Evaluación de la reactividad de las fracciones antigénicas de 10 y 24 kDa de mycobacterium tuberculosis, mediante una técnica inumnoenzimática

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(1)EVALUACIÓN DE LA REACTIVIDAD DE LAS FRACCIONES ANTIGENICAS DE 24 kDa Y 10 kDa DE Mycobacterium tuberculosis MEDIANTE UNA TÉCNICA INMUNOENZMATICA.. MARGARITA GOMEZ SARMIENTO. TESIS DE GRADO PARA OPTAR AL TITULO DE BIOLOGA. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES. FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS BOGOTÁ. ENERO DE 2003..

(2) A mi papá....

(3) AGRADECIMIENTOS. §. A mi directora Myriam Navarrete J. por toda su ayuda, comprensión paciencia y amabilidad durante la realización de este proyecto.. §. A mi codirector Orlando Martínez W. por su colaboración y preocupación.. §. A todo el personal del departamento de Microbiología de la Facultad de Medicina en la Universidad Nacional de Colombia por su valiosa participación en todos los aspectos de la elaboración de este trabajo.. §. A la bacterióloga Claudia Rocío Sierra por enseñarme todo acerca de las micobacterias y por colaborarme. especialmente con el. trabajo de. laboratorio. §. Al Doctor Jorge E. Ángel, director del Laboratorio de Diagnóstico Molecular Vegetal del ICA por su ayuda incondicional, sin la cual hubiese sido imposible realizar este proyecto.. §. A todo el personal del Laboratorio de Diagnóstico Molecular Vegetal del ICA por su paciencia y colaboración durante mi estancia allá.. §. A Julio Cesar Giraldo de la Universidad INCCA de Colombia, por su ayuda en la purificación y cuantificación de los antígenos.. §. A mi mamá, a mi hermana y a Javier por estar siempre ahí cuando los necesité y a mi papá por hacer posible todo este proceso..

(4) TABLA DE CONTENIDO INTRODUCCIÓN 1. JUSTIFICACIÓN............................................................................................1 2. TUBERCULOSIS...........................................................................................3 2.1 DEFINICIÓN.................................................................................................3 2.2 HISTORIA.....................................................................................................3 2.3 BACTERIOLOGIA........................................................................................4 2.3.1 POSICIÓN TAXONÓMICA.......................................................................5 2.4 FACTORES DE VIRULENCIA......................................................................6 2.5 DESCRIPCIÓN DE LA ENFERMEDAD........................................................7 2.6 INMUNOPATOLOGIA...................................................................................8 2.7 INMUNOLOGIA.............................................................................................9 2.8 TRATAMIENTO..........................................................................................11 2.9 DIAGNÓSTICO............................................................................................12 2.9.1 PRUEBA DE LA TUBERCULINA............................................................13 2.9.2 BACILOSCOPIA.....................................................................................15 2.9.3 CULTIVO................................................................................................16 2.9.4 OTROS ESTUDIOS DIAGNÓSTICOS...................................................16 2.9.5 REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA...................................17 2.9.6 ESTUDIOS PRELIMINARES PARA EL DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE LA TUBERCULOSIS........................................................................17 2.9.7 ANTÍGENOS DE BAJO PESO MOLECULAR.......................................19 2.10. EPIDEMIOLOGÍA...................................................................................20. 2.11. TUBERCULOSIS EN COLOMBIA.........................................................22.

(5) 3. OBJETIVOS.................................................................................................23 3.1 OBJETIVO GENERAL.................................................................................23 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS........................................................................23 4. MATERIALES. .............................................................................................24 4.1 EQUIPOS.....................................................................................................24 4.2 MATERIAL BIOLÓGICO..............................................................................25 4.3 MATERIAL DE LABORATORIO..................................................................25 4.4 REACTIVOS................................................................................................25 5. METODOS...................................................................................................27 5.1 MANTENIMIENTO DE LA CEPA Y OBTENCIÓN DEL ANTIGENO CRUDO DE Mycobacterium tuberculosis CEPA H37RV...........................................27 5.2. ELECTROFORESIS FRACCIONES. DE. PROTEINAS. ANTIGÉNICAS. DE. Y. OBTENCIÓN. Mycobacterium. DE. LAS. tuberculosis. H37RV..........................................................................................................28 5.3 RECOLECCION DE SUEROS DE PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS.........................................................................................................29 5.4 REABSORCIÓN DE LOS SUEROS CON LISADOS DE Escherichia coli...............................................................................................................30 5.5 ENSAYO INMUNOENZIMATICO ELISA....................................................31 5.6 ANÁLISIS ESTADÍSTICO...........................................................................32 6. RESULTADOS.............................................................................................33 6.1 OBTENCIÓN DEL ANTÍGENO CRUDO DE Mycobacterium tuberculosis H37RV. Y. PURIFICACIÓN. DE. PROTEÍNAS. MEDIANTE. SDS-. PAGE...........................................................................................................33.

(6) 6.2 TITULACIONES EN BLOQUE....................................................................34 6.3 REACTIVIDAD DE LA FRACCIÓN ANTIGENICA DE 24 kDa CON LOS SUEROS DE LOS PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS...................35 6.4 REACTIVIDAD DE LAFRACCIÓN ANTIGENICA DE 10 kDa CON LOS SUEROS DE LOS PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS...................36 6.5 REACTIVIDAD DE LA MEZCLA DE ANTÍGENOS DE 24 kDa Y 10 kDa CON LOS SUEROS DE PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS..........37 6.6 REACTIVIDAD DE LA FRACCIÓN ANTIGENICA DE 10 kDa CON LOS SUEROS DE PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS ABSORBIDOS CON LISADOS DE Escherichia coli............................................................38 6.6.1 CONDICIONES. ESTANDARIZADAS. PARA. LOS. SUEROS. SIN. ABSORBER............................................................................................38 6.6.2 CONDICIONES. ESTANDARIZADAS. INDEPENDIENTE. DE. LO. ENCONTRADO PARA LOS SUEROS SIN ABSORBER.......................39 6.7 REACTIVIDAD DEL ANTIGENO DE 24 kDa CON LOS SUEROS DE PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS ABSORBIDOS CON LISADOS DE Escherichia coli......................................................................................40 6.7.1 CONDICIONES. ESTANDARIZADAS. PARA. LOS. SUEROS. SIN. ABSORBER............................................................................................40 6.7.2 CONDICIONES ESTANDARIZADAS INDEPENDIENTEMENTE POR TITULACIONES EN BLOQUE................................................................41 6.8 REACTIVIDAD DE LA MEZCLA DE LOS ANTIGÉNOS DE 10 Y 24 kDa CON LOS SUEROS DE PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS ABSORBIDOS CON LISADOS DE Escherichia coli..................................42..

(7) 6.8.1 CONDICIONES. ESTANDARIZADAS. PARA. LOS. SUEROS. SIN. ABSORBER............................................................................................42 6.8.2 CONDICIONES ESTANDARIZADAS INDEPENDIENTEMENTE..........43 6.9 DETERMINACIÓN DE LOS VALORES DE RENDIMIENTO OPERATIVO PARA CADA UNA DE LAS PRUEBAS........................................................44 7. DISCUSIÓN DE RESULTADOS..................................................................46 7.1 REACTIVIDAD DE LA FRACCIÓN ANTIGENICA DE 24 kDa CON LOS SUEROS DE LOS PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS...................46 7.2 REACTIVIDAD DE LA FRACCIÓN ANTIGENICA DE 10 kDa CON LOS SUEROS DE LOS PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS...................47 7.3 REACTIVIDAD DE LA MEZCLA DE ANTÍGENOS DE 24 kDa Y 10 kDa CON LOS SUEROS DE PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS..........48 7.4 REACTIVIDAD DE LA FRACCIÓN ANTIGENICA DE 10 kDa CON LOS SUEROS DE PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS ABSORBIDOS CON LISADOS DE Escherichia coli.............................................................49 7.5 REACTIVIDAD DE LA MEZCLA DE LOS ANTIGÉNOS DE 10 Y 24 kDa CON LOS SUEROS DE PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS ABSORBIDOS CON LISADOS DE Escherichia coli ...................................50 7.6 REACTIVIDAD DEL ANTIGENO DE 24 kDa CON LOS SUEROS DE PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS ABSORBIDOS CON LISADOS DE Escherichia coli......................................................................................51 7.7 EVALUACIÓN. DE. LA. REACTIVIDAD. DE. LAS. FRACCIONES. ANTIGENICAS DE 24 kDa Y 10 kDa DE Mycobacterium tuberculosis....52 8. CONCLUSIONES.........................................................................................56.

(8) 9. RECOMENDACIONES................................................................................57 10. REFERENCIAS...........................................................................................58.

(9) INDICE DE ANEXOS.. Anexo 1.. Medio de cultivo. Ogagwa Kudoh para el mantenimiento de. Mycobacterium tuberculosis. Anexo 2.. Determinación de la concentración proteíca mediante el método de Bradford (dye binding).. Anexo 3.. Electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida.. Anexo 4.. Marcadores de peso molecular.. Anexo 5.. Resumen de los pacientes incluidos en el estudio.. Anexo 6.. Soluciones usadas para los ensayos inmunoenzimaticos ( ELISA indirecta).. Anexo 7.. Análisis de tablas tetracóricas (4 x 4) para la determinación de los valores de rendimiento operativo de una prueba diagnóstica..

