Quimiotaxis

La supervivencia de las bacterias está determinada por su capacidad para adaptarse y colonizar nuevos nichos. Poder reconocer un nicho determinado adaptando su desarrollo a ese medio confiere ventaja ecológica frente a otros microorganismos que no poseen esa cualidad, incluso aunque tengan los medios apropiados para poder sobrevivir en tales condiciones. Como hemos mencionado antes, en muchas bacterias el motor flagelar sirve como sensor de superficies, lo que conduce a activar los mecanismos de movimiento en superficie o adhesión a dicha superficie. La carencia de este mecanismo impide la adaptación de la bacteria a su nuevo modo de vida y los cambios necesarios para su supervivencia haciéndola menos competitiva en ese medio. X. alfalfae subsp.

citrumelonis es un patógeno de cítricos que únicamente produce síntomas en hojas de

plantas jóvenes, siendo incapaz de infectar frutos. Estudios realizados en nuestro laboratorio han mostrado que a pesar de ser capaz de pasar a un modo de vida sésil en hojas formando biopelículas, en fruto no se ha observado ningún tipo de agregación por parte de este patógeno. Este patógeno no es capaz de reconocer el huésped en el que se encuentra y no pone los medios apropiados para asegurar su supervivencia (Sena-Vélez et al., 2014).

La quimiotaxis es el mecanismo de percepción de señales del ambiente que permite a la bacteria adoptar el comportamiento adecuado, generalmente una respuesta mótil, a las variaciones producidas en el medio en el que se encuentra. Los procesos de quimiotaxis permiten a las bacterias dirigirse hacia zonas o compuestos más adecuados para su desarrollo, evitando compuestos repelentes o dañinos para ellas. Este comportamiento fue descrito por primera vez a finales del siglo XIX, cuando Engelmann observó mediante microscopía que las bacterias tendían a dirigirse y acumularse en zonas con altas concentraciones de oxígeno como las burbujas o algas, además observó que en

presencia de compuestos deletéreos para ellas, las bacterias huían y colonizaban las zonas con menos acumulación de dicho químico (Miller et al., 2009). Dado que las bacterias, por su tamaño, no pueden percibir gradientes, producen desplazamientos aleatorios en el medio en el que se encuentran hasta percibir variaciones en la concentración de uno o varios compuestos además otras características como el pH o la osmolaridad. En presencia de un compuesto quimioatrayente las carreras que tienen lugar durante el movimiento tipo swimming se alargan en dirección al compuesto, disminuyéndose el número de tumbos que se realizan. En presencia de un repelente el número de cambios de dirección es mayor aunque las carreras son más largas a medida que se alejan del compuesto. En la naturaleza las bacterias están expuestas a una gran cantidad de estímulos y eso implica que no solo influye la concentración de un solo atrayente o repelente sino el balance de factores que puedan afectar a su supervivencia (Miller et al., 2009; Porter et al., 2011).

La quimiotaxis es un factor importante en la virulencia de muchos patógenos tanto vegetales como animales, así como en bacterias beneficiosas para las plantas (Porter et al., 2011). Recientemente en Xcc se ha descrito mediante la mutación de distintos genes, que la quimiotaxis juega un papel importante para el establecimiento de la infección. Yaryura y colaboradores describieron que el mutante en el regulador XbmR veía disminuida su capacidad infecciosa respecto a la cepa silvestre, además este mutante se encontraba afectado en motilidad tipo swimming, formación de biopelículas y quimiotaxis frente a extractos de hoja de pomelo. En este artículo, sin embargo se discute si tanto la formación de biopelículas como la quimiotaxis podía ser un efecto secundario de la falta de motilidad tipo swimming (Malamud et al., 2011; Yaryura et al., 2015).

Sistema de transducción de señales que dirige a una respuesta quimiotáctica 5.4.1.

