CARACTERIZACIÓN Y SUSCEPTIBILIDAD A INFECCIONES CON ARBOVIRUS
JAIME ARTURO RODRÍGUEZ GUZMÁN
Director
Felio Jesús Bello García M.Sc.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS MAESTRIA EN BIOLOGIA
BOGOTA, D.C. 2001
CARACTERIZACIÓN Y SUSCEPTIBILIDAD A INFECCIONES CON ARBOVIRUS
JAIME ARTURO RODRÍGUEZ GUZMÁN
Trabajo de Grado presentado como requisito parcial para optar al título de Magister en Biología
Director
Felio Jesús Bello García M.Sc. Biología
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
MAESTRIA EN BIOLOGIA BOGOTA, D.C.
CARACTERIZACIÓN Y SUSCEPTIBILIDAD A INFECCIONES CON ARBOVIRUS
JAIME ARTURO RODRIGUEZ GUZMAN
Carlos Corredor P. Ph. D. Luis Alejandro Barrera Ph. D. Decano Facultad De Ciencias Director Programa de Posgrado
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS MAESTRIA EN BIOLOGIA
BOGOTA, D.C. 2001
Felio Bello García M. Sc. Director Tesis
Manuel Ruiz García Ph. D. Jurado
Alberto Morales M. Sc. Jurado
María Teresa Palau Ph. D. Jurado
A la Universidad De La Salle, al Instituto Nacional de Salud y a Colciencias por el apoyo financiero brindado.
Al doctor Felio Jesús Bello García, Investigador, por la confianza y el apoyo recibido.
Al doctor Robert Tesh de la Universidad de Texas, por la donación de los virus y los antisueros empleados.
Al doctor Víctor Alberto Olano por la asesoría en la parte entomológica y el apoyo incondicional recibido.
A las Doctoras Gloria Rey y Martha González por la asesoría y apoyo en el estudio de infecciones virales efectuadas con la presente línea celular.
A todas aquellas personas que directa o indirectamente colaboraron para la culminación de este trabajo de investigación.
ARTÍCULO 23 DE LA RESOLUCIÓN No. 13 DE JULIO DE 1996:
“ LA UNIVERSIDAD NO SE HACE RESPONSABLE POR LOS
CONCEPTOS EMITIDOS POR LOS ALUMNOS EN SUS TESIS
1. RESUMEN... 1
2. INTRODUCCIÓN... 2
3. MARCO TEÓRICO... 7
3.1 Biología General y Descripción Morfológica... 7
3.2 Taxonomía... 11
3.3 Bionomía... 12
3.4 Distribución del mosquito Psorophora confinnis... 15
3.5 Capacidad vs. Competencia vectorial... 17
3.6 Encefalitis Equina Venezolana (EEV)... 17
3.7 Líneas celulares... 22
3.7.1 Caracterización Bioquímica... 24
3.7.1.1 Electroforesis... 24
3.7.1.2 Técnicas de electroforesis en acetato de celulosa y otros substratos... 25
3.7.2 Inmunofluorescencia... 27
4. METODOLOGÍA... 29
4.1 Establecimiento de la línea celular... 29
4.1.1 Obtención y limpieza del material biológico... 29
4.1.2 Obtención de cultivos primarios... 31
4.1.3 Características de crecimiento... 31
4.1.4 Obtención de subcultivos... 32
4.2 Caracterización de la línea celular... 32
4.2.1 Caracterización morfológica... 32
4.2.2 Caracterización citogenética... 33
4.2.3 Caracterización isoenzimática... 34
5. RESULTADOS... 37
5.1 Establecimiento de la línea celular... 37
5.1.1 Iniciación de cultivos primarios... 37
5.1.2 Obtención de subcultivos... 41
5.2 Caracterización de la línea celular... 43
5.2.1 Caracterización morfológica... 43
5.2.2 Caracterización citogenética... 45
5.2.3 Caracterización isoenzimática... 50
5.3 Susceptibilidad de la línea celular a infecciónes con arbovirus………... 55
6. DISCUSIÓN... 57
7. CONCLUSIONES... 64
Fig 2. Macrofotografía de una pupa de Psorophora confinnis...9
Fig 3. Macrofotografía de una larva de Psorophora confinnis...10
Fig 4. Macrofotografía de huevos en gasa de Psorophora confinnis...11
Fig 5.Distribución del mosquito Psorophora confinnis en América... ...15
Fig 6.Distribución del mosquito Psorophora confinnis en Colombia...16
Fig 7.Distribución del virus de la Encefalitis Equina Venezolana en América... 21
Fig 8. Fragmentos larvalesdisgregados adheridos a la superficie del frasco... 39
Fig 9. Vesículas presentes en cultivo celular... ...40
Fig 10. Monocapa semi-confluente con formas celulares diversas...44
Fig 11. Curva de crecimiento exponencial de la línea celular...44
Fig 12. Fotografía de un cariotipo de la línea celular con 6 cromosomas...46
Fig 13. Idiograma del cariotipo de la línea celular Ps. confinnis...46
Fig 14. Fotografía de una poliploidia de la línea celular con 12 cromosomas...47
Fig 15. Fotografía de una aneuploidia de la línea celular con 2 cromosomas...47
Fig 16. Fotografía de Bandeamiento C aplicado a la línea celular...48
Fig 17. Fotografía de Bandas G aplicado a la línea celular...49
Fig 18. Idiograma correspondiente a los patrones de bandas G para la línea células de Ps. confinnis...50
Fig 19. Comparación electroforética In vivo vs In vitro para el Sistema PGM...51
Fig 20. Comparación electroforética In vivo vs In vitro para el Sistema PGI...52
Fig 21. Comparación electroforética In vivo vs In vitro para el Sistema 6-PGDH...53
Tabla 1. Clasificación de los virus utilizados en las infecciones de la línea celular...36
Tabla 2. Promedio de las mediciones cromosómicas de la línea celular...45
Tabla 3. Clasificación cariotípica de la línea celular de acuerdo con tres autores...48
Tabla 4. Porcentaje de la región centromérica para cada par cromosómico...48
Tabla 5. Promedio de bandas G presentes en los cromosomas de la línea celular...49
Una nueva línea celular, PC-0199-BR, fue establecida a partir de huevos embrionados del mosquito Psorophora (Grabhamia) confinnis, (82), con un registro hasta la fecha, noviembre, 2000, de 72 pases; siendo ésta la primera publicación de una línea celular de este mosquito, eficiente vector del virus de la Encefalitis Equina Venezolana (EEV).
Fueron necesarios 8 meses para la obtención de la primera monocapa confluente en el medio de cultivo MM/VP12, sin embargo, los subcultivos se desarrollaron sin atmósfera de CO2 en los medios de cultivo GRACE y L-15 con un pH de 6.3-6.8,
ambos suplementados con una concentración inicial del 20 % de Suero Fetal Bovino (SFB) y reducida gradualmente en los siguientes pases hasta alcanzar el 10%, a 28ºC.
La morfología celular en los cultivos primarios fue heterogénea, pero en la línea celular establecida se presentó una forma celular mayoritariamente de tipo epitelioide.
Se realizó una caracterización citogenética de la línea celular, identificándose en el cariotipo un número diploide de 6 cromosomas (2n=6), siendo el primer par metacéntrico y de menor tamaño, los pares 2 y 3 fueron ligeramente submetacéntricos y de mayor longitud, sin embargo, se presentaron anormalidades cromosómicas
numéricas en menor proporción. Se determinaron los patrones de bandas C y G para diferentes metafases cromosómicas.
En la caracterización bioquímica se determinaron los perfiles isoenzimáticos de la línea celular, al trabajar con 4 sistemas diferentes: PGM, PGI, ICDH y 6-PGDH, los cuales coincidieron con las muestras de adultos y pupas de la especie y a su vez fueron diferentes estos resultados con los obtenidos de una línea celular de Anopheles albimanus utilizada como control. No hubo evidencias de contaminación de los cultivos celulares con bacterias, hongos y micoplasma.
La susceptibilidad de la línea celular a la infección con diferentes arbovirus fue positiva demostrando que se puede utilizar como soporte importante para estudios de aislamiento e identificación de algunos arbovirus.
Psorophora confinnis es un eficiente vector del virus de la Encefalitis Equina Venezolana (EEV), tipo epidemo-epizoótico (1), presenta una amplia distribución en el continente americano y en Colombia (3).
