origen los sobrantes de los productos químicos o medios de cultivo. Si
3. No tocar con las manos y menos con la boca, los productos químicos, utilizar peras de succión o
propipetas.
4. Los ácidos requieren un cuidado especial, cuando haya que diluirlos, nunca echar agua sobre ellos;
por el contrario, se debe agregar el ácido sobre agua.
5. Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, etc.) no deben estar cerca de fuentes de calor. Si hay
que calentar tubos con estos productos, se hará al baño maría, nunca directamente a la llama.
6. Si se vierte sobre la piel cualquier ácido o producto corrosivo, lavarse inmediatamente con abundante
agua y avisar al encargado del laboratorio.
7. Si se preparan soluciones químicas, éstas deben colocarse en un frasco limpio y seco y rotulado
convenientemente.
III. NORMAS DE UTILIZACIÓN DEL MATERIAL DE VIDRIO
1. Tener cuidado con los bordes y puntas cortantes de los tubos u objetos de vidrio.
2. El vidrio caliente no se diferencia a simple vista del vidrio frio. Para evitar quemaduras, dejarlo enfriar
antes de tocarlo.
3. Las pipetas usadas deben colocarse en recipientes que contienen una solución desinfectante (mezcla
sulfocrómica o bicloruro de mercurio). De la misma manera se procede para tubos de ensayo, láminas cubreobjetos y laminillas.
4. Si se tiene que calentar a la llama el contenido de un tubo de ensayo, debe considerarse lo siguiente:
a) La boca del tubo de ensayo no debe apuntar a ningún compañero de trabajo ni a sí mismo. Puede hervir el líquido y salir disparado, ocasionando un accidente.
b) El tubo de ensayo debe calentarse por la parte lateral, nunca por el fondo, agitando suavemente. Todos los que trabajan en el laboratorio, deben saber dónde está el botiquín, las botellas de irrigación de los ojos, y los extintores de incendio.
I. INTRODUCCIÓN:
En el campo de la salud existen diversos lugares donde el profesional se desempeña, como hospitales, clínicas, postas, centros asistenciales, etc. Sin embargo el laboratorio también constituye un lugar de trabajo, tanto en el campo clínico, educativo y de investigación, siendo por ello necesario que se conozcan las pautas mínimas necesarias para el normal desempeño dentro de él. Los laboratorios microbiológicos constituyen ambientes de trabajo especiales, generalmente únicos, que pueden presentar riesgos de enfermedades infecciosas identificables para las personas que se encuentren en o cerca de ellos. Durante el transcurso de la historia de la microbiología, muchas infecciones se han contraído en el laboratorio. Desde la década de 1940 hasta la actualidad existes reportes de casos de infecciones adquiridas por personal de los laboratorios en todo el mundo. Dichos reportes concluyeron que la “manipulación de cultivos o especímenes o la inhalación de polvo con contenido de microorganismos constituye un peligro inminente para quienes trabajan en los laboratorios”. Algunos casos se atribuyeron al descuido o a malas técnicas en la manipulación de materiales infecciosos. Según la Organización Mundial de la Salud (2005), la Bioseguridad es un conjunto de normas y medidas para proteger la salud del personal, frente a riesgos biológicos, químicos y físicos a los que está expuesto en el desempeño de sus funciones, también a los pacientes y al medio ambiente.
Entonces definimos como bioseguridad al conjunto de combinaciones específicas (normas) de trabajo, equipo de seguridad y facilidades diseñadas para minimizar la exposición de los trabajadores y el ambiente a los agentes infecciosos; es así que las normas de bioseguridad están destinadas a reducir el riesgo de transmisión de microorganismos de fuentes reconocidas o no reconocidas de infección en Servicios de Salud vinculadas a accidentes por exposición a sangre y fluidos corporales, así como también agentes físicos y químicos. Los objetivos de estas normas son:
1. Proteger la salud del personal que pueda estar expuesto a riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos, químicos y físicos.
2. Establecer la conducta a seguir frente a un accidente con exposición a dichos elementos.
3. Participar de las normas de Bioseguridad a todo el personal que directa o indirectamente toma contacto con el laboratorio.
DEFINICIONES Y ABREVIATURAS
1. Agente biológico: Todo organismo viviente capaz de causar infección, enfermedad o muerte en el ser
humano con inclusión de los genéticamente modificados y endoparásitos humanos susceptibles de originar cualquier tipo de infección, alergia o toxicidad.
2. Antisépticos: Se definen como agentes germicidas para ser usados sobre la piel y los tejidos vivos.
Aunque algunos germicidas pueden ser utilizados como desinfectantes y antisépticos (alcohol 70-90%),
BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y
MICROSCOPÍA ÓPTICA: MANEJO Y CUIDADOS
su efectividad no es necesariamente la misma en cada caso, un buen antiséptico puede no ser eficaz como desinfectante y viceversa.
3. Área contaminada: Área donde se manipulan microorganismos de riesgo. Ejemplo: Laboratorios donde
se manipulan virus, producción de antígenos, etc.
4. Área de tránsito limitado: Área donde el tránsito está permitido sólo a personas previamente
autorizadas, debido a la presencia de agentes que corresponden a los grupos I y II de la clasificación de agentes de riesgo o al uso de sustancias químicas de bajo riesgo. El acceso del personal administrativo está terminantemente prohibido.
5. Área de tránsito restringido: Área en la que el tránsito está permitido sólo al personal adecuadamente
protegido y autorizado, debido a la presencia de agentes de los grupos III y IV. También incluye los laboratorios de producción de biológicos y control de calidad d alimentos, medicamentos y afines. El acceso del personal administrativo está terminantemente prohibido.
6. Área limpia: Área del laboratorio donde no se manipulan microorganismos de riesgo. Ejemplo: donde se
mantienen los medios de cultivos celulares, se preparan los medios de cultivo y a la vez se realiza la formulación de la vacuna.
7. Área libre: Área de tránsito libre para todo el personal. Ejemplo: pasadizos, comedor y otras áreas de
uso común.
8. Accidente de trabajo: Ocurrencia durante las horas de trabajo que causa la inhabilitación temporal o
permanente del trabajador.
9. Acción correctiva: Procedimiento realizado para eliminar la causa de una disconformidad, defecto u
otra situación no deseable y existente con el propósito de evitar que vuelva a suceder.
10. Acción preventiva: Acción tomada para eliminar las causas de una disconformidad, defecto u otra
situación potencial no deseada a fin de evitar que se produzca.
