Motilidad dependiente del flagelo

El flagelo es la estructura que más se ha relacionado con motilidad y quimiotaxis en bacterias, además está implicado en virulencia, adhesión a superficies y posterior formación y dispersión de biopelículas (Soutourina y Bertin, 2003). Posee una estructura helicoidal anclado a la membrana bacteriana mediante el cuerpo basal y unido al motor que permite su movimiento (Figura 20) y puede tener una longitud de hasta 15 µm y un diámetro de 0,02 µm (Jarrell y McBride, 2008; Rossez et al., 2015). Posee una estructura altamente compleja formada por un gran número de proteínas distintas, cuya expresión se encuentra altamente regulada dado el alto requerimiento energético necesario para su síntesis (Jarrell y McBride, 2008). La homología entre los distintos grupos de proteínas que la componen y su similitud con el SST3 sugieren que esta estructura ha surgido mediante la duplicación y diferenciación de sus genes, siendo el producto de miles de años de evolución (Evans et al., 2014; Pallen y Matzke, 2006). La estructura del flagelo se ha estudiado ampliamente tanto en Salmonella como en E. coli, siendo bastante similar a la de la mayoría de las bacterias salvo por pequeñas

modificaciones. Además hay géneros bacterianos que poseen más de un sistema flagelar como es el caso de Aeromonas o Vibrio entre otros (McCarter, 2004). Estas bacterias poseen un flagelo polar similar al del resto de las bacterias y flagelos laterales cuyas secuencias difieren de la del flagelo polar y son codificadas por los genes laf. Los flagelos laterales participan en swarming, pero no en swimming, participando además en colonización y formación de biopelículas. Este sistema está relacionado con la adhesión a células animales en Aeromonas causantes de diarrea y a las cubiertas de quitina presentes en los crustáceos en Vibrio (Kirov et al., 2002; Kirov et al., 2004; McCarter, 2001; McCarter, 2004).

Figura 20. Visualización de flagelos en Xcc Aw 12879. A y B, microscopía electrónica de transmisión de bacterias incubadas en placas de LB durante 48h. C y D, microscopía óptica de bacterias en biopelículas de 72 h, teñidas mediante tinción de flagelos, C magnificación 1000x y D ampliación digital de la imagen con magnificación 1000x. En ambas imágenes se puede observar la presencia de un único flagelo polar que tiene forma helicoidal y puede ser de longitud variable, llegando a ser casi 10 veces el tamaño de la bacteria. Fotos realizadas por Marta Sena Vélez.

El filamento del flagelo es una estructura helicoidal que funciona como propulsor de la bacteria y está formado por varias subunidades iguales de flagelina (FliC), a razón de

once unidades por cada dos vueltas de la hélice, que componen los once profilamentos. En algunos casos puede tener otras subunidades menores presentes. Además en el extremo terminal del filamento se encuentra la proteína HAP2 (Proteína asociada al gancho del inglés Hook Associated Protein) que forma la cubierta del mismo y es necesaria para una correcta formación del filamento (Galkin et al., 2008; McCarter, 2001; Rossez et al., 2015; Vonderviszt et al., 1995). El filamento tiene una estructura rígida cuya forma depende de la secuencia aminoacídica, el pH, la fuerza iónica y la torsión del mismo que puede ser rizada cuando el motor gira en sentido opuesto a las agujas del reloj o semienroscada si gira en el sentido de las agujas del reloj (Berg, 2003).

El gancho o garfio es una estructura corta, curva, más o menos flexible que une el filamento al cuerpo basal de flagelo. Está formado por alrededor de 120 copias de una proteína única denominada FlgE y dos proteínas asociadas HAP1 y HAP3, que unen el filamento con el gancho y sirven de adaptadores tanto estructurales como mecánicos. El filamento presenta una estructura más o menos rígida y el garfio posee una estructura más flexible que le permite transmitir el movimiento desde el motor al filamento y funcionar además, junto con el cuerpo basal, como exportador de componentes estructurales y reguladores como el factor anti-σ-FlgM (McCarter, 2001; Samatey et al., 2004). El ensamblaje tanto del filamento como del gancho tiene lugar de forma similar, a partir de once protofilamentos, sin embargo las subunidades de flagelina que conforman el filamento presentan en su mayoría estructuras de α-hélice, mientras que las subunidades del gancho lo hacen en láminas-β. Esta variación confiere mayor flexibilidad al gancho y una mayor rigidez al filamento que le permite funcionar como propulsor (Vonderviszt et al., 1995; Samatey et al., 2004).