La importancia de algunos insectos, y en especial la de los mosquitos, por ser considerados eficientes vectores de enfermedades que afectan al hombre y a los animales, ha justificado la necesidad de llevar a cabo investigaciones relacionadas con taxonomía, ecología, genética, bionomía, competencia y capacidad vectorial, entre otras, que permitan obtener un conocimiento más profundo de ellos, y lograr, en condiciones naturales, su control integral y por consiguiente, controlar las epidemias y endemias que estos insectos ocasionan.
Las hembras adultas de Psorophora confinnis que son hematófagas, permanecen abrigadas en la vegetación herbácea rastrera, a poca altura del suelo, de donde salen para alimentarse del hombre o los animales. Su actividad predominante es crepuscular y nocturna, inclusive durante las horas del día pero en lugares de luminosidad disminuida. La hematofagia es ejercida sobre gran variedad de hospederos de sangre caliente, especialmente bovinos, suídos, equinos y humanos (4).
Las primeras investigaciones sobre cultivos de tejidos fueron realizadas por Harrison en 1907 (5) y Carrel en 1912 (6), quienes idearon el método como una nueva herramienta para estudiar el comportamiento de células animales libres de
variaciones. A partir de los años 50 se comenzó a emplear la técnica de cultivos de células que sustituyó a los tejidos, para estudios de identidad genética, comparación entre poblaciones, crecimiento de varios tipos de virus, aislamiento de mutantes, preparación de antígenos (7), (8), (9), (10), (11) y como co-cultivos para estudios de parásitos (12), (13), (14), no obstante, en los últimos años, el uso de técnicas moleculares para estudiar la expresión de genes celulares y virales en células cultivadas ha estimulado el interés de las líneas celulares de insectos en investigaciones fisiológicas, bioquímicas y genéticas (14), (15), (16), (17), (18). A mediados del siglo XX, fueron derivándose trabajos en cultivos celulares de mosquitos de interés en medicina y veterinaria. En la iniciación de estos cultivos, varios investigadores (19), (20), (21), (22), trabajaron muchos años antes que Grace (23), quien en 1966 logró crecimiento celular continuo al establecer la primera línea celular de mosquitos utilizando larvas de Aedes aegypti. A partir de entonces se han elaborado y modificado diferentes técnicas para la obtención de líneas celulares de crecimiento continuo, que en términos generales se inician a partir de explantes de tejidos embrionarios, larvales o de ovarios de adultos, cuyas células después de frecuentes pases o subcultivos se van transformando hasta lograr una persistencia indefinida, lo cual caracteriza a una línea celular de crecimiento continuo (24), (25). Entre los trabajos más relevantes, mencionamos a Singh en 1967 (26), quien estableció una línea celular de Aedes albopictus; más tarde Singh y Baht en 1969 (27), obtuvieron cultivos primarios derivados de células embrionarias de Anopheles stephensi; sin embargo, no lograron el crecimiento continuo In Vitro de las células. Varma y Pudney en 1969 (28) también trabajaron con larvas de Aedes aegypti.
Schneider en 1969 (29) establece una línea celular de Anopheles stephensi, que más tarde, otros investigadores trabajando con la misma especie lograron crecimiento celular continuo. En 1978, Cahoon (30) estableció la línea celular de Aedes dorsalis. Para el mismo año, Lynn y Hink (31) efectuaron un análisis del ciclo celular de la línea (TN-368) en Trichoplusia por medio de porcentaje de metafases y autoradiografía, sincronizando la línea celular con timidina, en la cual se obtuvo un tiempo total del ciclo de 14.5 horas y un gran número de células especialmente en las fases S y G2. En 1984 Rowley y colaboradores (32), establecieron la línea celular de Aedes triseriatus, del mismo modo que Oro (33) estableció la línea celular de Haemagogus equinus. En 1990 Oelofsen, M. J. y colaboradores (34) establecieron una línea celular de Culex theileri.
Recientemente el interés despertado por las líneas celulares de mosquitos y su aplicabilidad con el estudio de organismos patógenos determina que en otras especies se hayan desarrollado trabajos similares, entre los que se mencionan: Toxorhynchites amboinensis establecida por Tesh en 1980 (35), Aedes taeniorhynchus y Anopheles albimanus establecidas por Bello et al., en 1995 y 1996 respectivamente (36), (37), y Rey en 2000 (38).
La utilización de los cultivos celulares de mosquitos ha permitido examinar la susceptibilidad a la infección con diferentes arbovirus, en el control de pestes en el sector médico y agrícola, también ha estimulado los estudios de toxicidad y virología en los insectos (39). De importancia significativa es la aplicabilidad epidemiológica y el diagnóstico viral que ofrecen las líneas celulares de mosquitos, en lo referente al
aislamiento de virus, preparación de antígenos, atenuación de la infección viral y expresión génica (40), (41), (42), (43).
En el presente trabajo se describe, por primera vez, una línea celular derivada del mosquito Psorophora confinnis a partir de huevos embrionados. Una vez establecida la línea celular se realizaron estudios de caracterización con base en patrones morfológicos, de crecimiento, citogenéticos, isoenzimáticos y también, se determinó la susceptibilidad de los cultivos celulares a infecciones con algunos arbovirus.
3.1 Biología General y Descripción Morfológica
Los Culicidae, familia a la que pertenece el mosquito Psorophora confinnis, presentan metamorfosis completa en su ciclo evolutivo. Pasan por las fases de huevo, larva, pupa y adulto. Entre la primera y la última ocurren cuatro estadíos larvales y uno pupal. La apariencia general de esta familia es la de insectos pequeños (alrededor de 0.5 cm de envergadura), de porte delgado, y patas largas; los machos son generalmente de menor tamaño que las hembras (44).
3.1.1 ADULTO. En la parte anterior de la cabeza se encuentran las antenas, constituidas por segmentos que en las hembras son más angostos, más largos que anchos y casi todos aproximadamente de la misma longitud; en los machos, los 11 primeros segmentos son cortos y cada uno lleva una arista que sirve de implantación a un mechón de pelos largos y numerosos, cosa que hace diferenciar a los machos de las hembras, ya que en éstas los pelos son cortos y pocos (44) (Fig. 1).
El aparato bucal de los machos es incapaz de perforar la piel de los animales, por lo tanto no son hematófagos. Estos se alimentan fundamentalmente de la sabia de las plantas, néctar y agua (2).
Figura 1. Macrofotografía de una hembra de Psorophora confinnis. Realizada por Jaime Rodríguez
La probóscide es oscura en la base y en el ápice y con un área mediana amarilla; un poco mas larga que el fémur anterior. Extremidad de los palpos y el torus antenal con escamas blancas; en el occipucio se observan escamas estrechas, dentadas, de tonalidad blanca a violeta pálido, también tiene escamas oscuras horquilladas (2).
El tegumento torácico es oscuro y el mesonoto está recubierto de escamas estrechas y curvas, oscuras en su mayoría excepto por un pequeño grupo de elementos blanquecinos de reflejos violáceo a blanco situados abajo del ángulo humeral, raíz alar, depresión pre-escutelar, tales elementos ocupan también los lóbulos del escutelo (2).
Posee escamas alares claras y oscuras mezcladas en la cara externa, anillos subapicales y apicales claros, tarsos con tarsómeros y anillos claros excepto en el V anterior y medio que puede ser totalmente oscuro. El tarsómero I también tiene un anillo mediano blanco. El abdomen posee tergitos oscuros con áreas medianas claras apicales, esternitos claros, oscuros y cersi también oscuros. (2).
3.1.2 PUPA. Presenta una forma de “coma”, distinguiéndose dos partes esenciales: el cefalotórax y el abdomen. La nueva forma y la posición que tiene en la superficie del agua le evita el uso de espiráculos mesotorácicos. Durante el estadío de pupa, ciertos órganos desaparecen, como los canales de alimentación y el órgano adulto, que está constituido de células embrionarias no diferenciadas (2). (Fig. 2.)
Figura 2. Macrofotografía de una pupa de Psorophora confinnis Realizada por Jaime Rodríguez
3.1.3 LARVA. Posee antenas espiculosas, algo mas cortas que la cabeza y tufo antenal múltiple. El peine del octavo segmento abdominal está constituido por 6 espinas aserradas con un diente central largo. Además el sifón respiratorio es equivalente a 3 veces el ancho de su base, dilatándose en su parte media y con un tubo sifonal único, triple o múltiple en el tercio distal y alejado del pecten, el cual presenta de 4 a 5 espinas dentadas en la base y a veces a ambos lados. Tiene un segmento anal con la silla de montar perforada ventralmente, con una brocha ventral con 2 cerdas (múltiple o simple), y branquias largas (2) (Fig. 3).
Figura 3. Macrofotografía de una larva de Psorophora confinnis Realizada por Jaime Rodríguez
3.1.4 HUEVO. Presenta forma circular, de contorno elíptico, oval, alargado o cilíndrico y color negro. Cada huevo está protegido por un caparazón. En la parte
superficial presentan pequeñas espinas. El huevo presenta dos partes esenciales: el exocorion, capa externa y el endocorion capa interna. Estos carecen de movilidad y están sujetos a la variación del medio ambiente (2) (Fig. 4).
Figura 4. Macrofotografía de huevos en gasa de Psorophora confinnis Realizada por Jaime Rodríguez
3.2 Taxonomía
El Phylum Arthropoda agrupa a los insectos que presentan simetría bilateral, cuerpo segmentado, exoesqueleto quitinoso y articulaciones móviles en algunos de sus segmentos (44).
El mosquito Psorophora confinnis pertenece a la clase Insecta, al orden Díptera y a la familia Culicidae. La clase Insecta, se caracteriza porque el cuerpo está constituido por una serie de segmentos transversos dispuestos en tres regiones distintas: cabeza, tórax y abdomen, poseen un par de antenas; llevan uno o dos pares de alas, o carecen de ellas; los órganos de reproducción están situados en los últimos segmentos
abdominales y tienen tres pares de patas. El orden Díptera lo forman todos los insectos con dos alas transparentes y bien desarrolladas, que nacen en el mesotórax; las posteriores son rudimentarias y están representadas por dos estructuras en forma de balancines, éstos están claramente presentes en todos los dípteros aún cuando las alas anteriores o mesotoráxicas estén ausentes (44).
3.3 Bionomía
Los criaderos preferenciales de desarrollo larvario de esta especie se encuentran en zonas arroceras, prados, pastos y depresiones donde se acumula temporalmente el agua lluvia o las que provienen de las inundaciones e irrigaciones para fines agrícolas. Sin embargo, aprovechan sitios de cría naturales y artificiales dotados de características apropiadas para el desarrollo de las larvas y pupas. En general bien soleados y con vegetación rastrera. Las hembras son atraídas para la postura en sitios con contenido de humedad arriba del 70% y no inferior al 45%. Los huevos son depositados en depresiones húmedas del terreno. La pupación y la emergencia de los adultos, obedece a cierto ritmo diario, influyendo principalmente las condiciones de temperatura y del agua (2).
Las hembras de esa especie son voraces y persistentes en la ingesta de sangre. El proceso de picar no es exclusivo durante la noche, también se da a plena luz del día; se muestran activas tanto de día como de noche, aunque su prevalencia se da en hora crepuscular. Esta actividad es ejercida a poca altura del suelo, no pasando algunos
metros de ese nivel y con escasa tendencia para frecuentar el domicilio humano. Este mosquito parece no poseer especial predilección por determinados hospederos. Se alimenta indistintamente del hombre y de los animales, dependiendo de la oportunidad que se le presente para ejercer la hematofágia (44).
El desarrollo larval es rápido, gastando no mas de 4 a 6 días en épocas favorables. Los adultos recién salidos de las pupas, reposan en la vegetación a no mas de 30 cm de altura. Allí permanecen gran parte de su vida, saliendo las hembras prontamente para atacar a los hospederos que se aproximan. Las migraciones se inician en una plantación de arroz y se dirigen a otra. En lo que concierne a la dirección de vuelo, influye el viento y en su ausencia se orientan en el sentido de la puesta del sol (44).
El comportamiento sexual parece estar en dependencia a la madurez de los machos. Estando éstos en periodo adulto y en número suficiente, la cópula puede ocurrir antes y durante el vuelo. La cópula de los mosquitos parece estar frecuentemente asociado con el llamado vuelo o danza nupcial o también enjambre de los machos. Este fenómeno consiste especialmente en un conjunto de individuos masculinos volando en círculos a variable altura. Las hembras penetran en el enjambre y de allí logran aparearse. La cópula dura generalmente un minuto o un poco más. El número de machos que toma parte en esta danza, varía desde unos pocos hasta millares (2).
La alimentación de los adultos en la fase que precede a la migración la obtienen sobre jugos vegetales y néctar de flores, desde que estén disponibles; en ese caso, la
ingestión de hidratos de carbono influye poderosamente sobre el vigor del vuelo y por tanto, sobre el alcance del movimiento migratorio (44).
La mayoría de los moquitos ingieren sangre y este hábito, como se sabe, es estricto de los individuos de sexo femenino; picando animales de sangre caliente. Algunos mosquitos pican gran número de animales, y otros parecen tener esa capacidad limitada a pocas o a una única especie. Este último aspecto lleva al Culicidae a adquirir hábitos de estrecha asociación con el hospedero. De esa manera, el mosquito se torna doméstico y antropofílico, cuando “prefiere” picar al hombre, por eso vive en el medio constantemente habitado por él. En caso contrario la especie es mencionada como extradomiciliar y zoófila (que pica animales y no tiende a frecuentar el domicilio humano) (2).
La máxima cantidad de sangre ingerida por un mosquito en una sola toma, equivale generalmente a 2 veces su propio peso. El acto de alimentación además de satisfacer una necesidad de vida, es en los mosquitos muy importante para despertar el instinto de la cópula y asegurar la maduración de los huevos. Por lo regular, la hembra está apta para picar y alimentarse a las 14 horas de haber nacido; en la mayoría de los Culicidae, la alimentación se realiza durante la noche y el día (44)
El mosquito Psorophora confinnis se presenta como un eficiente vector del virus de la EEV (1) y por lo tanto está considerado como una especie con alto riesgo potencial.
La longevidad para los individuos de esta especie es en promedio de un mes (valor calculado en condiciones de laboratorio), siendo generalmente más longevas las hembras que los machos (81).
3.4 Distribución del mosquito Psorophora confinnis
La especie Psorophora confinnis presenta una amplia distribución en el continente Americano encontrándose desde la región norte de los Estados Unidos, ocupando las áreas este y sur, extendiéndose también para el centro del país, alcanzando América Central, Antillas, y América del Sur, llegando también al norte de Argentina donde alcanza las áreas de Buenos Aires (2) (Fig. 5).
En Colombia se tienen registros de la presencia del mosquito en los departamentos de Norte de Santander, Santander, Tolima, Boyacá, Meta, Huila, Cundinamarca, Córdoba, Guajira (3), Arauca (4), Casanare (Brote de encefalitis equina venezolana y encefalitis equina del este en Casanare. Informe de evaluación entomológica. Laboratorio de Entomología y Laboratorio Nacional de Referencia. Instituto Nacional de Salud, 1998) y Amazonas (Colección de referencia, Laboratorio de Entomología, Subdirección de Epidemiología y Laboratorio Nacional de Referencia. Instituto Nacional de Salud, 1996) (Fig. 6).
Ecuador
Peru
Venezuela
Brazil Panama
3.5 Capacidad vs. Competencia vectorial
La capacidad vectorial es la habilidad que posee un vector en un determinado lugar y en un tiempo definido para transmitir un patógeno. Cuantitativamente, la capacidad vectorial puede ser entendida como la cantidad de picaduras infectantes diarias que recibe una persona o cualquier vertebrado de interés para el insecto. La capacidad vectorial abarca tanto las interacciones del vector con el patógeno y el huésped vertebrado, como las características innatas de vector, sin afectar directamente al patógeno ni al huésped vertebrado. El tamaño de la población del vector, longevidad, longitud y número de ciclo gonadotrópicos, comportamiento alimenticio, son factores que afectan la capacidad vectorial de una determinada población artrópoda.
En contraste con la capacidad vectorial, la competencia vectorial es la habilidad intrínseca de un vector (especie, cepa o individuo) para transmitir biológicamente un agente patógeno. La competencia vectorial incluye susceptibilidad a la infección, permisividad de reproducción del patógeno, duración del periodo de incubación extrínseco y eficiencia de transmisión. Por lo tanto, la competencia vectorial está restringida a la interacción vector-patógeno (45).
3.6 Encefalitis Equina Venezolana (EEV)
La Encefalitis Equina Venezolana, también conocida como “peste loca” es una grave enfermedad que ataca a los équidos, es decir a las mulas, caballos y burros. Produce afección al sistema nervioso y algunas veces la muerte. Normalmente se presenta en áreas geográficas ubicadas en alturas inferiores a los 1200 metros sobre el nivel del
mar (climas cálidos), donde hay proliferación de mosquitos, principalmente Culex, Aedes, Psorophora, Anopheles y Mansonia.