11. Bioseguridad: Conjunto de medidas preventivas reconocidas internacionalmente orientadas a proteger
la salud y la seguridad del personal y su entorno. Complementariamente se incluye normas contra riesgos producidos por agentes físicos, químicos y mecánicos. Modernamente se incorporan también las acciones o medidas de seguridad requeridas para minimizar los riesgos derivados del manejo de un organismo modificado genéticamente (OMG), sus derivados o productos que los contengan, y uso de la tecnología del ADN recombinante (ingeniería genética) y otras técnicas moleculares más recientes.
12. Cabina de flujo laminar: Son recintos que emplean un ventilador para forzar el paso del aire a través
de un filtro HEPA (acrónimo del término en inglés High Efficiency Particulate Air) es decir purificador de alta eficiencia de partículas suspendidas en el aire, barriendo la superficie de trabajo. El flujo de aire puede ser vertical u horizontal. Estas cabinas ofrecen protección únicamente al material que se maneja en su interior, pero nunca al operador.
13. Cabina de seguridad biológica: Son equipos que proporcionan una barrera de contención para
trabajar de forma segura con agentes infecciosos. Permiten proteger según su diseño y clasificación al trabajador, medio ambiente o al producto. Es una combinación de elementos electromecánicos/electrónicos y procesos físicos que impulsan el aire a través de unos filtros especiales de gran superficie estratégicamente situados, que tienen una eficiencia mínima de retención de partículas del 99,99%, cuando el tamaño de éstas es de 0,3 µ.
14. Daño: Es la consecuencia producida por un peligro sobre la calidad de vida individual o colectiva de las
personas.
15. Desinfección: Proceso que mediante el empleo de agentes (sobre todo químicos), es capaz de eliminar
los microorganismos patógenos de un material. Generalmente se presentan efectos tóxicos sobre tejidos vivos, por lo que se emplea sólo sobre materiales inertes.
16. Equipo de Protección Personal (EPP): El equipo de protección personal (PPE-Personal Protection
Equipment) está diseñado para proteger a los empleados en el lugar de trabajo, de lesiones o enfermedades serias que puedan resultar del contacto con peligros químicos, radiológicos, físicos, eléctricos, mecánicos u otros. Además de caretas, gafas de seguridad, cascos y zapatos de seguridad, el PPE incluye una variedad de dispositivos y ropa tales como gafas protectoras, overoles, guantes, chalecos, tapones para oídos y equipo respiratorio.
17. Esterilización: Proceso que mediante el empleo de agentes físicos o químicos produce la inactivación
total de todas las formas de vida microbiana en forma irreversible (estado esporulado y vegetativo).
18. Ensayo: Operación técnica que consiste en la determinación de una o varias características o el
rendimiento de un producto, material, equipo, organismo, fenómeno físico, proceso o servicio dados de acuerdo con un procedimiento especificado.
19. Incidente de trabajo: Situación de riesgo que podría generar la ocurrencia de un accidente de trabajo. 20. Inmunización: Proceso destinado a brindar protección mediante la aplicación de inmunobiológicos
(gammaglobulinas, toxoides, vacunas) a personas en riesgo de contraer enfermedades.
21. Laboratorio: Organismo que calibra o ensaya.
22. Laboratorio de ensayo: Es el lugar donde se realizan actividades para la determinación de una o varias
características o el rendimiento de un producto, material, equipo, organismo, fenómeno físico, proceso o servicio dados de acuerdo con un procedimiento especificado.
23. Laboratorio de biomedicina: Es en el que se realizan actividades de investigación biomédica
relacionadas con enfermedades transmisibles y no transmisibles.
24. Laboratorio médico/laboratorio clínico: Laboratorio para los análisis biológicos, microbiológicos,
inmunológicos, químicos, inmunohemato-lógicos, biofísicos, citológicos, patológicos u otros análisis de materiales derivados del cuerpo humano con el propósito de brindar información para el diagnóstico, prevención y tratamiento de las enfermedades o contribuyendo en la salud de los seres humanos.
25. Limpieza: Es el proceso físico por el cual se elimina de los objetos en uso, las materias orgánicas y
otros elementos sucios, mediante el lavado con agua con o sin detergente. El propósito de la limpieza no es destruir o matar los microorganismos que contaminan los objetos, sino eliminarlos por arrastre.
26. Microorganismo: Toda entidad microbiológica, celular o no, capaz de reproducirse o de transferir
material genético.
27. Muestra para diagnóstico: Es el material de origen humano o animal consistente en excretas,
secreciones, sangre y sus componentes, tejidos y líquidos tisulares enviados para diagnóstico. Se excluyen los animales vivos infectados.
28. Peligro: Todo aquello que puede producir un daño o un deterioro de la calidad de vida individual o
colectiva de las personas.
29. Peligro biológico: Todo agente biológico y materiales que son potencialmente peligrosos para los seres
humanos, animales o plantas.
30. Producto biológico: Es una vacuna producida con microorganismos vivos o atenuados, componentes
celulares, reactivos de diagnóstico o productos terapéuticos de naturaleza biológica destinados para uso humano o animal y fabricados según los requisitos estándares. Riesgo: Probabilidad de que ante un determinado peligro se produzca un cierto daño, pudiendo por ello cuantificarse.
31. Sustancia infecciosa: Es aquella que contiene microorganismos viables (bacterias, virus, rickettsias,
parásitos, hongos o recombinantes híbridos mutantes) que pueden causar enfermedades tanto en el hombre como en los animales. No incluye toxina que no contiene ninguna sustancia infecciosa.
RIESGOS EN EL LABORATORIO
Como la Bioseguridad se define como el conjunto de acciones que se ejecutan para proteger la vida y su entorno. El Laboratorio Clínico, es un espacio en donde deben considerarse potenciales riesgos inherentes a la naturaleza de sus actividades, dentro de los que se encuentran:
RIESGOS BIOLÓGICOS: Exposición a: Virus; Bacterias; Hongos, Parásitos y organismos
genéticamente modificados.
RIESGO QUÍMICO: Exposición a sustancias químicas potencialmente tóxicas por diversas vías.
RIESGOS FÍSICOS: Ruidos intensos; Vibraciones; Exposición a radiaciones ionizantes y no
ionizantes; Ausencia de protección personal (mascarilla, gorra de cirugía, guantes, gafas, ropa esterilizada, zapatos especiales, entre otros); Ausencia de protección colectiva (limpieza del lugar de trabajo, de los instrumentos, falta de ventilación, temperatura ambiental inadecuada.
RIESGO DE ACCIDENTES DE TRABAJO: Accidentes con punzocortantes, quemaduras.
RIESGO DE ENFERMEDADES PROFESIONALES: Dolores asociados a posturas inadecuadas;
estrés, fatiga.
