ACCIÓN ANTICANCEROSA SELECTIVA DE EXTRACTOS ETANÓLICOS
DE
Melia toosendan
Y TUSENDANINA PURA SOBRE CÉLULAS DE LA LÍNEA
CELULAR LEUCÉMICA S1T PORTADORA DEL VIRUS LINFOTRÓPICO
HU-MANO TIPO 1
SELECTIVE ANTICANCER ACTION OF ETHANOLIC EXTRACTS OF
Melia toosendan
AND
TO-OSENDANIN ON HUMAN ADULT T-CELL LEUKEMIA CELLS CARRYING HUMAN T-CELL
LYMPHOTROPIC VIRUS TYPE 1
Jesús Cabrera Moncayo1*, Paula Ordoñez Suárez2, Yoshito Eizuru3 1. Grupo de Investigación en Bioquímica y Estudios Genéticos BIOGEN, Departamento de Química,
Universidad de Nariño, Pasto, Colombia. [email protected].
2. División de Quimioterapia Antiviral, Centro de Enfermedades Virales Crónicas, Escuela de Ciencias
Médicas y Dentales, Universidad de Kagoshima. Kagoshima, Japón. [email protected].
3. División de Virus Oncogénicos Persistentes, Centro de Enfermedades Virales Crónicas, Escuela de
Ciencias Médicas y Dentales, Universidad de Kagoshima, Kagoshima Japón. [email protected]
Recibido: Marzo 2 de 2012 Aceptado: Junio 5 de 2012 *Correspondencia del autor: Departamento de Química, Universidad de Nariño, Calle 18 Carrera 50, Ciudadela Torobajo, Pasto, Colombia.
Teléfono: (092)7313062. Fax: (092)7311449. Correo electrónico: [email protected] o [email protected].
RESUMEN
La leucemia de células T del Adulto (ATL) es una patología causada por la infección con el Virus Linfotrópico Humano Tipo 1 (HTLV-1) y es resistente a la quimioterapia convencional. La tusendanina, un derivado triter-pénico aislado de la corteza de los frutos de Melia toosendan Sieb et Zucc, ha demostrado efecto inhibitorio del crecimiento de líneas celulares cancerosas mediado por procesos apoptóticos. En este estudio se investigó el efecto inhibitorio del crecimiento por parte de extractos etanólicos crudos de Melia toosendan y tusendani-na pura sobre la línea celular leucémica S1T portadora de HTLV-1. Los extractos etanólicos y la tusendanitusendani-na pura inhibieron significativamente el crecimiento celular de la línea S1T en forma dependiente de la dosis y del tiempo de exposición. Los valores de CC50 del extracto etanólico crudo y de la tusendanina pura en células
S1T fue de 4 μg/mL y 22 nM después de 72 horas de tratamiento respectivamente. Adicionalmente, la inhi-bición del crecimiento por tusendanina mostró alta selectividad contra células S1T comparada con tres líneas celulares no portadoras de HTLV-1 (MOLT-4, CEM y Jurkat) y células mononucleares de sangre periférica de individuos no infectados. Estos resultados indican que la tusendanina presenta un efecto inhibitorio selectivo del crecimiento de células leucémicas y permiten considerar al compuesto como un candidato promisorio que requiere posterior estudio en el desarrollo de estrategias terapéuticas para tratar pacientes con leucemia de células T del Adulto.
ABSTRACT
Adult T-cell leukemia (ATL) is a disease caused by human T-lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) infection and is resistant to conventional chemotherapy. Toosendanin, a triterpenoid derivative isolated from fruit barks of Melia toosendan Sieb et Zucc, has been used as an anthelmintic vermifuge against ascaris for more than fifty years, especially in China and has shown markedly antibotulismic effects in vivo and in vitro. Interes-tingly, toosendanin has also shown inhibition of cell growth in several human cancer cell lines by inducing apoptosis. In this study, we investigated the effects on growth inhibition by crude ethanolic extracts of Melia toosendan and pure toosendanin in the HTLV-1-carrying human ATL cell line S1T. Ethanolic extracts and pure toosendanin significantly inhibited cell growth of S1T cells in a time and dose dependent manner. CC50
values of the crude ethanolic extract and pure toosendanin in S1T cells was 4 μg/mL and 22 nM after 72 hours of treatment, respectively. In addition, growth inhibition by toosendanin showed high selectivity against S1T cells compared to three HTLV-1-negative cell lines (MOLT-4, CEM and Jurkat) and PBMCs from non-infected individuals. These results indicate that toosendanin had a selective effect on growth inhibition of ATL cells and is a promising candidate that requires further study in the development of therapeutic strategies to treat ATL patients.