La percepción de un compuesto o quimioefector por parte de las bacterias da lugar a un sistema de transducción de señales basado en el paso de fosfatos a través de las proteínas Che, que producen un cambio en el sentido de giro del flagelo y un cambio en la dirección de la bacteria mediante un tumbo. El sistema de quimiotaxis más estudiado hasta ahora es el de E. coli, y aunque se encuentra bastante conservado en todos los grupos bacterianos existen algunas excepciones. Por ejemplo, B. subtilis posee proteínas accesorias no encontradas en E. coli, algunas de las cuales están también presentes en los genomas de Xanthomonas. Además se ha descrito en diversas especies bacterianas

sistemas de quimiotaxis alternativos que regulan la formación de biopelículas y estructuras de resistencia como los quistes formados por Myxococcus, Azospirillum o

Azotobacter, motilidad basada en los pili tipo IV y producción de exopolisacárido entre

otros. Hasta la fecha sólo unos pocos han sido estudiados. En P. aeruginosa existen cuatro rutas de quimiotaxis que regulan la respuesta quimiotáctica perse, el swarming, el twitching, la virulencia y la formación de biopelículas, cada uno de estos sistemas posee sus propios sensores que son homólogos a las MCPs (Tabla 3) (da Silva et al., 2002; He y Bauer, 2014; Miller et al., 2009; Porter et al., 2011).

Tabla 3. Proteínas relacionadas con quimiotaxis en Xanthomonas patógenas de cítricos comparadas con Pseudomonas y E. coli.

Organismo MCP CheW CheA CheR CheB CheV CheD CheZ Total X. axnopodis pv. citri 306 22 5 4 3 5 1 1 1 42 X. axnopodis pv. citri 29_1 25 6 4 3 5 1 1 1 46 X. citri subsp. citri 12879 Aw 25 6 4 3 6 1 1 1 47 X. alfalfae subsp. citrumelonis 24 6 4 3 5 1 1 1 45

P. aeruginosa PAO1 26 7 4 4 4 1 1 1 48

P. putida KT2440 27 6 3 3 3 3 0 1 46

Escherichia coli 55989 5 1 1 1 1 0 0 1 10

Como se ha descrito anteriormente, el número de MCPs y sistemas de transducción de señales es menor en E. coli que en el resto de las bacterias, además se observan diferencias incluso entre cepas correspondientes a la misma especie, como es el caso de las X. citri subsp. citri. Los datos han sido obtenidos de la base de datos MiST2 Database (Ulrich y Zhulin, 2010). La totalidad de los genes que

codifican para las proteínas de la tabla están presentes en el genoma.

Dado que es el sistema de transducción de señales más estudiado y que es común a la mayoría de las especies bacterianas, describiremos como modelo el sistema de E. coli. En esta especie la señal proviene de las proteínas aceptoras de grupos metilo (MCPs), que en general poseen dominios sensores periplásmicos y dominios señalizadores en el citoplasma. Normalmente se encuentran formando dímeros de la misma MCP asociados en grupos de tres MCPs distintas en los polos de la bacteria (Figura 27). Estos conjuntos de MCPs se encuentran unidos a una única proteína de unión CheW y a CheA que es una histidín quinasa. Cuando los sensores unen un ligando o quimioefector se produce

un cambio conformacional que se transmite al espacio citoplásmatico. Las interacciones alostéricas que tienen lugar en este conjunto de proteínas producen una ampliación de la señal de quimiotaxis, lo que permite a la bacteria percibir variaciones muy pequeñas en la concentración del quimioefector. La histidín quinasa CheA produce la fosforilación de CheY y CheB, la proteína CheY fosforilada (en la figura CheY-P) se desplaza hasta el motor flagelar donde se une a las proteínas que controlan la dirección de giro del flagelo (FliM y FliN) cambiando la dirección de giro del mismo y provocando un tumbo y un cambio de dirección en la trayectoria de la bacteria. Finalmente la proteína CheY es desfosforilada mediante la fosfatasa CheZ, siendo susceptible de recibir nuevamente la señal de la MCP. Las proteínas CheR y CheB producen la metilación y desmetilación del receptor MCP respectivamente. CheR que se encuentra activa de forma constitutiva, añade grupos metilo a los dominios de metilación conservados en los quimiorreceptores desde una S-adenosilmetionina.

Figura 27. Sistema de transducción de señales quimiotácticas en E. coli. Modificado de (Bi y Lai, 2015).