RIESGOS ERGONÓMICOS: Manejo de materiales pesados; transportes de aparatos.
RIESGO DE SOBRECARGA PSÍQUICA: Malas relaciones interpersonales en el lugar de trabajo;
malas remuneraciones; alejamiento geográfico.
CLASIFICACIÓN DE RIESGO POR TIPO DE PATÓGENO
Las designaciones del nivel de bioseguridad se basan en una combinación de las características de diseño, construcción, medios de contención, equipo, prácticas y procedimientos de operación necesarios para trabajar con agentes patógenos de los distintos grupos de riesgo.
Cuadro 1. Clasificación de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo
Grupo de riesgo 1: (riesgo individual y poblacional escaso o nulo). Microorganismos que tienen
pocas probabilidades de provocar enfermedades en el ser humano o los animales.
Grupo de riesgo 2: (riesgo individual moderado, riesgo poblacional bajo). Agentes patógenos que
pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de ocasionar un riesgo grave para el personal de laboratorio. La exposición puede provocar una infección, pero existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces y el riesgo de propagación es limitado.
Grupo de riesgo 3 (riesgo individual elevado, riesgo poblacional bajo). Agentes patógenos que
suelen provocar enfermedades humanas o animales graves, pero que de ordinario no se propagan de un individuo a otro. Existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces.
Grupo de riesgo 4 (riesgo individual elevado, riesgo poblacional elevado). Agentes patógenos que
suelen provocar enfermedades graves en el ser humano o los animales y que se transmiten fácilmente de un individuo a otro, directa o indirectamente. No existen medidas preventivas o terapéuticas eficaces.
TIPIFICACIÓN DE PATÓGENOS POR GRUPO DE RIESGO
GRUPO DE RIESGO 1: Agrupa microorganismos que tienen escaso o nulo riesgo de provocar
enfermedades.
Bacterias Virus Hongos Parásitos
Bacilos subtilis Virus de plantas. Saccharomyces sp. Entamoeba coli
GRUPO DE RIESGO 2: Agrupa a microorganismos que pueden provocar enfermedades humanas de
riesgo moderado. Si provoca una infección al personal de laboratorio, ésta tiene tratamiento y cura.
Bacterias Virus Hongos Parásitos
Bacteroides fragilis Bartonella baciliformes Bordetella pertussis Campylobacter jejuni Clostridium sp. Corynebacterium spp. Enterococcus sp. Astroviridae Coranaviridae Parvoridae Papviridae Parayxoviridae Picornaviridae Rubivirus Actinomyces spp.´ Blastomyces dermatitidis Candida albicans Mucor sp. Rhyzopus sp. Sporothrix schenkii Cryptococcus neoformans Acantamoeba castellani Ancylostoma duodenale Ascaris lumbricoides Balantidium coli Leishmania peruviana Giardia lamblia Fasciola hepática
GRUPO DE RIESGO 3: Agrupa microorganismos que pueden provocar enfermedades humanas
graves. Tienen tratamiento, cura limitada.
Bacterias Virus Hongos Parásitos
Bacillus anthracis Brucella abortus Mycobacyterium leprae Salmonella tiphi Yersinia pestis Adenoviridae Astroviridae Flebovirus Calciviridae Flaviviridae Ajellomyces dermatitidis Histoplasma capsulatum Paracoccidioides brasiliensis Echinococcus granulosus Leishmania brasiliensis Plasmodium falciparum Taenia solium Trypanosoma cruzi
GRUPO DE RIESGO 4: Agrupa microorganismos que provocan enfermedades graves en el ser
humano. No hay tratamiento para su cura.
Solo Virus: Lassa, Guanarito, Junín, Machupo, Sabia, de la fiebre hemorragica de Crimea – Congo,
Ébola, de Marburg, Variola (major&minor) virus, Whitepox virus y Morbilli virus equino
MEDIDAS DE PROTECCIÓN
Las medidas de protección en los laboratorios buscan disminuir la probabilidad de contacto con agentes potencialmente patógenos y/o sustancias que puedan afectar piel y/o mucosas. Las barreras de protección pueden ser individuales y físicas.
A. MEDIDAS DE PROTECCIÓN INDIVIDUAL
El personal que trabaje en el laboratorio, dependiendo del lugar de trabajo deberá usar como medidas de protección individual, respetando el principio de universal de que “cualquier muestra
en el laboratorio deberá ser considerada potencialmente infecciosa”, todos los estudiantes sin
ninguna distinción deberán portar al laboratorio los siguientes materiales de protección:
a. Mandil o guardapolvo con manga larga, el cual deberá usarse siempre
cerrado, para que ejerza su efecto de barrera mecánica. Por ningún motivo se deberá usar el mandil para acudir a áreas diferentes al laboratorio, como áreas de alimentación, áreas administrativas, más aún fuera del área física de laboratorio (incluso a las propias casas) pues por concepto se trata de ropa “SUCIA”, potencialmente infecciosa.
b. Gafas de seguridad, para disminuir el contacto con aerosoles, debe ser de
uso obligatorio en las áreas de recepción de muestras, separación de muestras y áreas de análisis.
c. Guantes: De Látex, para la manipulación de muestras y contenedores
independientemente del área de trabajo. Debe evitarse el uso de guantes en áreas de circulación de personal administrativo o de público en general. De caucho, para las áreas de Servicios Generales en la ejecución de las tareas de limpieza.
d. Zapatos cerrados: para evitar el riesgo de accidentes con muestras. No se
usarán sandalias. Esta instrucción aplica a todas las personas que ingresan al laboratorio.
e. Otras: Como gorras, mascarillas, guantes de caucho. B. MEDIDAS FÍSICAS DE CONTENCIÓN
Son todas aquellas medidas tendientes a separar físicamente a la(s) persona(s) del potencial agente patógeno o agente de riesgo. Las barreras físicas de separación deben aplicarse para áreas particulares como las de microbiología, cultivos celulares y biología molecular. Se consideran como medios físicos de contención también el uso de cabinas de seguridad y cámaras de flujo laminar. La infraestructura de los laboratorios, debe favorecer la disminución de potenciales riesgos, debiendo considerarse al menos:
Cada unidad debe tener un lavabo para el lavado de manos e incluir un lavador de ojos.
Las superficies de trabajo tienen que ser impermeables y resistentes a los ácidos, álcalis,
disolventes orgánicos y al calor moderado. Además hay que calcular una longitud de 2 metros lineales por persona.
Deben existir medios de protección contra incendios, para evitar su inicio y propagación.
Debe disponerse de una instalación eléctrica segura y de suficiente capacidad.