Key words: Melia toosendan, ethanolic extract, toosendanin, HTLV-1, anticancer therapy, ATL, S1T
INTRODUCCIÓN
La leucemia de células T del Adulto (ATL) es una pato-logía causada por la infección de células T CD4+ con el virus linfotrópico humano tipo 1 (HTLV-1) y se estima que cerca de 20 millones de personas en el mundo son portadoras del virus (1,2). Otras patologías asociadas con la infección por HTLV-1 incluyen a la Parapare-sia Espástica Tropical/Mielopatía asociada al HTLV-1 (PET/MAH) y la Uveítis asociada al HTLV-1 (UAH). Aunque el desarrollo de la ATL presenta una baja fre-cuencia (2-6%) en los portadores de HTLV-1, su pro-nóstico es generalmente severo después del desarrollo de la ATL (2). Debido a que las células ATL son re-sistentes a la quimioterapia convencional, persiste una urgente necesidad de desarrollar nuevas estrategias te-rapéuticas para tratar los pacientes con ATL.
Varias partes de las plantas de la familia Meliaciae, es-pecialmente la corteza de los frutos, han sido utilizadas como antiparasitarias en el tracto digestivo de humanos y como insecticidas de uso agrícola en la China mile-naria. El derivado triterpénico tusendanina (C30H38O11, PM= 574 g/mol), es un producto natural encontrado como el componente principal presente en la corteza de los frutos de plantas de la familia Meliaceae especial-mente Melia toosendan o Melia azedarach (Figura 1).
El compuesto fue reportado inicialmente como posee-dor de actividad terapéutica antihelmíntica y con capa-cidad de inhibir la alimentación y desarrollo de insectos
en condiciones experimentales (3,4). Como consecuen-cia de tales evidenconsecuen-cias, el uso de tusendanina ha expe-rimentado un continuo incremento en el tratamiento de enfermedades parasitarias gastrointestinales y en la prevención y control de plagas agrícolas (5). La tusen-danina también ha mostrado efectos antibotulínicos in vivo e in vitro en ratones, monos y en ensayos clíni-cos (6-9). Entre otras propiedades de la tusendanina, se incluyen su elevada toxicidad intrínseca (10), su ac-ción mas destacada es como inhibidor del crecimiento celular e inductor de apoptosis en líneas celulares hu-manas cancerosas. Estudios previos demostraron que la tusendanina es capaz de inducir necrosis en líneas celulares de neuroblastoma NG108-15 y SK-N-SH en concentraciones del orden de 10−5 M (11). En con-centraciones más bajas (1-10 x10-7 M), la tusendanina
induce inicialmente diferenciación y luego apoptosis en la línea celular de feocromocitoma PC12 (12,13). El
efecto citotóxico de la tusendanina es más potente que el del compuesto anticanceroso etopósido (VP-16) en varias líneas celulares humanas cancerosas, efecto que se encuentra mediado por la detención del progreso del ciclo celular y por la inducción de apoptosis dependien-te de mitocondrias (14-16).
La línea celular S1T portadora de HTLV-1 fue previa-mente establecida a partir de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de un paciente con ATL (17). Esta línea celular contiene una sola copia integrada de la secuencia proviral del HTLV-1 verificada por análisis de transferencia de Southern y también ha sido utiliza-da como un modelo in vitro de ATL en varios estudios (comunicación personal de Naomichi Arima). En este estudio, se investigó los efectos sobre la inhibición del crecimiento por parte de un extracto etanólico de Melia toosendan y de tusendanina purificada en células S1T y su acción contra líneas celulares no portadoras de HTLV-1.
MATERIALES Y MÉTODOS
Extractos y compuestos. El extracto etanólico de la corteza de los frutos de Melia toosendan se obtuvo me-diante un protocolo de extracción estándar. Brevemen-te, se tomaron 5 g de corteza de los frutos y se sometió el producto a maceración con 125 mL de etanol al 95% durante 24 horas a 37ºC. El filtrado se liofilizó y el só-lido obtenido se redisolvió en etanol al 80% ajustando el volumen para una concentración final de 1 mg/mL y se guardó en alícuotas de 1 mL protegidas de la luz a -20ºC hasta su posterior utilización. La tusendanina fue aislada y purificada sometiendo el extracto etanó-lico a cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC) como se ha descrito previamente (18). El extracto eta-nólico se utilizó en concentraciones escalonadas hasta 100 µ/mL en todos los experimentos de inhibición. La tusendanina se recristalizó en etanol y se resuspendió en dimetilsulfóxido (DMSO) a una concentración final de 100 mg/mL (174.216 µM).
Células. La línea celular de células portadoras de HTLV-1 S1T fue establecida a partir de CMSPs pro-venientes de un paciente con ATL como se ha descri-to previamente (17). En los experimendescri-tos también se utilizaron las líneas celulares MOLT-4, CEM, y Jurkat, las cuales no son portadoras de HTLV-1. Todas las lí-neas celulares fueron mantenidas en medio RPMI 1640 (Wako, Osaka, Japón) suplementado con 20% de suero fetal bovino inactivado por calor (Gibco, NY, USA),
200 mg/mL de L-glutamina, 100 U/mL penicilina G, y 100 μg/mL de estreptomicina. Las CMSPs fueron donadas por portadores asintomáticos y voluntarios saludables en el hospital Universitario de Kagoshima bajo consentimiento informado. Las células se aislaron a partir de sangre heparinizada con Ficoll-Paque Plus (Pharmacia, Uppsala, Sweden) hasta obtener CMSPs. El diagnóstico de los portadores asintomáticos se basó en la presencia de anticuerpos séricos contra HTLV-1 y la inserción de ADN proviral en las células infecta-das. Todas las células, incluyendo las líneas celulares y CMSPs se cultivaron en una incubadora humidificada a 37oC en una atmósfera de 5% de CO2. En los
experi-mentos que excedieron las 96 horas de duración, se hizo realizaron cambios de medio de cultivo cada 2 o 3 días dependiendo de las condiciones de crecimiento celular.
Ensayos de inhibición del crecimiento celular. Las células S1T, MOLT-4, CEM y Jurkat fueron incubadas a una concentración 2 × 104 células/100 mL en
micro-placas de de 96 pozos en presencia de diferentes con-centraciones del extracto etanólico que variaron desde 0.01 hasta 100 μg/mL o con tusendanina purificada en concentraciones que cubrían el rango desde 10 hasta 100 nM. Las CMSPs se cultivaron bajo las mismas condiciones de las líneas celulares, pero partiendo de una cantidad dos veces mayor que aquellas (4 × 104
cé-lulas/100 mL). El número de células viables fue moni-toreado después de 24, 48, 72 o 96 horas de incubación a 37°C dependiendo del experimento, mediante el mé-todo colorimétrico del bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)- 2,5-difenil-2H-tetrazolio (MTT) (Takara, Shiga, Japón) (19, 20). Brevemente, se adicionaron 10 μl de la solución de MTT (1 mg/mL) al medio y las células se cultivaron durante dos horas adicionales a 37oC en una atmósfera con 5% de CO2. Después de esta incubación final las células se lisaron por adición de 100 μL de do-decil sulfato de sodio (SDS) al 20% y se mantuvieron en la oscuridad durante 2 horas a 37oC. La absorbancia específica se midió a 570 nm en un lector de micropla-cas BioRad®. Cada experimento se desarrolló en
cua-druplicado y con tres repeticiones. Las células control negativas se incubaron en medio sin extracto o sin tu-sendanina según el caso. Los valores de la concentra-ción citotóxica 50 (CC50), definida como la concentra-ción requerida para reducir el crecimiento celular en un 50% se estimaron mediante un análisis de regresión no lineal de las curvas de concentración/respuesta.
minutos y luego fueron resuspendidas con 1.5 mL de PBS de pH 7.0. 100 µL de esa suspensión se utilizaron para tinción con GIEMSA. Brevemente, 100 µL de la suspensión se sometieron a citocentrifugacón y las lá-minas fueron secadas a temperatura ambiente. Después de secarlas durante 10 minutos, las láminas se fijaron en metanol durante 5 minutos y nuevamente fueron se-cadas durante 5 minutos adicionales. Las láminas se colorearon colocando sobre ellas tres gotas de solución de tinción de GIEMSA (Merck chemicals, Australia) durante 5 minutos, tiempo después del cual se lavaron bajo agua de la llave y se les permitió secarse hasta que finalmente las láminas fueran observadas bajo el mi-croscopio. Las células restantes (de 1.4 mL) fueron uti-lizadas para extraerles el ADN utilizando el método es-tándar de Fenol-Cloroformo previamente descrito (21). En breve, las células resuspendidas se centrifugaron durante 10 min a 10000 x g y se resuspendieron nueva-mente en 200 µL de amortiguador TEN pH 8.0. Luego, se agregó sucesivamente 20 µL SDS al 10% y 10 µL of proteinasa K a 20 mg/mL. Se dejó digerir durante toda la noche a 37 oC y se extrajo el ADN sucesivamente con
500 µL fenol, 500 µL fenol-cloroformo 1:1, y 500 µL de cloroformo, con centrifugaciones a 5,000 x g durante 5 minutos cada vez. Finamente, el ADN se precipitó con etanol absoluto durante 1 hora a -80oC, luego se
centrifugó durante 15 minutos a 15,000 x g, y luego se lavó con etanol frio al 70% y se centrifugó finalmente durante 15 minutos a 15,000 x g. El ADN precipitado una vez seco a temperatura ambiente se resuspendió en buffer TRIS-EDTA (TE) de pH 8.0 para ser usado en los experimentos de PCR en tiempo real.
PCR en tiempo real. Para determinar las diferencias en el número de copias de provirus HTLV-1 después del tratamiento con tusendanina, las células se sembraron en placas de 12 pozos (2x105 células/3 mL) y se trataron
con tusendanina en concentraciones de 50 y 100 nM. Las células no tratadas se utilizaron como control nega-tivo. Después del tratamiento, el ADN fue extraído de las células como se describió anteriormente y con él se realizó los experimentos de PCR en tiempo real. Bre-vemente, el PCR cuantitativo en tiempo real (qRT-PCR) se realizó utilizando la mezcla maestra SYBR Green (Applied Biosystems, CA, USA) para el gen guar-dián HLA-DQα (VIC / MGB Probe, Primer Limited) (Applied Biosystems, CA, USA) como control endóge-no y el gen tax de HTLV-1 como blanco en un sistema de PCR en tiempo real ABI 7500 (Applied Biosystems, CA, USA), bajo las condiciones previamente descritas (22). Los cebadores utilizados fueron: HTV-F5
5`-CG-GATACCCIGTCTACGTGTTT y HTV-R4 CTGAGCI-GAIAACGCGTCCA-3` para el gen blanco y GH-26 5`-GTGCTGCAGGTGTAAACTTGTACCAG-3` y GH27 5`-CACGGATCCGGTAGCAGCGGTAGAG-TTG-3` para el gen endógeno. Los datos se analizaron utilizando SDS 2.2 (Applied Biosystems), y la expre-sión del ADN se normalizó con la del gen HLA DQα. Los datos de qRT-PCR para los controles se establecie-ron con un valor de 1 y la expresión del gen fue compa-rada con este valor. Todos los experimentos se realiza-ron por triplicado.
RESULTADOS
Inhibición del crecimiento de células S1T por ex-tracto etanólico de Melia Toosendan. El efecto inhi-bidor del extracto etanólico de Melia toosendan en el crecimiento de células de la línea S1T fue determinado por medición del porcentaje de células viables median-te el método colorimétrico de MTT. La acción del ex-tracto etanólico fue evaluada durante 1, 2 y 3 días de tratamiento en concentraciones crecientes ubicadas en el rango desde 0.01 hasta 100 μg/mL. Después de un periodo de incubación de 2 días, el extracto etanólico inhibió significativamente el crecimiento celular de las células S1T de manera dependiente de la concentración y del tiempo de acción (Figura 2A). La concentración del extracto etanólico requerida para reducir el creci-miento celular en un 50% (CC50) en células S1T fue de 4 µg/mL después de 3 días de tratamiento. En la figura 2B se muestran las curvas concentración/respuesta ante el extracto etanólico después de tres días de tratamiento.
Inhibición del crecimiento de células S1T por tusen-danina pura. El efecto de la tusendanina pura se eva-luó después de 1, 2 y 3 días de tratamiento a concentra-ciones crecientes desde 10 hasta 100 nM, utilizando el mismo ensayo colorimétrico de MTT como se describió previamente. Después de un periodo de incubación de 2 días, la tusendanina pura inhibió significativamente el crecimiento celular de células S1T de manera depen-diente del tiempo de acción y de la concentración utili-zada (Figura 3A). La CC50 para tusendanina pura sobre células S1T fue 22 nM después de 3 días de tratamiento. En la figura 3B se muestran las curvas concentración/ respuesta ante tusendanina pura después de 3 días de tratamiento.
eva-Figura 2. Efecto inhibitorio del crecimiento de células S1T inducido por el extracto etanólico de Melia toosendan. La viabilidad celular se cuantificó mediante el método de MTT y se expresó como porcentaje de las células control sin tratamiento. A. Efecto inhibitorio de diferentes concentraciones del extracto etanólico en células S1T. B. Curvas concentración/respuesta ante el extracto etanólico en células S1T después de 1, 2 y 3 días de exposición.
luaron utilizando tinción con GIEMSA. Las células se trataron con tusendanina por periodos desde 1 hasta 4 semanas. La presencia de características típicas apoptóticas, tales como condensación y desintegración nuclear, fueron observadas después de 1 semana de tratamiento y fueron más evidentes en periodos más largos de acción del compuesto (Figura 4).
Figura 4. Tinción GIEMSA de células S1T tratadas con tusendanina. Las células se trataron con tusendanina durante 1 a 4 semanas. Desde la primera semana se pueden ver células necróticas (flechas) en presencia de tu-sendanina 20 nM y en la segunda semana en presencia de tutu-sendanina 10 nM. A. células control sin tratamiento, B-E. células después de 1 hasta 4 semanas de tratamiento respectivamente, B1, C1, D1, E1. células tratadas con tusendanina 10 nM, B2, C2, D2, E2. células tratadas con tusendanina 20 nM.
A medida que transcurrió el tiempo de acción de la tusendanina en los experimentos se observó desinte-gración generalizada de las células y necrosis (Figura 4B-E). Por el contrario, las células control no tratadas mostraron una morfología normal (Figura 4A). Las células necróticas (señaladas con flechas) se pudieron observar desde la primera semana en presencia de una concentración 20 nM de tusendanina y en la segunda semana en presencia de una concentración 10 nM del compuesto (Figura 4, B2 y C1).
Inhibición del crecimiento de de CMSPs por acción de tusendanina pura. El efecto inhibidor del crecimien-to de CMSPs por acción de diferentes concentraciones de tusendanina se evaluó en células S1T y CMSPs no infectados (Figura 5). Los CMSPs obtenidos de un do-nante sano se sometieron a acción de un tratamiento con tusendanina durante 96 horas y paralelamente se utili-zaron células S1T como control. A pesar de observarse una reducción del 40% en la viabilidad celular de los CMSPs después de un tratamiento con tusendanina 10 nM, este valor se mantuvo constante a concentraciones hasta de 50 nM (Figura 5A, barras grises) y solo des-pués de un tratamiento de 100 nM de tusendanina, la viabilidad disminuyó hasta un 20%.
Las células S1T, por su parte, disminuyeron su viabi-lidad hasta un 5% después de un tratamiento con tu-sendanina 30 nM (Figura 5A, barras negras). A pesar
del crecimiento diferencial de las células S1T y CMSPs, una mayor disminución en la viabilidad celular fue ob-servada en células S1T cuando se comparan con las CMSPs normales. En la figura 5B se muestran las cur-vas concentración/respuesta ante tusendanina en células S1T y CMSPs normales.
Inhibición del crecimiento celular de células S1T y CMSPs de un portador asintomático de HTLV-1 por acción de tusendanina. El efecto inhibitorio del creci-miento celular a diferentes concentraciones de tusenda-nina también fue evaluado en células S1T y CMSPs de un portador de HTLV-1 asintomático (Figura 6). Los CMSPs obtenidos a partir de un portador de HTLV-1 asintomático se sometieron al tratamiento con tusenda-nina durante 72 horas. Durante los experimentos, las células S1T fueron usadas de forma paralela como con-trol. Aunque se observó una disminución en la viabili-dad celular tanto en células S1T como CMSPs, esta fue más evidente en las células S1T que en las CMSPs del portador asintomático (figura 6A).
Figura 5. Efecto inhibitorio del crecimiento de células S1T y CMSPs normales por acción de tusendanina purificada. La viabilidad celular se cuantificó mediante el método de MTT y se expresó como porcentaje de las células control sin tratamiento. A. Efecto inhibitorio de diferentes concentraciones de tusendanina en células S1T y CMSPs normales. B. Curvas concentración/respuesta ante tusendanina pura en células S1T y CMSPs normales después de un tratamiento por 96 horas.
Expresión del gen HL DQα en células S1T y CMSPs normales tratados con tusendanina. Las células via-bles S1T y CMSPs fueron colectadas después del tra-tamiento con tusendanina por 96 horas. La figura 7 muestra el efecto comparativo de dos diferentes con-centraciones de tusendanina por cuantificación relativa del gen HL DQα por PCR en tiempo real determinando el porcentaje de expresión del gen HL DQα en células S1T y CMSPs normales después del tratamiento con tu-sendanina en concentraciones de 50 y 100 nM (Figura 7A).
El efecto citotóxico de tusendanina es claramente ma-yor en células S1T que en células CMSPs normales. Nótese que la tusendanina en una concentración 50 nM disminuyó la expresión génica en un 80% en células S1T mientras que en CMSPs normales no se observó una disminución detectable en la expresión del gen. Después de un tratamiento con tusendanina en una con-centración 100 nM durante 96 horas, las CMSPs nor-males aun conservaron un 80% de su expresión génica mientras las células S1T fueron casi totalmente extintas. La figura 7B también muestra las curvas concentración/ respuesta para la expresión del gen HL DQα en células S1T y CMSPs normales después de un tratamiento con tusendanina en concentraciones de 50 y 100 nM (Figura 7B).
Efecto de la tusendanina pura en el crecimiento de células S1T y de 3 líneas celulares T no portadoras de HTLV-1. Finalmente, se evaluó el efecto inhibito-rio de la tusendanina pura en el crecimiento de células S1T y de 3 líneas celulares no portadoras de HTLV-1 después de 72 horas de tratamiento. En la figura 8 se pueden observar las curvas concentración/respuesta después del tratamientos con tusendanina en concen-traciones de 50 y 100 nM.
La inhibición del crecimiento por acción de la tusenda-nina mostró alta selectividad contra células S1T si se la compara con la observada en las 3 líneas celulares no infectadas con HTLV-1 (Jurkat, CEM and MOLT-4). Después de 72 horas de tratamiento, la viabilidad celular de las líneas celulares no portadoras de HTLV-1 no disminuyó más allá del 60% aun cuando la concen-tración de tusendanina fuera la máxima utilizada de 100 nM. La tusendanina mostró un valor de CC50 de 20 nM en células S1T, mientras los valores de CC50 en las tres líneas celulares no portadoras de HTLV-1 no pudo de-terminarse con las concentraciones examinadas.
DISCUSIÓN
Después de de 35 años de la descripción inicial de la ATL como una nueva entidad clínica, esta enfermedad aún continúa teniendo un pronóstico muy pobre, con una supervivencia media de 12 meses en pacientes japo-neses y europeos (23-26). Esta situación contrasta con la vasta acumulación del conocimiento sobre la biología molecular y la oncogénesis de la ATL logradas hasta la fecha (27-30). Con el propósito de investigar nuevos agentes terapéuticos que tengan como blanco a las célu-las T leucémicas, en el presente estudio se investigó el efecto del compuesto natural tusendanina sobre la inhi-bición del crecimiento de las células pertenecientes a la línea de células S1T portadoras de HTLV-1.
Estudios previos indicaron que varios compuestos ex-traídos a partir de plantas de la familia Meliaceae, entre los que se encuentra la tusendanina, suprimen la proli-feración de células cancerosas (10-16, 31). El presente estudio demostró que el extracto etanólico de Melia to-osendan es capaz de suprimir significativamente la pro-liferación de las células S1T a bajas concentraciones de una manera dependiente del tiempo de exposición y de la concentración del extracto. Un efecto similar, pero mucho más pronunciado se obtuvo con la tusendanina purificada, la cual actuó suprimiendo la proliferación de células S1T en concentraciones ubicadas dentro del ran-go nanomolar. La acción continuada de la tusendanina, como se evidenció mediante la tinción con GIEMSA, produjo encogimiento celular, desintegración y necro-sis, procesos probablemente mediados por mecanismos apoptóticos. La ultima presunción puede ser deducida de la observación de la figuras 2 y 3, donde el efecto citotóxico de la tusendanina puede ser visto solamente a partir del segundo día de exposición, tiempo necesa-rio para que un proceso apoptótico pueda evolucionar hasta un estado necrótico de las células tratadas. Este efecto apoptótico de la tusendanina seguido por la ci-totoxicidad observada en el presente trabajo puede corroborar varios studios que han propuesto que la ne-crosis inducida por tusendanina en células NGC108-15 y SK-N-SH está precedida por procesos apoptóticos (12,13,32). Tambien en el mismo sentido, varios auto-res han propuesto que este proceso apoptótico se instau-ra a tinstau-ravés de mecanismos que incluyen rutas mediadas por mitocondrias en varias líneas celulares cancerosas (12,15,33,34).
Figura 7. Expresión del gen HL DQα en células S1T y CMSPs tratadas con tusendanina durante 96 horas. Lue-go el ADN fue extraído y el gen HL DQα fue amplificado por PCR en tiempo real. A. Porcentaje de expresión como cuantificación relativa (CR) del gen HL Dqα en células S1T y CMSPs normales tras un tratamiento con tusendanina 50 y 100 nM. B. Curvas concentración/respuesta para la expresión del gen HL DQα en células S1T y CMSPs normales tras tratamientos con tusendanina 50 y 100 nM.
encuentra esclarecido, estudios previos si han demos-trado que la tusendanina incrementa la conductancia de las membranas al ión Ca2+ y han evidenciado el influjo de Ca2+ hacia las células de la línea NG108-15 (35-37). La tusendanina también ha exhibido un efecto de incre-mento de la concentración del calcio libre intracelular tanto en células NG108-15 (38) como en células croma-fines (39). Se sugiere que el efecto apoptótico inducido por tusendanina puede encontrarse ligado con el con-tinuo incremento de calcio intracelular que conduce a una sobrecarga de este ión en este compartimiento (12). Otro estudio desarrollado en células PC12 ha mostrado que la tusendanina causa la liberación de citocromo c desde la mitocondria hacia el compartimiento citosólico generando activación de la cascada de caspasas, indi-cando que un mecanismo dependiente de mitocondrias sería el responsable del proceso apoptótico inducido por tusendanina (33)
El efecto altamente citotóxico de la tusendanina obser-vado sobre células S1T parece ser selectivo para células ATL como se pudo evidenciar porque el compuesto no fue tan activo contra CMSPs tanto de donantes salu-dables como de un portador asintomático. Compara-tivamente, el efecto citotóxico de la tusendanina fue más alto en el portador asintomático que en las CMSPs normales. Para confirmar este hallazgo, se examinó el efecto de la tusendanina en la proliferación de las líneas celulares derivadas de células T CEM, Jurkat, y MOLT-4 que no son portadoras de HTLV-1. Los resultados mostraron una vez más un efecto citotóxico selectivo de la tusendanina sobre la línea celular portadora de HTLV-1 SHTLV-1T. Este efecto citotóxico selectivo en células positi-vas para HTLV-1 indica que la infección de las mismas podría ser un factor predisponente que hace a las células más susceptibles a la acción de la tusendanina. Este ha-llazgo de la toxicidad selectiva de la tusendanina contra células infectadas con HTLV-1 es la primera evidencia encontrada hasta el momento y no existen reportes en la literatura que exploren tal clase de relación. Con el propósito de extender estos resultados, el grupo se en-cuentra examinando la actividad de la tusendanina en CMSPs de pacientes con ATL y portadores de HTLV-1 asintomáticos mediante la determinación del número de copias de células infectadas prolongando el tiempo de exposición a la tusendanina por periodos superiores a las 72 horas.
En resumen, el presente estudio mostró el efecto cito-tóxico del extracto de Melia toosendan y de la tusenda-nina purificada en células leucémicas de la línea S1T.
En particular, la tusendanina mostró actividad antican-cerosa como fue demostrado previamente en otras líneas celulares cancerosas, contra células derivadas de ATL. Estos resultados indican que la tusendanina tiene un efecto selectivo sobre la inhibición del crecimiento de células ATL y es un candidato promisorio que requiere ser estudiado más a fondo en el propósito de desarrollar estrategias terapéuticas para tratar pacientes con ATL de mayor eficacia que las actualmente existentes.
Agradecimientos
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