En équidos las manifestaciones clínicas se presentan de 1 a 3 días, después de que el virus entra en la sangre del animal a través de la picadura de un mosquito infectado. El animal puede recuperarse posteriormente, o presentar los siguientes síntomas: fiebre alta entre 41 ó 42ºC, afección del sistema nervioso que se manifiesta con cambios en la conducta, sueño y depresión; el animal trata de sostenerse en pie y abre sus patas para no caer, puede caminar en círculos o negarse a caminar, se estrella contra los obstáculos, apoya su cabeza contra los objetos, puede llegar a convulsionar violentamente al ser excitado por ruidos, cae y en el transcurso de 2 a 4 días muere. Otros síntomas que pueden presentarse son: diarrea, constipación, perdida de apetito y perdida de peso desmesurada.
En humanos los síntomas varían, entre los 2 y los 5 días después de ser picados por un mosquito infectado, el paciente manifiesta fiebre leve que se confunde con una simple gripa o, en ocasiones, presenta fiebre alta, dolores musculares, articulares, y de cabeza, vómito, diarrea, fastidio a la luz e inclusive la muerte. Algunos pacientes se recuperan muy lentamente y en ocasiones, especialmente los niños, pueden presentar secuelas como parálisis, disminución de reflejos u otras de tipo neurológico (46).
La EEV, es producida por un virus del grupo A de los arbovirus (virus trasmitidos por artrópodos) perteneciente al género de los Alphavirus de la familia Togaviridae, clasificados en seis subtipos I al VI. Las variantes A, B y C del subtipo I han sido
responsables de las epizootias y epidemias ocurridas en las Américas. Estos virus tienen la capacidad de multiplicarse en los tejidos de los artrópodos vectores, sin producir una enfermedad o daño aparentes. El virus se mantiene naturalmente en las selvas húmedas de la América Tropical y en regiones pantanosas donde la transmisión del virus es enzoótica y se mantienen ciclos naturales entre reservorios silvestres como roedores y varias especies de mosquitos que sirven de vectores para transmitir la infección desde animales virémicos para otros susceptibles. El hombre puede infectarse al penetrar el ecosistema enzoótico. El ciclo epizoótico se mantiene entre los équidos y varios mosquitos equinófilos. Durante las epizootias otros animales pueden infectarse, como los bovinos, porcinos y perros, pero solo se ha comprobado la enfermedad en el perro.
Los vectores que participan en las epizootias son diversos: Psorophora confinnis, Psorophora discolor, Mansonia titillans, Mansonia indubitants, Aedes taeniorhynchus, Aedes sollicitans, Aedes scapularis, Aedes thelcter, Deinocerites pseudes. Los aislamientos del virus logrados en Aedes aegypti, lo sugieren como vector de hombre a hombre.
Cuatro virus pertenecen a este grupo: Encefalitis Equina del Este (EEE), Encefalitis Equina del Oeste (EEO), Encefalitis Equina Venezolana y el virus de Highland J que afecta únicamente a los equinos y se encuentra localizado en el Estado de la Florida, Estados Unidos. Estos virus se transmiten por medio de picaduras de mosquitos infectados. Los principales vectores pertenecen a la familia Culicidae y algunos Anopheles (47).
En Centroamérica se ha observado en los tres últimos años una creciente actividad de síndromes compatibles con encefalitis equinas en poblaciones de equinos, particularmente en Belice, Guatemala, Honduras y Panamá. Algunos aislamientos y/o tipificaciones serológicas han demostrado la presencia de los virus de EEE y EEV. Estos dos agentes son conocidos por la rápida propagación entre las poblaciones de caballos, burros y mulares que amplían la infección propagándose luego a las poblaciones humanas. El virus de la EEV ha sido causante de epidemias de gran magnitud en el pasado (47).
Este virus fue aislado por primera vez por Kubes y Rios (48) en caballos durante una epizootia en Venezuela, en 1938; el virus no fue asociado a enfermedad humana hasta muchos años después.
El virus de la EEV es originario de América y ha producido epizootias en Brasil, Surinam, Colombia, Venezuela, Trinidad y Tobago, Panamá, Costa Rica, Nicaragua, Honduras, Belice, Guatemala, México y Estados Unidos (Texas y sur de Florida), en forma intermitente en este siglo, desde la década de los años 30 (49) (Fig. 7).
Una de las mayores epizootias registradas ocurrió entre los últimos años de la década de los 60, iniciando en Ecuador, América del Sur, afectando la América Central y México, alcanzando el estado de Texas (EE.UU.), en el año 1971. En los años de 1994 y 1995, otra epizootia afectó a Colombia reportándose unos 75000 casos, 3000 de los cuales sufrieron complicaciones neurológicas, y 300 muertes (49).
Figura 7. Distribución del virus de la Encefalitis Equina Venezolana en América
El virus probablemente se introdujo desde Venezuela, pero no pudo demostrarse transmisión de persona a persona. En Venezuela se reportaron 12.317 casos humanos, con 24 muertes. Los focos reportados en équidos llegaron a 146 (61 confirmados por laboratorio), en el que se afectaron miles de équidos, en nueve Estados del país, a saber, Yaracuy, Falcón, Carabobo, Zulia, Lara, Cojedes, Portuguesa, Trujillo y Guárico. Las causas del brote estuvieron asociadas con una precipitación pluvial inusual, incremento en el número de mosquitos vectores y falta de vacunación de los
equinos. La morbilidad suele ser elevada en los équidos, pudiendo serlo también en los humanos. La letalidad es alta en los caballos sintomáticos y baja en los humanos (0.2 – 1.0 %) (49).
3.7 Líneas celulares.
Desde que comenzaron los trabajos con cultivos de tejidos a comienzos de siglo (5),(6) como método para estudiar el comportamiento de las células animales, se han ido derivando, a través del tiempo, trabajos con cultivos celulares de mosquitos de interés médico-veterinario para estudios básicos y de control (50). En sus inicios Harrison (5) empleó técnicas In Vitro para el estudio de fenómenos In Vivo, realizando cultivos de medula espinal embrionaria de anfibios, presumiblemente por ser un animal de sangre fría, en consecuencia no fue necesaria la incubación, pero el estímulo de la ciencia condujo a un nuevo interés en animales de sangre caliente por el desarrollo patológico normal mas cercano al humano. Esta técnica fue elaborada primero con fragmentos disgregados y el crecimiento fue restringido a la sola migración de células del tejido fragmentario con ocasionales mitosis.
Los primeros estudios intentando el crecimiento continuo de células de mosquitos fueron realizados en 1938 (19), pretendiendo la propagación del virus de la Encefalitis Equina Venezolana en tejidos del mosquito Aedes. Más tarde Kitamura (22) obtuvo sobrevivencia y crecimiento celular por mas de 4 semanas a partir de tejidos ováricos del mosquito Culex molestus (Forskal). Pero fue Grace en 1966 (23)
quien obtuvo por primera vez una línea celular del mosquito Aedes aegypti a partir de larvas próximas a pupación, utilizando un medio compuesto tanto de la formulación del análisis de hemolinfa del gusano de seda Bómbyx mori como de la hemolinfa de pupas de la polilla nocturna Antheraea eucalrpti. Las células de este explante crecieron en un número suficiente para permitir subcultivos después de cuatro semanas In Vitro.
En época mas reciente, las necesidades de controles agrícolas y de pestes han estimulado los estudios de toxicidad y de virología en los insectos apoyados en el cultivo de tejidos de vertebrados e invertebrados la cual continua siendo un área muy especializada de interés (52).
Cuando se establece un cultivo, se lleva a cabo un proceso de diferenciación y selección celular. Así solo formarán el cultivo aquellas células que sean por una parte capaces de superar el proceso de disgregación, y por otra capaces de adherirse al substrato y proliferar en forma de monocapa o en suspensión.
Cuando se mantiene el cultivo se establece una nueva selección: aumentan en número aquellas células que tienen una mayor tasa de crecimiento. En el momento en que se alcanza la confluencia de las células, es cuando muchas líneas celulares expresan sus aspectos más relevantes, también es el momento en el que se hace necesario caracterizar la línea celular (7).