MANEJO Y DISPOSICIÓN DE DESECHOS EN EL LABORATORIO A. CLASIFICACIÓNDE LOS DESECHOS
Por lo general, los laboratorios deben reconocer la existencia de 3 tipos de desechos:
1. Desechos generales o comunes: No representan riesgo adicional para la salud humana y el
ambiente; no requieren manejo especial. Mismo grado de contaminación que los desechos domiciliarios. Ejemplo: Papel, cartón, plástico, restos alimenticios.
2. Desechos infecciosos: Contienen gérmenes patógenos, se encuentran:
a. Desechos de laboratorio: cultivo de agentes infecciosos, placas Petri, láminas de frotis, etc. b. Desechos anátomo–patológicos: órganos, tejidos o partes corporales extraídas mediante cirugía
autopsia, biopsia u otro procedimiento.
c. Desechos de sangre: sangre de pacientes, suero, plasma u otros componentes, insumos usados para toma de muestras de laboratorio.
d. Desechos cortopunzantes: agujas, pipetas de equipos, tubos primarios, tubos secundarios, copas, bajalenguas, isopos, palillos, entre otros.
3. Desechos especiales: Desechos provenientes de reactivos o materiales no infecciosos utilizados en
B. SEPARACIÓN DE PUNTO PRIMARIO
Los desechos deben separarse directamente en las áreas de trabajo, asegurando la clasificación en desechos infecciosos, especiales y generales o comunes. Cada una de las áreas de laboratorio deberá disponer al menos de los siguientes tipos de recipientes perfectamente rotulados e identificados:
a. Recipientes para basura común (tachos con bolsas negras). b. Recipientes para basura infecciosa, que incluyen:
Tachos con bolsas rojas para almacenar desechos potencialmente infecciosos NO
CORTOPUNZANTES.
Recipientes de plástico resistente y de boca angosta para DESECHOS CORTOPUNZANTES de
plástico resistente de boca angosta; se llenarán hasta no más de las ¾ partes de su capacidad; no deben contener por ningún concepto ningún tipo de líquidos para evitar la generación de aerosoles.
Los desechos especiales: (Ejemplo: frascos de reactivos, toners de impresoras), deben
almacenarse en recipientes de cartón rotulados DESECHOS ESPECIALES.
MICROSCOPÍA ÓPTICA: MANEJO Y CUIDADOS
El microscopio es un instrumento óptico que nos permite ver de cerca y aumentados objetos pequeños o detalles estructurales imperceptibles a simple vista. Es de mucha utilidad en el campo médico, con aplicaciones en el campo del diagnóstico y en la valoración clínica de trastornos o enfermedades en el hombre. Por ser los fotones (partículas elementales de la energía de todo el espectro luminoso desde el infrarrojo al ultravioleta) los que se utilizan para formar imágenes en los microscopios comunes, se le ha propuesto denominarlo microscopio fotónico, aunque se acepta unánimemente la de microscopio común u óptico.
El desarrollo y perfeccionamiento del microscopio en los últimos años, ha permitido ampliar el campo de las investigaciones biológicas y se ha convertido en uno de los instrumentos básicos para abrir fronteras en la Biología. El microscopio es un instrumento que permite observar una imagen amplificada de un objeto pequeño. La imagen puede ser observada directamente, fotografiada o proyectada, dependiendo de la naturaleza y del uso que haya de hacerse de esta imagen.
RESOLUCIÓN DE UN MICROSCOPIO: Se denomina así a la capacidad del microscopio de distinguir
siempre que exista entre ellos una distancia mínima llamada “límite de resolución”(r), si la distancia que separa dos puntos es menor que r, formarán una sola imagen, es decir se confunden.
MICROSCOPIO ÓPTICO
PARTES DEL MICROSCOPIO: Se pueden agrupar en cuatro sistemas: El sistema de soporte, el
sistema de aumento, el sistema de iluminación, y el sistema de ajuste.
A. EL SISTEMA DE SOPORTE
1. EL PIE: Es la parte que sostiene al microscopio, asegurando perfecta estabilidad del aparato en posición vertical, inclinada u horizontal. Presenta diferentes formas siendo la más común la de herradura.
2. LA COLUMNA, BRAZO O BASTIDOR: Es la parte articulada al pie por medio de una bisagra, sostiene la platina, el tubo óptico, lleva los tornillos macrométrico y micrométrico. Generalmente tiene la forma de un arco, es por donde se toma para su traslado de un lugar a otro.
3. LA PLATINA: Es una plancha metálica colocada en posición horizontal, presenta un orificio en la parte central que permite el paso de luz proveniente del sistema de iluminación. En algunos modelos la platina lleva adherida un par de pinzas que sirven para sujetar la lámina porta-objeto o un carro móvil (charriot) para el desplazamiento del preparado hacia la derecha o izquierda durante la observación.
4. EL REVOLVER: Es un dispositivo metálico de forma circular, atornillado en la parte inferior del tubo óptico, gira sobre su eje central; presenta 3 o 4 orificios a los que van atornillados los objetivos. Este dispositivo sirve para cambiar la posición de los objetivos durante las observaciones.
B. EL SISTEMA DE AUMENTO
1. EL OCULAR. Denominado así porque va cerca al ojo del observador, dispuesto en un tubo
cilíndrico de metal, con un diafragma intermedio, ambos lentes presentan las caras planas hacia el ojo del observador y las caras convexas hacia el objeto. La lente que va cerca al ojo del observador se denomina ocular propiamente dicho y la lente inferior como lente de campo; en la parte lateral y superior del tubo cilíndrico lleva una numeración que indica el número de aumento propio del ocular. El más común es el de 10X.
2. OBJETIVOS. Llamado así porque va cerca del objeto a observar, constituye la parte más
importante del microscopio de los cuales depende su alcance. Está constituido por un tubo metálico cilíndrico cónico, que lleva en su interior un sistema de lentes destinados a dar la imagen real e invertida del objeto.
a. Objetivos Secos. Son aquellos en los que, entre el lente frontal y el preparado a observar, no existe sustancia alguna, excepto el aire. Se utiliza generalmente para observaciones de preparados en fresco. Los más comunes son de 4X, 10X y 40X.
b. Objetivos de Inmersión. Son aquellos en los que, entre el lente frontal y el preparado a observar, se interpone una sustancia líquida, comúnmente el aceite de cedro, cuyo índice de refracción es de 1.5; se utilizan generalmente para observaciones de preparados en seco. El más común es el de 100X. De acuerdo a la procedencia lleva una franja o una raya negra o blanca para facilitar su identificación.