(10) INDICE DE FIGURAS.. Figura 1.. Microfotografía. electrónica. de. bacilos. de. Mycobacterium. tuberculosis Figura 2.. Aplicación de la prueba de la tuberculina. Figura 3.. Algoritmo diagnóstico e interpretación del PPD. Figura 4.. Baciloscopia de esputo positiva para bacilos ácido- alcohol resistentes.. Figura 5.. Incidencia de tuberculosis en el mundo según la Organización Mundial de la Salud.. Figura 6.. Electroforesis en gel de poliacrilamida al 13%..

(11) INDICE DE TABLAS.. Tabla 1.. Principales fármacos usados en el tratamiento de la tuberculosis.. Tabla 2.. Condiciones de trabajo para ELISA estandarizadas mediante titulaciones en bloque.. Tabla 3.. Valores de los rendimientos operativos para las distintas pruebas.

(12) INDICE DE GRÁFICOS.. Gráfico 1.. Número de casos reportados en Colombia según un reporte de la Organización Mundial de la Salud. OMS 2000. Gráfico 2.. Regresión semi logarítmica de los Marcadores de Peso molecular en función de su tasa de migración RF.. Gráfico 3.. Reactividad de la fracción antigénica de 24 kDa con los sueros de los pacientes tuberculosos y sanos.. Gráfico 4.. Reactividad de la fracción antigénica de 10 kDa con los sueros de los pacientes tuberculosos y sanos.. Gráfico 5.. Reactividad de la mezcla de fracciones antigénicas de 24 kDa y 10 kDa con los sueros de los pacientes tuberculosos y sanos.. Grafico 6.. Reactividad de la fracción antigénica de 10 kDa con los sueros de pacientes tuberculosos y sanos absorbidos con lisados de Escherichia coli. (condiciones estandarizadas para los sueros sin absorber). Gráfico 7.. Reactividad de la fracción antigénica de 10 kDa con los sueros de pacientes tuberculosos y sanos absorbidos con lisados de Escherichia coli. (estandarización independiente). Gráfico 8.. Reactividad del antígeno de 24 kDa con los sueros de pacientes tuberculosos y sanos absorbidos con lisados de Escherichia coli. (condiciones estandarizadas para los sueros sin absorber).

(13) Grafico 9.. Reactividad del antígeno de 24 kDa con los sueros de pacientes tuberculosos y sanos absorbidos con lisados de Escherichia coli. (estandarización independiente). Gráfico 10.. Reactividad de la mezcla de los antigénos de 10 y 24 kDa con los sueros de pacientes tuberculosos y sanos absorbidos con lisados de Escherichia coli. (condiciones estandarizadas para los sueros sin absorber). Gráfico 11.. Reactividad de la mezcla de los antigénos de 10 y 24 kDa con los sueros de pacientes tuberculosos y sanos absorbidos con lisados de Escherichia coli. (estandarización independiente).

(14) INTRODUCCIÓN.. La tuberculosis es la causa de muerte de millones de personas y actualmente se considera una de las endemias mas severas en el mundo. Cada año aparecen 8 millones de nuevos enfermos y 2 millones de muertos incluidos varios niños y enfermos de SIDA y las condiciones socioeconómicas de países en desarrollo contribuyen a la diseminación de la enfermedad (OMS, 2000).. Descrita por primera vez a finales del siglo XIX por el científico Robert Koch (Koch, 1884) el agente etiológico de esta enfermedad es una bacteria del complejo Mycobacterium tuberculosis que se disemina fácilmente a partir de gotas de saliva y que a través de la sangre puede abarcar cualquier órgano o sistema (Volk et al. 1988).. El diagnóstico temprano es adecuado para el oportuno tratamiento de pacientes con tuberculosis y de esta forma se previene la alta diseminación de bacilos típica de las formas mas avanzadas de la infección. La historia clínica y la radiología son la base para sospechar de esta enfermedad pero sólo la comprobación bacteriológica de la existencia de M. tuberculosis en cualquier muestra o tejido asegura el diagnóstico.. Para esto se realizan cultivos y. exámenes directos a las muestras en un método conocido como baciloscopia (Gutierrez et al. 1998). Este tipo de diagnóstico tarda mucho tiempo, un cultivo puede demorar hasta 5 semanas y suele hacerse sólo en ciertos.

(15) laboratorios especializados.. Es por eso que se hacen necesarios métodos. diagnósticos mas rápidos, eficientes y precisos. Las pruebas serológicas no han tenido mucho éxito y no han llegado a sustituir a los métodos tradicionales. Los resultados usando antígeno crudo son poco concluyentes por lo que se han probado diversos antígenos proteicos y lipídicos,. (Garcia, David y Papa. 1988), (Barnes et al.. 1992), (Tortola,. Laneelle y Martín-Casabona. 1996), (Diagbouga et al 1997), (Laal et al. 1997), (Samanich et al. 2000), (Laurens et al. 2000) , pero hasta el momento los resultados son muy variables y parecen diferir entre grupos de estudio. Al usar antígenos de menor peso molecular se espera obtener mejores resultados en el diagnóstico serológico y de esta manera evaluar algunos candidatos para ser usados como ligandos en pruebas serodiagnósticas de rutina como ELISA..

(16) 1. JUSTIFICACIÓN. Se calculó que para finales del siglo pasado aparecieron cerca de 90 millones de nuevos casos de tuberculosis, 30 millones de muertes, 30 más de nuevos infectados y un tercio de la población total mundial tuvo algún contacto con el bacilo. Su alta incidencia en la población la ha convertido en la principal causa de muerte en adultos dentro del grupo de enfermedades infecciosas y se asume que más de 50 millones de personas están infectadas con cepas resistentes a por lo menos una de las drogas antituberculosas (Estrada, 2000). En Colombia, esta enfermedad no es menos importante y sumado a las condiciones de pobreza y hacinamiento se convierte en un serio problema de salud pública. Teniendo en cuenta que muchos de los casos ocurren en áreas rurales donde los servicios de salud son deficientes, un método diagnóstico rápido, simple y barato es una prioridad para el control de esta enfermedad en el país. Si bien la serología no ha sido capaz de sustituir a la bacteriología como patrón de oro en el diagnóstico de la TBC, esta puede llegar a convertirse en una herramienta de ayuda diagnóstica importante para casos especiales como TB extrapulmonar, o pacientes con VHI o menores de 6 años, en los cuales la baciloscopia tiene un bajo rendimiento y la clínica y la radiología pueden llegar a ser muy inespecíficas.. 1.

(17) Por otra parte, la búsqueda activa de casos y el registro epidemiológico también se ve afectado por la complicidad de los métodos diagnósticos tradicionales lo cual resulta en un importante subregistro de nuevos casos. Se han realizado diversos estudios para estandarizar y validar técnicas serológicas de diagnóstico en tuberculosis, pero los resultados pueden diferir enormemente entre los grupos de investigación y la aplicación de estas pruebas depende directamente de las características de las poblaciones estudiadas, es así como en Colombia, se hace necesario el estudio de antígenos que sean lo suficientemente específicos. para detectar a los. enfermos exitosamente teniendo en cuenta que la mayoría de la población adulta fue vacunada con BCG y que la alta prevalencia de la enfermedad implica una gran cantidad de personas infectadas no enfermas, de modo que existe un nivel de anticuerpos circulantes que podrían producir muchos resultados falsos positivos. Es por eso que es importante estudiar otros ligandos para las pruebas inmunoenzimáticas como los antígenos de bajo peso molecular que puedan detectar con mayor especificidad la enfermedad.. 2.

(18) 2. TUBERCULOSIS. 2.2. DEFINICIÓN.. El término. Tuberculosis (TBC) define una amplia gama de. manifestaciones clínicas causadas por Mycobacterium tuberculosis y menos frecuentemente por Mycobacterium bovis o Mycobacterium africanum. Es la causa de muerte mas frecuente en el mundo por un único agente infeccioso y se ha declarado como una emergencia global de salud pública. La tuberculosis puede afectar prácticamente cualquier órgano, sobre todo los pulmones y típicamente se asocia con la formación de granulomas (Mendell,. Bennet y. Dolin, 2002).. 2.2. HISTORIA.. La tuberculosis es una enfermedad muy antigua, se han encontrado lesiones raquídeas características de tuberculosis en restos humanos del periodo neolítico. Aproximadamente en el año 380 A.C. Hipócrates efectuó una descripción de un trastorno pulmonar llamado tisis (fundirse, derretirse) y sugirió que era causado por alguna sustancia en el aire exhalado por los pacientes enfermos, solo casi 2000 años después el médico Robert Koch describió el agente causal de la enfermedad y comprobó la teoría de Hipócrates (Rossman, MacGregor, 1995).. 3.