El cuerpo basal consiste en una estructura central con complejos protéicos en forma de anillo, se encuentra embebido en la membrana bacteriana (DePamphilis y Adler, 1971; Jarrell y McBride, 2008). Esta estructura se encarga de la exportación de los componentes del flagelo como las proteínas del eje central y el gancho a traves de las membrana interna y externa (Minamino y Macnab, 1999) y contiene el motor flagelar (Berg, 2003).

Figura 21. Estructura del flagelo de E. coli y S. enterica y diversidad de algunos de los genes implicados en su formación y estructura (Pallen et al., 2005).

Los anillos que posee esta estructura se encuentran en las distintas zonas de la membrama bacteriana, el anillo L se encuentra embebido en el lipolisacárido presente en la membrana externa, y parece estar relacionado con el transporte de los componentes del gancho y el filamento, el anillo P se encuentra en la capa de peptidoglicano. Estos dos anillos solo están presentes en bacterias Gram negativas dada la estructura de su membrana (Figura 22) (DePamphilis y Adler, 1971; Jarrell y McBride, 2008; Minamino y Macnab, 1999).

El anillo MS se localiza entre la membrana citoplasmática y el espacio periplasmático y el anillo C en el citoplasma, ambos anillos participan en la secreción de todos los sustratos relacionados con la formación del flagelo y en la rotación del mismo. Las

proteínas presentes en el anillo C activan y controlan la dirección de giro del flagelo (Berg, 2003; Minamino et al., 2008).

Figura 22. Microscopía electrónica de transmisión de los flagelos purificados de E. coli (A) y B. subtilis (B). En las imágenes se pueden ver las diferentes estructuras de los cuerpos basales, modificado de (DePamphilis y Adler, 1971). (C) Modelo del sistema de exportación de las proteínas del flagelo a través del cuerpo basal (Minamino y Macnab, 1999).

El motor flagelar mide alrededor de 50 nm de diámetro, está compuesto por varios tipos de proteínas, es capaz de girar a unas 100.000 rpms cuando la energía se obtiene a través de protones y a 18.000 rpms cuando utiliza iones sodio (Minamino et al., 2008; Jarrell y McBride, 2008). Posee cuatro partes principales, el rotor formado por los anillos MS y C, el eje de accionamiento que corresponderá con el eje central del cuerpo basal y el cojinete que está formado por los anillos L y P (Minamino et al., 2008). El estátor se compone de once o doce complejos MotA y MotB que son proteínas transmembrana que permiten el paso de protones hasta el citoplasma. La energía producida con el paso de los iones genera una fuerza electrostática que se transmite al rotor, se produce un cambio conformacional en MotA y activa el giro del rotor a través de la proteína FliG del anillo C produciendo un par de torsión que producirá el giro del flagelo (Minamino et al., 2008; Thormann y Paulick, 2010). Además de las proteínas MotA y MotB existen otras proteínas relacionadas con la generación de energía para el giro. En algunas especies de Vibrio o Aeromonas la energía se genera a través del paso de iones sodio, siendo las proteínas que permiten el paso PomA y PomB, que parecen actuar junto con MotC y MotD para favorecer la interacción. En Vibrio además la energía para el giro de los flagelos laterales proviene del paso de protones (McCarter, 2001; Thormann y Paulick, 2010). En el caso de P. aeruginosa existen dos tipos de

estátores, cualquiera de los dos es válido para el movimiento tipo swimming, sin embargo no son redundantes para el movimiento tipo swarming, siendo más importante el estátor MotCD, además parecen influir en el twitching y en la adhesión a superficies (Toutain et al., 2005; Toutain et al., 2007). En P. syringae pv. tabaci el comportamiento parece ser distinto puesto que el estátor MotCD parece influir más en swimming,

swarming y adhesión a superficies (Kanda et al., 2011). En Xcc y X. campestris pv.

campestris existen los genes correspondientes a los dos tipos de estátores, sin embargo no se ha descrito su papel en motilidad o adhesión (da Silva et al., 2002; Thormann y Paulick, 2010).

