TÉCNICAS DE SEPARACIÓN. CROMATOGRAFÍA

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TÉCNICAS DE SEPARACIÓN. CROMATOGRAFÍA

1.- Introducción

• Cromatografía y métodos de separación clásicos. Separación de componentes de una muestra. No son técnicas de caracterización propiamente dicha

• Las propiedades de los materiales dependen de los componentes y de la proporción existente entre ellos

• No dan información de la naturaleza de los componentes, necesitan otros métodos de análisis.

1.1.- Cromatografía y ciencia de materiales

• Separación de compuestos relacionados con la síntesis de materiales

• Evaluación de la actividad de materiales catalizadores y soportes sólidos en síntesis orgánica.

• Desarrollo de nuevos materiales empleados en cromatografía • Seguimiento de una síntesis

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2.- Lugar que ocupa la cromatografía en la caracterización de materiales

Muestra

¿Hay que solubilizarla?

¿Es volátil? ¿Descompone térmicamente?

¿Forma plasma?

Otros métodos

¿Es soluble? Digestión

GAS DISOLUCIÓN

¿Hay que separar

componentes? Cromatografía

¿Hay que separar componentes?

Técnicas y Métodos de análisis

NO NO NO NO NO NO SI SI SI SI SI SI SI SI SI NO

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3.- La cromatografía. Conceptos y definiciones

• Cromatografía: método físico de separación • Proceso cromatográfico

• Fase estacionaria (sólido, gel o líquido). Lecho cromatográfico o sorbente •Fase ligada

•Fase inmovilizada

• Fase móvil (gas portador, eluyente) •Cromatografía líquida

•Cormatografía de gases

•Cromatografía con fluido supercrítico • Eluir • Efluente • Muestra • Componentes • Zona o banda • Cromatograma • Cromatógrafo

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3.1.- Mecanismos de separación

a) Separación por adsorción (cromatografía de adsorción)

Diferente afinidad de los componentes de la muestra sobre la superficie de un sólido activo (componentes con polaridad baja o media)

b) Separación por reparto (cromatografía de reparto)

Diferente solublidad en fases estacionaria y móvil (Componentes con polaridad media o alta)

[ ]

A

Fase

Estacionar

ia

móvil

Fase

A

K

_d

=

Reparto

de

e

Coeficient

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3.1.- Mecanismos de separación

c) Separación por tamaño molecular (Cromatografía de permeación de gel,

de tamiz molecular o de exclusión por tamaños).

Parámetros de columna

- Intervalo de trabajo: intervalo de M que pueden ser separados

- Límite de exclusión: M mínimo a partir del cual las macromoléculas no experimentan retención.

Partícula polimérica (gel) con poros Moléculas grandes Moléculas pequeñas Pared de columna cromatográfica Disolvente F lu jo d e l d is o lv e n te

Las moléculas pequeñas penetran en los poros de las partículas de gel, por lo que necesitan más tiempo para salir al final de la columna. Las moléculas grandes, en cambio, al no penetrar en las partículas de gel se mueven con el disolvente a una velocidad mayor de elución y salen antes de la columna. Por tanto, a mayor masa molecular menor tiempo de elución. Este método permite separar por tamaños moleculares siendo posible obtener incluso distribuciones de masas moleculares a distintos tiempos de elución.

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“Una separación puede estar basada en la conjunción de diversos

d) Separación por Intercambio iónico

La separación se basa principalmente en la diferente afinidad para el

intercambio de iones de los componentes de la muestra.

+

Partículas sólidas (matriz) cargada positivamente Especies negativas Especies positivas Pared de columna cromatográfica Disolvente F lu jo d e l d is o lv e n te

+

-

+

-+

-Las especies cargadas negativamente se unen a la matriz sólida cargada positivamente y son retenidas, mientras que las especies positivas son rechazadas. De esta manera en función de la carga las especies se eluyen a distintos tiempos dando lugar a la correspondiente separación.

La elución de las especies retenidas se consigue cambiando el pH del disolvente hasta igualarlo a su punto isoeléctrico o hasta invertir su carga neta.

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3.2.- Métodos de análisis cromatográfico

a) Análisis por desarrollo (cromatografía en papel o capa fina)

b) Análisis por elución (cromatografía de gases, cromatografía líquida) c) Análisis frontal

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ANÁLISIS POR DESARROLLO

F

a

se

M

ó

v

il

Cromatografía plana

F a s e m ó v il

Cromatografía en columna

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Muestra

Fase Móvil

S

or

b

e

nt

e

Placa Porosa

Efluente

Análisis por elución

Volumen de fase móvil

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Fase Móvil

Con la muestra A+B+C

A

Placa Porosa

Efluente

A+B

A+B+C

Volumen de fase móvil

Cromatograma

A

+

B

A

+

B

+

C

Análisis frontal

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3.3.- Clasificación de acuerdo con la forma del lecho cromatográfico

a) Cromatografía en columna - Columna empaquetada - Columna tubular abierta

b) Cromatografía plana (o de lecho abierto) - Cromatografía en papel

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3.4.- Clasificación de acuerdo con el estado físico de la fase móvil a) Técnicas cromatográficas - GLC - GSC - LLC - LSC

b) Cromatografía de gases (siempre en columna) c) Cromatografía Líquida (en columna o sobre plano)

- Cromatografía Líquida de Alta Eficacia o de Alta Presión, HPLC d) Cromatografía con fluido supercrítico

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3.5.- Técnicas especiales

a) Cromatografía con fase invertida b) Cromatografía con fase normal

c) Análisis isocrático (composición F. móvil constante)

d) Elución con gradiente (Composición F. móvil cambia de forma continua)

e) Elución en etapas o escalonada (

Composición F. móvil cambia de

forma escalonada)

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3.6.- Parámetros básicos en cromatografía

a) Retención = capacidad real de la fase estacionaria para retardar la salida de un componente.

- si caudal constante ⇒ v ∝ t - t_M = tiempo muerto

- t_R = tiempo de retención

- t’_R = tiempo de retención corregido = t_R - t_M

Figura tomada de:

-ALBELLA, J.M.; CINTAS, A.M.; MIRANDA, T. y SERRATOSA, J.M.: "Introducción a la ciencia de materiales". C.S.I.C., 1993.

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b) Factor de capacidad (retención de un compuesto con independencia del caudal) c) Dispersión de bandas M M R M R

t

K

'

=

'

=

−

Parámetros característicos

de un pico gaussiano

Figura tomada de:

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3.6.- Parámetros básicos en cromatografía

d) Eficacia

- Número de platos teóricos 2









=

σ

R

t

n

2

16 _











=

b R

W

t

n

2

545 .

5 _











=

h R

W

t

n

-Altura equivalente de un plato teórico = L/n (Para comparar columnas de diferente

Debe evitarse el ensanchamiento de bandas. Dependen de características de columna, velocidad de fase móvil, etc.

Figura tomada de:

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3.6.- Parámetros básicos en cromatografía e) Separación y resolución - Retención relativa - Resolución 1 2

'

R R

t

=

α

2 1

2

b b s

W

t

R

+

∆

=

Eficacia de columna

Sistema cromatográfico

Figura tomada de:

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4.- Técnicas cromatográficas no instrumentales

4.1.- Cromatografía en columna

El gradiente de presión necesario para el desplazamiento de la fase móvil a través de la fase estacionaria se origina por gravedad.

Figura tomada de:

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4.2.- Cromatografía en capa fina

La elución se consigue por el movimiento capilar ascendente de la fase móvil a) aplicaciones analíticas

b) aplicaciones preparativas

y

Aplicación

Frente del disolvente

x

y

R

_f

====

x x Aplicación

Frente del disolvente

x

y

R

_x

====

x y Sustancia patrón

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5.- Métodos instrumentales en cromatografía

5.1.- Cromatografía de gases (Gas-Líquido)

Distribución de un componente entre una fase móvil gaseosa y una líquida inmovilizada sobre la superficie de un sólido inerte.