C. SISTEMA DE ILUMINACION: Se encuentra ubicado en la parte inferior de la platina y comprende:
1. Fuente de Luz: Antiguamente estaba constituido por un espejo de forma circular, sujeto por medio de un eje giratorio. Se utilizaba para enviar los rayos luminosos hacia el preparado. Actualmente la mayoría de microscopios compuestos presentan una fuente de luz eléctrica incorporada, constituida por una lámpara de 15 vatios.
2. El diafragma: Es un dispositivo constituido por un sistema de laminillas metálicas dispuestas concéntricamente, de tal forma que permita cerrar y abrir, regulando de esta manera la entrada de luz emitida por el espejo.
3. El condensador: Es un dispositivo constituido, por un sistema de dos o más lentes montadas dentro de un cilindro cónico truncado de metal, está situado por debajo de la platina. Este sistema óptico sirve para concentrar o condensar los rayos luminosos emitidos por el espejo; funciona accionando un tornillo.
4. Porta filtro: Es un dispositivo que permite colocar filtros de diferentes colores, los cuales facilitan la observación.
D. EL SISTEMA DE AJUSTE: El sistema comprende:
1. TORNILLO MACROMETRICO. Se utiliza primero para lograr la aproximación del enfoque. Se
encuentra situado en la parte superior o inferior de la columna, permite desplazamiento del tubo óptico y de la platina.
2. TORNILLO MICROMETRICO. Hace que el objetivo se desplace más lentamente. Se encuentra
situado por debajo del macrométrico. En los microscopios modernos, el micrométrico y el macrométrico se encuentran accionados por un solo tornillo.
3. TORNILLO DE AJUSTE DEL CONDENSADOR. Se utiliza para elevar el condensador y
aumentar la iluminación o descenderlo y reducir la iluminación.
4. TORNILLOS PARA CENTRAR EL CONDENSADOR. Se usan para centrar el condensador
exactamente en relación con el objetivo.
5. ELEVADOR DEL DIAFRAGMA IRIS. Es un pequeño elevador fijado al condensador. Se mueve
para cerrar o abrir el diafragma, reduciendo o aumentando así el ángulo y la intensidad de la luz.
6. REGULADORES DE LA PLATINA METALICA. Se utilizan para desplazar el portaobjeto sobre la
platina (presente en los microscopios mejorados).
ILUMINACION Y ENFOQUE
La iluminación y enfoque son dos condiciones principales para realizar una observación microscópica. La iluminación se consigue utilizando fuentes luminosas adecuadas, que pueden ser: natural o artificial. Los rayos de luz son reflejados por el espejo o por la lámpara de iluminación hacia el objeto o preparado. Cuando se examina con grandes aumentos, la luz debe ser intensa, en cambio cuando se hacen con menores aumentos, la luz debe ser menos intensa, lo que se consigue desplazando en forma vertical (arriba o abajo) al condensador, y graduando la abertura del diafragma. Obtenida la iluminación conveniente, se efectuará el enfoque del preparado, utilizando primero el macrométrico hasta encontrar la imagen (enfoque aproximado), y por último accionando el tornillo micrométrico que permite el enfoque perfecto (visualización de la imagen).
CONDICIONES NECESARIAS PARA LA ILUMINACIÓN Y ENFOQUE:
Son las siguientes:
2. Diafragma abierto. 3. Lámpara encendida.
4. Descienda el objetivo hasta que se encuentre inmediatamente por arriba de la preparación que se encuentra en el portaobjetos.
5. Utilizando el tornillo macrométrico eleve el objetivo hasta que observe una imagen clara a través del ocular.
AMPLIFICACION
Cuando se trabaja en el laboratorio con el microscopio, es de gran importancia conocer los grados de aumento o de magnificación de los objetos observados. Así tenemos que, el grado de aumento es la amplificación que ha sufrido la imagen del objeto que está siendo observado. Para obtener la amplificación se multiplica el número de aumento del ocular por el número de aumento del objetivo.
Ejemplo: La lente ocular presenta el número 10X y el número de la lente del objetivo es 4X, el poder
de amplificación del microscopio cuando se trabaja simultáneamente con estas dos lentes será de: Amplificación: 10X x 4X = 40 diámetros.
AUMENTO DE LA OBSERVACIÓN
Pare determinar el aumento al cual se está observando una muestra en particular, se debe multiplicar el valor del lente ocular por el valor del lente objetivo.
Así por ejemplo: Lente ocular empleado = 10x, Lente objetivo utilizado = 4x Aumento = (10x) (4x) = 40x; es decir, 40 veces de su imagen real.
MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES:
1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posición de observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda.
2. Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo.
3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica.
4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el microscopio.
5. Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pañuelos especiales para óptica o con papel de filtro (menos recomendable). En cualquier caso se pasará el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden dañar las lentes y su sujeción.
6. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico, platina, revólver y condensador).
7. El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está observando a través del ocular.
8. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún líquido, secarlo con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un paño humedecido en xilol.
9. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión práctica y, al acabar el curso, encargar a un técnico un ajuste y revisión general de los mismos.
FACTORES QUE DAÑAN AL MICROSCOPIO:
a. Lavar las lentes con alcohol.
b. Mojar los objetivos con xilol o alcohol, o bien con alguna otra sustancia. c. Usar papel ordinario para limpiar las lentes.
d. Poner los dedos sobre las lentes.
e. Limpiar el soporte o la platina con xilol o alcohol Isopropílico.
f. Limpiar el interior de las lentes con tela o papel, en caso de que sea completamente necesario, utiliza un pincel de cerdas muy pequeñas y/o utiliza papel seda.
g. Dejar el microscopio sin oculares.
h. Guardar el microscopio con aceite de inmersión en el objetivo. i. Transportar el microscopio con una sola mano.
II. COMPETENCIAS:
Conoce y aplica las normas de bioseguridad durante el desarrollo de las prácticas de microbiología.
Utiliza adecuadamente y con responsabilidad el microscopio óptico dentro del laboratorio.
III. MATERIAL Y MÉTODOS: 3.1. Materiales:
a. De Laboratorio:
Microscopios ópticos
Estereomicroscopio
b. Del Alumno: (por mesa de trabajo)
01 caja de láminas portaobjeto
01 caja de laminillas cubreobjeto
3.2. Procedimiento:
Manejo y uso del microscopio óptico:
1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya debería estar en esas condiciones. 2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.
3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición). Para realizar el enfoque:
a. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos.
b. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítido la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino.
Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con
mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3.
El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran
dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión.
Empleo del objetivo de inmersión:
- Bajar totalmente la platina.
- Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite.
- Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo entre éste y el de x40. - Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz.
- Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión.
- Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente.
- Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande.
- Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3.
- Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación.
- Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio.
IV. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
1. Dirección General de Salud Ambiental (DIGESA). Agencia Internacional de Cooperación del Japón.
Manual de difusión técnica No 01: Gestión de los residuos Peligrosos en el Perú. Lima; 2006.
2. Chiriboga M., Sáenz K., Sánchez M., Montalvo G. Guía Básica de Bioseguridad para Laboratorios de Atención Primaria. Quito; 2010.
3. Organización Mundial de la Salud. Manual de Bioseguridad en el Laboratorio. 3a Ed. Ginebra; 2005. 4. Ministerio de Salud. Subsecretaria de Programas de Prevención y Promoción Programa de Vigilancia
de la Salud y Control de Enfermedades (CDC). Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud. Bioseguridad en Laboratorios de Microbiología y Biomedicina. 4a ed. Atlanta, Georgia; 2010. 5. Ministerio de Salud. Dirección General de Salud Ambiental. Plan Nacional de Gestión de Residuos
Sólidos en Establecimientos de Salud y Servicios Médicos de Apoyo 2010-2012. Lima; 2010.
6. Negroni M. MICROBIOLOGÍA ESTOMATOLÓGICA. Fundamentos y Guía práctica. 2ª ed. Buenos Aires: Médica Panamericana; 2009.
I. INTRODUCCIÓN:
La coloración y la observación microscópica de las bacterias revelan su tamaño, morfología y tipos de agrupaciones, características que son de ayuda para la identificación bacteriana. Las bacterias tienen alrededor de 1 µm de diámetro y 0.2 a 3-4 µm de largo y poseen tres formas básicas; las cocáceas o cocos (bacterias de forma esférica); los bacilos (bacterias de forma cilíndrica) y las espiroquetas (bacterias con forma de espiral). Muchas especies bacterianas, especialmente las cocáceas, permanecen unidas luego de su división, dando origen a distintas agrupaciones que facilitan su identificación presuntiva. Las agrupaciones están determinadas por el plano de división bacteriana y la mayor o menor tendencia de las bacterias a permanecer unidas.
Todas las células son demasiado pequeñas para ser observadas por el ojo humano, por lo que es esencial el uso del microscopio para evaluar la forma y estructura de estas. Además, se debe tener en cuenta dos factores de gran importancia:
Para que el objeto sea percibido a través del microscopio, este debe de poseer cierto grado de
contraste con el medio circundante.
El microscopio debe poseer un poder de resolución suficiente para permitir la percepción, como
objetos separados, de dos puntos adyacentes muy próximos en la imagen.
Distinguimos dos tipos de microscopía: óptica y electrónica. Dentro de la primera tenemos, a su vez, microscopía de campo claro, de campo oscuro, de contraste de fase, ultravioleta y de fluorescencia mencionados en la práctica anterior. En la microscopía óptica, muchas veces es necesaria la utilización de colorantes. Un colorante es sustancia química orgánica de naturaleza variable. Los colorantes aumentan el contraste, estos constan de dos partes en su molécula: grupo cromóforo (confiere el color) y grupo auxocromo (confiere su capacidad a comunicar el color a la estructura). Los colorantes se clasifican en función al grado de ionización o a su origen. En microbiología, el uso de colorantes es fundamental para la identificación de la morfología bacteriana. Y como se sabe, inicialmente se clasificaron a las bacterias según la técnica propuesta por Christian Gram, 1844, en Gramnegativas (rojas) y Grampositivas (violetas).
MORFOLOGÍA BACTERIANA:
COLORACIONES MICROBIOLÓGICAS
II. COMPETENCIAS:
Distingue al microscopio las distintas morfologías bacterianas.
Conoce los diferentes tipos de coloraciones empleadas en microbiología.
Realiza inequívocamente una tinción Gram y explica su fundamento.
III. MATERIAL Y MÉTODOS: 3.1. Materiales:
a. De Laboratorio (por mesa de práctica).
03 Microscopios
03 mecheros bunsen o de alcohol.
Cultivo de Staphylococcus aureus en caldo (2 mL).
Cultivo de Bacillus sp. en caldo (2 mL).
Cultivo de Escherichia coli en caldo (2 mL).
06 Tubos de ensayo de 13 x 100 mm en gradilla.
02 Asas bacteriológicas en anillo.
100 mL de agua destilada
Set de GRAM: Cristal violeta, Lugol, Alcohol-acetona, Safranina.
Set BK: Ziehl Neelsen, Alcohol-ácido, Fucsina fenicada de Ziehl.
Tinción de espirilos: Líquido de Rouge (ácido acético glacial 1mL, formol 2 mL y agua destilada
100 mL). Alcohol de 96o, ácido tánico al 5%. Solución de fontana (Colocar solución de nitrato de
plata al 5 % y agregar, gota a gota, una solución de amoníaco al 5 % hasta opalescencia. Seguir agregando amoníaco hasta clarificación de la solución y finalmente agregar solución de nitrato de plata hasta ligera opalescencia. La solución debe prepararse en el momento de usarse).
Colorante azul de metileno.
Colorante verde de malaquita.
Colorante nigrosina o tinta china negra.
b. Del Alumno: (Individual)
Manual de prácticas impreso y anillado.
Libreta de apuntes y lapicero.
Barreras de bioseguridad personal: Guantes descartables, mascarilla descartable y toca o gorro
01 Marcador indeleble
c. Del alumno: (Grupal)
Paquete de hisopos de toma de muestra microbiológica (por mesa de trabajo).
Caja de láminas portaobjeto.
Caja de laminillas cubreobjeto.
Caja de mondadientes
3.2. Procedimiento:
3.2.1. Preparados para microscopia óptica: Procedimiento General.
Los pasos fundamentales previos a una coloración son: extendido, secado y fijado.
a. Extendido: se coloca una pequeña porción de la muestra en un portaobjetos y se extiende con
el asa en forma circular en el centro de la lámina. Para muestras provenientes de medios sólidos, debe colocarse previamente una gota de agua sobre el portaobajetos.
b. Secado: puede dejarse secar el extendido a temperatura ambiente, o colocar a 30-40 cm sobre
c. Fijado: la fijación tiene como finalidades evitar el desprendimiento del preparado durante la
coloración así como también preservar la forma original de los microorganismos. El procedimiento más común es pasar el preparado 3 veces por la llama del mechero. Sin embargo, esta técnica no es conveniente para ciertas coloraciones para las cuales deben utilizarse procedimientos más suaves. Algunos agentes fijadores utilizados son etanol, metanol, formol, sales de mercurio, tetróxido de osmio, ácido pícrico, etc.