(19) En el siglo XVII el anatomista holandés Francisco Silvio describió pequeños nódulos en los pulmones de los pacientes que tenían tisis a los que llamó tubérculos, también en este siglo la enfermedad empezó a considerarse como un problema de salud pública y se catalogó entre las tres principales causas de muerte en el mundo (Rossman, MacGregor, 1995).. Durante el siglo XIX se acuñaron los términos de Tuberculosis (1893) y de Peste Blanca (1861) y además el nacimiento de la Bacteriología como ciencia permitió a Robert Koch describir detalladamente a M. tuberculosis y confirmar su postulados respecto a la infección (Rossman, MacGregor, 1995).. A mediados del siglo XX en 1940, se iniciaron pruebas clínicas de los dos primeros fármacos eficientes contra M. tuberculosis y durante el resto del siglo los esfuerzos se han centrado en la producción y búsqueda de nuevos y mejores agentes terapéuticos para el tratamiento de esta enfermedad, y en especial con el advenimiento de la tuberculosis multirresistente y la pandemia de VIH (Rossman, MacGregor, 1995).. 2.3.. BACTERIOLOGIA. El género Mycobacterium consiste en organismos con forma de bacilo ( Figura 1), los cuales en algún estadio de su ciclo de vida son ácido alcohol resistentes. Esta propiedad tintatorial se debe a la presencia en la superficie celular de componentes lipídicos específicos llamados ácidos micólicos y. 4.

(20) puede evidenciarse mediante la coloración de Ziehl Neelsen (Madigan , Martinko y Parker , 1997).. Figura 1. Microfotografía electrónica de bacilos de Mycobacterium tuberculosis. BBC.News en http://news.bbc.co.uk/1/hi/health/986406.stm. Mycobacterium tuberculosis es un anaerobio obligado que puede cultivarse en un medio sencillo hecho de sales inorgánicas, asparagina y glicerol. En virtud del elevado contenido de lípido de la bacteria, forma colonias muy densas o una película superficial en medio líquido. El ritmo de proliferación de M. tuberculosis es mucho más lento que el de otras bacterias, e incluso en circunstancias óptimas, la división requiere 12 a 20 horas, por lo que puede ser necesario el transcurso de seis semanas para que sea visible el crecimiento a partir de una pequeño inóculo (Volk et al.1988).. 2.3.1. POSICIÓN TAXONÓMICA. ORDEN: Actynomycetales FAMILIA: Mycobacteriaceae GENERO: Mycobacterium ESPECIE: tuberculosis, bovis, africanum, microti y ulcerans (Complejo M. tuberculosis). 5.

(21) 2.4. FACTORES DE VIRULENCIA.. Si bien no se ha aclarado del todo la base de la virulencia y los modelos actuales son insuficientes para determinar los mecanismos moleculares de la virulencia en tuberculosis se conocen algunos factores que pueden estar involucrados con la capacidad infecciosa del bacilo tuberculoso.. Se conocen algunos constituyentes de las capas exteriores de la pared de M. tuberculosis. que pueden desempeñar un papel como factores en la. virulencia.. ♦ Factor de cordón: conocido ahora como dimicolato de trehalosa. Tiene actividad tóxica. Su función como factor de virulencia es dudosa debido a que se encuentra también en micobacterias no patógenas. ♦ Sulfolípidos: intensifican la toxicidad del factor de cordón. ♦ Micósidos: específicos de especie, conforman una zona transparente a los electrones y les confieren protección contra el ambiente hostil intracelular. ♦ Lipoarabinomanán (LAM): polisacárido de pared que puede actuar como factor de virulencia debido a sus múltiples interacciones con el sistema inmune del hospedero: intensifica la producción de TNF alfa y a su vez inhibe la producción de INF gamma y es además un depredador de radicales libres (Rossman, MaC Gregor, 1996).. 6.

(22) 2.5. DESCRIPCIÓN DE LA ENFERMEDAD. La infección inicial de la tuberculosis suele ser asintomática. Las lesiones, por lo general, curan y no dejan alteraciones residuales, excepto calcificación ocasional de los ganglios linfáticos pulmonares o traqueobronquiales. La gran mayoría de las personas infectadas entran en esta fase de latencia, a partir de la cual existe el peligro permanente de reactivación. En algunos casos, la infección inicial puede evolucionar de manera directa hasta culminar en tuberculosis pulmonar o, por la diseminación linfohematógena del bacilo, causar afección pulmonar, miliar, meníngea o de localización extrapulmonar. En los lactantes, los adolescentes y los adultos jóvenes es más frecuente que la infección inicial tenga consecuencias y pronóstico graves. La tuberculosis extrapulmonar es menos común que la pulmonar. Puede afectar cualquier órgano o tejido, incluye meningitis tuberculosa, y tuberculosis hematógena aguda (miliar), y afecta los ganglios linfáticos, la pleura, el pericardio, los riñones, los huesos y las articulaciones, la laringe, la piel, los intestinos, el peritoneo y los ojos. La tuberculosis pulmonar progresiva surge por reinfección exógena o por reactivación endógena del foco latente que persistía desde la infección inicial. Sin tratamiento, aproximadamente la mitad de los enfermos mueren en el lapso de dos años. La quimioterapia apropiada casi siempre cura la enfermedad. El estado clínico depende más bien de la presencia o ausencia de bacilos tuberculosos en el esputo, como también de la naturaleza de los cambios en las radiografías de tórax (Netsalud, 2002).. 7.

(23) 2.6. INMUNOPATOLOGIA.. Los bacilos que son inhalados profundamente en los pulmones son fagocitadas por los macrófagos alveolares y allí son eliminados inmediatamente o sobreviven para iniciar una infección. Si no hay suficientes macrófagos activados para eliminar los bacilos se pueden formar lesiones caseosas que crecen localmente o pueden licuarse para liberar mas bacilos y sus derivados al tronco bronquial.. La activación de los macrófagos alveolares está. acompañada de una reacción mediada por células que habilita a los macrófagos para matar y digerir los bacilos. Esta respuesta celular tiene dos funciones aparentemente contradictorias, una es destruir los macrófagos incapaces de destruir las bacterias intracelulares y la otra es. activar los. macrófagos infectados para destruir a su invasor, lo anterior requiere un balance entre los diferentes mecanismos efectores de los linfocitos que muestran. actividad. citolítica. a. la. vez. que. secretan. citoquinas. inmunoprotectivas. Tanto la lisis de los macrófagos como su activación pueden detener el crecimiento del tubérculo ya que los bacilos no se multiplican apreciablemente en tejido necrótico caseoso no licuado. La destrucción de los macrófagos no activados, resulta inevitablemente en daño tisular, y puede causar patologías características como necrosis caseosa y cavitaciones. Más tarde en la infección se pueden reclutar otras células circulantes como monocitos, linfocitos y neutrófilos, pero ninguno de estos tipos celulares es muy eficiente en la destrucción de las bacterias. La destrucción y activación de los macrófagos alveolares puede ser evidenciada a nivel macro por la presencia de. 8.

(24) granulomas, éstos presentan una reacción típica de hipersensibilidad retardada mediada por células T dentro del tejido parenquimatoso. Las lesiones focales granulomatosas compuestas de células epiteloides gigantes y de linfocitos T antígeno-específicos empiezan a formar una pared alrededor del patógeno y así previene su diseminación, por lo tanto, el daño pulmonar característico de esta enfermedad se debe casi exclusivamente a la respuesta de daño celular del hospedero. Los granulomas o tubérculos previenen la multiplicación de las micobacterias gracias al pH interior ácido y a la falta de nutrientes esenciales, pero algunos bacilos pueden permanecer dormantes por décadas.. En. conclusión, el proceso de formación de granulomas es eficiente para contener los patógenos, pero la formación de cavitaciones puede permitir la diseminación del bacilo a otros hospederos por vía aérea (Kaufmann, Sher y Ahmed, 2002).. 2.7. INMUNOLOGIA.. La tuberculosis es el prototipo de infecciones que requieren una respuesta inmune de tipo celular para su control.. Aunque se producen. abundantes anticuerpos durante la infección, estos no parecen desempeñar ningún papel en la defensa del hospedero. Durante las primeras semanas después de la exposición, el huésped casi no tiene ninguna defensa contra la infección por el bacilo tuberculoso, de modo que las bacterias se replican libremente en los alvéolos pulmonares o en los macrófagos alveolares. Esta. 9.

(25) replicación sin restricciones prosigue durante semanas hasta que sobreviene el desarrollo de la hipersensibilidad tisular e inmunidad celular (Mendell, Bennet y Dolin, 2002).. Los linfocitos T. activados por el reconocimiento de los antígenos. micobacteriales presentados dentro de un contexto de histocompatibilidad mayor clase II proliferan y producen proteínas secretorias que atraen, retienen y activan los macrófagos en el sitio del antígeno potenciando su actividad micobactericida. (TNF. Los macrófagos también secretan sustancias reguladoras. , Factor de crecimiento plaquetario, Factor transformante. y Factor de. crecimiento fibroblástico) que en conjunto con las proteínas secretorias de los linfocitos (INF gamma, factor inhibitorio de la migración MIF) determinan el carácter de la respuesta (Mendell, Bennet y Dolin, 2002).. La última fase de la respuesta inmune en tuberculosis será la aparición de una resistencia adquirida. No todos los linfocitos T permanecen en el foco de infección, algunos retornan a la circulación sanguínea o linfática, entre estos están los que median las reacciones de hipersensibilidad retardada, estos linfocitos se diferencian a formas de larga vida y cuando se vuelven a encontrar con los antígenos micobacteriales secretan citocinas nuevamente para desencadenar la respuesta granulomatosa, contrarrestando de alguna manera las infecciones secundarias (Sánchez y Toro, 2001).. 10.

(26) 2.8. TRATAMIENTO.. El tratamiento para las formas pulmonar y extra pulmonar es el mismo y debe iniciarse presuntivamente antes del diagnóstico. Los pacientes se tratan inicialmente con un esquema tetra conjugado mientras se realizan pruebas de resistencia (solo en algunos casos). El tratamiento de la tuberculosis se basa en tres principios básicos: el uso de múltiples medicamentos, la toma regular de los mismos y el tratamiento prolongado. Sólo así se asegura un éxito en la recuperación del paciente y una menor probabilidad de generar resistencia a los fármacos (Wilson 2002).. La Tabla 1 muestra los fármacos de elección mas comunes en el tratamiento de la tuberculosis.. 11.

(27) Tabla 1. Principales fármacos usados en el tratamiento de la tuberculosis ( Wilson, 2002). FARMACOS Isoniacida. EFECTOS ADVERSOS Hepatitis, Neuropatia periférica. Rifampicina. Síndrome similar al resfriado Coloración de los fluidos corporales. Pirazinamida. Atralgia, Hiperuricemia.. Estreptomicina. Ototoxicidad. Etambutol. Neuritis óptica. PRIMERA ELECCIÓN. SEGUNDA ELECCIÓN. Etionamida Kanamicina Cicloserina Amikacina Ciprofoxacina Clofazimina Cicloserina Ofloxacina Rifabutina. 2.9. DIAGNÓSTICO.. A partir de la historia clínica y el examen radiológico se puede sospechar de tuberculosis, pero éstos nunca deben considerarse probatorios del diagnóstico, el cual se confirma mediante la comprobación de la existencia de M. tuberculosis en cualquier material proveniente del sospechoso de tener la enfermedad. La presencia de granulomas con necrosis de caseificación en muestras de tejido se considera altamente sugestiva de la enfermedad.. 2.9.1. PRUEBA DE LA TUBERCULINA. 12.

(28) Las personas que muestran infección por Mycobacterium tuberculosis, M. africanum y M. bovis casi siempre reaccionan a las pruebas cutáneas con dosis pequeñas de tuberculina (Figura 2), es decir, el bioequivalente de 5 unidades internacionales (UI) del Patrón Internacional del Derivado Proteínico Purificado (PPD). La reacción a veces no aparece en las personas gravemente enfermas de tuberculosis, durante algunas enfermedades infecciosas agudas y en las personas que han sufrido inmunosupresión. Las reacciones causadas por otras bacterias, inclusive BCG, tienden a ser menores; su frecuencia relativa varía con la prevalencia de esas otras micobacterias en el medio ambiente. Suele definirse una reacción positiva como aquella que tiene un diámetro de 10 mm o más de induración, esta cifra constituye un límite arbitrario y no es adecuada para todas las situaciones y grupos de edad. Entre contactos familiares de enfermos tuberculosos infectantes y personas con infección por VIH hay que considerar como signo de infección tuberculosa, incluso una induración de 5 mm de diámetro (Netsalud 2002). La Figura 3 muestra la sinapsis diagnóstica y la interpretación de la prueba de tuberculina.. figura 2. Aplicación de la prueba de la tuberculina. http://www.med.sc.edu:85/fox/mycobacteria.htm. 13.

(29) Figura 3. Algoritmo diagnóstico e interpretación del PPD. Según Louro J. 2000. 2.9.2. BACILOSCOPIA. 14.

(30) Es el examen directo de cualquier material orgánico en busca de micobacterias, en el caso de la tuberculosis respiratoria se hace la búsqueda en esputo, espontáneo o inducido, o en las secreciones broncopulmonares obtenidas por lavado bronquial o broncoalveolar.. El examen se basa en la. propiedad de ácido-alcohol resistencia de las micobacterias; en la coloración de Ziehl Neelsen, la más empleada, las micobacterias conservan el color rojo dado por la fucsina, después de ser expuestas al alcohol ácido.. La. sensibilidad de la baciloscopia del esputo no es alta y varia entre 40 y 60 % dependiendo de la concentración de la bacteria en la muestra. En países con condiciones sanitarias deficientes como el nuestro, en los cuales la prevalencia de la tuberculosis en alta y la consulta suele ser tardía, la baciloscopia tiene un mayor rendimiento.. La especificidad de la baciloscopia es buena, aunque. micobacterias no tuberculosas y nocardias pueden dar falsos positivos.. El. bajo costo y la accesibilidad del examen hacen de la baciloscopia el estudio fundamental, obligatorio e insustituible para el diagnóstico de esta enfermedad (Gutierrez et al. 1998) (Figura 4).. figura 4. Baciloscopia de esputo positiva para bacilos ácido- alcohol resistentes (rojos) http://www.nationaljewish.org/faculty/iseman.html. 2.9.3. CULTIVO. 15.

(31) La sensibilidad del cultivo de esputo para el diagnóstico de la tuberculosis respiratoria es superior al 80%, por lo cual permite captar un mayor número de pacientes (Gutierrez et al. 1998).. Tiene los inconvenientes de tener un. costo mayor, menor accesibilidad y especialmente, mayor tiempo requerido para obtener el resultado. El cultivo toma en promedio entre 4 y 8 semanas para ser informado (INS 2000).. 2.9.4 OTROS ESTUDIOS DIAGNÓSTICOS.. La baja sensibilidad de la baciloscopia, el retardo del resultado del cultivo y la necesidad de invasión para los estudios histopatológicos han justificado la investigación de otros métodos diagnósticos en tuberculosis. Las pruebas serológicas no diferencian infección de enfermedad y tienen sensibilidad y especificidad variables en diferentes estudios por lo que no han llegado a sustituir a los métodos tradicionales. En casos particulares pueden orientar un diagnóstico.. La detección de antígenos específicos mediante. anticuerpos monoclonales y sondas de DNA tiene buena sensibilidad y especificidad para la identificación de micobacterias en cultivo y en muestras de tejido, no obstante en otras muestras clínicas rutinarias no se ha confirmado el mismo rendimiento (Gutierrez et al. 1998).. 2.9.5. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR). 16.

(32) Ha demostrado excelente sensibilidad y especificidad, las cuales, no obstante, no han sido fáciles de reproducir en condiciones de la práctica clínica diaria. La estandarización cuidadosa de la técnica y la validación local son necesarias antes de depositar toda la confianza en los resultados de la prueba. Su uso rutinario y masivo aún no está justificado y no han sustituido a los métodos tradicionales debido a la ausencia de controles internos para la detección de inhibidores de la reacción, también las comparaciones inter.laboratorios son insatisfactorias, por lo cual se necesita mucho trabajo adicional en investigación (Ieven y Goossens, 1997).. Actualmente se han mejorado. muchos las técnicas de PCR y su sensibilidad y especificidad han aumentado pero aún siguen siendo pruebas especializadas y costosas para ser aplicadas como método diagnóstico en países en desarrollo.. 2.9.6. ESTUDIOS PRELIMINARES PARA EL SERODIAGNÓSTICO DE LA TUBERCULOSIS.. Se han probado muchos antígenos proteicos de M. tuberculosis para ser usados ya sea en diagnóstico o en el diseño de nuevas vacunas que ofrezcan una mayor protección contra la infección.. Un antígeno importante es el. complejo 85, que comprende algunas de las proteínas mas frecuentemente encontradas en las suspensiones de cultivos de M. tuberculosis. Las proteínas de este complejo difieren en peso molecular entre 30 y 31 kDa y todas son proteínas de unión a la fibronectina, aunque la relación de esta actividad con la fisiología bacteriana no es muy clara.. 17. Las proteínas del complejo 85 son.

(33) altamente inmunogénicas en infecciones naturales y experimentales en términos de tanto producción de anticuerpos como de activación de reacciones mediadas por linfocitos T (Wiker y Harboe 1992). Otros antígenos identificados como el de 10 kDa que tiene actividad efectora de linfocitos T reportada pero su acción no difiere significativamente de la exhibida por el antígeno crudo de la bacteria completa (Barnes et al. 1992). En el caso del antígeno de 38 kDa se encontró una buena especificidad al reaccionar con sueros hiperinmunes contra M. tuberculosis y M. bovis (Cadival, Chaparras y Hudssong 1987). Lo que lo hace un buen candidato para el diseño de vacunas y la inmunización contra TBC pero debido a su reacción cruzada con M. bovis no es un péptido útil para diagnóstico serológico ya que la mayoría de la población ha sido vacunada con BCG y por lo tanto pueden darse falsos positivos.. Otros. antígenos como Dna K y las proteínas de choque térmico (65 kDa y 12 kDa) son altamente conservadas entre distintos miembros del género. e incluso. entre dominios por lo que su uso potencial para el diagnóstico es limitado. (Thole, Janssen y Young, 1999) Recientemente los estudios se han enfocado en antígenos de alto peso molecular como el de 88 kDa que ha demostrado ser inmunodominante en la respuesta humoral durante infecciones de tuberculosis pulmonar (Laal et al. 1997) y parece ser el candidato mas importante para el diagnóstico de esta enfermedad en pacientes VIH positivos (Samanich et al. 2000).. Dentro de los antígenos de menor peso molecular la proteína MPT64. de 24 kDa parece ser idónea para aumentar la especificidad de las pruebas diagnósticas ya que se ha encontrado en el complejo M. tuberculosis pero no en M. bovis BCG (Oettinger y Andersen. 1994).. 18.

(34) Debido a las limitaciones de los péptidos analizados se estudian a veces cocteles de diferentes péptidos sobre todo en pruebas cutáneas que puedan reemplazar al PPD para un mejor diagnóstico (Konstanti et al.1998).. 2.9.7. ANTIGÉNOS DE BAJO PESO MOLECULAR.. El uso de antígenos de bajo peso molecular para diseñar pruebas diagnósticas presenta algunas ventajas, en especial en tuberculosis se requiere de una proteína o fracción antígénica que sea capaz de diferenciar entre la vacunación con BCG y la infección con alguna especie del complejo M. tuberculosis; el caso del antígeno de 24 kDa es adecuado ya que está ausente en las 4 cepas mas comúnmente usadas para fabricar la vacuna BCG. (Thole, Janssen y Young, 1999).. Por otra parte, es importante disminuir la reactividad cruzada en especial con otras micobacterias no tuberculosas, por ejemplo, las especies del complejo Mycobacterium avium intracellulare (MAC o MAI) y se ha demostrado que son las proteínas de menor peso molecular ( <15 kDa ) las que menor reactividad cruzada exhiben en pruebas serológicas usando sueros policlonales de conejo (Olsen, Reytan y Wiker, 2000).. Debido a esto se escogieron las fracciones correspondientes a 24 kDa y a 10 kDa para determinar su reactividad con sueros de pacientes diagnosticados con tuberculosis y clínicamente sanos.. 19.

(35) 2.10. EPIDEMIOLOGIA.. M. tuberculosis infecta a un tercio de la población mundial y en 1996 produjo mas de 6 millones de casos en todo el mundo, los factores esenciales para su propagación son las condiciones de hacinamiento y la poca resistencia natural a la infección.. Durante un tiempo se creyó que la enfermedad tendería a desaparecer ya que sólo el 10% de las infecciones desarrolla enfermedad activa y de éstos aproximadamente el 50% produce cavitaciones pulmonares, es decir, se tornan contagiosos, así que cada caso debería infectar a cerca de 20 personas para mantener las tasas. Sin embargo, las últimas décadas han demostrado lo contrario y la tuberculosis ha reemergido con incidencias importantes en todo el mundo en especial en Asia y África (Mendel, Bennett y Dolin,. 2002).. Se. estima que durante la decada de 1990 a 1999 cerca de 90 millones de nuevos casos de tuberculosis ocurrieron en el mundo y de éstos alrededor de dos tercios fueron en Asia. En los países en vías de desarrollo, la tuberculosis a emergido como la enfermedad oportunista mas común asociada a la infección por VIH (Raviglione, Zinder y Kochi , 1995).. La Figura 5 muestra la incidencia de tuberculosis alrededor del mundo según un informe de la Organización Mundial de la Salud del 2002.. En. América Latina, Colombia es uno de los países con menos incidencia, sin. 20.

(36) embargo, es muy posible que las cifras sean mayores debido al sub-registro de casos y la falta de búsqueda activa.. Figura 5. Incidencia de tuberculosis en el mundo según la Organización Mundial de la Salud. (OMS, 2002). 2.11. TUBERCULOSIS EN COLOMBIA. 21.

(37) En Colombia se diagnostican anualmente un promedio de 10.000 nuevos casos de tuberculosis, pero el número real puede ser mayor debido a que existe disminución en la búsqueda de potenciales enfermos. Los casos de tuberculosis en el país tienen predominio de la forma infecciosa de la enfermedad, conocida como tuberculosis pulmonar y la proporción de casos en los menores de 15 años es de un 7,2% del total. El gráfico 1 muestra el registro de casos reportados en el país en los últimos años según la Organización Mundial de la Salud (OMS, 2000).. 9.000 8.000 7.000 6.000 5.000 4.000 3.000 2.000 1.000 0 1993. 1994. 1995. 1996. 1997. 1998. 1999. Gráfico 1. Número de casos reportados en Colombia según un reporte de la Organización Mundial de la Salud. OMS 2000. 3. OBJETIVOS 3.1. OBJETIVO GENERAL.. 22.

(38) •. Diseñar una técnica serológica rápida como ayuda en el diagnóstico de la tuberculosis en Colombia.. 3.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS.. •. Obtener. antígenos. proteicos. Mycobacterium tuberculosis. de. bajo. peso. molecular. de. H37RV mediante la separación por. Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS- PAGE). •. Evaluar la reactividad de las fracciones antigénicas de 24 y 10 kDa de. Mycobacterium tuberculosis en sueros de pacientes sanos y. tuberculosos •. Evaluar la sensibilidad y especificidad de ELISA usando las fracciones de 24 y 10 kDa frente a sueros previamente absorbidos con lisados de Escherichia coli.. •. Estandarizar la prueba de ELISA indirecta como serodiagnóstico de la tuberculosis, usando como ligandos antígenos de bajo peso molecular.. 4. MATERIALES. 4.1. EQUIPOS.. 23.

(39) §. Agitador mecánico Biodancer.. §. Agitador mecánico Indulab.. §. Autoclave.. §. Balanza digital OHAUS.. §. Baño serológico Memert.. §. Cámara de flujo laminar LABCONCO Purifier Class II Total Exhaust.. §. Centrífuga refigerada Eppendorf 580R.. §. Congelador –20 ºC Framec.. §. Dispensador volumen ajustable Nichryco.. §. Espectrofotómetro digital Spectronic II.. §. Incubadora 37ºC.. §. Lavador manual de placas SIGMA.. §. Lector de ELISA Labsystems Uniskan II.. §. Micropipetas ajustables Eppendorf.. §. Nevera Industrial Indifrial.. §. Potenciometro digital Orion.. §. Pipeta multicanal Labsystems.. §. Revco ScienTemp.. §. Sonicador Sonics Vibracell.. §. Sistema de electroforesis vertical Penguin water coged –gel.. §. Vortex Fisher Scientific.. 4.2. MATERIAL BIOLÓGICO. §. Cepa de Escherichia coli ATCC.. 24.

(40) §. Cepa de Mycobacterium tuberculosis H37Rv.. §. Sueros TBC negativos.. §. Sueros TBC positivos.. 4.3. MATERIAL DE LABORATORIO. §. Criotubos.. §. Espátulas de madera estériles.. §. Frascos de vidrio con tapón de caucho.. §. Perlas de vidrio.. §. Pipetas de vidrio 1. 5 y 10 ml.. §. Placas de ELISA Dynatech.. §. Puntas para micropipeta (volumen según requerimientos).. §. Tubos para centrífuga FALCON de 15 mL.. §. Tubos de vidrio tapa rosca para cultivo microbiológico. §. Viales de 1.5 ml Eppendorf.. 4.4. REACTIVOS. §. B—mercaptoetanol SIGMA.. §. Ácido acético Merck.. §. Ácido etilen dinitrilo tetra acético (EDTA) Merck. §. Acrilamida SIGMA.. §. Azul brillante de Coomasie R 250 Merck. §. Azul de bromofenol SIGMA.. §. Carbonato ácido de sodio Merck.. 25.

(41) §. Carbonato de sodio Merck.. §. Cloruro de magnesio Merck.. §. Cloruro de sodio Merck.. §. Conjugado anti-IgG humana ligado a peroxidasa (Fc Specific) SIGMA.. §. Fosfato dibásico de sodio Merck.. §. Fosfato monobásico de sodio Merck.. §. Glicerol.. §. Glicina SIGMA.. §. Huevos.. §. L-Asparagina Merck.. §. Lauril sulfato de sodio SDS SIGMA.. §. Marcadores de peso molecular Bench Mark.. §. Metanol.. §. N.N Metilen bisacrilamida SIGMA.. §. Peroxido de hidrógeno Merk.. §. Persulfato de amonio SIGMA.. §. Sulfato de magnesio.. §. TEMED( N,N,N´,N´;-tetrametilen-etilendiamida) SIGMA.. §. Tris –HCL SIGMA.. §. Trizma base SIGMA.. §. Tween 20 SIGMA.. §. Verde de Malaquita MercK. 5. METODOS.. 26.

(42) 5.1.. MANTENIMIENTO DE LA CEPA Y OBTENCIÓN DEL ANTIGENO. CRUDO DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS CEPA H37RV.. La cepa pura se sembró en medio sólido Ogawa Kudoh (OK) (Anexo 1) y se incubó a 37ºC durante aproximadamente 4 semanas al cabo de las cuales se cosechó el antígeno de la siguiente manera: a los tubos crecidos se les adicionaron aproximadamente 2 ml de solución salina estéril 0.85% y se hizo un raspado superficial para desprender las colonias. Esta suspensión se llevó a agitación en Vórtex por 2 ó 3 minutos y posteriormente se centrifugó a 8000 r.p.m. a 4ºC durante 30 minutos. Se descartó el sobrenadante y se agregó de nuevo solución salina estéril 0.85% (4 a 5 ml). El anterior procedimiento se repitió 5 veces para eliminar los restos de medio que puedan haber quedado en la suspensión. Por último, se resuspendió el precipitado en aproximadamente 3 ml de solución salina estéril.. La suspensión de bacterias se llevó posteriormente a choque térmico y sonicación. Para el choque térmico alícuotas de aproximadamente 1.5 ml se calentaron hasta 70ºC en baño serológico. durante 90 segundos y se. sumergieron en nitrógeno líquido por un minuto y medio o en congelador a -60ºC durante 6 minutos. Esto se repitió 6 veces. Para la sonicación, el volumen total de la suspensión celular se sometió a nueve ciclos de sonicación de 1 minuto aproximadamente con descanso en baño de hielo de un minuto usándose de 60Hz en cada ciclo.. 27.

(43) El porcentaje de ruptura celular se evaluó mediante coloración de Ziehl Neelsen, una ruptura aproximada al 70% fue suficiente para continuar con la obtención del antígeno crudo; para esto, se centrifugó durante media hora a 13.000 r.p.m a 4 ºC y se tomó el sobrenadante, al cual se le determinó la concentración de proteínas mediante el método de Bradford. (Anexo 2).. 5.2.. ELECTROFORESIS. DE. PROTEINAS. Y. OBTENCIÓN. DE. LAS. FRACCIONES ANTIGÉNICAS DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS H37RV. El procedimiento ha sido descrito previamente (Cangrejo 2000), de manera general, se usaron tres tipos de soluciones de poliacrilamida, inicialmente se sirvió 1 ml de del de sellamiento (solución de poliacrilamida 10% y 5. l de TEMED) que se solidifica rápidamente. Posteriormente se. agregaron 4,5 ml de gel separador (solución acrilamida 13%) que se dejaron polimerizar por al menos 20 minutos y por último se agregaron 2,5 ml de gel concentrador (5% poliacrilamida) (Anexo 3). Se usó un peine de 10 pozos para la mayoría de las electroforesis y uno con un dos pozos uno pequeño y otro grande para la electroforesis preparativa.. El gel se coloreó con solución colorante (Anexo 3) durante 2-3 horas y se decoloró (Anexo 3) hasta que se observaron las bandas,. para la. electroforesis preparativa, el gel no se coloreó y se cortaron con bisturí fracciones de 1 a 1,5 mm en frente del marcador de peso molecular deseado. 28.

(44) (Anexo 4), estas fracciones se alicuotaron con 300. l de buffer de elusión o. PBS pH 7.4, se maceraron con tubo de vidrio o pistilos y se llevaron a agitación fuerte en Vórtex por 5 minutos. Posteriormente se centrifugaron a 13000 r.p.m durante 10 minutos y luego se les determinó la concentración proteica por el método de Bradford. Se almacenaron a 4 ºC para ser usados en las pruebas serológicas.. 5.3. RECOLECCION DE SUEROS DE PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS.. Los sueros de pacientes diagnosticados con Tuberculosis, proceden de diferentes centros de atención médica y pertenecen al banco de sueros del Laboratorio de Investigación en Micobacterias de la Universidad Nacional de Colombia. Los sueros negativos para Tuberculosis pertenecen a estudiantes de la Universidad Nacional de Colombia, clínicamente sanos que aceptaron voluntariamente participar en los estudios del laboratorio.. No se usó un patrón de oro específico para el estudio ya que los sueros de la seroteca tenían diferentes tipos de diagnóstico. Por eso se consideró el patrón de oro como un constructo diagnóstico que incluía el criterio clínico epidemiológico, la baciloscopia, el cultivo y los hallazgos radiológicos. Se incluyeron en el estudio aquellos pacientes negativos o positivos para al menos dos de los cuatro criterios.. 29.

(45) La población de sueros en la seroteca consistía de 71 sueros negativos y 25 positivos para TBC diagnosticados por alguno de las técnicas tradicionales. Se conocían. algunos antecedentes de los pacientes tanto positivos. como negativos (Anexo 5).. 5.4.. PREABSORCIÓN DE LOS SUEROS CON LISADOS DE Escherichia Coli.. Se usó el método descrito previamente (Samanich et al.. 1997) de. manera general se cubrieron placas de ELISA con 200 µl de lisado celular de E-coli en una concentración de aproximadamente 180 µg por mL que se incubaron durante la noche en solución de cobertura a 4ºC. Posteriormente se lavaron 3 veces con una solución de buffer salino fosfato –Tween 20 PBS-T20 y se secaron muy bien. Luego se incubaron con una solución bloqueadora de leche descremada en PBS-T20 durante 30 minutos a 37ºC. posteriormente se lavo la placa muy bien. Un volumen de 150. L de los sueros diluidos 1:10 en. PBS-T20 se sometieron a 8 ciclos de absorción frente a estos lisados celulares.. 5.5.. ENSAYO INMUNOENZIMATICO ELISA.. 30.

(46) Mediante titulaciones en bloque se determinaron las diluciones de trabajo y los tiempos de incubación.. Las placas se sensibilizaron con 100. L por pozo de antígeno diluido en. buffer carbonato de cobertura durante toda la noche en cámara húmeda a 4ºC. Posteriormente se hicieron 3 lavados con PBS-T20 y se dejaron secar. se bloqueo con una solución de leche descremada al 5% en PBS-T20 durante 45 minutos a 37ºC, se hicieron tres lavados con PBS-T20 y se dejó secar. Los sueros se diluyeron en PBS-T20 a la dilución establecida y se incubaron durante 30 minutos en cámara húmeda a 37ºC, nuevamente se hicieron 5 lavados y se secó la placa totalmente. Se adicionaron 100. l por pozo de. conjugado diluido en PBS-T20 y se incubó a 37ºC en cámara húmeda durante 30 minutos y se repitió el procedimiento de lavado. Se agregaron 100. l de. sustrato por pozo, se dejó reaccionar y por último se detuvo la reacción con 50 l solución frenadora (2M ácido sulfúrico).. Para determinar el titulo de. anticuerpos se leyó la absorbancia en un lector de ELISA a 450 nm. (Anexo 6).. 5.6.. ANÁLISIS ESTADÍSTICO.. 31.

(47) El punto de corte se determinó por medio del método del análisis discriminante (Gerardino y Martínez,. 1996 ) y los valores de rendimiento. operativo para cada prueba se obtuvieron por medio del análisis de tabla tetracórica ( Ardila, Sánchez y Echeverri, 2001) (Anexo 7).. 6. RESULTADOS. 6.1. OBTENCIÓN DEL ANTÍGENO CRUDO DE Mycobacterium tuberculosis H37Rv Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE SDS-PAGE.. 32.

(48) El método de obtención de antígeno crudo fue adecuado, observándose un buen bandeo durante la electroforesis (Figura 6), además la concentración proteica del extracto determinada por el método de Bradford fue superior a 3 mg/mL, ideal para la realización de una electroforesis preparativa.. Se. observaron alrededor de 40 bandas en el gel , lo cual coincide con lo reportado previamente (Millership y Want, 1992). Se escogieron dos fracciones que correspondían al peso molecular de interés, para esto se usaron marcadores de peso molecular (Benchmark) y se determinó el peso molecular aproximado de las bandas interpolando su tasa de migración (RF) en una regresión semi logarítmica del peso molecular de los marcadores en función de su RF. El Gráfico 2 muestra esta regresión y el Anexo 4 muestra detalles de los marcadores de peso molecular. 1. kDa. 2. 3. 4. 5. 241 147 99 69 57 43 29 24kDa. 23 19. 10kDa Figura 6. Electroforesis en gel de poliacrilamida al 13%. Carril 1. Marcadores de peso molecular. Carriles 2 y 3. Antígeno crudo de M. tuberculosis puro y dilución 1:2 .Carriles 4 y 5. como en 1 pero dilución 1:5 y 1:10. En rojo las fracciones seleccionadas para estudio.. Gráfico 2. Regresión semi logarítmica de los Marcadores de Peso Molecular en función de su tasa de migración RF.. 33.

(49) 3 Log 10 PM. 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0. 0,2. 0,4. 0,6. 0,8. 1. RF. Ecuación: Y= 2.286 –1.26X RF fracción 24 kDa : 0.716 à Y= 1.3838 à 24.19 kDa RF Fracción <10 kDa: 0.9811 à Y= 1.049 à 11.1 kDa. 6.2. TITULACIONES EN BLOQUE.. Se probaron diferentes concentraciones de suero, antígeno y conjugado y se determinó la mejor combinación siendo ésta en la cual había mayor alejamiento entre las absorbancias de los sueros positivos y negativos. La Tabla 2 muestra las distintas condiciones de trabajo estandarizadas para cada caso.. Tabla 2. Condiciones de trabajo para ELISA estandarizadas mediante titulaciones en bloque.. Prueba. Concentración Antígeno. Dilución Suero. 34. Dilución Conjugado. Tiempo Revelado.

(50) ELISA antígeno 24 kDa ( sueros sin absorber) 1 g / ml 1:5 1:40.000 8 minutos ELISA antígeno ** 3 g/ ml **1:80 **1:40.000 **12 minutos 24 kDa ( sueros absorbidos con E.coli) 1 g / ml 1:5 1:40.000 8 minutos ELISA antígeno 10 kDa ( sueros sin absorber) 1 g/ ml 1:40 1:40.000 8 minutos. ELISA antígeno10 kDa **10 minutos. **3 g/ ml **1:80 **1:40.000 ( sueros absorbidos con E.coli) 1 g/ml 1:40 1:40.000 8 minutos ELISA Mezcla de antígenos 10 y 24 kDa ( sueros sin absorber) 0.5 g/ ml c/u 1:80 1:40.000 10 minutos ELISA Mezcla de antígenos 10 y **1.5 g/ ml c/u **1:80 **1:40.000 **10 minutos 24 kDa ( sueros absorbidos con E.coli). 0.5 g/ml c/u 1:80 1:40.000 10 minutos ** Según titulación realizadas ignorando los resultados para los sueros sin absorber. 6.3. REACTIVIDAD DE LA FRACCIÓN ANTIGENICA DE 24 kDa CON LOS SUEROS DE LOS PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS.. La prueba detectó el 62.5% (15) de los pacientes diagnosticados como positivos para tuberculosis con el patrón de oro y el 62.9%(39) de los pacientes clínicamente sanos. Se determinó un punto de corte de 0.109 y se obtuvo una tasa de falsos negativos de 37.5% (9) y una tasa de falsos positivos de 37.1% (23). El gráfico 3 muestra la distribución de los valores de absorbancia para cada suero.. Gráfico 3. Reactividad de la fracción antigénica de 24 kDa con los sueros de los pacientes tuberculosos y sanos.. 35.

(51) 0,3. Absrorbancia. 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0. 10. 20. 30. 40. 50. 60. 70. 80. 90. No. muestra TBC (-). 6.4.. TBC(+). PC. REACTIVIDAD DE LA FRACCIÓN ANTIGENICA DE 10 kDa CON LOS SUEROS DE LOS PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS.. El ensayo inmuno enzimático detecto solo el 50% (11) de los verdaderos positivos y el 71.42 % (50) de los sueros negativos. Es decir que su tasa de falsos positivos fue 50 % (11) y la de falsos negativos fue tan solo 28.5% (20). El gráfico 4 muestra la distribución de los sueros estudiados con respecto al punto de corte determinado por el análisis discriminante (0.204).. Gráfico 4. Reactividad de la fracción antigénica de 10 kDa con los sueros de los pacientes tuberculosos y sanos.. 36.

(52) 0,8 0,7. Absorbancia. 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0. 10. 20. 30. 40. 50. 60. 70. 80. 90. 100. No. muestra TBC (-). 6.5.. TBC(+). PC. REACTIVIDAD DE LA MEZCLA DE ANTÍGENOS DE 24 kDa Y 10 kDa CON LOS SUEROS DE PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS.. El antígeno mostró reactividad suficiente para un diagnóstico positivo solo en el 36.8%. (7). de los pacientes tuberculosos, el resto de pacientes. correspondientes al 63.2% (12) fueron catalogados como falsos negativos. Por otra parte la prueba inmuno enzimática detectó el 67% (46) de los pacientes clínicamente sanos, se presentó una tasa de falsos positivos del 33% (23). La gráfica 5 muestra la distribución de las absorbancias de los diferentes sueros con respecto al valor de punto de corte (0.176).. 37.

(53) Gráfico 5. Reactividad de la mezcla de fracciones antigénicas de 24 kDa y 10 kDa con los sueros de los pacientes tuberculosos y sanos.. 0,8 0,7 0,6. Absorbancia. 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 -0,1. 0. 10. 20. 30. 40. 50. 60. 70. 80. 90. 100. -0,2. No. Muestra TBC (-). TBC (+). PC. 6.6. REACTIVIDAD DE LA FRACCIÓN ANTIGENICA DE 10 kDa CON LOS SUEROS DE PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS ABSORBIDOS CON LISADOS DE Escherichia coli.. 6.6.1. Condiciones estandarizadas para los sueros sin absorber.. De. 90 sueros estudiados, el 70% (14) de los catalogados como. positivos por el patrón de oro reaccionaron con el antígeno y se detectaron como verdaderos positivos mediante la prueba de ELISA; por otra parte, el 66.7% (66) de los sueros pertenecientes a los pacientes clínicamente sanos fue catalogado adecuadamente como verdaderos negativos para esta prueba.. 38.

(54) Usándose como punto de corte 0.28 se presentó una tasa de falsos positivos y una de falsos negativos de 34.3% y 30% respectivamente.. El grafico 6. muestra la distribución de los sueros con respecto al punto de corte determinado por análisis discriminante.. Grafico 6. Reactividad de la fracción antigénica de 10 kDa con los sueros de pacientes tuberculosos y sanos absorbidos con lisados de Escherichia coli. 0,6. Absorbancia. 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0. 10. 20. 30. 40. 50. 60. 70. 80. 90. 100. No. Muestra TBC (-). TBC (+). PC. 6.6.2. Condiciones estandarizadas independiente de lo encontrado para los sueros sin absorber.. Al usar las condiciones estandarizadas independientemente no se encontró mucha diferencia entre los resultados obtenidos con respecto a lo observado para la prueba realizada bajo las condiciones estandarizadas para los sueros sin absorber;. excepto porque aumentó el porcentaje de falsos. negativos al 35% (7) y la consecuente disminución de la sensibilidad. Para los. 39.

(55) sueros de pacientes clínicamente sanos los resultados fueron iguales, detectándose el 65.7% (46). El gráfico 7 muestra la distribución de los sueros estudiados con respecto a un punto de corte de 0.18.. Gráfico 7. Reactividad de la fracción antigénica de 10 kDa con los sueros de pacientes tuberculosos y sanos absorbidos con lisados de Escherichia coli.. 0,5. Absorbancia. 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0. 10. 20. 30. 40. 50. 60. 70. 80. 90. 100. -0,1. No. muestra TBC (-). TBC (+). PC. 6.7. REACTIVIDAD DEL ANTIGENO DE 24 kDa CON LOS SUEROS DE PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS ABSORBIDOS CON LISADOS DE Escherichia coli.. 6.7.1.. Condiciones estandarizadas para los sueros sin absorber.. El antígeno detectó el 45% (9) y el 55% (33) de los sueros positivos y negativos respectivamente.. El gráfico 8 muestra el comportamiento de los. 40.

(56) diferentes sueros con respecto al punto de corte 0.216 y se observa una tasa de falsos positivos del 45% y una de falsos negativos del 55%.. Gráfico 8. Reactividad del antígeno de 24 kDa con los sueros de pacientes tuberculosos y sanos absorbidos con lisados de Escherichia coli.. 0,45 0,4. Absorbancia. 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0. 10. 20. 30. 40. 50. 60. 70. 80. No. muestra TBC(-). 6.7.2.. Condiciones. TBC(+). estandarizadas. PC. independientemente. por. titulaciones en bloque.. La prueba de ELISA indirecta determinó como positivos solo el 40% (10) de los pacientes verdaderos positivos y el. 76.8% (53) de los pacientes. verdaderamente negativos. En el gráfico 9 se observa la distribución de las absorbancias de cada suero a 450 nm y su comportamiento con respecto al punto de corte 0.186.. 41.

(57) Grafico 9. Reactividad del antigeno de 24 kDa con los sueros de pacientes tuberculosos y sanos absorbidos con lisados de Escherichia coli.. 0,7 0,6. absorbancia. 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0. 10. 20. 30. 40. 50. 60. 70. 80. 90. 100. No. muestra TBC (-). TBC(+). PC. 6.8. REACTIVIDAD DE LA MEZCLA DE LOS ANTIGENOS DE 10 Y 24 kDa CON. LOS. SUEROS. DE. PACIENTES. TUBERCULOSOS. Y. SANOS. ABSORBIDOS CON LISADOS DE Escherichia coli.. 6.8.1 Condiciones estandarizadas para los sueros sin absorber.. De los sueros catalogados como verdaderos positivos por el patrón de oro (clínica, baciloscopia, cultivo o Rayos x), el 65% (13) reaccionó con la mezcla de antígenos y de los sueros verdaderos negativos lo hizo el 35.2% (25).. Usándose como punto de corte 0.1705 se obtuvo un tasa de falsos. 42.