El ensamblaje tiene lugar mediante el paso de las distintas proteínas a través del cuerpo basal que posee una estructura similar al SST3. Las primeras proteínas que se ensamblan son los anillos MS y C que forman el canal que atraviesan el resto de las proteínas. Las distintas subunidades recién sintetizadas se transportan hacia la entrada donde se linearizan y se estabilizan con chaperonas específicas para cada subunidad, posteriormente atraviesan en esta forma todo el canal hasta el lugar donde se tienen que ensamblar. El ensamblaje tiene lugar desde dentro hacia afuera, primero el eje transversal, el gancho, la cubierta del filamento o HAP2 y finalmente el filamento desde la zona distal hasta las subunidades más cercanas a la membrana. La traslocación de las diferentes subunidades a través de la membrana requiere hidrólisis de ATP y fuerza protomotriz (Evans et al., 2014).

La complejidad del flagelo y el gran número de proteínas que participan en su formación hacen que sea un proceso altamente regulado. Los genes que codifican para las distintas proteínas se encuentran regulados en forma de cascada, de manera que primero se activan los genes que regulan la formación del flagelo, posteriormente los que componen el cuerpo basal, el sistema de secreción, el gancho y los genes que activan la transcripción de las flagelinas, finalmente los genes relacionados con quimiotaxis y el motor flagelar. Aunque en esencia la regulación del flagelo sigue unas pautas similares para todas las especies bacterianas existen variaciones en el tipo de reguladores y determinadas proteínas en función del tipo de flagelación que presente la bacteria, perítrica o polar (Soutourina y Bertin, 2003). La regulación del flagelo se ha descrito para X. campestris pv. campestris cuyo proceso se puede ver en la Figura 23 (Yang et al., 2009), la describiremos a continuación y posteriormente la compararemos con otros sistemas de regulación.

Figura 23. Modelo de la cascada de regulación para la formación del flagelo en Xc. Modificado de Yang et al. 2009.

En X. campestris la regulación del flagelo tiene lugar en forma de cascada (Figura 23). Los primeros genes dentro de esta cascada son los dependientes de RpoN/FleQ, que regulan la expresión de genes relacionados con el sistema de secreción flagelar (fliEFGHIJ, fliLMNOP y fliQR), el eje central (flgBCDEF), el gancho (flgGHIJKL) y los reguladores fliA (factor σ28), fleN y flhF. Estos dos últimos genes están relacionados en P. aeruginosa con la cantidad y distribución de flagelos en la bacteria (Dasgupta et al., 2000). Además parece regular también la expresión de las proteínas FlhA y FlhB que forman parte del sistema de secreción, entrando en contacto con las histonas que estabilizan las distintas subunidades del flagelo (Evans et al., 2014). Mutantes en los genes para estas dos proteínas ven reducida la transcripción de la flagelina y de fliA (únicamente FlhB). Es posible que al no estar formado el sistema de secreción haya acumulación de la proteína FlgM que se une a FliA impidiendo la regulación de los genes de la flagelina. FlgM pertenece también a la Clase I de reguladores junto con RpoN y FleQ, permanece unido a FliA hasta que es secretada a través del sistema de secreción flagelar. Los genes que se activan en último lugar son dependientes de FliA, esta proteína activa 21 genes, entre los que se encuentran la flagelina, y otros genes relacionados con el motor flagelar y quimiotaxis. Además regula de forma positiva cinco proteínas con dominio GGDEF y una con dominio HD-GYP, que están relacionadas con la síntesis y degradación de diGMPc pudiendo regular la motilidad a través de este sistema (He y Zhang, 2008; Mole et al., 2007; Yang et al., 2009).

En P. aeruginosa la cascada de regulación posee cuatro niveles, a diferencia que en X.

campestris pv. campestris la transcripción de los genes relacionados con la formación

del gancho tiene lugar en un paso posterior. Al igual que en Xanthomonas en la clase I se encuentran FleQ y RpoN, además de FliA cuya transcripción parece ser independiente de los reguladores de clase I y II. Al igual que en Xc la regulación de los genes dependientes de FliA se activa con la secreción de FlgM. En esta especie un sistema de regulación de dos componentes, FleSR parece regular la transcripción de los genes del gancho (Figura 24) (Dasgupta et al., 2003).

Figura 24. Modelo de regulación de la formación del flagelo en P. aeruginosa. Los símbolos (+) significan regulación positiva y los (-) regulación negativa. (Dasgupta et al., 2003)

La principal diferencia entre la flagelación perítrica y la polar es la presencia de los reguladores FleN/FlhG que controlan la activación de los genes dependientes de FleQ evitando la formación de nuevos flagelos, además la posición del flagelo es controlada por FlhF (Dasgupta et al., 2000; Kazmierczak y Hendrixson, 2013), tanto E. coli como

Salmonella carecen de estos genes que controlan el número y posición de flagelos

(McCarter, 2001).

Los movimientos realizados por las bacterias dependientes del flagelo son el swimming y el swarming:

Motilidad tipo swimming 5.1.1.

El swimming es el movimiento realizado por las bacterias en medio líquido o medio semisólido (agar a una concentración de 0,3% o menor). La velocidad que pueden alcanzar las bacterias en este medio puede llegar hasta 160 µm s-1, aunque E. coli se suele mover a una velocidad de entre 25 y 35 µm s-1, la velocidad puede variar en presencia de un compuesto quimioatrayente. Durante el swimming las bacterias realizan dos tipos de movimientos, desplazamientos en línea recta denominados carreras y cambios de dirección que se realizan mediante volteretas o tumbos. En un medio neutro las carreras y tumbos son realizados de forma aleatoria, sin embargo en presencia de un compuesto o estímulo atrayente las bacterias alargan sus carreras en la dirección de éste orientándose mediante tumbos, si el estímulo fuera repelente, en vez de acercarse se alejarían (Berg y Brown, 1972; Deepika et al., 2014; Jarrell y McBride, 2008; Larsen et al., 1974). Larsen en 1974 describió que el flagelo giraba en sentido contrario a las agujas del reloj cuando se dirigía hacia un compuesto atrayente y en sentido de las agujas del reloj cuando el compuesto era repelente. Estudios posteriores mostraron que cuando la bacteria se mueve en línea recta el giro del flagelo se realiza en el sentido contrario a las agujas del reloj y cuando el sentido de uno o más flagelos cambia se produce un tumbo y un redireccionamiento de la carrera. Normalmente los cambios en el sentido del giro del flagelo son aleatorios, sin embargo en presencia de compuestos determinados se activa el sistema de quimiotaxis que mediante una cadena de fosforilación desde las MCPs y a través de las proteínas Che hacen que se produzca el cambio en el giro del motor flagelar (Berg, 2003).

La motilidad tipo swimming es importante en la virulencia de muchas bacterias patógenas o no de plantas y animales. Para colonizar las raíces de tomate y poder penetrar en el interior de las mismas R. solanacearum requiere motilidad tipo

swimming, sin embargo una vez ha colonizado el xilema la motilidad dependiente del

flagelo no es necesaria (Tans-Kersten et al., 2001; Yao y Allen, 2006).

Motilidad tipo swarming 5.1.2.

El swarming se ha descrito como la translocación bacteriana que tiene lugar rápida y coordinadamente en una superficie semisólida (Kearns, 2010; Tremblay y Deziel, 2010). Este tipo de movimiento permite a una población bacteriana colonizar nuevos nichos rápidamente, activando genes relacionados con virulencia tanto en patógenos

animales como vegetales así como en bacterias beneficiosas para las plantas (Pearson et al., 2010; Verstraeten et al., 2008; Xu et al., 2012). La morfología más característica de las colonias de swarming es el patrón dendrítico, sin embargo existen diversos patrones que pueden realizar las bacterias en función de su especie, y las características del medio, como la cantidad de nutrientes, el porcentaje de agar o la humedad del medio (Figura 25).

Figura 25. Patrones descritos para la motilidad tipo swarming. A: B. subtilis. Este patrón se produce cuando las células se dispersan de forma continua en la placa, es difícil de ver a simple vista; B: Proteus mirabilis. En este tipo de patrón se produce un crecimiento discontinuo de la colonia que está marcado por los diferentes halos de crecimiento; C: P. aeruginosa. Se produce por la secreción de distintos agentes surfactantes que interaccionan entre sí dando este patrón; D: Paenibacillus vortex. Este patrón se caracteriza por el desplazamiento de grupos de bacterias de forma circular, puede ser debido a la morfología curva de esta bacteria; E: mutante de B. subtilis que ha perdido la capacidad de hacer swarming. En este caso se produce el crecimiento de una colonia en el lugar de inoculación y movimiento tipo sliding; F: mutante supresor de B. subtilis incapaz de hacer swarming que presenta un crecimiento en la placa provocado por células que ha conseguido recuperar el fenotipo del swarming (Kearns, 2010).

Las células swarmer en general se caracterizan por ser hiperflageladas, llegando a doblar el número de flagelos en su superficie, por presentar aumento de tamaño y multinucleación. En Proteus mirabilis el tamaño de la célula swarmer puede llegar a ser hasta 40 veces mayor que la célula vegetativa, además se produce la secreción de

agentes surfactantes que favorecen el desplazamiento en la superficie y regulación tipo

quorum sensing, puesto que el swarming es un comportamiento poblacional

(Verstraeten et al., 2008). Sin embargo P. aeruginosa no produce flagelos laterales, únicamente produce dos flagelos polares (Köhler et al., 2000; Rashid y Kornberg, 2000), además es capaz de realizar swarming en medios con altas concentraciones de agar en ausencia de flagelo y pili tipo IV, siendo por lo tanto uno de los factores más importantes la producción de rhamnolípidos (Takahashi et al., 2008). Sin embargo en P.

syringae pv. tabaci el pilus tipo IV parece ser esencial para este movimiento (NGUYEN

et al., 2012). Los géneros Vibrio y Aeromonas poseen un flagelo polar necesario para la motilidad tipo swimming y flagelos laterales que son utilizados en el movimiento tipo

swarming (Kirov et al., 2002; McCarter, 2004; Kirov et al., 2004).

El cambio de estado vegetativo a célula swarmer parece estar relacionado con el sistema de transducción de señales de quimiotaxis a través del motor flagelar y con otros sensores de superficie que son similares a las MCPs. Además el reconocimiento de superficies puede tener lugar por variaciones en el lipopolisacárido de la membrana bacteriana. En S. typhimurium el flagelo, además, es un sensor de la humedad presente en el medio activando el paso a célula swarmer. Esta transición requiere un tiempo de adaptación en la bacteria denominado “swarm lag” que es variable en función de la especie bacteriana y posiblemente el medio. Hay casos en los que este tiempo es tan largo que para inducir swarming en placa, las bacterias necesitan ser repicadas de una placa de swarming y ser inoculadas en una nueva (Anderson et al., 2010; Belas, 2014; Burkart et al., 1998; Kearns, 2010).

Durante las primeras etapas del swarming se incrementa la transcripción de los reguladores iniciales de la formación del flagelo como flhDC en P. mirabilis o lafK o el operón scrABC para la síntesis de flagelos laterales en V. parahaemolyticus, sin embargo en algunas especies no parece observarse diferencias en la transcripción de los genes relacionados con el flagelo sugiriéndose además una regulación post- transcripcional para E. coli o Salmonella (Kearns, 2010; Patrick y Kearns, 2012; Verstraeten et al., 2008). Durante la fase lag se produce también el aumento de tamaño en la célula, en Proteus y Vibrio se ha observado que en esta etapa se inhibe la expresión de genes relacionados con la formación del septum, lo que da lugar a células multinucleadas. Además se activan genes que se han relacionado con la organización de las membranas lipídicas y el peptidoglicano (Pearson et al., 2010). Otra característica

importante para el movimiento tipo swarming es la producción de agentes surfactantes que en muchos casos es dependiente del sistema de quorum sensing, por lo que para poder realizar este movimiento se requiere una densidad poblacional alta, también se ha descrito que en P. syringae es dependiente de FleQ, el regulador inicial del flagelo. Los