Debe tenerse en cuenta que, luego del procedimiento de coloración, los preparados pueden contener microorganismos viables, en especial si hay esporos. Por consiguiente siempre deben considerarse como potencialmente riesgosos y manejarse con precaución.
3.2.2. Coloración simple
1. Extender, secar y fijar por calor.
2. Aplicar solución de colorante durante alrededor de 2 minutos. En general, el tiempo de la coloración depende de la concentración y del colorante utilizado.
3. Lavar con agua corriente.
4. Secar entre papeles de filtro y observar con objetivo de inmersión.
3.2.3. Tinción negativa
1. Colocar sobre un portaobjetos, con la ayuda de un asa, una gota de una solución acuosa de nigrosina al 10 %.
2. Tomar una porción del cultivo, suspender en la gota de nigrosina y extender en forma circular en el centro de la lámina.
3. Dejar secar (no exponer al calor) y observar con objetivo de inmersión.
3.2.4. Tinciones compuestas y específicas 3.2.4.1. Coloración de Gram.
Prepare un extendido con los cultivos bacterianos proporcionados y con el sarro dentario
de la manera ya conocida. Déjelo secar y fíjelo por calentamiento sobre la llama del mechero.
Cubra el extendido con la solución de cristal violeta y déjelo actuar por un minuto. Escurra
el exceso de colorante y lave a chorro suave con agua de caño o con piseta.
Agregar solución de Lugol y dejar actuar durante un minuto. Elimine el exceso de Lugol y
decolore con una mezcla de alcohol-acetona hasta que no se desprenda más colorante de la preparación (15 segundos). Lave con agua corriente.
Aplique solución de safranina y déjela actuar por 30 segundos. Elimine el colorante y lave.
3.2.4.2. Coloración de Ziehl Neelsen.
Prepare un extendido con la muestra indicada por el docente. Déjelo secar y fíjelo por
calentamiento sobre la llama del mechero.
Coloque la lámina en el soporte apropiado y cubra el extendido con fucsina fenicada de
Ziehl concentrada y caliente suavemente hasta la emisión de vapores. No debe dejarse hervir el colorante. Sostenga el calentamiento por 3 minutos.
Lave con agua corriente y decolore con alcohol-ácido hasta que deje de eliminar colorante. Lave con agua corriente y cubra el extendido con la solución de azul de metileno y déjelo actuar por 1 minuto.
Lave nuevamente con agua corriente, escúrralo y deje secar al ambiente. observar con
objetivo de inmersión.
3.2.4.3. Coloración de Espirilos
1. Extender la muestra a examinar sobre un portaobjetos. Si la muestra es sanguinolenta deshemoglobinizar con líquido de Rouge (ácido acético glacial 1 ml, formol 2 ml y agua 100 ml). Lavar con agua corriente.
2. Fijar vertiendo alcohol sobre el preparado, dejando escurrir y encendiendo el alcohol. Apagar inmediatamente.
3. Cubrir con la solución de ácido tánico (5 %) y calentar con hisopo encendido hasta emisión de vapores.
4. Mantener la emisión de vapores durante 30 segundos cuidando que no hierva la solución. Lavar con abundante agua destilada.
5. Cubrir con solución de Fontana en frío, mover el preparado hasta que tome color castaño claro. Calentar y mantener emisión de vapores durante 15 segundos.
6. Lavar con agua destilada, secar entre papeles de filtro y observar con objetivo de inmersión.
3.2.4.4. Coloración de Esporas: Según método de Dorner.
1. Preparar una suspensión del cultivo a analizar en 1 mL de agua destilada. Añadir 1 mL de fucsina fenicada (solución acuosa de fucsina 1 % y fenol 5 %) y colocar la mezcla en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos.
2. Tomar una asada del material y colocar en un portaobjetos. Añadir una asada de una solución acuosa, saturada, fresca y filtrada de nigrosina (10 %). Mezclar bien y extender en forma de circular en el centro de la lámina.
3. Dejar secar y observar con objetivo de inmersión.
IV. FUNDAMENTACIÓN: 4.1. Coloración simple
Esta coloración permite la observación de la morfología y agrupación de los microorganismos. Se realiza con un solo colorante. Entre los colorantes más utilizados para realizar coloraciones simples podemos nombrar el cristal violeta y el azul de metileno que se utilizan en soluciones acuosas al 1 %.
4.2. Coloración negativa
Para esta coloración, se utilizan sustancias que no penetran en la célula y por lo tanto se tiñe el fondo quedando los microorganismos incoloros. Normalmente el tamaño de las bacterias observadas por esta técnica es mayor que el real y no debe utilizarse para la medición de microorganismos. Los agentes más utilizados son la nigrosina y la tinta china y los microorganismos quedan incluidos en el colorante que forma una capa relativamente gruesa. Con este método pueden observarse morfología y agrupación así como también estructuras extracelulares como la cápsula.
4.3. Coloración GRAM
Esta coloración fue ideada por el bacteriólogo danés Christian Gram en el año 1883y ha demostrado
ser de suma utilidad. Permite agrupar a los microorganismos en Gram (+) y Gram (-) lo cual reviste especial importancia taxonómica. En esta técnica, el preparado fijado por calor se trata primeramente con cristal violeta, luego se agrega Lugol como mordiente, se decolora con alcohol-acetona y finalmente se contracolorea con safranina. Las bacterias Gram (+) serán las que resulten violetas luego del procedimiento de coloración de Gram mientras que las Gram (-) se verán rojas. La explicación de las diferencias en el comportamiento tintorial entre bacterias Gram (+) y Gram (-), debe buscarse en la estructura y composición de la pared celular bacteriana.
La pared de las bacterias Gram (+) está constituida fundamentalmente por una gruesa capa de peptidoglucano (20-30 nm), que es un polímero de N- acetil glucosamina y ácido N-acetil murámico. Las cadenas de peptidoglucano, se unen a través de puentes formados por aminoácidos, en arreglos que varían de una especie bacteriana a otra. En esta capa podemos también encontrar ácidos teicoicos, formados por ésteres fosfato de glicerol o ribitol, y ácidos lipoteicoicos cuya estructura es similar a los ácidos teicoicos pero se hallan anclados a la membrana citoplasmática. En las bacterias Gram (-), la capa de peptidoglucano es mucho más delgada (3-5 nm) y poseen una membrana externa de estructura compleja en cuya composición intervienen fosfolípidos, proteínas y lipopolisacáridos. En la figura puede observarse una representación de las paredes celulares de organismos G (+) y G (-).