3.7.1 Caracterización Bioquímica.
3.7.1.1 Electroforesis.
Al estar cargados, los iones en solución se mueven en los campos eléctricos. Los aniones migran al ánodo (el electrodo cargado positivamente), y los catones migran al cátodo (el electrodo cargado negativamente). Cuanta más carga tenga un ión, más rápidamente migra. La diferencia en las velocidades de migración de los iones con diferente carga es la base de la electroforesis. El valor de la electroforesis como método de separación de proteínas se debe a que las diferentes clases de moléculas de proteínas se comportan como iones complejos con cargas ligeramente diferentes. El tamaño de la carga, en una molécula dada de proteína, depende no sólo del número y de la clase de cadenas laterales ácidas o básicas en los residuos de aminoácidos de la proteína, sino también del pH de la solución que contiene la proteína. En soluciones ácidas, la mayor parte de las proteínas están cargadas positivamente, ya que en los grupos amino están presentes como grupos amonio (iones) cargados positivamente; los grupos ácido carboxílico también están protonados y son, por tanto, eléctricamente neutros. En soluciones básicas, la mayoría de las proteínas están cargadas negativamente, pues los grupos amino no están protonados y son eléctricamente neutros; los grupos, ácido carboxílico, no están protonados y su carga es negativa. En el pH isoeléctrico de una proteína, las cargas positivas y negativas están equilibradas y la proteína se comporta como si no tuviera carga, por lo tanto no migrará en un campo eléctrico (93).
Las proteínas cargadas se separan migrando a diferentes velocidades hacia el electrodo de carga opuesta. Las proteínas separadas se pueden ver directamente si tienen color, pero a menudo es necesario hacerlas visibles tiñéndolas con un colorante adecuado.
Para que la electroforesis sea efectiva como método de separación y caracterización, se requiere generalmente que:
a) Los componentes de la mezcla tengan forma iónica o sean convertidos a ella. b) Que cada componente tenga una carga neta distinta (84).
3.7.1.2 Técnicas de electroforesis en acetato de celulosa y otros substratos.
En este medio-soporte desarrollado por Kohn, se presenta la ventaja de poseer un alto poder de resolución y además no existe retención residual de las fracciones protéicas. Por tal causa, las zonas existentes entre las fracciones separadas permanecen totalmente desprovistas de colorante.
La electroforesis es valiosa en Bioquímica por dos principales razones: 1. Los métodos electroforéticos se pueden realizar en condiciones muy suaves, protegiendo así a las proteínas muy inestables de cualquier modificación estructural severa, y 2. Algunos métodos tienen un alto poder de resolución, resultando una clara separación de moléculas protéicas similarmente cargadas.
Existe en la actualidad una gran variedad de soportes sólidos para llevar a cabo la electroforesis, que incluyen las tiras de papel de filtro, que fue el soporte primeramente usado, los geles de poliacrilamida y los geles porosos de almidón cuyo
alto poder de resolución se debe al hecho de que la migración diferencial de las partículas cargadas no está controlada sólo por las diferencias de carga, sino también por las diferencias de tamaño.
Puesto que las partículas de gel son porosas, los solutos pueden difundirse reversiblemente dentro de los gránulos. De esta manera, en los métodos de gel, tanto la carga molecular neta como el tamaño molecular, son en realidad variables importantes (84).
En el año de 1980 Brown y Knudson (53) propusieron la técnica de electroforesis en acetato de celulosa como método para separar y caracterizar líneas celulares de invertebrados. En este estudio se examinaron previamente 16 extractos de líneas celulares utilizando la técnica de electroforesis en gel de almidón. Estos mismos extractos celulares fueron reevaluados respecto a su fenotipo isoenzimático utilizando el sistema de electroforesis en acetato de celulosa. Los datos arrojados por este estudio indicaron que los dos sistemas electroforéticos conducen a resultados muy similares. Fue así, como un análisis isoenzimático de un preparado fresco de extractos de células de Aedes albopictus (ATC-15) y Spodoptera frugiperda (IPLB-SF-21AE) resultó ser idéntico en cuanto a las movilidades isoenzimáticas, comparado con las mismas líneas celulares que se han mantenido almacenadas.
El hecho de que las isoenzimas catalicen el mismo tipo de reacción en diversos organismos y de que solamente difieran en su estructura molecular, permite que los valores de movilidad electroforética (zimogramas) se tomen como indicadores de la
identidad del cultivo celular y organismo del cual provienen, además de constituir un indicador del metabolismo de los mismos (53).
En este orden de ideas, las enzimas: 6-Fosfogluconato dehidrogenasa (6-PGDH), Fosfoglucosa Isomerasa (PGI), Isocitrato deshidrogenasa (ICDH) y Fosfoglucomutasa (PGM), que intervienen en el metabolismo de los carbohidratos serán evaluadas a través del método de electroforesis en acetato de celulosa.
3.7.2 Inmunofluorescencia
La posibilidad de encontrar técnicas refinadas que condujeran a la visualización o la presencia de un anticuerpo o un antígeno en cualquier preparación biológica, se empezó a buscar en 1933 por Heildelberg, Kendal y Soo (54), quienes buscaban conjugar los anticuerpos con algún tipo de colorante que le permitiera seguir el curso de la reacción antígeno anticuerpo, lógicamente sin que el colorante afectase en nada las propiedades biológicas del anticuerpo. Estudios posteriores de Marrack (55) en 1934, demostraron que efectivamente era posible conjugar los anticuerpos con ciertos colorantes sin que se afectara su especificidad. Posteriormente se pensó en la posibilidad de usar un tipo de colorante que tuviera la propiedad física de fluorescer bajo una fuente de excitación luminosa apropiada tal como la ultravioleta. En 1941 Coons y colaboradores (56), intentaron conjugar anticuerpos con colorantes fluorescentes, logrando determinar que las características biológicas de los anticuerpos se mantenían y por lo tanto eran fácilmente detectables. Un año después Coons y col. (57) publicaron la primera aplicación práctica de esta técnica en el
estudio de un antígeno de S. pneumoniae en tejido de ratones infectados con tal microorganismo. A partir de este nuevo procedimiento, grandes modificaciones ha sufrido esta técnica en vista de su aplicabilidad en casi todos los sistemas de reacción antígeno-anticuerpo.
4.1 ESTABLECIMIENTO DE LA LINEA CELULAR
4.1.1 Obtención y Limpieza del Material Biológico:
Se utilizaron formas inmaduras (huevos embrionados y larvas recién eclosionadas) y adultos (ovarios) del mosquito Psorophora confinnis, provenientes de dos colonias establecidas en el insectario del Laboratorio de Entomología de la Universidad De La Salle, las cuales, a su vez, fueron iniciadas a partir de ejemplares adultos, hembras y machos, colectados en Lorica (Córdoba) y Granada (Meta) a finales de 1997, cuyas generaciones sucesivas fueron mantenidas a una temperatura de 28ºC, humedad relativa del 80-90% y 12 horas luz.
Los huevos embrionados, utilizados para los explantes, fueron obtenidos de las posturas que realizaron las hembras sobre gasas previamente humedecidas, dejadas en la parte superior de la jaula por un periodo de 5-8 días, y posteriormente sometidos a incubación durante 8-10 días. 300 a 500 huevos embrionados, por cada explante, fueron depositados en un tubo de centrífuga mediante arrastre por adición de un chorro de agua; luego, al descartarse éste, se adicionó de inmediato una solución de hipoclorito de sodio al 1.6% por 10 minutos con agitación continua, al cabo del cual se efectuó una centrifugación a 2000 r.p.m. durante 5’; después de descartar el sobrenadante, se adicionó etanol al 70% por 10 minutos, repitiendo el anterior procedimiento de centrifugación y reemplazando el alcohol por tres lavados sucesivos con agua destilada estéril, los huevos fueron finalmente enjuagados con el medio de
crecimiento y llevados a un homogenizador donde ocurrió la rotura mecánica de éstos (35), (36).
También fue adaptado, para la esterilización de los huevos, el método frecuentemente usado para obtener ovarios estériles de las hembras adultas (24), con algunas modificaciones; para tales efectos, fueron inmersos en una solución del 0.25% de cloruro de mercurio disuelta a su vez en etanol al 70 %, por un tiempo de 2-3 minutos. Luego, los huevos se lavaron 2-2-3 veces con agua destilada estéril y fueron sumergidos en 0.5 ml de medio de crecimiento, en donde se rompieron con la ayuda de un homogenizador de vidrio Ten Broek de 2 ml.
Como segunda opción, se utilizaron larvas neonatas (1er estadio), de acuerdo con el siguiente protocolo: después de esterilizar los huevos, se dejaron eclosionar sumergidos en el medio de cultivo seleccionado, el cual contenía antibiótico y antimicótico, luego se pasaron a una caja de Petri estéril. Con la ayuda de un estereoscopio al interior de la cabina de flujo laminar y manipulando con agujas entomológicas número cero estériles, se fragmentaron las larvas. Estos fragmentos se pasaron a frascos plásticos de 25cm2 con 10 ml de medio de cultivo.
Como tercera opción, se emplearon ovarios de hembras de aproximadamente 3 días de nacidas, éstas se congelaron por 1 minuto a –20ºC, luego se sumergieron en un tubo de centrifuga que contenía la solución de cloruro de mercurio en etanol por 4 minutos, se centrifugó y se descartó el sobrenadante, posteriormente se enjuagaron 2-3 veces con agua destilada estéril por 2-3 minutos. Las hembras estériles se colocaron en una caja de Petri, a la cual se adicionaron unas gotas de medio de cultivo, en donde con ayuda de un estereoscopio dentro de la cabina de flujo laminar y un par de agujas
entomológicas No. 0, se disectaron cada una de las hembras para la obtención de los ovarios. En algunos casos, éstos se fragmentaron, colocándose, luego, en frascos plásticos de 25 cm2 con 10 ml de medio de cultivo y en otros, se dejaron sin disgregación. Al final del procedimiento, todos los frascos fueron incubados a una temperatura de 28ºC, sin atmósfera de CO2.
4.1.2 Obtención de Cultivos Primarios
Las suspensiones celulares de los embriones y los fragmentos de larvas y ovarios se sembraron, por separado, en frascos plásticos de 25 cm2 con 10 ml de medio de cultivo adecuado para insectos, tales como: L-15, MM, VP12, MM/VP12, MK, MK/VP12 y GRACE, todos suplementados con suero fetal bovino (SFB) al 20% y una solución de antibiótico-antimicótico al 1%. Se incubaron los frascos a 28ºC y diariamente se observó al microscopio invertido Olympus CK-2, la evolución de cada explante. Los cultivos primarios fueron suplementados semanalmente por adición de 2 ml de medio fresco.
4.1.3 Características de crecimiento
Las células cultivadas en platos de 24 pozos, fueron ajustadas a una fase logarítmica de 2X105 células/ml. Para ensayar el efecto de la temperatura, las células fueron incubadas a 15, 20, 25, 28 y 37º C, también, se determinó el efecto del suero bovino fetal sobre el crecimiento celular, mediante la adición al medio de las concentraciones siguientes: 0.1, 5, 10 y 15 %. Las células fueron teñidas con azul tripano y contadas diariamente usando un hemocitómetro con observación bajo un microscopio.
La morfología celular fue observada y fotografiada a través de un microscopio invertido con fase de contraste y un sistema microfotográfico “Olympus” en incrementos de 100 a 400X de aumento.
4.1.4 Obtención de Subcultivos
Como consecuencia del crecimiento celular, la superficie inferior de los frascos es ocupada totalmente por las células, tiempo en el cual, la monocapa alcanza la confluencia, haciéndose necesario realizar subcultivos, inicialmente en una proporción de 1:1, luego en relaciones moderadas de 1:5 y finalmente, en últimos pases, que correspondieron a proporciones hasta de 1:50. El desprendimiento de las monocapas se efectuó con remoción mecánica con un removedor de goma o “scraper” o “policía de goma”. Las células fueron resuspendidas con la ayuda de una pipeta y el contenido del frasco, previa agitación, fue trasladado a otro, en el cual se adicionó 10 ml de medio fresco.
4.2 CARACTERIZACIÓN DE LA LÍNEA CELULAR
4.2.1 Caracterización Morfológica
Las formas celulares, más predominantes, fueron determinadas por observación y seguimiento en el proceso de desarrollo de los cultivos, para su respectiva caracterización, con base en patrones conocidos de morfologías epiteloides, fibroblásticas o pleomórficas.
4.2.2 Caracterización citogenética
4.2.2.1 CARIOTIPO. Para obtener cromosomas metafásicos, se aplicó 0.1 ml de colchicina al 0.016% a un frasco de cultivo con una monocapa confluente de 24-48 horas de sembrado. Después de 3-4 horas, se removió la monocapa y se centrifugó. Se descartó el sobrenadante y se adicionó solución hipotónica (KCL al 0.56%), se dejó incubando por 10-20 minutos. Se centrifugó y se descartó el sobrenadante para luego adicionar Carnoy por 30 minutos, después se hicieron 2-3 lavados adicionales con Carnoy invertido. Se centrifugó y se retiró el sobrenadante dejando solo 1 ml aproximadamente, en donde se resuspendió el pellet celular, el cual se goteó en láminas previamente lavadas con Carnoy. Se observó al microscopio y se fotografiaron las mejores metafases (59). En total se tomaron 20 metafases para ser medidas en micras a una ampliación de 3000X.
4.2.2.2 BANDAS C. Se utilizaron láminas de 4 o más días de maduración y se las sumergió en una solución de HCl 0.2 N por 40 minutos a temperatura ambiente, luego se lavaron con agua destilada y se trataron con 3% de Hidróxido de Bario a 53ºC por 30 segundos. Se enjuagaron rápidamente con agua destilada y se incubaron en solución doblemente citratada (2xSSC) a 55ºC por 1 hora.
Finalmente, cada lámina fue lavada con agua corriente y se coloreó con giemsa al 2% (60), (61), (62)
4.2.2.3 BANDAS G. Se utilizaron láminas de 4 o más días de maduración y se las trató con solución doblemente citratada (2xSSC) a 52-53 ºC durante 1 hora. Luego, las láminas se dejaron secar al aire y se sumergieron en una solución de 0.1% de
tripsina a 9ºC por 30 segundos. Se detuvo la acción de la tripsina con etanol. Por último, fueron coloreadas con giemsa al 2% por 45 minutos (63), (64).
4.2.3 Caracterización isoenzimática
Con base en la técnica de electroforesis en acetato de celulosa descrita por Brown y Knudson (1980) (53), se establecieron los fenotipos isoenzimáticos de la línea celular de cuatro sistemas. Las muestras celulares fueron simultáneamente corridas con extractos de pupas y adultos provenientes de la misma colonia. Los perfiles isoenzimáticos de la línea celular fueron comparados con la línea celular LSB-AA695BB de Anopheles albimanus (37). Los sistemas isoenzimáticos trabajados fueron: fosfoglucomutasa (PGM), fosfogluconato isomerasa (PGI), 6-fosfogluconato deshidrogenasa (6-PGDH) e isocitrato deshidrogenasa (ICDH).
4.3 SUSCEPTIBILIDAD DE LA LÍNEA CELULAR A INFECCIÓN CON ARBOVIRUS.
Se ensayó la susceptibilidad de la línea celular a 12 arbovirus, representantes de cinco familias diferentes, realizándola infecciones en paralelo con la línea celular Aedes albopictus clon C6/36, AAC6/36, y Vero (fibroblastos de riñón de Mono verde africano, proporcionadas por la sección de Cultivos Celulares, Virología –INS). Cada uno de los virus adicionados, junto con la identificación del género, familia y asociación conocida con el artrópodo se relaciona en la Tabla 1. Se prepararon
diluciones de 10-1 de cada uno de los virus, luego se adicionaron 0.1 ml de éstas en tubos de ensayo donde se encontraba subcultivada la línea celular, las cuales se dejaron incubando a 28ºC, durante un tiempo máximo de 12 días, sin embargo, cada 24 horas fueron extraídos tubos infectados, como también controles, para establecer el ciclo de cada virus. Posterior al tiempo de incubación, las células fueron desprendidas, lavadas con PBS y se realizaron impresiones en láminas Cell Line de 18 pozos, éstas láminas se fijaron en acetona fría durante 10 minutos y se conservaron congeladas a –70o C hasta cuando se realizó la técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI). En desarrollo de esta técnica, se preparó una dilución en PBS 1:20 del anticuerpo hiperinmune específico producido en ratón (a excepción de los virus de EEV y EEE, que se utilizaron anticuerpos monoclonales), de éste se agregaron 10 µl por pozo y se incubó por una hora a 37ºC. Las láminas se lavaron 3 veces con PBS, se dejaron secar y se adicionaron 10 µl de conjugado (anti IgG de ratón marcado con fluoresceína, diluido 1:80 en azul evans 1:10000) en cada pozo, dejando en incubación por 30 minutos a 37ºC. Después de este tiempo, las láminas se lavaron dos veces con PBS y una con agua destilada, luego se realizó el montaje con buffer glicerina para observarlas al microscopio de fluorescencia (38).
Las cepas virales utilizadas en este estudio fueron suministradas por el Dr. Tesh (Investigador U. de Texas): Dengue 1: V-540 0,5 ml; Marzo 13/87 Dengue 2: V-543 Dengue 3: V-368 Dengue 4: Fiebre Amarilla: V524 17D.
Ilhéus: 10% smb, 7.5% bov. Pass 39, 0.5 ml; 4/26/87.
Mayaro: TR-VL 4675, P. SM #13, Vero #1, 0.5 ml; 8/16/84.
Estomatitis vesicular. VSV-ALAGOAS: CoAr 171044, P. Vero #1, 0.5 ml; 4/14/86
Punta Toro: (ADAMES) TVP-633 Pase Vero No. 3; 0,5 ml; 17/03/83
Changuinola: Bt 436 Pase 2 (N.H); 100% BMB 7,5% bpa; 0,5 ml; Harv-23/07/65
Encefalitis Equina Venezolana. V-263E Tr. Burro (cepa epizoótica)
Encefalitis Equina del Este V-191 (cepa enzoótica)
FAMILIA GENERO VIRUS CEPA VECTOR
Mayaro Tr-VL4675 Haemagogus
E.E.V. V-263E Aedes, Psorophora
Togaviridae Alfavirus
E.E.E. V-191 Aedes, Psorophora
Ilhéus 10% smb, 7.5% bov., Pass 39, 0.5 ml; 4/26/87 Aedes, Psorophora Dengue 1, 2, 3 y 4 V-540, V-543, V-368 Aedes Flaviviridae Flavivirus
Fiebre Amarilla V-524 Aedes, Psorophora
Rhabdoviridae Vesiculovirus VSV T-33894 Lutzomyia
Reoviridae Orbivirus Changuinola Bt 436 Lutzomyia
Bunyaviridae Phlevovirus Punta Toro TVP-633 Lutzomyia
4.4 PRUEBAS DE ESTERILIDAD
Se realizaron pruebas de esterilidad a la línea celular para verificar la presencia o ausencia de bacterias y hongos. Para esto, se inocularon 0,1 ml de una suspensión de células de 2 x 106 cél/ml en Caldo BHI y 0,1 ml en Agar Sabouroud e incubando a 37ºC y 28ºC por una y dos semanas respectivamente. Para descartar la contaminación con micoplasmas, se realizó la técnica de coloración con bisbenzimide, modificación de la técnica descrita por Russell, Newman and Williamson (1975). Finalmente, para evidenciar que los cultivos celulares no se encontraban infectados con virus, se preparó una suspensión celular de una botella de cultivo de 7 días de incubación y se conservó congelada a -70ºC por una semana, después se descongeló y volvió a congelar rápidamente por dos veces y luego de centrifugar a 3000 rpm por 5 minutos, del sobrenadante se inoculó 0,1 mL intracerebralmente a 20 ratones lactantes y 0,1 mL a cada uno de 20 tubos de células Vero. Los ratones se observaron por 28 días en el bioterio y las células Vero por 15 días a 37ºC en microscópio invertido (94).
4.5 CRIOPRESERVACIÓN DE LA LÍNEA CELULAR
Se rotularon 2 frascos, uno con medio de cultivo y suero fetal bovino (frasco No. 1) y otro con medio de cultivo y dimetil sulfoxido (DMSO) o glicerol (frasco No. 2). Las proporciones finales, para cada uno de los componentes de la mezcla, fueron: 50% de medio de cultivo, 40% de suero fetal bovino y 10% de dimetil sulfoxido (DMSO) o glicerol.
Se tomaron varios frascos de cultivos con monocapas confluentes (3-5 x 106cél/ml), se descartó el medio de cultivo, y se adicionó el contenido del frasco No. 1, las células se desprendieron mecánicamente con un policía, y el frasco se colocó dentro de un recipiente con hielo, luego lentamente se adicionó el contenido del frasco No. 2, mientras se agitaba en forma continua. Se dispensó 1,5 ml de células en crioviales previamente marcados con el nombre de la línea celular, numero del pase y fecha de congelación. El enfriamiento y congelación se realizó lentamente, de la siguiente forma: 15 minutos a 4°C y 4 horas a -70°C. Finalmente se llevaron a nitrógeno líquido (-196ºC) en donde permanecerán indefinidamente.
5. RESULTADOS
5.1 ESTABLECIMIENTO DE LA LÍNEA CELULAR 5.1.1 Iniciación de cultivos primarios.
El crecimiento celular, a partir de los explantes de tejidos embrionarios, se inició en promedio a los 62 días posteriores a la siembra de éstos. El medio de cultivo donde hubo proliferación celular fue el MM/VP12, la cual se evidenció a través de colonias
de células aisladas provenientes de células adheridas a los frascos, que tuvieron, selectivamente, mayor capacidad para adaptarse a las condiciones establecidas en los cultivos. En los otros medios de cultivo no hubo crecimiento. En un principio, el crecimiento celular, fue supremamente lento, situación ésta que se prolongó durante 3 meses, al cabo del cual se observó un mayor número de células que fueron ocupando mas superficie del frasco, sin embargo, la evolución de las células no fue igual en todas las colonias, ya que algunas degeneraron, observándose sitios demarcados en el fondo del frasco con vestigios celulares, donde antes había colonias establecidas. Una característica importante en los frascos de cultivos, donde se inició el crecimiento celular, fue la presencia de una gran cantidad de vesículas envueltas de células epitelioides con un espacio interior vacío, las cuales se observaron inmersas en el medio de cultivo y también, en menor cantidad, adherida a los extremos de fragmentos de tejidos, procedentes de los embriones macerados, que más tarde al adherirse directamente éstos a la superficie del frasco, se constituyeron en una fuente importante de células en activo crecimiento (Fig. 8). Las vesículas aumentaron en
número y tamaño, a medida que la proliferación celular en la superficie del frasco se hizo más intensa, pero al mismo tiempo, también éstas contribuyeron a suministrar células, debido a que al reventarse la capa epitelioide, se dispersó en el medio, disgregando un número importante de células, que luego se adhirieron al fondo del frasco y comenzaron también a crecer. La monocapa celular confluente se alcanzó, en promedio, después de 8 meses de sembrados los tejidos embrionarios.
El mejor resultado, en la iniciación de los cultivos, se obtuvo al trabajar con huevos de 8 días o más de incubación, con menos tiempo, los explantes no progresaron, ni mostraron un crecimiento significativo.
Los cultivos realizados a partir de larvas neonatas, no mostraron progreso y el estancamiento en el crecimiento celular se mantuvo por más de un año, motivo por el cual fueron desechados.
La iniciación de cultivos primarios a partir de tejidos de ovarios, se limitó sólo a algunas células sueltas, disgregadas de la masa de los ovarios, sembradas en el medio MM/VP12, las cuales a la segunda semana post-explante presentaron su mayor proliferación, sin embargo, fueron perdiendo viabilidad hasta que finalmente a la cuarta semana, las células degeneraron. Los tejidos ováricos se mantuvieron en los medios de cultivo, sin lograr adherirse a la superficie del frasco, no obstante, evidenciaron actividad metabólica, a través de movimientos contráctiles que se extendieron durante 2 meses. Estos cultivos también fueron descartados después de un año de permanecer incubados, sin signos de actividad celular proliferativa.
Figura 8. Proliferación celular a partir de fragmentos de embriones adheridos a la superficie del frasco.
La técnica utilizada para la esterilización de los huevos descrita por Tesh en 1980 (35) e inicialmente aplicada, no dio buenos resultados, debido que al durar inmersos por 20 minutos, las larvas eclosionaban y se perdía este material. Se cambió por la técnica empleada en la esterilización de las hembras para la obtención de ovarios, logrando buenos resultados al acortar el tiempo de desinfección de los huevos.
Se apreció a los 20 días post-explante, pequeños grupos de células adheridas a la superficie del frasco. A los 62 días se observó proliferación celular de estos grupos de células, algunas aumentaron de volumen y se redondearon, dando inicio a “vesículas”
(Fig. 9), que aunque en principio se encontraban adheridas al frasco, se desprendieron y con el transcurrir del tiempo aumentaron de tamaño y se conformaron internamente por más células. Mas adelante se reventaron, dispersando así su contenido (células) ayudando a la formación de la monocapa, la cual se logró hasta los 8 meses.
Las principales fuentes para obtención de la monocapa fueron fragmentos de embriones adheridos a la superficie de los frascos, colonias aisladas de células con morfologías diversas que proliferaron y vesículas que reventaron disgregando células por todo el frasco.
