Mecanismos implicados en las etapas iniciales de infección en la cancrosis de los cítricos provocada por Xanthomonas citri subsp. citri

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(1)UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos de Madrid. MECANISMOS IMPLICADOS EN LAS ETAPAS INICIALES DE INFECCIÓN EN LA CANCROSIS DE LOS CÍTRICOS PROVOCADA POR Xanthomonas citri subsp. citri. Tesis Doctoral. Marta Sena Vélez Ingeniera Agrónoma 2015.

(2) Departamento de Biotecnología Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos Universidad Politécnica de Madrid. Tesis Doctoral. Mecanismos implicados en las etapas iniciales de infección en la cancrosis de los cítricos provocada por Xanthomonas citri subsp. citri. Autor. Director. Marta Sena Vélez. Jaime Cubero Dabrio. Ingeniera Agrónoma. Dr. en Ciencias Biológicas. Madrid, 2015.

(3) UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID (D15). Tribunal nombrado por el Magfco. y Excmo. Sr. Rector de la Universidad Politécnica de Madrid el día. de. de 2015.. Presidente Secretario Vocal Vocal Vocal Suplente Suplente Realizado el acto de defensa de la tesis el día. de. de 2015 en la Escuela. Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos de Madrid. Calificación:. El Presidente. El Secretario. Los Vocales. iii.

(4) A mi familia, amigos y compañeros, porque me habéis apoyado estos años, y porque este trabajo también es un poco vuestro. Os quiero mucho.. v.

(5) Ἓν οἶδα ὅτι οὐδὲν οἶδα “Sólo sé que no sé nada” Sócrates, 470-399 a. C. Porque cuanto más investigamos y mayor es nuestro conocimiento, mayor es también nuestra inquietud por conocer y saber más, y solo así, nos damos cuenta de todo lo que nos queda por descubrir.. “Por eso, si conoces los planes del enemigo sabrás qué estrategias serán eficaces y cuáles no” “Para estar seguro de tomar lo que atacas, ataca en lugares que el enemigo no defiende. Para estar seguro de conservar lo que proteges, defiende un lugar donde el enemigo no ataca” “Cuando esté unido, divídelo” Sun Tzu El Arte de la Guerra, Siglo IV a. C.. vii.

(6) Reconocimientos. Este trabajo ha sido realizado en el Departamento de Protección Vegetal del Instituto Nacional de Investigaciones Agrarias y Agroalimentarias (INIA), bajo la dirección del Dr. Jaime Cubero Dabrio. Algunos de los estudios han sido realizados en el Citrus Research and Education Center (CREC) y el Emerging Pathogens Institute (EPI) ambos pertenecientes a La Universidad de Florida, con la ayuda de los Doctores James H. Graham y Jorge A. Girón.. En este trabajo han colaborado las siguientes personas: Dr. Jaime Cubero Dabrio, INIA Dr. James H. Graham, CREC Elisa Ferragud Capó, INIA Dra. Cristina Redondo Casero, INIA Dr. Jorge A. Girón, EPI Dr. Pablo Rodríguez Palenzuela, CBGP-ETSIA Dr. Evan Johnson CREC. Durante la realización de este trabajo he disfrutado de una beca FPI-INIA del Ministerio de Ciencia e Innovación que, además, me ha permitido realizar dos estancias en el CREC y EPI de La Universidad de Florida. Este trabajo ha sido financiado con los siguientes proyectos nacionales e internacionales: CRDF546/UF12170 (Citrus Advance Technology Program), FCPRACNAS85 (Florida Department of Citrus-University of Florida), RTA2008-0048 (INIA) y RTA2006-00149 (INIA).. ix.

(7) Agradecimientos “ Wi t h a l i t t l e h e l p o f m y f r i e n d s ” Con la defensa de este trabajo se cierra una etapa de mi vida, mi última etapa de estudiante, aunque creo que nunca dejaré de aprender. Durante todo este tiempo he aprendido muchas cosas, no todas relacionadas con el laboratorio ni con Xanthomonas, y aunque a veces se ha hecho cuesta arriba, la mayoría de los momentos han sido buenos, muy buenos, es por ello que os agradezco a todos vuestra ayuda durante este tiempo. En primer lugar me gustaría dar las gracias a Jaime por haberme permitido realizar este trabajo en su grupo y por tener siempre, la puerta de su despacho abierta. Por haber escuchado pacientemente mis dudas y contestado siempre a mis múltiples preguntas. Por escuchar mis ideas, que a veces eran demasiadas, por habérmelas razonado y enseñarme a mí a razonarlas y valorarlas, a ser crítica. Por la libertad, por los pruébalo o demuéstramelo… Algunas cosas han salido, otras no, otras necesitan todavía algún reajuste y otras están pendientes, pero con todas he aprendido, si no las hubiéramos probado no habríamos ganado nada. Por las estancias en el extranjero y por preocuparte de que todo me fuera bien allí. Por los ánimos en los últimos momentos y por hacer que siempre contemos todos en el laboratorio y que colaboremos entre nosotros. En resumen, por ser tan buen guía en este camino que es llegar a ser doctor. A mis compañeros de laboratorio, por todo, por las risas, los llantos, por los desayunos, las comidas y los desayunos de los viernes que se han convertido en tradición. Porque como dice Pilar, con vosotros venir a trabajar no es trabajo, y la verdad es que tiene razón, sois los mejores. Por ser como sois cada uno de vosotros, y haber ocupado un huequito de mi corazón. A Elisa porque no creo que con otra persona hubiera sido capaz de compartir una cabina de flujo de un metro durante tantas horas y no haber muerto en el intento. Por todas las horas de trabajo juntas y nuestras charlas para amenizar el rato. Por compartir un poquito de ti conmigo todos los días y porque aunque no he llegado a tu nivel soy bastante más organizada que antes. Por tu alegría, tus lágrimas y tus abrazos, pero también por los conciertos y lo loca que estás, o mejor dicho estamos (Como un día nos vea Jaime…).. A Jerson, por su ayuda y sus ideas, pero también por su. compañía y por los ratos que salíamos a fumar. Porque es un buen amigo y siempre está dispuesto a escuchar y a discutir cualquier idea. Por todas las pruebas que hemos hecho, alguna en secreto,. aunque no hayan salido, porque al fin y al cabo, a veces, esto es un poco xi.

(8) como jugar, un reto, y eso lo hace divertido. Muchas gracias por hacer este camino conmigo. A Cristina por decir las cosas como son, porque de ella he aprendido a organizar y analizar los resultados, por preocuparse siempre por todos nosotros y estar disponible con cualquier duda o ayuda que necesitáramos, por ser un apoyo durante estos años. A Pilar porque también me ha enseñado un montón de cosas y me ha apoyado y ayudado. Por ser peleona, que con algo de eso me he quedado y por ayudarme a convencer a Jaime para hacer algunos ensayos. A Iray porque además de ayudarme y enseñarme siempre estaba animando el laboratorio, ya sea con sustos o con su buen humor. A Bea, Gema y Carlos que han compartido los estreses de la tesis conmigo, por todos los ratos juntos y las tardes en el INIA que no se acababan nunca, por vuestra amistad y vuestra alegría, y porque me habéis enseñado muchas cosas que me han hecho ser mejor persona y científica. Aunque seáis fúngicos, os quiero también un montón. A los Frikis en su conjunto por las cañas, los viajes y todos los ratos juntos. A Fernando, Maite y Javiera, porque si podían ayudarme con lo que fuera siempre lo han hecho, por vuestra alegría y buen humor y por compartir los buenos y los malos ratos que hemos tenido en el laboratorio. A Javier y Gerardo, porque nos han dejado ocupar su laboratorio y ayudarnos siempre que han podido, sin poner pega alguna, muchas gracias a vosotros también. I would like to thank Jim for his help throughout the all thesis and for inviting me either to his laboratory at the CREC or his home. For being so critical with our work and always show us different points of view. For making me everything so easy during my stay in Lake Alfred, and allow full microscopes access to me. It was very nice to have your support all these years. I have learnt many things from you, so thank you very much. To Susan and Laura for taking care of me when I was in US. To Jim`s group for helping me in everything I needed there, to Marta, Evan, Diane, Alma and Swapna, and also to CREC workers. To Diann Achor for teach me how to use the microscopes and how to treat the samples for microscopy. To let me work in her lab and with the microscopes anytime even without her supervision, thank you for trusting me. A Jorge, por permitirme trabajar en su laboratorio y colaborar con nosotros, por enseñarme a trabajar con proteínas y a usar el microscopio de transmisión. Gracias por tu paciencia, buen humor y por quedarte hasta las mil en el laboratorio para acabar las extracciones y los geles. xii.

(9) A Pablo y Emilia, por estar siempre dispuestos a colaborar y ayudar siempre que lo hemos necesitado. Por todo lo que me aprendí de vosotros trabajando en el Labo X, y que me ha servido mucho durante estos años. A Ethel, Isabel y Mariel, porque aunque vinieron a nuestro laboratorio para aprender, a mí me enseñaron mucho más. Gracias por los ratos que pasasteis con nosotros en Madrid. A la pandilla de Lake Alfred por acogerme en su grupo como a uno más y ofrecerme su amistad, por las cenas, los cines, la fiesta, los bailes y thanksgiving. Sin vosotros mi estancia en Lake Alfred no hubiera sido lo mismo. En especial a Raquel y Rubén que además de ayudarme a conocer el laboratorio, me acogieron en su casa unos días y se preocupaban porque siempre tuviera algo que hacer. Pero también a Evan, Megan, Pedro, Raquel y otros cuyos nombres no recuerdo, gracias. A Elisabeth y Angélica por ser las mejores compañeras de piso, también a Gaudi que me hizo mucha compañía. Me alegro mucho de haberos conocido y haber pasado una temporada en Gainesville con vosotras. También me gustaría agradecer a Feli y Gloria, por todas las tardes que me han hecho un poco de compañía, por su alegría y por preocuparse y preguntar siempre por nosotros. A mis amigos, a todos, los Agrónomos y los no agrónomos, por preocuparos por mí y por mi trabajo todo este tiempo. Porque desde hace años habéis aguantado mis quebraderos de cabeza, da igual donde estuvierais, siempre he sentido vuestro apoyo. Por las quedadas y las cañas improvisadas que a veces se nos van de las manos, por los viajes, las cenas y Gandía. Siempre es un placer con todos vosotros, os quiero un montón. A mi familia, de la que Edu forma ahora también parte, porque siempre me han estado apoyando y dando fuerza para continuar, en los buenos y en los malos ratos. Por quererme y aguantarme incluso cuando estaba de mal humor. Por darme todos los abrazos que he necesitado e incluso más. Por ayudarme, aconsejarme, y a veces hasta leeros algún trabajo para revisarlo. Sin vosotros, este trabajo no habría sido posible. Muchas gracias, os quiero.. xiii.

(10) Principales abreviaturas. Principales Abreviaturas ADN: Ácido Desoxirribonucleico ANOVA: análisis de la varianza APHIS: Animal and Plant Health Inspection Service ARN: Ácido Ribonucleico cGMP: GMP cíclico CLSM: Confocal Laser Scanning Microscopy. Microscopía de barrido láser confocal CV: Cristal Violet. Cristal violeta DSF: Diffusible Signal Factors. Factores de señalización difusibles EFSA: European Food Safety Authority FAO: Food and Agriculture Organization of the United Nations EPPO: European and Mediterranean Plant Protection Organization HAP: Hook Associated Protein. Proteína asociada al gancho o garfio Hrp: hypersensitive response and pathogenicity Hrc: hypersensitive response and conserved GFP: Green Fluorescence Protein. Proteína verde fluorescente IPPC: International Plant Protection Convention ISR: Induced Systemic Response. Resistencia sistémica inducida LB: Luria Bertani medium. Medio Luria Bertani LPS: Lipopolisacárido Mpb: Mega pares de bases MCP: Methyl Accepting Chemotaxis Protein. Proteínas aceptoras de grupos Metilo MLVA: Multiple-Locus Variable number tandem repeat Analysis MMA: Minimal Medium A. Medio mínimo A. xv.

(11) Principales abreviaturas. PAMP: Pathogen Associated Molecular Pattern. Patrones moleculares asociados a patógenos PCR: Polymerase chain reaction. Reacción en cadena de la polimerasa PNPs: Péptidos Natriuréticos de Plantas PYM: Peptone, Yeast, Malt medium. Medio peptona, levadura y malta. RFLP: Restriction Fragment Length. Polymorphism. Polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción Rpf: regulation of pathogenicity factor SAR: Systemic Adquired Resistance-Respuesta Sistémica Adquirida SDS: dodecil sulfato sódico SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis SDW: Sterile Distilled Water. Agua destilada estéril SEM: Scanning Electron Microscopy. Microscopía electrónica de barrido SNK: Student Newmans-Keuls SST2: Sistema de Secreción Tipo II SST3: Sistema de Secreción Tipo III SST4: Sistema de Secreción Tipo IV SST5: Sistema de Secreción Tipo V SOPP: Sodium Ortophenylphenate. Ortofenilfenato de sodio STCR: Sensors of Two-Component Regulatory System. Sensores de los sistemas de regulación de dos componentes TBDT: TonB dependent transporters. Transportadores dependientes de TonB TEM: Transmission Electron Microscopy. Microscopía electrónica de transmisión TEMED: Tetramethylethylendiamina. xvi.

(12) Principales abreviaturas. ufc: unidades formadoras de colonias USDA: United States Department of Agriculture VBNC: Viable y no cultivable Xac: Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis Xc: Xanthomonas campestris Xcc: Xanthomonas citri subsp. citri Xfa: Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii. xvii.

(13) Índice. Índice Reconocimientos ............................................................................................................. ix Agradecimientos .............................................................................................................. xi Principales Abreviaturas ................................................................................................. xv Índice ............................................................................................................................. xix Resumen ....................................................................................................................... xxv Abstract ....................................................................................................................... xxvii CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN ................................................................................... 1 1.. El género Xanthomonas ............................................................................................ 3. 2.. Cancrosis o Chancro de los Cítricos ......................................................................... 7. 2.1. Tipos de cancrosis o chancros descritos ................................................................ 7 2.1.1. Chancro o cancrosis tipo A (Asiatic Citrus Canker) ......................................... 9 2.1.2. El Chancro tipo B ............................................................................................ 10 2.1.3. El Chancro tipo C ............................................................................................ 11 2.1.4. Chancros tipo D y E ......................................................................................... 11 2.2. Descripción de la enfermedad ............................................................................. 12. 2.2.1. Síntomas........................................................................................................... 12 2.2.2. Ciclo de la enfermedad y epidemiología ......................................................... 16 2.3. Diagnóstico y detección....................................................................................... 20 2.4. Control ................................................................................................................. 24 2.4.1. Prevención ....................................................................................................... 24 2.4.2. Control químico ............................................................................................... 28 2.4.3. Prácticas culturales .......................................................................................... 30 2.4.4. Control biológico ............................................................................................. 31. 2.4.5. Métodos barrera: cortavientos ......................................................................... 32 2.4.6. Uso de variedades resistentes y mejora de cítricos .......................................... 34 2.4.7. Control integrado ............................................................................................. 35 3.. Xanthomonas citri subsp. citri ................................................................................ 35. 4.. Factores de Virulencia de Xanthomonas citri subsp. citri ...................................... 40. 4.1. Sistema de Secreción Tipo III ............................................................................. 41 4.2. Exopolisacárido: goma xanthana ......................................................................... 44 4.3. Regulación tipo quorum sensing ......................................................................... 45 4.4. Enzimas Pectolíticas ............................................................................................ 46 xix.

(14) Índice. 4.5. Lipopolisacáridos ................................................................................................ 47 4.6. Motilidad ............................................................................................................. 48 4.7. Hemaglutinina filamentosa y Sistema de Secreción Tipo V ............................... 48 4.8. Sistema de secreción tipo II ................................................................................. 49 4.9. Presencia de Péptido Natriurético ....................................................................... 51 4.10.. Presencia del enzima fosfoglucosa isomerasa ................................................. 53. 4.11.. Resistencia a especies reactivas de oxígeno .................................................... 53. 4.12.. Proteína LOV ................................................................................................... 53. 5.. Motilidad y quimiotaxis .......................................................................................... 54. 5.1. Motilidad dependiente del flagelo ....................................................................... 56 5.1.1. Motilidad tipo swimming ................................................................................. 64 5.1.2. Motilidad tipo swarming .................................................................................. 64 5.2. Motilidad tipo sliding .......................................................................................... 67 5.3. Movimiento tipo twitching .................................................................................. 68 5.4. Quimiotaxis ......................................................................................................... 70 5.4.1. Sistema de transducción de señales que dirige a una respuesta quimiotáctica 71 5.4.2. Proteínas aceptoras de grupos metilo ............................................................... 74 6.. Formación de Biopelículas ...................................................................................... 77. 6.1. Etapas en la formación de biopelículas ............................................................... 78 6.2. Factores que determinan la formación y dispersión de biopelículas ................... 81 6.2.1. Señales del medio en el que se encuentran las bacterias ................................. 81 6.2.2. Mensajeros secundarios y cadenas de proteínas .............................................. 83 6.3. Composición de la matriz de las biopelículas ..................................................... 86 6.3.1. Polisacáridos .................................................................................................... 87. 6.3.2. ADN extracelular ............................................................................................. 87 6.3.3. Lípidos ............................................................................................................. 92 6.3.4. Proteínas extracelulares ................................................................................... 93 6.4. Biopelículas en Xanthomonas citri subsp. citri ................................................... 94 6.4.1. Etapas en la formación de biopelícula en Xcc ................................................. 94 6.4.2. Factores implicados en la formación de biopelículas en Xcc .......................... 96 6.4.3. Regulación en biopelículas formadas por Xcc ................................................. 98 7.. Fimbrias y pili ....................................................................................................... 100. xx.

(15) Índice. 7.1. Ensamblados mediante ruta de ujier-chaperona ................................................ 100 7.2. Pili tipo Curli ..................................................................................................... 102 7.3. Familia Pilus CS1 .............................................................................................. 103 7.4. Pili tipo IV ......................................................................................................... 104 7.4.1. Funciones del pili tipo IV .............................................................................. 107 CAPÍTULO 2: OBJETIVOS ........................................................................................ 111 CAPÍTULO 3: MOTILIDAD Y QUIMIOTAXIS EN Xanthomonas citri subsp. citri CON DISTINTA GAMA DE HUÉSPED .................................................................... 115 1.. Abstract ................................................................................................................. 117. 2.. Introduction ........................................................................................................... 118. 3.. Results ................................................................................................................... 120. 3.1. Carbon source utilization by Xanthomonas strains ........................................... 120 3.2. Chemotactic response of Xanthomonas strains to carbon compounds .............. 123 3.3. Chemotactic response of Xanthomonas strains to leaf fractions ....................... 126 CAPÍTULO 4: PROTEÍNAS ACEPTORAS DE GRUPOS METILO EN Xanthomonas Y SU RELACIÓN CON LA GAMA DE HUÉSPED.................................................. 133 1.. Abstract ................................................................................................................. 135. 2.. Background ........................................................................................................... 136. 3.. Experimental procedures ....................................................................................... 136. 3.1. Bacterial strains, culture media and growth conditions ..................................... 136 3.2. Detection of methyl accepting chemotaxis proteins in silico ............................ 138 3.3. MCP detection by conventional PCR ................................................................ 138 4.. Results ................................................................................................................... 139. 4.1. Detection of Methyl accepting chemotaxis proteins in silico............................ 139 4.2. Presence of MCPs in non-sequenced Xanthomonas strains .............................. 142 5.. Discussion ............................................................................................................. 145. CAPÍTULO 5: FORMACIÓN DE BIOPELÍCULAS EN Xanthomonas citri subsp. citri CON DISTINTA GAMA DE HUÉSPED .................................................................... 147 1.. Abstract ................................................................................................................. 149. 2.. Introduction ........................................................................................................... 150. 3.. Material and methods ............................................................................................ 151. 3.1. Bacterial strains and growth conditions ............................................................ 151 3.2. Adhesion assays on an inert surface .................................................................. 152 3.3. Adhesion to plant surfaces ................................................................................. 153. xxi.

(16) Índice. 3.4. Swimming motility ............................................................................................ 153 4.. Results ................................................................................................................... 154. 4.1. Adhesion and biofilm formation on an inert surface ......................................... 154 4.2. Adhesion and biofilm formation on plant surfaces ........................................... 155 4.3. Swimming motility ............................................................................................ 161 5.. Discussion ............................................................................................................. 163. CAPÍTULO 6: PRESENCIA DE ADN EXTRACELULAR DURANTE LA FORMACIÓN DE BIOPELÍCULAS EN Xanthomonas DE CÍTRICOS Y CRUCÍFERAS ............................................................................................................. 167 1.. Summary ............................................................................................................... 169. 2.. Background ........................................................................................................... 170. 3.. Methods ................................................................................................................. 172. 3.1. Bacterial strains, culture media and growth conditions ..................................... 172 3.2. Determination of eDNA in biofilms .................................................................. 172 3.3. eDNA staining ................................................................................................... 173 4.. Results ................................................................................................................... 174. 4.1. Importance of eDNA in Xanthomonas biofilms ................................................ 174 4.2. Importance of eDNA in preformed biofilm ....................................................... 175 4.3. Detection of eDNA in Xanthomonas strains ..................................................... 176 5.. Discussion ............................................................................................................. 180. CAPÍTULO 7: CARACTERIZACIÓN DE LA MATRIZ EXTRACELULAR PRODUCIDA DURANTE LA FORMACIÓN DE BIOPELÍCULAS EN CEPAS DE Xanthomonas citri subsp. citri CON DISTINTA GAMA DE HUÉSPED .................. 185 1.. Abstract ................................................................................................................. 187. 2.. Introduction ........................................................................................................... 188. 3.. Materials and methods .......................................................................................... 189. 3.1. Bacterial strains and growth conditions ............................................................ 189 3.2. Extracellular protein purification....................................................................... 190 3.3. Evaluation of extracellular structures in Biofilm vs. Planktonic stages ............ 191 3.4. Extracellular structures characterization by microscopic approaches ............... 191 3.5. Surface motility ................................................................................................. 192 3.6. RNA purification ............................................................................................... 193 3.7. Primers and probes design and qPCR conditions .............................................. 193 4.. Results ................................................................................................................... 195. xxii.

(17) Índice. 4.1. Visualization of extracellular structures produced by Xanthomonas citri subsp. citri ........................................................................................................................... 195 4.1.1. Plate growth ................................................................................................... 195 4.1.2. Early stages of biofilm formation .................................................................. 196 4.1.3. Surface motility.............................................................................................. 197 4.2. Extracellular protein purification and characterization ..................................... 198 4.3. Microscopy of Xanthomonas citri subsp. citri; biofilm formation and planktonic growth ........................................................................................................................ 199 4.4. Gene transcription during biofilm formation .................................................... 203 4.5. Surface motility in Xanthomonas strains ........................................................... 208 5.. Discussion ............................................................................................................. 210. CAPÍTULO 8: CONCLUSIONES ............................................................................... 217 BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 223. xxiii.

(18) Resumen. Resumen. La cancrosis o chancro bacteriano de los cítricos (CBC) causada por Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) y X. fuscans subsp. aurantifolii, afecta a un gran número de especies dentro de la familia de las rutáceas, especialmente cítricos. Esta enfermedad produce graves pérdidas económicas allí donde está presente, principalmente porque la comercialización de cítricos desde las zonas afectadas hacía zonas libres de cancrosis, está sujeta a fuertes medidas cuarentenarias. La cancrosis se encuentra distribuida a nivel mundial pero no se ha localizado ni en la Unión Europea ni en ningún área del Mediterráneo. Se han descrito tres tipos de cancrosis en función de la gama de huésped y de las características fenotípicas y genotípicas de las bacterias que las producen. La más extendida es la cancrosis tipo A producida por Xcc, dentro de la cual se distinguen los subtipos Aw y A*, originarios de Florida y Sudeste Asiático, respectivamente, que de forma natural solo son capaces de producir enfermedad en lima mejicana. En este trabajo se presentan estudios sobre mecanismos implicados en las primeras etapas de la infección, como la quimiotaxis y formación de biopelículas, en la cancrosis de los cítricos. La quimiotaxis es el proceso por el cual las bacterias se dirigen hacia zonas favorables para su supervivencia y desarrollo. Los perfiles quimiotácticos obtenidos frente a distintas fuentes de carbono, así como los estudios en relación al contenido de proteínas aceptoras de grupos metilo (MCPs), permitieron agrupar a las cepas de Xanthomonas estudiadas en este trabajo, de acuerdo a la enfermedad producida y a su gama de huésped. Todas las cepas mostraron quimiotaxis positiva frente a extractos de hoja y apoplasto de diferentes especies, sin embargo, Xcc 306, X. alfalfae subsp. citrumelonis (Xac) y X. campestris pv. campestris (Xc) manifestaron respuestas más específicas frente a extractos de apoplasto de hojas de naranjo dulce, lima y col china, respectivamente. Dicho resultado nos permite asociar el mecanismo de quimiotaxis con la capacidad de las cepas de Xanthomonas para colonizar estos huéspedes de forma específica.. xxv.

(19) Resumen. Las cepas estudiadas fueron capaces de realizar movimiento tipo swimming, twitching y sliding en distintos medios, siendo el movimiento swimming el único en el que se encontraron diferencias entre las cepas de Xcc con distinta gama de huésped. En este trabajo se ha estudiado además la formación de biopelículas en superficies bióticas y abióticas, un mecanismo importante tanto para la supervivencia en superficie vegetal como para el desarrollo de la infección. Las cepas de Xanthomonas estudiadas fueron capaces de formar biopelículas in vitro, siendo mayor en un medio que simula el apoplasto y que contiene una baja concentración de nutrientes en comparación con medios que contenían alta concentración de nutrientes. La formación de biopelículas en superficie vegetal se encontró relacionada, en las cepas patógenas de cítricos, con la capacidad para infectar un tejido o huésped determinado. Se han caracterizado algunos de los componentes de la matriz extracelular producida por Xcc, que compone hasta un 90% de las bipoelículas. Entre ellos destaca el ADN extracelular, que tiene un papel como adhesina en las primeras etapas de formación de biopelículas y estructural en biopelículas maduras. Además, se han identificado el pilus tipo IV como componente importante en las biopelículas, que también participa en motilidad. Finalmente, se han realizado estudios sobre la expresión de genes implicados en motilidad bacteriana y formación de biopelículas que han confirmado las diferencias existentes entre cepas de Xcc de amplia y limitada gama de huésped, así como el papel que juegan elementos como el pilus tipo IV o el flagelo en estos procesos.. xxvi.

(20) Abstract. Abstract Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) and X. fuscans subsp. aurantifolii are the causal agents of Citrus Bacterial Canker (CBC) which is one of the most important citrus diseases. CBC affects all Citrus species as well as other species from Rutaceae family. CBC produces strong economic losses; furthermore the commercialization of plants and fruits is restricted from infested to citrus canker free areas. The disease is worldwide distributed in tropical and subtropical areas, however it is not present in the European Union. Three types of CBC have been described according to the host range and phenotypic and genotypic characteristics. CBC type A caused by Xcc is he widest distributed. Within CBC A type two subtypes Aw and A* were described from Florida and Iran respectively, both infecting only Mexican lime. Herein mechanisms connected to early events in the citrus bacterial canker disease such as chemotaxis and biofilm formation, were studied. Chemotaxis allows bacteria to move towards the more suitable environments for its survival, host colonization and infection. Studies performed on citrus pathogenic Xanthomonas and X. campestris pv. campestris (Xc), a crucifer pathogen, have shown different chemotactic profiles towards carbon compound as well as different MCPs profile, which clustered strains according to host range and disease caused. Every strain showed positive chemotaxis toward leaf extracts and apoplastic fluids from sweet orange, Mexican lime and Chinese cabbage leaves. However, a more specific response was found for strains Xcc 306, X. alfalfae subsp. citrumelonis and Xc towards sweet orange, Mexican lime and Chinese cabbage apoplastic fluids, respectively. These results relate chemotaxis with the higher ability of those strains to specifically colonize their proper host. Xanthomonas strains studied were able to perform swimming, sliding and twitching motilities. The ability to swim was variable among CBC strains and seemed related to host range. Biofilm formation is an important virulence factor for Xcc because it allows a better survival onto the plant surface as well as facilitates the infection process. The studied Xanthomonas strains were able to form biofilm in vitro, on both nutrient rich and xxvii.

(21) Abstract. apoplast mimicking media, furthermore the biofilm formation by all the strains was higher in the apoplast mimicking media. The ability to form biofilm in planta by Xcc and Xac strains was dependent of the host and the tissue colonized. The wide host range CBC strain was able to form biofilm onto several citrus leaves and fruits, however the limited host range CBC strain produced biofilm solely onto Mexican lime leaves and fruits. Furthermore Xac strain, which solely infects leaves of young plants, was not able to develop biofilms on fruits. Some components of the extracellular matrix produced by Xcc strains have been characterized. Extracellular DNA acted as an adhesin at the very early stages of biofilm formation and as structural component of mature biofilm for citrus pathogenic Xanthomonas. Furthermore type IV pilus has been identified as a component of the extracellular matrix in biofilm and motility. Transcriptional studies of genes related with biofilm formation and motility have confirmed the differential behavior found among wide and limited host range CBC strains as well as the role of type IV pili and flagellum on those processes.. xxviii.

(22) CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN. 1.

(23) Introducción. 1. El género Xanthomonas El nombre de Xanthomonas viene del griego “xanthos” que significa amarillo y “monas” que significa entidad. Es uno de los géneros más importantes dentro de las bacterias Gram negativas y sus componentes siempre se encuentran asociados a plantas, ya sea como patógenos o como endófitos. Además es el género de bacterias fitopatógenas que mayor gama de plantas huésped posee, al menos 68 familias y más de 240 géneros (124 especies monocotiledóneas y 268 dicotiledóneas) (Figura 1). Es un género de bacterias muy interesante en los estudios de interacción de la bacteria con el huésped por presentar una alta especificidad, cada género, especie o cepa está practicamente restringida a un grupo específico de plantas huésped, pudiendo incluso ser específicas de un tejido determinado (Brunings y Gabriel, 2003; Ryan et al., 2011). En general son patógenos hemibiótrofos, en un principio se nutren del tejido vivo pero según la enfermedad va avanzando producen muerte celular en planta (Büttner y Bonas, 2010). No se ha descrito, hasta el momento, la capacidad para colonizar el suelo o el agua en ninguna de las especies existentes (Mhedbi-Hajri et al., 2013).. Figura 1. Bacterias fitopatógenas modelo del género Xanthomonas, partes de la planta que afectan y plantas huésped. Xcc: Xanthomonas campestris pv. campestris; Xoo: X. oryzae pv. oryzae; Xac: X. citri subsp. citri; Xcv: X. campestris pv. vesicatoria; Xoc: X. oryzae pv. oryzicola. Modificación de Büttner y Bonnas 2010.. 3.

(24) Introducción. La especialización de los patógenos vegetales parece que comenzó a tener lugar con la domesticación de las plantas y fue evolucionando de forma conjunta al desarrollo de la agricultura. En el caso de X. axonopodis, dentro de la que se incluía, hasta hace poco a Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc), anteriormente X, axonopodis pv. citri y otras especies patógenas de cítricos, pudo tener lugar en dos pasos. Se postula la aparicion de un patógeno generalista hace aproximadamente 25.000 años, produciéndose la especialización de estas Xanthomonas hace aproximadamente 10.000 años. Dicha especialización tuvo lugar hacia el nicho ecológico de cada planta huésped, en su mayoría fueron plantas monocotiledóneas. Con la llegada de la agricultura intensiva comenzó la divergencia en patovares, debido a la especialización de las bacterias a los cultivos intensivos, altamente homogéneos genéticamente, dando lugar a la aparición de cepas muy eficientes en colonización y muy agresivas, pero cuya supervivencia estaba restringida a un huésped. La globalización y el comercio de plantas, frutos y semillas permitieron que varios de estos grupos entraran en contacto, lo que favoreció el intercambio de material genético y la aparición de nuevos patotipos. Un ejemplo muy claro es el de las Xanthomonas patógenas de cítricos, X. alfalfae subsp. citrumelonis se separó de las causantes de chancros aproximadamente hace 23.000 años y las dos especies causantes de chancros (Xcc y X. fuscans subsp. aurantifolii) hace unos 8.000 años, sin embargo todas son patógenas de cítricos e incluso producen lesiones similares (Figura 2) (Mhedbi-Hajri et al., 2013). La especificidad de huésped dentro de este género, parece ser debida a leves variaciones en algunos genes relacionados con patogénesis, pudiendo ser estas variaciones en genes codificantes para proteínas de secreción o dianas de regulación (Lu et al., 2008). Además existen otros mecanismos implicados en las etapas tempranas de la infección como son la quimiotaxis, sensores de variaciones ambientales y adhesión a superficies cuya evolución ha podido producir procesos de adaptación al huésped en las distintas Xanthomonas (Mhedbi-Hajri et al., 2011a).. 4.

(25) Introducción. Figura 2. Estructura genética de X. axonopodis. Modificado de Mhebdi-Hajri y col. 2013.. El genoma de las especies pertenecientes al género Xanthomonas, de forma general, está compuesto por un único cromosoma circular de 4,8 a 5,3 Mpb, con un contenido en GC (Guanina-Citosina) de más del 60% y presencia de plásmidos, que pueden comprender desde un plásmido para X. arboricola pv. pruni (Garita-Cambronero et al., 2014) a cuatro para X. axonopodis pv. vesicatoria. El porcentaje del genoma cubierto por marcos de lectura abierto varía entre el 83,9% en X. oryzae pv. oryzae al 90,3% en Xcc (Ryan et al., 2011). En los genomas secuenciados de Xanthomonas se han identificado aproximadamente el mismo número de genes (entre 4.600 y 5.800) que en las alfaproteobacterias, betaproteobacterias y gammaproteobacterias así como dos operones para ARN ribosomal. Poseen además, elementos posiblemente procedentes de los Reinos Archaea, Eukarya y Virus. Se han descrito variaciones adicionales en en los plásmidos de algunas cepas que varían entre 2 y 138 kb y que contienen genes que codifican para efectores del Sistema de Secreción tipo III (SST3) y el Sistema de Secreción tipo IV (SST4) entre otros (Comas et al., 2006; Lima et al., 2008; Lu et al., 2008; Ryan et al., 2011). Existen dos clúster relacionados con patogénesis comunes en el genoma de todas las Xanthomonas secuenciadas, el clúster xps, que codifica para el Sistema de Secreción. 5.

(26) Introducción. tipo II (SST2) y el clúster rpf (regulation of pathogenicity factors), de regulación de factores de patogenicidad (Ryan et al., 2011). El SST2 está encargado del transporte de enzimas degradadoras de la pared celular, está presente en todas las Xanthomonas, en Xylella fastidiosa y el género Stenotrophomonas. Además Xanthomonas campestris pv. campestris, Xanthomonas citri subsp. citri y Xanthomonas euvesicatoria poseen un segundo SST2 cuya función no parece estar relacionada con virulencia. El sustrato de este sistema de secreción es variable en función de la especie, por lo que es posible que también influya en los procesos que determinan la especificidad de huésped. Otros dos elementos relacionados con virulencia comunes a todas las Xanthomonas, menos a X. albineans, son el SST3 que tiene como función inyectar efectores de virulencia en las células del huésped y los genes gum, encargados de la producción del exopolisacárido característico de este género, la denominada goma xanthana. Se han identificado en el género Xanthomonas hasta 53 efectores de virulencia. Algunos de estos efectores poseen un papel determinante en virulencia o avirulencia y pueden ser responsables de restringir la gama de huésped a unas especies vegetales o incluso a variedades dentro de una misma especie vegetal. Todas las Xanthomonas estudiadas, a excepción de X. campestris pv. armoraciae con solo seis efectores y X. albineans sin efectores descritos, poseen nueve efectores comunes (xopR, xopK, xopL, xopN, xopP, xopQ, xopX, xopZ y avrBs2). Además se han descrito cuatro efectores conservados tanto en X. axonopodis, como en aquellas especies denominadas como tal en el pasado: xopF1, xofE2, avrXacE3 y pthA. Otros efectores de virulencia descritos se han relacionado con una única especie bacteriana en un huésped determinado, como es el caso de varios genes xop presentes en X. campestris causantes de enfermedad en crucíferas o los genes xopA1 y xopE3, localizados en islas de patogenicidad (o genómicas) en X. citri subsp citri o X. fuscans subsp. aurantifolii ambos patógenos de cítricos y X. arboricola pv. pruni patógena de frutales de hueso (Garita-Cambronero et al., 2014; Moreira et al., 2010b; Ryan et al., 2011). Otros elementos relacionados con patogénesis y asociados a la especificidad de huésped o tejido son los distintos tipos de adhesinas, tanto fimbriales como no fimbriales (Ryan et al., 2011), los sensores ambientales tales como las proteínas aceptoras de grupos metilo (MCPs: Methyl Accepting Chemotaxis Proteins), los sensores de los sistemas de regulación de dos componentes (STCR: Sensors of Two-Component Regulatory System) y los transportadores dependientes de TonB (TBDT: TonB-Dependent Transporters). Se 6.

(27) Introducción. ha descrito que la mayoría de los patovares pertenecientes al género Xanthomonas poseen patrones distintos de las proteínas anteriores, siendo X. citri subsp. citri el que posee el mayor número de patrones distintos. Además se ha demostrado que muchos de esos genes se encuentran bajo selección positiva en la planta huésped (Mhedbi-Hajri et al., 2011a; Mhedbi-Hajri et al., 2011b; Ryan et al., 2011).. 2. Cancrosis o Chancro de los Cítricos La cancrosis o chancro de los cítricos está causada por las especies Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) y X. fuscans subsp. aurantifolii (Xfa), es una enfermedad distribuida en zonas tropicales y subtropicales productoras de cítricos (Figura 3, pág. 8). En la actualidad se encuentra distribuida en más de 30 países pertenecientes a Asia, África, América y Oceanía. La primera detección de la enfermedad tuvo lugar en el siglo XIX, en la India, considerándose esta zona como el centro de origen de la enfermedad (Bitancourt, 1957; Civerolo, 1984; Civerolo, 1985; Mohammadi et al., 2001). Hoy en día el chancro de los cítricos es una de las enfermedades de cítricos que ha causado mayores pérdidas económicas en la producción de cítricos a nivel mundial (Stall y Civerolo, 1991). Las Xanthomonas causantes de chancros en cítricos son catalogadas como patógenos de cuarentena en las zonas productoras de cítricos donde no está presente. En la Unión Europea (UE) están consideradas como organismos de cuarentena y se encuentran reguladas por la Directiva de la comunidad europea 2000/29/EC (Diario Oficial de las Comunidades Europeas, 2000). Además se encuentra en la lista de patógenos de cuarentena de la Organización Europea y Mediterránea para la Protección Vegetal (EPPO, 2005), en la Organización de Protección Vegetal Norteamericana (North American Plant Protection Organization, NAPPO), la Comisión Fitosanitaria InterAfricana (Inter-African Phytosanitary Commission, IAPSC), y el Board of the Cartegena Agreement (JUNAC). 2.1. Tipos de cancrosis o chancros descritos Existen distintos tipos de chancros de los cítricos en función de las cepas bacterianas que los producen. Todas ellas, dan lugar a síntomas muy similares, aunque muestran diferente gama de huésped (Stall y Civerolo, 1991) (Figura 4). Además, las cepas 7.

(28) Introducción. responsables se han podido separar y caracterizar en función de la sensibilidad a fagos, características. serológicas,. patrones. de. RFLPs. (Restriction. fragment. length. polymorphism) y también es posible separarlas mediante PCR (Polymerase chain reaction) y la utilización de distintos cebadores, entre otros (Gottwald et al., 2002a).. Figura 3. Distribución a nivel mundial de Xanthomonas citri subsp. citri (EPPO, 2005).. Figura 4. Tipos de chancros descritos y su virulencia en susceptibilidad a la enfermedad (Brunings y Gabriel, 2003).. 8. plantas huéspedes con distinta.

(29) Introducción. 2.1.1. Chancro o cancrosis tipo A (Asiatic Citrus Canker) El chancro tipo A está causado por Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) (anteriormente como Xanthomonas axonopodis pv. citri) (Schaad et al., 2005) es originario del continente asiático.y es el que tiene mayor importancia económica por encontrarse distribuido a nivel mundial, e incluso haber desplazado a los tipos B y C allí donde estaban presentes (Stall y Civerolo, 1991). El chancro tipo A es el más agresivo y es capaz de producir enfermedad en la mayoría de las especies de cítricos, además de en otros géneros pertenecientes a las Rutaceae, como por ejemplo el naranjo espinoso o trifoliado (Poncirus trifoliata). Los cítricos más susceptibles son pomelo (Citrus paradisi), naranjo dulce (Citrus sinensis), lima mejicana (Citrus aurantifolia) y algunos híbridos utilizados como píes en los injertos. Entre los menos susceptibles se encuentran el mandarino (Citrus x tangerina) y el kumquat (Fortunella margarita) (Graham et al., 2004). Está descrito que la resistencia en kumquat se debe a la activación de genes relacionados con la muerte celular programada y la respuesta hipersensible: degradación de proteínas, producción de especies reactivas de oxígeno y regulación de la fotosíntesis (Abeer A Khalaf et al., 2011). Estudios comparativos de los transcriptomas del kumquat (tolerante al chancro) y del naranjo dulce (susceptible) han mostrado que, durante la infección, ambas especies activan genes relacionados con defensa, entre ellos quitinasas y glucanasas En el kumquat se activan un mayor número de genes de este tipo, mientras que en el naranjo dulce se reprimen, muchos de ellos relacionados con fotosíntesis (Fu et al., 2012). Dentro del chancro tipo A están descritos varios subgrupos de CBC. El primero de ellos se ha denominado tipo A* (Vernière et al., 1998), inicialmente identificado en Oman, Arabia Saudí, Irán e India. Tiene un impacto importante en los cultivos de lima mejicana en Asia y África (Derso et al., 2009; Ngoc et al., 2007). Las cepas de Xcc tipo A* poseen una limitada gama de huésped, pudiendo únicamente producir lesiones típicas de la enfermedad en lima mejicana aunque son capaces de dar lugar a manchas acuosas en otros cítricos y de aumentar su población en hojas de pomelo al mismo nivel que Xcc tipo A (Escalon et al., 2013; Rybak et al., 2009; Vernière et al., 1998). Las cepas tipo A* poseen características similares a las de los chancros tipo B y C respecto a la gama de huésped sin embargo las pruebas de hibridación de ADN, amplificación por PCR con cebadores específicos , perfil de RFLPs y otras pruebas fenotípicas las clasifican claramente dentro del grupo de las Xcc A. Comparten además con Xcc A el 9.

(30) Introducción. patrón de asimilación descrito para el tipo A en las placas de Biolog® GN para Lfucosa, D-galactosa y alaninamida (Vernière et al., 1993), aunque no reacciona con el anticuerpo altamente específico MAb A1 ni con el antisuero policlonal para la cepa modelo Xcc 62 (tipo A) (Vernière et al., 1998). La cepa Xcc Aw fue descrita en el Sur de Florida (EEUU) en el año 2000 en lima mejicana y Citrus macrophylla (Sun et al., 2004), aunque parece ser originaria de la India (Bui Thi Ngoc et al., 2009; Schubert et al., 2001). Al igual que las cepas tipo A*, posee una limitada gama de huésped pero es capaz de producir respuesta hipersensible en pomelo Duncan cuando es inoculado por infiltración. Presenta un perfil similar en las placas de Biolog® GN que las cepas tipo Xcc A y A*, además de las mismas características génicas, sin embargo al igual que Xcc A* no reacciona con el anticuerpo MAb A1 lo que permite distinguirlas de las cepas de amplia gama de huésped (Cubero y Graham, 2002; Sun et al., 2004). Se han descrito otros tipos de cepas de CBC en Taiwán que también pertenecen al chancro tipo A, pero que son consideradas subgrupos distintos (Af, Ar y Ap). El subgrupo Af es capaz de producir infección en lima mejicana, siendo solo capaz de producir lesiones necróticas en otros hospedadores, al igual que sucede con los subgrupos Aw y A*. El subgrupo Ar parece tener amplia gama de huésped produciendo lesiones típicas de chancro que carecen del halo acuoso alrededor de la lesión, posiblemente debido a una mutación en el gen que codifica para la pectina Pel1 (Lin et al., 2010). El subtipo del chancro tipo A descrito como Ap, únicamente es capaz de producir lesiones necróticas planas con halo clorótico y mancha acuosa en todos los huéspedes. Estas cepas originarias de Taiwán comparten con Xcc las características bioquímicas y fisiológicas descritas para esta subespecie, diferenciándose de las cepas de limitada gama de huésped en los análisis ERIC-PCR, amplificación por PCR convencional con primers específicos para Xanthomonas asociadas a cítricos, secuencias del gen lrp, y actividad pectolítica que diferencia el grupo Ar del resto de las Xcc descritas (Lin et al., 2005; Lin et al., 2008). 2.1.2. El Chancro tipo B El chancro tipo B está causado por Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii (anteriormente Xanthomonas axonopodis pv. aurantifolii) y fue descrito en Argentina en 1923 (Civerolo, 1984). Las cepas de este tipo de chancro producen enfermedad en. 10.

(31) Introducción. limonero, lima mejicana, naranjo amargo y pomelo. El chancro tipo B se distingue del chancro tipo A a pesar de ser igual de virulento en un huésped altamente sensible como el limonero (Gottwald y Timmer, 1995). Las cepas del tipo B se distinguen de las del chancro tipo A en la utilización de lactosa y maltosa, la susceptibilidad al fago CP3 y en algunas características serológicas y moleculares (Gottwald et al., 2001; Graham et al., 2004; Stall y Civerolo, 1991). 2.1.3. El Chancro tipo C Al igual que el chancro tipo B, está causado por Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, fue descrito en lima mejicana en el año 1963 en el Estado de San Paulo en Brasil. Las cepas de este chancro producen enfermedad tanto en lima mejicana como en naranjo amargo. Estas cepas se distinguen de las de los chancros anteriores por su resistencia a los fagos CP1 y CP2 y por otras características serológicas y moleculares (Gottwald et al., 2001; Graham et al., 2004; Stall y Civerolo, 1991). 2.1.4. Chancros tipo D y E Otras enfermedades causadas por bacterias y hongos fueron descritas como chancros de los cítricos, pero posteriormente se determinó que eran enfermedades distintas, es el caso de los chancros tipo D y E. El primero se describió en Méjico en 1981, la enfermedad cumplía con las características típicas de los chancros tipo A, pero producía un reducido número de lesiones en hojas y tallo de cítricos. Fue denominado bacteriosis de los cítricos. Posteriormente, se determinó que dicha enfermedad era producida por Alternaria limicola y la enfermedad se denominó mancha de los cítricos (Graham et al., 2004; Stall y Civerolo, 1991). El segundo de ellos denominado actualmente mancha bacteriana de los cítricos (en adelante CBS, del inglés “Citrus Bacterial Spot”), está causado por X. alfalfae subsp. citrumelonis y es un problema menor en plantas de vivero. Esta enfermedad se caracteriza por la aparición de lesiones planas de color pardo con mancha acuosa alrededor en hojas y tallos en diversas variedades de cítricos (Graham et al., 2004; Stall y Civerolo, 1991). La aparición de CBS en Florida y la confusión inicial en la identificación y caracterización de las cepas bacterianas causantes, dio lugar a un programa de erradicación que supuso un altísimo coste para el estado y los productores. Aún hoy en día es frecuente el error cuando el diagnóstico de la enfermedad se basa únicamente en la observación de síntomas (Graham et al., 2004).. 11.

(32) Introducción. 2.2. Descripción de la enfermedad Toda la parte aérea de la planta es susceptible a la infección por el chancro de los cítricos, aunque cuando las hojas y frutos se encuentran completamente desarrollados son menos susceptibles a la enfermedad (Graham et al., 2004). En el medio natural la infección óptima tiene lugar con un inóculo de 104-105 cfu/ml cuando se inoculan estomas y entre 102 y 103 si se inocula por herida, a pesar de esto, los síntomas pueden producirse por la presencia de un número muy limitado de bacterias (Gottwald y Graham, 1992). 2.2.1. Síntomas En hojas las infecciones se producen por la entrada del patógeno a través de estomas o heridas (Graham et al., 1992a; Graham et al., 1992b; Koizumi y Kuhara, 1980; Pruvost et al., 2002). Los primeros síntomas comienzan a aparecer aproximadamente a los nueve días de la inoculación como pequeños abultamientos en la superficie foliar. Según va avanzando la enfermedad, las lesiones adquieren un tono marrón rodeado de un halo clorótico y aparecen manchas acuosas que desaparecen con el tiempo. El centro de la lesión se eleva sobre la superficie de la hoja adquiriendo una textura esponjosa y acorchada que normalmente adopta forma de cráter (Figura 5 A, B, D, E y F, pág. 13). Cuando la enfermedad se hace más acusada puede producir caída tanto de hojas como de frutos provocando una disminución en la producción (Schubert et al., 2001). En frutos los síntomas son similares a los de las hojas; lesiones elevadas de textura acorchada rodeadas de halos acuosos (Figura 5 C, pág. 13). Son variables en tamaño y únicamente tiene lugar en la parte más externa de la piel (Civerolo, 1984). Cuando el fruto tiene un tamaño comprendido entre 20 y 40 mm las lesiones aumentan durante un periodo de 106 días aproximadamente (Graham et al., 1992b).. 12.

(33) Introducción. Figura 5. Síntomas producidos por Xanthomonas citri subsp. citri en hojas de lima mejicana (A, E y F) (E y F: microscopía electrónica de barrido de las lesiones) y en campo de hojas y frutos de pomelo (B, C y D). En la imagen C se puede ver el exudado proveniente de las lesiones. Fotos realizadas por Marta Sena Vélez.. Las lesiones en los brotes y ramas son similares a las observadas en hojas y frutos, pero no producen halo clorótico. Además, perpetúan el inóculo prolongando la vida del patógeno que puede ser el origen para las nuevas infecciones (Graham et al., 2004).. Figura 6. Lesiones de Xcc producidas en ramas (Gottwald et al., 2002a).. 13.

(34) Introducción. La aparición de síntomas y la severidad de los mismos pueden depender de varios factores, como la edad del tejido, la temperatura y la humedad. La edad o estado de desarrollo del tejido es uno de los factores que más afecta a la formación de manchas acuosas, penetración de la bacteria y desarrollo de los síntomas (Graham et al., 1992b). Además, es un factor importarte en inoculaciones de la bacteria mediante pulverización en hojas y frutos, siendo este método el que mejor simula el proceso natural de infección. La sensibilidad de las hojas jóvenes se debe a su mayor capacidad para acumular agua en su superficie y a la menor abundancia de ceras que puedan dificultar la entrada del patógeno (Figura 7). Sin embargo, el tamaño y número de estomas en la superficie foliar no varía con la edad de la hoja por lo que la diferencia en la susceptibilidad de las hojas jóvenes no está relacionada con este hecho (Gottwald y Graham, 1992; Graham et al., 1992a).. Figura 7. Microscopía electrónica de transmisión (TEM) de la cara abaxial de hojas de pomelo (Citrus paradisi) en distintos estados de desarrollo de la hoja (A) 50% de la expansión, la cutícula todavía no se ha formado sobre la pared celular. (B) 75% de la expansión, la cutícula es un 15% del grosor final. (C) hoja desarrollada y cutícula completamente formada. Graham et al. 2004. 14.

(35) Introducción. El periodo de mayor susceptibilidad de la hoja tiene lugar cuando éstas se encuentran entre un 50 y un 75 % del desarrollo total (Gottwald y Graham, 1992). El periodo de mayor susceptibilidad de los frutos comprende desde la caída de los pétalos de la flor hasta el completo desarrollo, siendo especialmente sensibles cuando tiene lugar la formación de los estomas (Graham et al., 1992b). Los frutos muy jóvenes, con menos de 20 mm de diámetro, presentan una susceptibilidad menor debido a que los estomas no se han formado todavía. Si la infección tiene lugar cuando éstos se encuentran en una etapa temprana del desarrollo se produce mayor sintomatología y se llegan a producir roturas y malformaciones del fruto (Vernière et al., 2003). Cuando se inoculan frutos de forma artificial, bien produciendo heridas o por pulverización, aquellos que tienen un menor tamaño (entre 15 y 20 mm) muestran una mayor sensibilidad a la enfermedad. Esta sensibilidad disminuye durante la maduración del fruto como consecuencia de la secreción de ceras y el desarrollo estomático que hacen que el fruto retenga menos cantidad de agua en superficie (Gottwald y Graham, 1992; Graham et al., 1992b; Vernière et al., 2003). A pesar de que los frutos maduros son muy poco susceptibles a la infección pueden contener bacterias en su superficie y especialmente en heridas que suponen reservorios y fuente de inóculo de nuevas infecciones (Gottwald et al., 2009). Los brotes y los tallos también son susceptibles de ser infectados, generalmente mediante heridas naturales o producidas durante el manejo del cultivo y, sobre todo, se producen en tejidos poco lignificados. Son importantes porque, pueden servir de reservorio de inóculo por periodos más prolongados de tiempo que las hojas o los frutos (Vernière et al., 2003). La temperatura óptima para el desarrollo de síntomas se encuentra entre 20ºC y 30ºC con un máximo de 35ºC (Christiano et al., 2009; Dalla Pria et al., 2006; Graham et al., 2004). Pocas veces se observan lesiones a temperatura mayores de 42ºC o menores de 10ºC. Además, el número, tamaño y densidad de las lesiones aumenta con la temperatura desde los 15 a los 35ºC (Figura 8). Para que se produzcan síntomas las plantas requieren un mínimo de humedad, que tiene un especial efecto en el número, tamaño y densidad de las lesiones, especialmente a temperaturas mayores de 30ºC (Dalla Pria et al., 2006; Christiano et al., 2009).. 15.

(36) Introducción. Figura 8. Efecto combinado de la temperatura y la humedad en el desarrollo del chancro de los cítricos en lima de Tahití en plantas de 25 cm de altura en cámaras de cultivo (Christiano et al., 2009). En la gráfica A se ve el efecto de estos factores en el área debajo de la curva, B la densidad de lesiones, C el tamaño de la lesión y D la severidad.. La enfermedad se ve favorecida por climas en los que la temperatura y la lluvia ascienden y desciende al mismo tiempo, haciéndose por lo tanto más severo en áreas cálidas y húmedas como son las zonas tropicales o subtropicales (Das, 2003). En zonas como Argentina o Japón donde existen inviernos fríos, la población bacteriana disminuye a causa de las bajas temperaturas que tienen lugar en esa época del año (Koizumi, 1977; Stall et al., 1980). Sin embargo en zonas tropicales como la Isla Reunión la población permanece constante durante todo el año (Pruvost et al., 2002). 2.2.2. Ciclo de la enfermedad y epidemiología Como se ha mencionado anteriormente Xcc es capaz de multiplicarse en todas las partes aéreas de la planta, tanto hojas y frutos, como ramas y brotes. Desde la cavidad subestomática y en presencia de agua en superficie las bacterias son capaces de salir al exterior a través de los estomas pudiendo propagarse y producir nuevas infecciones. 16.

(37) Introducción. (Figura 9A). El número de bacterias que se libera al exterior es solo una parte de la población bacteriana, que se ha calculado aproximadamente en unas 100 unidades formadoras de colonia (ufc, en adelante) por mililitro (mL) en lesiones jóvenes de entre 4 y 6 meses. Si las lesiones son más antiguas, la liberación de bacterias es menor y va disminuyendo con el tiempo (Timmer et al., 1991). El agua de lluvia recogida de hojas con lesiones puede contener alrededor de 100 ufc mL-1. El mejor agente de dispersión de Xcc es el viento, aunque ésta también tiene lugar por la arena transportada en él o la maquinaria y enmiendas agrícolas. La dispersión se ve favorecida por daños mecánicos y actividades humanas como el movimiento de variedades de una zona geográfica a otra (Gottwald et al., 2002a; Irey et al., 2006).. Figura 9. A: bacterias saliendo de un estoma a las 48 horas de la inoculación; B: heridas producidas por el movimiento del viento y las espinas de la planta infectadas con Xcc; C: Phyllocnistis citrella Stainton, minador de los cítricos en estadio adulto y larva en la hoja; D: dispersión del patógeno en hoja causada por el minador de los cítricos. Gottwald et al. 2002.. 17.

(38) Introducción. No se ha podido probar la diseminación de Xcc a través de insectos, sin embargo el minador de los cítricos Phyllocnistis citrella (Stainton) favorece el desarrollo de la enfermedad, tanto en hojas como tallos jóvenes (Figura 9-C y D) y en algunos casos frutos de pequeño tamaño (Graham et al., 2004). El daño causado por este insecto es debido a la formación de galerías producidas por la alimentación y el movimiento del insecto que favorece la proliferación de Xcc en el espacio subcuticular parenquimático. La formación de galerías y la degradación del tejido vegetal producen un aumento en el número de lesiones y la infección causada por el chancro de los cítricos (Heppner, 1993). Las galerías hacen que el tejido sea más susceptible durante un periodo comprendido entre 7 y 14 días, mientras que las causadas por espinas o poda solo lo son durante 24 horas (Das, 2003). Cuando se inoculan plantas con el segundo y tercer estadío larvario o con la pupa del minador, los daños causados por el chancro son entre el 95 y 100% de hojas infectadas porcentaje similar al producido por heridas mecánicas (Chagas et al., 2001). Cuando la superficie foliar de los cítricos infectados con Xcc se recubre de agua, las bacterias se liberan al exterior de la planta, sirviendo de inóculo para nuevas infecciones. La cantidad de agua mínima necesaria para que se liberen las bacterias es de 8 mm h-1. El número de bacterias que se libera de los estomas disminuye con la duración de la lluvia como consecuencia de una disminución en el inóculo disponible (Timmer et al., 1991) y está relacionado con la población en el interior de la hoja (Pruvost et al., 2002). El número de lesiones disminuye en ausenciade lluvia puesto que las hojas viejas se caen y los nuevos tejidos no son infectados (Gottwald y Timmer, 1995). El viento se ha descrito como la forma de dispersión más importante, tanto el seco como aquel que contiene gotas de agua en las que la bacteria está presente (Gottwald y Irey, 2007; Irey et al., 2006). El viento fuerte hace que las hojas y lesiones sean fuentes de inóculo más eficientes (Bock et al., 2010a; Bock et al., 2010b) y de hecho el uso de barreras de viento para proteger los huertos se ha revelado como un método eficaz para el control de la enfermedad (Gottwald y Timmer, 1995). Se ha demostrado que en condiciones de calma o viento suave, las hojas y gotas de agua que contienen el inóculo se depositan en zonas cercanas o directamente en el suelo. Con el aumento de la velocidad del viento, alrededor de 8 m sg-1, se produce un aumento de la cantidad de inóculo que puede ser desplazado a distancias mayores, lo que produce 18.

(39) Introducción. nuevos focos de infección en el campo. Además, las condiciones de viento turbulento favorecen la dispersión del patógeno dentro de la misma planta, así como la entrada del mismo al interior celular lo que produce un aumento en la severidad de la enfermedad (Bock et al., 2010a; Bock et al., 2012; Pruvost et al., 2002).. Figura 10. Ciclo del chancro de los cítricos (Sena-Vélez et al., 2015a).. Una vez se encuentran en la superficie vegetal, las bacterias causantes de chancros en cítricos entran por estomas o heridas al apoplasto donde son capaces de crecer y multiplicarse. La bacteria es capaz de sobrevivir siempre que esté relacionada con la planta huésped, ya sea en los márgenes de las lesiones de hojas y frutos en el árbol o en el suelo hasta que se descomponen, además pueden sobrevivir en las ramas infectadas durante varios años (Gottwald et al., 2002a). Establecida la infección la población bacteriana disminuye significativamente con el tiempo. Las lesiones de 1 a 6 meses tienen una población mayor que las lesiones de 8 a 18 meses. Alrededor de los 8 y 10 meses la población disminuye una unidad logarítmica y a los 18 meses 1,5 unidades logarítmicas. En la superficie foliar el número de bacterias detectadas está comprendido entre 102 y 103 cfu por gramo de hoja (Pruvost et al., 2002).. 19.

(40) Introducción. 2.3. Diagnóstico y detección En general no existen tratamientos químicos efectivos para el control de bacterias fitopatógenas, por lo que la mejor medida de control para las bacteriosis es la prevención (López et al., 2009). Esta medida es especialmente importante en el caso de enfermedades de cuarentena como el chancro o cancrosis de los cítricos en la Unión Europea (Diario Oficial de las Comunidades Europeas, 2000). La utilización de técnicas precisas y eficientes de detección e identificación es fundamental para prevenir la propagación de un patógeno y especialmente para el control del material vegetal. Los síntomas causados por Xcc pueden confundirse con los producidos por otras enfermedades como la sarna de los cítricos causada por Elsinoe fawcettii en naranjo dulce y limonero, la antracnosis causada Glomerella cingulata o la melanosis causada por Diaporthe citri, con lo cual la observación visual no es suficiente para el diagnóstico correcto de la enfermedad (EPPO, 2005). Además, es conocida la existencia de cepas de Xanthomonas saprófitas en cítricos que no son Xcc, por lo que una correcta identificación de las cepas es imprescindible para evitar errores que puedan llevar pérdidas innecesarias como las producidas en Florida en el caso de la mancha bacteriana de los cítricos (EFSA Panel on Plant Health, 2014; Graham et al., 2004). Para el diagnóstico y detección de Xcc existen un gran número de metodologías que han ido mejorando a medida que han avanzado las técnicas de biología molecular y su aplicación a la patología vegetal. Oficialmente a nivel europeo no existe ningún protocolo para la detección del patógeno, sin embargo la EPPO (European and Mediterranean Plant Protection Organization) desarrolló un protocolo (PM 7/44(1)) en el año 2005 que se usa en varios laboratorios de la Unión Europea (EPPO, 2005). En agosto de 2014, se publicó un protocolo por parte de la IPPC-FAO (International Plant Protection Convention) que ha sido coordinado por investigadores de Brasil, Uruguay y España, donde se describen protocolos para la detección de este patógeno en plantas tanto sintomáticas como asintomáticas (Figura 11) (IPPC-FAO, 2014). En ambos protocolos se describen técnicas similares.. 20.

(41) Introducción. Figura 11. Protocolo IPPC para la detección de Xcc en plantas (IPPC-FAO, 2014).. 21.