(58) negativos del 35%. En el gráfico 10 se observa el comportamiento de los sueros analizados por ELISA.. Gráfico 10. Reactividad de la mezcla de los antigénos de 10 y 24 kDa con los sueros de pacientes tuberculoos y sanos absorbidos con lisados de Escherichia coli.. 0,45 0,4. Absorbancia. 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0. 10. 20. 30. 40. 50. 60. 70. 80. 90. 100. No. muestra TBC (-). TBC (+). PC. 6.8.2. Condiciones estandarizadas independientemente.. Se determinó un punto de corte de 0.255 el cual logró discriminar como positivos al 65% (13). de los sueros pertenecientes a pacientes. tuberculosos y como negativos al 74.28% (52) de los sueros de pacientes clínicamente sanos. El gráfico 11 muestra el comportamiento de los sueros. 43.

(59) estudiados, se observa una tasa de falsos positivos del 25.7% y una de falsos negativos del 35%.. Gráfico 11. Reactividad de la mezcla de los antigénos de 10 y 24 kDa con los sueros de pacientes tuberculosos y sanos absorbidos con lisados de Escherichia coli.. 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0. 10. 20. 30. 40. 50. TBC (-). 60 TBC (+). 70. 80. 90. 100. PC. 6.9. DETERMINACIÓN DE LOS VALORES DE RENDIMIENTO OPERATIVO PARA CADA UNA DE LAS PRUEBAS.. Por medio del análisis de tablas tetracóricas (4x4) se determinaron los valores de Sensibilidad, Especificidad, Valor Predictivo Positivo y Valor Predictivo Negativo para cada una de las pruebas realizadas. muestra estos valores.. 44. La Tabla 3.

(60) Tabla 3. Valores de los rendimientos operativos para las distintas pruebas. Sensibilidad Especificidad 24 kDa sueros sin absorber 10 kDa sueros sin absorber mezcla 24 y 10 kDa sin absorber 24 kDa sueros Absorbidos con E.coli. 10 kDa sueros Absorbidos con E.coli. mezcla 24 y 10 kDa Absorbidos con E.coli. VPP. VPN. NFP. NFN. n. 62,5 %. 62.9%. 81.3%. 39.5%. 23. 9. 86. 50%. 71.42%. 33.3%. 81.97%. 20. 11. 92. 36.8%. 67%. 23%. 79.3%. 23. 12. 88. **40%. **76.8%. **16. **15. **94. 45%. 55%. 27. 11. 80. **65%. **65.7%. **7. **90. 70%. 65.7%. 24. 6. 90. **65%. **74.28%. **18. **7. 90. 65%. 64.2%. 25. 7. 90. **38.5% **77.9% 25%. 75%. **31.1% **86.79% **24 36.8%. 88.46%. **41.9% **88.1% 34.2%. 86.5%. ** Según titulación realizadas ignorando los resultados para los sueros sin absorber VPP: valor predicitivo positivo, VPN: Valor predicitivo negativo, NFP: Número de falsos positivos, NFN: Número de falsos negativos. n: número total de muestras analizadas.. 7. DISCUSIÓN DE RESULTADOS.. 45.

(61) 7.1.. REACTIVIDAD DE LA FRACCIÓN ANTIGENICA DE 24 kDa CON LOS SUEROS DE LOS PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS.. La prueba serológica con el antígeno de 24 kDa mostró sensibilidad y especificidad de aproximadamente 62%, esto lo hace útil como herramienta diagnóstica de la tuberculosis, su alto valor predictivo positivo (81.3%) demuestra que esta fracción antigénica detecta exitosamente los pacientes positivos lo cual es ventajoso para la confirmación de la enfermedad en casos complicados donde los métodos tradicionales de diagnóstico (baciloscopia, radiología) son inconcluyentes.. Por otro lado, los valores de sensibilidad y. especificidad sin ser muy altos son aceptables para la aplicación de una prueba de tamizaje en campo que permita determinar con cierta precisión la prevalencia de la enfermedad en lugares donde no se hace búsqueda activa de nuevos casos debido a la complicación que conlleva el diagnóstico tradicional. No se encontró correlación entre la reacción a PPD y la falsa positividad de algunos de los pacientes estudiados, es poco probable la presencia de reactividad cruzada con anticuerpos producidos por inmunización con BCG, debido a la alta especificidad de la fracción antigénica de 24 kDa (Oettinger y Andersen, 1994), sin embargo, en un país como el nuestro donde la TBC es endémica es altamente probable que muchos de los pacientes clínicamente sanos hayan tenido una primoinfección que no generó enfermedad activa pero que produjo algunos anticuerpos detectables por la prueba serológica. Además, aunque la pureza de la fracción se comprobó mediante electroforesis SDS –PAGE, está fracción puede contener otros péptidos que si pueden estar. 46.

(62) involucrados en reacciones cruzadas con la vacunación o incluso con otras infecciones bacterianas (ver discusión reactividad de la fracción antigénica de 24 kDa con los sueros absorbidos con E.coli).. En el caso de los falsos. negativos se observa que aproximadamente el 50% de estos se encontraban en tratamiento, aunque iniciándolo, es posible que el efecto de los medicamentos antituberculosos haya disminuido notablemente la carga bacilar y por ende la cantidad de antígenos micobacterianos en estos pacientes, resultando en una baja producción de anticuerpos.. Estos resultados son prometedores, en especial porque contrario a lo reportado previamente para antígenos de pesos moleculares similares (MPT64, MPT70) (Colangeli et al. 1999). los cuales presentan poca o ninguna. reactividad con los sueros de pacientes TBC (+) / VIH (+), en nuestra prueba esta fracción antigénica reaccionó con un buen número de pacientes positivos con diagnóstico de VIH.. 7.2.. REACTIVIDAD DE LA FRACCIÓN ANTIGENICA DE 10 kDa CON LOS SUEROS DE LOS PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS.. Como era de esperarse los antígenos de menor peso molecular evaluados con la fracción de 10 kDa son más específicos de la enfermedad tuberculosa por M. tuberculosis y por lo tanto en la técnica serológica sólo se presentó una tasa de falsos positivos de 28.5%,. esta técnica altamente. específica, al igual que la ELISA indirecta con la fracción antigénica de 24 kDa. 47.

(63) es útil para la confirmación de casos complicados con patrones de oro inconcluyentes o para pacientes que no pueden ser diagnosticados por los métodos tradicionales,. por ejemplo, niños o pacientes con SIDA que no. esputan o son por naturaleza paucibacilares. Sin embargo, en este caso la sensibilidad apenas alcanzó el 50% (11) de los casos positivos por lo cual no es adecuada para usarse como una técnica de tamizaje en campo, para un sondeo epidemiológico ya que en términos generales se estaría escapando el 50% de los casos positivos y se estimaría con un grado de error muy alto la prevalencia de la enfermedad en el país.. 7.3.. REACTIVIDAD DE LA MEZCLA DE ANTÍGENOS DE 24 kDa Y 10 kDa CON LOS SUEROS DE PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS.. Contrario a lo que se esperaría al usar mezclas de antígenos, la sensibilidad de la prueba no mejoró con respecto a lo encontrado para las fracciones individuales y en algunos casos pacientes con resultados positivos para alguno de los dos antígenos resultaron negativos al analizarlos con la mezcla, esto puede deberse a que la estructura espacial de los. epítopes. cambia cuando éstos se encuentran en presencia de otros epítopes antigénicos y de esta forma no se detectan una cantidad suficiente de anticuerpos, además puede existir competencia ente los diversos epítopes por la carga inmunológica del paciente resultando en bajos títulos de anticuerpos para las fracciones analizadas. La especificidad se mantuvo y en la mayoría de los casos los. 48.

(64) falsos positivos para alguna de las dos fracciones resultaron de nuevo positivos para la mezcla de las fracciones. Con base en estos resultados no parece útil usar la mezcla de estos dos antígenos para confirmar o descartar casos de tuberculosis, ya que no representa ninguna ventaja con relación a las pruebas individuales, de hecho es posible que sea de mayor utilidad realizar las pruebas individuales de manera simultanea con cada una de las fracciones para tener una mayor probabilidad de obtener un diagnóstico adecuado.. Es posible que una mezcla de más fracciones antigénicas de diferentes pesos moleculares, permita una prueba más sensible, sin embargo, es importante usar antígenos altamente específicos, ya que se conoce la alta reactividad cruzada con otras entidades bacterianas e incluso con infecciones micobacterianas no tuberculosas (Grange. 1984).. 7.4.. REACTIVIDAD DE LA FRACCIÓN ANTIGENICA DE 10 kDa CON LOS SUEROS DE PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS ABSORBIDOS CON LISADOS DE Escherichia coli.. No se encontró ningún aumento en la especificidad de la prueba al absorber los sueros con lisados de E. coli previamente, esto indica que los pacientes detectados como falsos positivos para esta fracción antigénica no presentaban en general reactividad cruzada por infecciones bacterianas de otro origen, esto no es sorprendente ya que los antígenos secretados de bajo peso. 49.