Figura 9. Grupo de vesículas presentes en cultivo celular
5.1.2 Obtención de subcultivos
Después del octavo mes, se realizó un primer pase tomando todo el contenido del cultivo primario y adicionándolo en otro con medio fresco. Después se realizaron
divisiones de 1:2, en donde el contenido del frasco se repartió en 2 frascos con medio fresco suplementado con 20% de SFB.
Inicialmente el crecimiento celular se dio en los explantes que se realizaron en el medio de cultivo MM/VP12 los cuales alcanzaron la formación de la monocapa a los 240 días post-explante.
Después se realizaron 2 pases de uno de los cultivos primarios donde no hubo progreso en el crecimiento celular, las células presentaron vacuolas en su interior y los subcultivos degeneraron y perdieron viabilidad. Se trato de estimularlos con la adición semanal de 5 ml de medio fresco, pero no se observó cambio positivo.
Casi a la par (254 días después del explante) se tomó otro frasco de 25 cm2 que había completado la monocapa confluente y se le realizó un primer pasaje en una proporción de 1:3 a frascos de 12 cm2 con medio de cultivo MM/VP12, a los 136 días se les retiró el medio de cultivo el cual tenía células y tejidos larvales sin adherir y se les adicionó medio MM/VP12 fresco, estos 3 frascos no siguieron progresando. El medio retirado de estos tres frascos se sembró en otro de 12 cm2 el cual contenía medio de cultivo GRACE suplementado con 20 % de SFB. El crecimiento en comparación con los otros fue bastante significativo, las células se adhirieron rápidamente al frasco sin volverse a desprender. A los 2 días de realizado el pasaje, se comenzaron a observar pequeños movimientos contráctiles en ciertas partes de los fragmentos larvales, denotando que los tejidos no habían perdido viabilidad y que el medio de cultivo utilizado fue el más adecuado ya que proporcionó los nutrientes esenciales para su proliferación.
El tiempo de duración de este primer pase o subcultivo para la obtención de una monocapa semiconfluente fue largo, alcanzando 185 días para realizar el segundo pase. Para el tercer pase el tiempo fue algo mas corto, 137 días.
A medida que se han ido aumentando el número de pasajes, el tiempo que ha habido entre uno y otro se ha ido reduciendo paulatinamente, hasta alcanzar un máximo de 10 días post-siembra para la obtención de una monocapa semiconfluente. Aunque se ha observado que después de formada la monocapa, las células permanecen adheridas al frasco y viables por un periodo de un mes.
Desde la realización del primer subcultivo hasta la fecha, se han realizado 62 pases con éxito, y aunque todavía están presentes vesículas en los cultivos, estas han disminuido en cantidad. El rango de pH óptimo para el mantenimiento de la línea fue de 6.3 - 6.8, sin atmósfera de CO2 a una temperatura de 28ºC y una concentración de
SFB del 20%, sin embargo, de los ensayos realizados se observó que la mejor concentración del SFB, para el crecimiento y mantenimiento de los subcultivos fue del 10 %.
Se observó que las células se comportaron igual que en el medio GRACE solamente en el medio L-15, en los demás medios se observó que muchas células no se adhieren a la superficie del frasco y perdieron viabilidad. Además se experimentó dejándolas incubando a temperatura ambiente y solamente se observó un alargamiento de las células, pero permanecieron viables el mismo tiempo que mantienen en incubadora, sin que se desprendieran o se vacuolaran.
5.2 CARACTERIZACION DE LA LINEA CELULAR
5.2.1 Caracterización Morfológica
La morfología celular desde el principio fue muy variable, todo tipo de formas celulares estuvieron presentes en los cultivos, desde células grandes redondas hasta pequeñas alargadas, pasando por formas irregulares. En los primeros 2 pasajes se logró observar un deterioro morfológico al estar presentes en las células pequeñas vacuolas alrededor del núcleo, como también gran cantidad de vacuolas de mayor tamaño en el citoplasma, que luego perdían viabilidad y morían. Después de realizado el cambio de medio se observó un aumento en la viabilidad de las células que permitió progresar los cultivos celulares, y que al transcurrir del tiempo y de los pasajes se observó una selección natural de células que llevó a observar principalmente un predominio de células epitelioides aunque con la poca presencia de células de tipo fibroblastoide (Fig. 10).
Cuando la línea celular se mantuvo a temperatura ambiente, la morfología celular cambio, las células tomaron una forma alargada, sin que perdieran viabilidad. El tiempo de replicación entre un pase y otro no se modificó con respecto a los cultivos control que se mantuvieron en la incubadora a 28ºC.
Figura 10. Monocapa semi-confluente con formas celulares diversas.
También se determinó la curva de crecimiento exponencial de la línea celular desde que se realizó el explante hasta el actual pasaje (62), lográndose observar un crecimiento lento en la evolución de los cultivos primarios, luego un aumento constante del número total de células por frasco. A continuación se muestra la tabla de crecimiento exponencial de las células (Fig. 11).
0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 4 5 5 0 5 5 6 0 6 5 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 6 0 0 6 5 0 D Í A S P A S A J E S
5.2.2 Caracterización citogenética
5.2.2.1 CARIOTIPO. A partir del pase 35 se comenzó a aplicar la técnica para la obtención de cromosomas, también empleada para la obtención de cariotipos de células de mamíferos con buenos resultados.
El número diploide obtenido para la línea celular fue predominantemente de seis cromosomas (2n=6) (Fig. 12) clasificándose por su tamaño, siendo el primer par, el sexual, metacéntrico y más pequeño. Los pares 2 y 3 fueron ligeramente submetacéntricos y de mayor tamaño. Esta clasificación se realizó de forma directa y se determinó esta clasificación al encontrar diferencias en lo promedios de las longitudes y la respectiva realización de un idiograma (Fig.13). Estuvieron presentes en menor proporción poliploidias (Fig. 14), al rededor de un 5% y aneuploidias (1%) (Fig. 15)
A continuación se muestran en la tabla, los promedios de las longitudes cromosómicas correspondientes a la línea celular.
p q LT LR q/p p/q IC LRC Metafases PAR 1 1.46 + 0.004 1.46 + 0.004 3.82 + 0.005 0.29 1.00 1.00 0.38 1.00 20 PAR 2 1.85 + 0.006 2.12 + 0.005 4.31 + 0.006 0.33 1.14 0.87 0.42 1.12 20 PAR 3 2.21 + 0.004 2.68 + 0.006 4.93 + 0.004 0.37 1.21 0.82 0.44 1.29 20
Tabla 2. Promedio de las mediciones cromosómicas de la línea celular donde P=brazo corto; q= brazo largo; TL= longitud total; LR= longitud relativa; IC= Índice centromérico; LRC= longitud cromosómica relativa; Met.= metafases; *Error estándar +SE
Figura 12. Fotografía del cariotipo de la línea celular con 6 cromosomas. 0,70 0,79 0,43 0,43 1,18 1,32
1
2
3
Figura 14. Fotografía de una poliploidia de la línea celular con 12 cromosomas.
A partir de estos promedios, se procedió a realizar la respectiva clasificación, utilizando como patrón los parametros establecidos por Levan, Zimmerman y De Dulce.
CROMOSOMAS LEVAN (q/p) ZIMMERMAN (q/p) DE DULCE (IC)
PAR 1 Metacéntrico Metacéntrico Metacéntrico
PAR 2 Metacéntrico Submetacéntrico Metacéntrico
PAR 3 Metacéntrico Submetacéntrico Metacéntrico
Tabla 3. Clasificación cariotípica de la línea celular de acuerdo con tres autores
5.2.2.2 BANDAS C. Se realizó un análisis de bandeamiento cromosómico aplicando la técnica para la obtención de banda C (Fig. 16), donde la longitud promedio del centrómero se expresó en porcentaje, correspondiente a la longitud de los centrómeros de cada cromosoma con respecto a la longitud total de los mismos.
CROMOSOMAS % CENTROMERO
PAR 1 11.34
PAR 2 6.29
PAR 3 4.58
Figura 16. Fotografía de Bandeamiento C aplicado a la línea celular.
5.2.2.3 BANDA G
Se estableció el patrón de banda G (Fig. 17) correspondiente a cada par cromosómico de la línea celular obtenidas en más de 20 metafases y la representación ideogramática del patrón de bandas G (Fig. 18) denotando el tamaño de cada una. El número de bandas correspondiente se relaciona en la siguiente tabla.
CROMOSOMAS PROMEDIO BANDAS
PAR 1 5
PAR 2 7
PAR 3 9
Figura 17. Fotografía de Bandas G aplicado a la línea celular.
1
2
3
Figura 18. Idiograma correspondiente a los patrones de banda G para la línea celular de Psorophora confinnis.