Componentes básicos

- Gas portador según detector (He, Ar, N₂, CO₂, H₂) - Sistema de inyección de muestra

- Columnas

Control de caudal

Figura tomada de:

(21)

5.- Técnicas instrumentales en cromatografía

Mejora de un cromatograma por programación de temperatura en columna

Figura tomada de:

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Detectores

CARACTERÍSTICAS DEL DETECTOR IDEAL

•Adecuada sensibilidad

•Buena estabilidad y reproducibilidad

•Una respuesta lineal para los componentes que se extienda a

varios órdenes de magnitud

•Intervalo térmico de trabajo (25 – 400)ºC

•Un tiempo de respuesta corto que lo haga independiente del

caudal

•Alta fiabilidad y manejo sencillo

•Respuesta semejante para todos los componentes

•No destructivo

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5.1.- Cromatografía de gases (Gas-Líquido)

Detectores

DETECTOR DE IONIZACIÓN DE LLAMA - Componente + H₂/aire + encendido eléctrico ⇒ iones + e

-Diferencia de potencial entre extremo de quemador y electrodo colector (se mide la corriente que pasa a su través)

- Iones producidos ∝ nº átomos de carbono ⇒ _{sensible a masa}

- C-OH; -C=O; -X; -NH₂ ⇒ generan pocos iones

- Insensible a: H₂O; CO₂; SO₂ y NO_x

-Detector de los más utilizados para el análisis de compuestos orgánicos

+

-H

₂

Aire

Efluente de la columna

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Detectores

DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD TÉRMICA

- Cambios de conductividad térmica del gas portador por la presencia de analito. - Sensor = hilo de Pt, Au ó W calentado (a potencia eléctrica cte) cuya T depende

del gas circundante (su R cambia) - Características:

* Simple

* Amplio rango dinámico lineal (~ 10

5

₎

* Respuesta universal (especies orgánicas e

inorgánicas)

* Carácter no destructivo

* Sensibilidad relativamente baja (~ 10

-8

_{g de soluto/ml}

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Detectores

DETECTOR TERMOIÓNICO

- Detector selectivo de compuestos orgánicos con P y N.

- Efluente + H₂ + llama ⇒ gas caliente + bola de silicato de rubidio caliente (a 180V respecto colector)

⇓

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Detectores

DETECTOR DE CAPTURA DE ELECTRONES

- Detector selectivo de

halógenos, peróxidos, quinonas y grupos nitro.

- Efluente + emisor β ⇒ iones (gas portador) + ráfaga de electrones ⇓

Corriente constante que varía en presencia de moléculas capturadoras de e

-DETECTOR DE EMISIÓN ATÓMICA

plasma de He que atomiza y excita el efluente

⇒

espectros de

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Métodos acoplados

- GC/Espectrometría de masas - GC/espectroscopía IR

5.2.- Cromatografía de gases (Gas-Sólido)

H₂S; CS₂; NO_x; CO; CO₂; gases nobles (no se retienen en columnas Gas/Líquido)

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5.- Técnicas instrumentales en cromatografía

5.3.- Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC)

- Alta sensibilidad

- Adaptación a determinaciones cuantitativas - Separación de especies no volátiles

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5.3.- Cromatografía de líquidos de alta resolución

Instrumentación para la cromatografía de líquidos

- Recipientes para la fase móvil y sistemas para el tratamiento de disolventes (eliminación de O₂ y N₂)

- Filtración de disolventes - Sistemas de bombeo

- Sistemas de inyección de muestra - Columnas

- Precolumnas -Termostatos

- Detectores: i) responden a propiedad de fase móvil; ii) responden a propiedad del soluto.

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5.3.- Cromatografía de líquidos de alta resolución

Instrumentación para la cromatografía de líquidos

Figura tomada de:

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6.- Bibliografía

• D.A. Skoog, J.J. Leary, “Análisis Instrumental”, McGraw-Hill, Madrid (1996)

• H.H. Willard, L.L. Merritt Jr.,J.A. Dean, F.A. Settle Jr., “Métodos Instrumentales de análisis”, Grupo Editorial Iberoamericana S.A. de C.V., México (1991).

• TECHNIQUES in liquid chromatography Simpson, Colin F. John Wiley & Sons (1984). • Liquid chromatography column theory Scott, Raymond P.W. John Wiley & Sons (1992).

• Chromatography of polymers : characterization by SEC and FFF American Chemical Society (1993).

• Handbook of size exclusion chromatography Marcel Dekker (1995).

• Cromatografía de exclusión por tamaños [Vídeo] Pérez Dorado, Angel, CEMAV, Universidad Nacional de Educación a Distancia (1997).

• Manual de cromatografía Loro Ferrer, Juan Francisco Gobierno de Canarias, Dirección General de Universidades e Investigación (2001).

7.- Direcciones URL útiles

• http://www.uib.es/depart/dqu/dquo/pau/Cromatograf%92a/chrom10/chrom/GC/concept/

main.htm