Por otro lado cuando la proteína CheB recibe el grupo fosfato de CheA produce la desmetilación del quimiorreceptor. Este proceso de metilación-desmetilación tiene una fase de latencia que le confiere a la bacteria memoria a corto plazo, esta memoria le

permite comparar la concentración del quimioefector en el área donde se encuentra con la percibida anteriormente (Baker et al., 2006; Bi y Lai, 2015; He y Bauer, 2014; Miller et al., 2009; Porter et al., 2011).

Proteínas aceptoras de grupos metilo 5.4.2.

Las proteínas aceptoras de grupo metilo o MCPs son sensores de moléculas o compuestos químicos entre los que se encuentran aminoácidos, azúcares e incluso metales pesados como el níquel o el cobre en bacterias y arqueas. Las MCPs están altamente relacionadas con el movimiento de la bacteria puesto que son capaces de inducir cambios el sentido de giro del flagelo y en la dirección de la carrera de la bacteria.

Figura 28. Estructura de ensamblaje de las unidades sensoras en bacterias. Modificado de (Bi y Lai, 2015) Las MCPs poseen un dominio de unión a ligandos cuya estructura es variable, que se encuentra generalmente en el espacio periplasmático, un dominio transmembrana que transforma la señal con un dominio HAMP, y un dominio de señalización que se encuentra en el citoplasma que es el que controla la fosforilación. Este dominio se subdivide en la zona de metilación, un dominio flexible y una zona de contacto de proteínas. Los quimiorreceptores se agrupan en trímeros formados por tres MCPs distintas con dos subunidades de una misma MCP (Figura 27), cada trímero va unido a una proteína CheW y CheA. La agrupación de estos complejos tiene lugar de forma que las proteínas CheA y CheW forman hexámeros mediante interacciones hidrofóbicas. Los hexámeros a su vez se encuentran unidos a los trímeros de MCPs formando una unidad funcional. Las unidades funcionales se unen entre sí formando una red que

compone el sistema sensorial de la bacteria, localizado en los polos de la misma (Figura 28) (Bi y Lai, 2015).

El número de MCPs en las bacterias es variable y es dependiente del medio en el que se encuentran y el tamaño del genoma de las mismas (Lacal et al., 2010b). Las arqueas poseen de media 6,7 MCPs y las bacterias una media de 13,9 MCPs por genoma.

Magnetospirillum magnetotacticum posee 64 MCPs, mientras que E. coli únicamente 4

MCPs. Especies bacterianas como E. coli, cuyo nicho es muy específico o son patógenos estrictos, tienen un bajo número de MCPs, y sin embargo bacterias del suelo, agua o rizosfera poseen mayor número, debido a la variabilidad y complejidad tanto física como química que poseen los medios que colonizan (Alexandre et al., 2004; Miller et al., 2009).

Figura 29. Clasificación de MCPs en seis grupos descrita por Lacal y col en 2010 (Lacal et al., 2010b) y abundancia de los distintos grupo en bacterias. LBR indica la región de unión a ligandos (del inglés ligand binding residues) y MA significa zona de metilación.

La topología de las distintas MCPs es variada y ha llevado a establecer una clasificación en 6 grupos que se muestran en la Figura 29. En estas proteínas la región de unión a ligandos puede estar presente o ausente y dentro o fuera de la membrana bacteriana. Como se puede ver en la figura, el modelo más abundante es el Ia en el que la región de unión a ligandos está en el espacio periplásmico flanqueada por dos hélices

transmembrana. La función de las MCPs o receptores que son completamente citoplasmáticos puede estar relacionada con la monitorización de los niveles energéticos en la bacteria (Alexandre, 2010; Lacal et al., 2010b; Bi y Lai, 2015).

Los quimiorreceptores están compuestos de una región de unión a ligandos (LBR del inglés ligand binding residues) y un dominio señalizador. La región de unión a ligandos es variable en tamaño, clasificándose en Clúster I aquellas LBR que tienen un tamaño entre 120 y 210 aminoácidos, y en el Clúster II aquellas LBR cuyo tamaño esté comprendido entre 220 y 300 aminoácidos. Estas últimas pueden tener dos módulos estructurales que reconocen distintos tipos de ligandos (Lacal et al., 2010b), como sucede en la proteína McpS de Pseudomonas putida KT2440, que une compuestos intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (Lacal et al., 2010a) y acetato (Pineda-Molina et al., 2012). Además los distintos módulos pueden unir su ligando sin que la unión a uno de los módulos impida la unión del ligando al otro (Pineda-Molina et al., 2012).

Se han descrito diferentes estrategias de percepción de señales por parte de las MCPs y no todas ellas se basan en el reconocimiento directo del ligando. Existen mecanismos descritos en los que tiene lugar la unión de distintas moléculas, ya sea con más de una región de unión de ligandos o mediante la unión del complejo formado por el ligando y una proteína secretada (Pineda-Molina et al., 2012).

La quimiotaxis y el reconocimiento de una señal no se encuentran siempre asociado al consumo de los quimioefectores por parte de la bacteria. En muchos casos la señal percibida por la bacteria es simplemente un indicativo de de la existencia de un nicho apropiado para su desarrollo (Alexandre y Zhulin, 2001). D. dadantii, presenta quimioatracción frente al ácido jasmónico, siendo esta sustancia únicamente un indicativo de que hay una herida en la planta por la que puede penetrar y producir infección (Antunez-Lamas et al., 2009b; Río-Álvarez et al., 2014). De hecho, el primer tipo de quimiotaxis descrito fue el independiente del metabolismo, que es aquel en el que el quimioefector no es metabolizado por la bacteria. Este tipo de quimiotaxis cumple las pautas descritas por Adler para la quimiotaxis, análogos no metabolizables de quimioatrayentes metabolizables son también atrayentes y la mutación de genes implicados en el metabolismo del compuesto no suele alterar la quimiotaxis hacia dicho compuesto. Por último los quimioefectores son atrayentes en presencia de otros compuestos metabolizables. Se ha comprobado, sin embargo, que estos postulados no

siempre se cumplen, hay casos en los que los quimioefectores han de ser metabolizados para producir una respuesta, siendo los subproductos de este metabolismo los que realmente producen dicha respuesta.

El reconocimiento de un quimioefector y su gradiente puede tener lugar mediante las variaciones energéticas que se producen en la célula en presencia del compuesto. Este proceso es mediado por el sistema de transporte de electrones y se le denomina taxis energética, o en inglés energy taxis. En este tipo de taxis el nicho óptimo para las bacterias es aquel en el que el rendimiento metabólico de las mismas es mayor. Las variaciones energéticas no son solo debidas al metabolismo de compuesto químicos, sino que pueden tener lugar además por la presencia de luz, aceptores finales de electrones, o compuestos con actividad redox, considerándose además la aerotaxis como un tipo de taxis energética (Alexandre, 2010; Alexandre y Zhulin, 2001).

6. Formación de Biopelículas

Las bacterias en su medio natural pueden encontrarse en forma libre o planctónica, o estar asociadas en agregados formando una comunidad organizada. Se puede describir biopelícula o biofilm como un conjunto de comunidades bacterianas sésiles adheridas a superficies y con estructura más o menos tridimensional. Como grupo de bacterias coordinadas entre sí presentan un comportamiento similar a un organismo multicelular con altas tasas de transmisión génica, cooperación y estratificación. Las biopelículas confieren a las bacterias múltiples ventajas frente al modo de vida planctónico, favoreciendo la supervivencia de la población. Cuando las bacterias se encuentran organizadas en biopelículas pueden llegar a ser hasta mil veces más resistentes a antibióticos y condiciones deletéreas del medio. La formación de agregados organizados permite a las bacterias colonizar un nicho o huésped apropiado para su desarrollo (Busscher y van der Mei, 2012; Petrova y Sauer, 2012).

Xcc es capaz de agregarse y formar biopelículas tanto en superficies bióticas como

abióticas, esta estructura protege a las bacterias de las distintas condiciones adversas que se pueden producir en la superficie vegetal como son la desecación, la presencia de compuestos antimicrobianos y otros mecanismos de defensa de la planta, además favorece la comunicación intercelular, el crecimiento en medios poco nutritivos o en la hoja o fruto (Rigano et al., 2007), favoreciendo a su vez la generación de diversidad

dentro de las población de la biopelícula (Boles et al., 2004). El proceso de infección está directamente relacionado con el tamaño de la población en la superficie, y la formación de lesiones puede depender de la efectividad de la bacteria para adherirse y formar de biopelículas en la superficie vegetal (Rigano et al., 2007; Cubero et al., 2011).