Al tratar los preparados con cristal violeta y Lugol, se forman agregados entre el colorante y el mordiente que durante el proceso de decoloración, no pueden ser extraídos de las bacterias Gram (+)
debido a la gruesa capa de peptidoglucano. En las bacterias Gram (-), la mezcla decolorante puede atravesar fácilmente la capa de lípidos de la membrana externa y la delgadez de la capa de peptidoglucano presente, permite la extracción de los agregados y, por consiguiente, del color violeta. Al ser tratadas con safranina, las bacterias Gram (-) tomarán el color del colorante de contraste. En esta coloración, el paso crítico es la decoloración, ya que si se prolonga demasiado resultarán decoloradas aún las bacterias Gram (+). Debe tenerse en cuenta asimismo, que como la integridad de las envolturas celulares resulta fundamental para lograr una buena diferenciación, debe trabajarse en lo posible con cultivos jóvenes. Es importante mencionar, que la clasificación en Gram (+) y Gram (-) no puede aplicarse a todas las bacterias ya que hay algunas que no pueden colorearse con esta técnica o para las cuales no tiene sentido esta clasificación.
4.4. Coloración de Ziehl-Neelsen
La pared celular de los bacilos ácido alcohol resistentes (BAAR) está compuesta por una gran cantidad de lípidos tanto libres como covalentemente unidos: los ácidos micólicos y los micósidos. La alta proporción lipídica otorga a estas bacterias una gran hidrofobicidad, con la consiguiente tendencia a formar agregados y la dificultad para captar colorantes que hace necesaria la utilización de métodos drásticos. Se utiliza fucsina fenicada en caliente, luego un paso de decoloración con ácido-alcohol y una contracoloración con azul de metileno. La mezcla decolorante no podrá extraer el colorante de los BAAR que permanecerán rojas mientras que las demás bacterias se verán azules. Entre las bacterias ácido-alcohol resistentes más representativas se encuentran las pertenecientes al género Mycobacterium, al cual pertenecen los agentes etiológicos de la tuberculosis (Mycobacterium
tuberculosis) y de la lepra (Mycobacterium leprae). Esta coloración es de suma importancia
4.5. Coloración de Espirilos y Espiroquetas
Existen bacterias de forma espiralada que son llamadas en forma general espirilos aunque debe hacerse una aclaración: los espirilos son bacterias con morfología helicoidal y un cuerpo bastante rígido, que se mueven mediante flagelos, pero existe otro tipo de microorganismos con la misma morfología que se llaman espiroquetas cuyo cuerpo es flexible y tienen flagelos internos. Las espiroquetas están formadas por un cilindro protoplasmático constituido por el citoplasma, la región nuclear, la membrana citoplasmática y la pared celular. El cilindro protoplasmático se halla rodeado a su vez por una membrana multilaminar llamada capa externa en cuya composición intervienen proteínas, lipoproteínas, polisacáridos y fosfolípidos. Alrededor del cilindro protoplasmático se encuentran un número variable de flagelos periplásmicos que, según la especie, puede variar entre 2 y más de 100. La composición química de los flagelos es similar a la de otros flagelos bacterianos. A diferencia de otras bacterias móviles, las espiroquetas pueden desplazarse en medios de alta viscosidad a través de un movimiento de sacacorchos. Entre los géneros de bacterias espiraladas del tipo de las espiroquetas, podemos nombrar Treponema (el Treponema pallidum es el agente etiológico de la sífilis), Borrelia y Leptospira. En general, estos microorganismos son demasiado delgados para poder ser visualizados mediante microscopía óptica y por lo tanto deben engrosarse. En la técnica de Fontana – Tribondeau, se usa ácido tánico como mordiente y luego se realiza una impregnación argéntica con nitrato de plata amoniacal (solución de Fontana). Es importante que los lavados se realicen con agua destilada libre de cloruros ya que de otra manera precipitaría cloruro de plata. En los casos en que la muestra contenga sangre, debe deshemoglobinizarse con líquido de Rouge (ácido acético – formaldehído – agua). Al aplicar esta técnica de coloración, se verán los microorganismos marrón oscuro sobre fondo amarillento.
4.6. Coloración de Esporas
Algunas bacterias, son capaces de producir formas de resistencia a través de un proceso llamado esporulación. Este proceso de diferenciación, está codificado genéticamente y permite a los microorganismos sobrevivir hasta que las condiciones exteriores sean favorables para el desarrollo. Los géneros de bacterias capaces de esporular hasta ahora descriptos son Bacillus, Clostridium y Sporosarcina por lo cual la presencia de esporas en una bacteria es de gran utilidad taxonómica. Estructuralmente, las esporas bacterianas están rodeadas por gruesas envolturas y tienen muy bajo contenido de agua. El córtex o corteza, está compuesto por un peptidoglucano que contiene menos enlaces cruzados que el correspondiente a la pared celular. La cubierta está formada por una proteína del tipo de la queratina con gran cantidad de puentes disulfuro. Esta capa es fundamental para la resistencia de la espora a los agentes físicos y químicos. El exosporium es de naturaleza lipoproteica. Asimismo poseen en su composición química, una alta concentración de dipicolinato de calcio, que es una sustancia que no se encuentra en las células vegetativas, y que estaría involucrada en la eliminación de agua durante el proceso de esporulación. Estas características, dan cuenta de la resistencia de las esporas a los agentes físicos y químicos y de la dificultad que presentan para ser coloreados. Cabe aclarar que una vez coloreados son difíciles de decolorar. En todas las técnicas para colorear esporas se utilizan procedimientos drásticos. Describiremos las técnicas de Dorner y de Moeller. Para la coloración de esporos según Dorner, se sensibiliza y colorea al esporo con fucsina fenicada en caliente y luego se extiende sobre nigrosina. La nigrosina extraerá el colorante de todas las estructuras celulares excepto de las esporas y por consiguiente, se verán las esporas rojas, el resto de la bacteria incolora y el fondo oscuro. La técnica de Moeller utiliza ácido crómico y fucsina fenicada
en caliente para sensibilizar y colorear la espora. La decoloración se realiza con ácido-alcohol y se contracolorea con azul de metileno. Se observan las esporas rojas y el resto de la bacteria azul. Si bien es cierto que con otras coloraciones las esporas se verán incoloras, en algunos casos las bacterias pueden presentar zonas sin colorear que no corresponden a esporas y debe confirmarse su presencia mediante una coloración específica. Otro aspecto que debe tenerse en cuenta al observar esporas es su posición: terminal, subterminal o central, y si deforman o no a la bacteria ya que serán características que ayudarán en la clasificación.
V. RESULTADOS: Observaciones microscópicas.
Muestra: Coloración: Aumento: Observación: Muestra: Coloración: Aumento: Observación: