BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR DEL CÁNCER METÁSTASIS

QUÍMICA FISIOLÓGICA Y PATOLOGÍA INTEGRADA I

BIOLOGÍA CELULAR Y

MOLECULAR DEL CÁNCER

METÁSTASIS

2015

Vicente A. Torres, PhD

Laboratorio de Biología Celular y Molecular Instituto de Investigación en Ciencias Odontológicas

Facultad de Odontología – Universidad de Chile Centro FONDAP-ACCDIS

PRIMERA PARTE – BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR

DEL CÁNCER

Generalidades y Conceptos

Características del Cáncer (“

hallmarks”

)

Proliferación, Diferenciación y Muerte Celular Angiogénesis

Invasión de Tejidos y Metástasis Marcadores Emergentes

Oncogenes y Supresores de Tumores

Aproximaciones Experimentales para Estudiar el Cáncer

La Cascada de Metástasis

SEGUNDA PARTE

Muertes en Chile: años 1970, 1990, 2004

órgano/tejido vs ranking

Prevalencia de Distintos Tipos de Cáncer en Chile

El Cáncer de Colon como Modelo de Estudio

pólipos y adenomas

adenocarcinoma

tejido normal

PÉRDIDA DE LA

HOMEOSTASIS CELULAR TUMORIGÉNESIS

¿Qué sucede a nivel celular y

molecular durante el cáncer?

HOMEOSTASIS CELULAR

En un determinado tejido, las células deben co-existir de manera organizada e interdependiente. En relación a ésto, se destacan una serie de características que deben ser finamente reguladas:

⇒PROLIFERACIÓN Y VIABILIDAD CELULAR

⇒INTERACCIONES DE LA CÉLULA CON SU ENTORNO ⇒RESPUESTA A SEÑALES EXTRACELULARES

(MITÓGENOS Y FACTORES INHIBITORIAS DEL CRECIMIENTO)

⇒

“TRANSFORMACIÓN CELULAR”

Proliferación muerte celular

Proliferación sostenida Evasión de la muerte celular

Ejemplo en el cáncer de colon

cáncer colorectal Normal muerte celular Proliferación cáncer muerte celular

Proliferación

Se han definido una serie de eventos característicos o marcadores

(hallmarks) asociados al cáncer

Douglas Hanahan & Robert Weinberg Cell 2000: 100: 57-70

Douglas Hanahan & Robert Weinberg Cell 2011: 144: 646-674

INMORTALIDAD REPLICATIVA

PÉRDIDA DE LA RESPUESTA A SEÑALES DE DIFERENCIACIÓN E INHIBIDORAS DEL CRECIMIENTO

RESISTENCIA A LA MUERTE CELULAR INDUCCIÓN DE LA ANGIOGÉNESIS INVASIÓN DE TEJIDOS Y METÁSTASIS

Hallmarks del Cáncer

El orden y la temporalidad de cada uno de estos marcadores es propio de cada neoplasia en particular

SEÑALIZACIÓN PROLIFERATIVA SOSTENIDA

La capacidad de proliferación en una célula somática es limitada. Esta proliferación ocurre hasta alcanzar el “Límite de Hayflick” (Exp Cell Res

1965; 37: 614). Este límite restringe hasta 40-50 divisiones, luego del

cual se llega a un estado de “senescencia” y muerte celular PROLIFERACIÓN Y VIABILIDAD CELULAR

Inmortalización celular

Senescencia

Poblaciones clonales con crecimiento continuo (alteraciones teloméricas y cromosomales, aneuploidía)

Dependencia de anclaje a sustrato: La proliferación celular está directamente asociada a la interacción célula-matriz extracelular, mediada porintegrinas

Inhibición por contacto: En cultivos celulares, el contacto entre células del “mismo tipo” inhibe su movimiento

INTERACCIONES DE LA CÉLULA CON SU ENTORNO

Pérdida de la “inhibición por contacto”: Las células pueden crecer por sobre la capacidad

permitida en una monocapa

Pérdida de la dependencia de anclaje a sustrato Las células pueden crecer en suspensión

Transformación Celular:

Proliferación Celular Viabilidad Celular

Interacción Célula-Célula

Respuesta a Señales Extracelulares

¿Cuál célula será más transformada?

1

2

ONCOGENES

1. Son genes cuya sobre-expresión o mutación con “ganacia de función”

favorecen la tumorigénesis

2. Descubiertos a raíz de virus con acción transformante

PROTEÍNAS ONCOGENES SUPRESORES DE

TUMORES

SUPRESORES DE TUMORES

1. Son genes cuya “pérdida o disminución de su función” favorece la

tumorigénesis

2. Inicialmente se describieron en el contexto de mutaciones, ya sean de la línea germinal (hereditarias) o de origen somático. Ejemplos, pRb, p53, APC, BRCA1

ALTERACIONES

EN LA

PROLIFERACIÓN Y

CRECIMIENTO

CELULAR

Dependencia de factores de crecimiento: La proliferación depende de la disponibilidad de factores de crecimiento específicos para el tejido. En cultivos celulares, la privación de estos factores (por ejemplo, suero suplementario) lleva a muerte celular. Otro factor importante es la producción autocrina de estos factores

Pérdida completa o parcial de la dependencia de factores de crecimiento

Factores de suplemento en cultivo (suero) Crecimiento a menor densidad inicial

In vitro

RESPUESTA A SEÑALES EXTRACELULARES

RECEPTORES DE TIPO TIROSINA KINASA

5. Catalizan la transfosforilación en residuos de tirosina (autofosforilación) 4. La unión de ligando lleva a la dimerización del receptor

1. Son proteínas integrales de membrana 2. Poseen actividad tirosina kinasa intrínseca

3. Sus ligandos son usualmente MITÓGENOS

EGF, PDGF, FGF, VEGF, insulina

SEÑALIZACIÓN POR FACTORES DE CRECIMIENTO _{RECEPTORES DE TIPO TIROSINA KINASA}

SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR POR RECEPTORES DE

TIROSINA KINASA La cascada de proteínas MAP kinasa (MAPK, Proteína Kinasa_{Activada por Mitógeno)}

La cascada de señalización MAPK se inicia por Ras-GTP Las MAPK son kinasas que fosforilan en residuos de Ser o Thr Estas enzimas se activan en respuesta a estímulos extracelulares, como MITÓGENOS, shock térmico y citoquinas

Ras

MAPK MAPKK

MAPKKK

Proliferación y

Diferenciación Celular Apoptosis Expresión génica Mitosis

Mecanismos moleculares por los cuales las células tumorales sobre-activan las vías de señalización de mitógenos (RTKs)

1.Sobre-producción de ligando (mitógeno)

2.Mutaciones activadoras del receptor (RTK)

3. Mutaciones en la cascada río abajo: Ras

VIABILIDAD Y

MUERTE CELULAR

Mecanismos de Control de la Viabilidad y Muerte

Celular

MUERTE CELULAR PROGRAMADA

www.invesmed.com Principal forma caracterizada:

apoptosis

Otras formas: autofagia, necrosis programada DESARROLLO Y PROCESOS FISIOLÓGICOS En el modelo de adenocarcinoma de colon

APOPTOSIS: DOS VÍAS PRINCIPALES CON UN MISMO FIN

ANGIOGÉNESIS,

INVASIÓN DE TEJIDOS

Y METÁSTASIS

ANGIOGÉNESIS

El ”sprouting” de vasos sanguíneos ocurre a razón de varios milímetros por día (dependiendo del estímulo)

“Crecimiento de nuevos vasos a partir de vasos sanguíneos pre-existentes”

Angiogénesis de “sprouting” (brotante)

Factores de regulación importantes:

Factores de crecimiento: FGF, VEGF, PDGF Receptores: VEGFR

Receptores de adhesión célula-célula: VE-cadherina Enzimas: eNOS, COX2

VEGFR (Tirosina kinasa receptora)

El receptor VEGF (VEGFR) es una proteína tirosina kinasa receptora, del tipo PDGFR

PRIMERA PARTE – BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR

DEL CÁNCER

Generalidades y Conceptos

Características del Cáncer (“

hallmarks”

)

Proliferación, Diferenciación y Muerte Celular Angiogénesis

Invasión de Tejidos y Metástasis Marcadores Emergentes

Aproximaciones Experimentales para Estudiar el Cáncer

Oncogenes y Supresores de Tumores

La Cascada de Metástasis

SEGUNDA PARTE

La METÁSTASIS ocurre a través de una serie de

pasos interrelacionados, en donde cada uno de ellos

puede ser una etapa limitante

MIGRACIÓN CELULAR

E INVASIVIDAD

INTRAVASACIÓN

TRANSPORTE

EXTRAVASACIÓN

CRECIMIENTO DE

TUMOR 2

Nat Rev Mol Cell Biol 2004; 5: 816

Cada uno de estos procesos son muy ineficientes: <0,1% células diseminadas formarán mets

Composición del Tejido

(ECM y células vecinas)

Receptores de Superficie Señalización Intracelular Remodelamiento de la ECM

MIGRACIÓN CELULAR

E INVASIVIDAD

Composición del Tejido

(ECM y células vecinas)

Receptores de Superficie Señalización Intracelular Remodelamiento de la ECM

MIGRACIÓN CELULAR

E INVASIVIDAD

(Medición Experimental en Ensayo de Cierre de Herida) Células de melanoma murino B16-F10 La migración celular es un proceso fundamental, tanto durante el desarrollo, como en el organismo adulto

MIGRACIÓN CELULAR

Durante la migración celular existen alteraciones en estas uniones

Mol Biol Cell 2010; 21: 369

MIGRACIÓN CELULAR:

composición del microambiente

INTERACCIÓN CÉLULA – CÉLULA INTERACCIÓN CÉLULA – ECM

Célula de cáncer de mama (MCF10A) sr.burnham.org

¿Qué Sucede con estas Interacciones

entre la Célula y su Entorno Durante el

Cáncer?

La célula sufre una serie de transformaciones, tanto

a nivel morfológico, como bioquímico

Célula de cáncer de mama (MCF10A) sr.burnham.org

E-cadherina actina núcleo

ALTERACIONES EN LA INTERACCIÓN CÉLULA-CÉLULA

Características de tipo epitelial Características de tipo mesenquimáticas TRANSICIÓN EPITELIO-MESÉNQUIMA (epithelial-mesenchymal transition, EMT)

“EMT”

BioEssays 2001; 23: 912

↓ Expresión de E-cadherina

↓ Expresión de componentes

estructurales de Uniones Adherentes

Cancer Res 2006; 66 (17): 9 MORFOLOGÍA CARACTERÍSTICAS FÍSICAS UNIONES INTERCELULARES MARCADORES MOLECULARES ORGANIZACIÓN CITOESQUELETO Polaridad Apical y Basolateral Asimetría: extremo líder y posterior Adhesión celular e

inhibición por contacto

Movilidad celular e invasividad AJ, TJ, GJ y desmosomas Adhesiones focales / GJ transitorios E-cadherina y citoqueratinas N-cadherina, vimentina, metaloproteasas Microtúbulos longitudinales actina circunferencial Microtúbulos astrales / Fibras de estrés DIFERENCIAS PRINCIPALES

MECANISMOS DE DISMINUCIÓN EN LA EXPRESIÓN DE E-CADHERINA

Una célula de carcinoma pulmonar migrando sobre matriz extracelular de fibronectina

Adhesiones Focales (sitios de adhesión celular)

Citoesqueleto Celular

MIGRACIÓN

CELULAR

Cancer Sci 2007; 98(10): 1512-1520

TRENDS Cell Biol 2004; 14(5) Adhesión celular

Remodelamiento del citoesqueleto

Desensamble de adhesiones

¿Cuáles son los mecanismos moleculares implicados en la migración celular?

MIGRACIÓN CELULAR: MECANISMOS MOLECULARES

LA MIGRACIÓN CELULAR ADHESIÓN CELULAR CITOESQUELETO

FACTORES EXTRACELULARES (ECM, QUIMIOQUINAS, ETC)

PROTEÍNAS DE SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR

EXPRESIÓN GÉNICA

Modelo de estudio: migración celular sobre sustrato 2D

Según este modelo, la migración celular puede ser descrita como una serie sucesiva de etapas

EXTENSIÓN O PROTRUSIÓN (“leading edge”) FORMACIÓN DE CONTACTOS CON LA ECM CONTRACCIÓN CELULAR DESENSAMBLE Y LIBERACIÓN DE LOS SITIOS

DE CONTACTO POLARIZACIÓN CELULAR

MIGRACIÓN CELULAR: Secuencia de etapas repetitivas

EXTENSIÓN O PROTRUSIÓN (“leading edge”) FORMACIÓN DE CONTACTOS CON LA ECM CONTRACCIÓN CELULAR DESENSAMBLE Y LIBERACIÓN DE LOS SITIOS

DE CONTACTO

MIGRACIÓN CELULAR: Secuencia de etapas repetitivas

POLARIZACIÓN CELULAR

Science 2003; 302: 5

MDA-MB-231 golgi

núcleo

Polarización celular (Cdc42, Rac)

Contracción (Rho)

GTPasas de la Familia Rho

Cdc42

Rac

Rho

Polarización celular, filopodios

Protrusiones celulares, lamelipodios,

polarización celular

Contracción celular, maduración de adhesiones focales, fibras de estrés

Dev Biol 2004: 265: 23

Tanto la regulación, como la actividad de estas GTPasas se ven alteradas en cáncer EXTENSIÓN O PROTRUSIÓN (“leading edge”) FORMACIÓN DE CONTACTOS CON LA ECM CONTRACCIÓN CELULAR DESENSAMBLE Y LIBERACIÓN DE LOS SITIOS

DE CONTACTO

MIGRACIÓN CELULAR: Secuencia de etapas repetitivas

POLARIZACIÓN CELULAR Importancia del citoesqueleto en la

adhesión y migración celular

Célula expandiéndose sobre fibronectina. Tinción de actina con faloidina. J Cell Sci 2013; 126(17): 3835

Nature Rev Mol Cell Biol 2004; 5: 2647

Podosomas

Invadopodios

Fibroblasto, microscopía electrónica de barrido

Molecular Biology of the Cell (Alberts, cap 16)

Queratocito, microscopía de luz

DINÁMICA DEL CITOESQUELETO Y LA MEMBRANA PLASMÁTICA

Lamelipodios y

procesos de membrana Mol Cancer Ther 2005; 4 (5): 772-778

FIBRAS DE ESTRÉS (fibras de tensión)

DINÁMICA DEL CITOESQUELETO Y LA MEMBRANA PLASMÁTICA

www.lifetechnologies.com EXTENSIÓN O PROTRUSIÓN (“leading edge”) FORMACIÓN DE CONTACTOS CON LA ECM CONTRACCIÓN CELULAR DESENSAMBLE Y LIBERACIÓN DE LOS SITIOS

DE CONTACTO

MIGRACIÓN CELULAR: Secuencia de etapas repetitivas

POLARIZACIÓN CELULAR Formación y desensamble de los sitios

de contacto celulares

TRENDS Cell Biol 2004; 14(5)

Estos sitios de contacto se encuentran principalmente en la interfase célula-ECM

INTEGRINAS

2. Reclutamiento de proteínas adaptadoras 1. Unión ligando extracelular (ECM)/Activación

3. Anclaje del citoesqueleto (actina o filamentos intermedios) 4. Formación de complejos macromoleculares

FORMACIÓN DE CONTACTOS CON LA ECM

Complejos Focales

Complejos Macromoleculares Formados por las Integrinas CONTACTOS FOCALES Sitio de Iniciación ADHESIONES FOCALES

Madurez del complejo de adhesión

Filamentos de Actina Paxilina

Adhesiones Focales

FORMACIÓN DE CONTACTOS CON LA ECM

CONTACTOS FOCALES Sitio de Iniciación ADHESIÓN FOCAL

Madurez del complejo de adhesión

CONTACTOS FOCALES Sitio de Iniciación ADHESIÓN FOCAL

?

DESENSAMBLE DE CONTACTOS CON LA ECM

MECANISMO POCO CLARO Proteínas de señalización: Kinasa de Adhesión Focal (FAK), Pyk2, Src, MAPK Proteasas: Calpaínas

Componentes de la endocitosis: Dynamin, AP-2, Clathrin, Rabs

Se ha postulado que el tráfico endosomal es esencial en el desensamble de los complejos de adhesión

Traffic 2009; 10: 811–818 Traffic 2009; 10: 811–818

MARCACIÓN DE ADHESIONES Y CONTACTOS FOCALES

(GFP-vinculina, transfección transitoria de células de cáncer de mama MDA-MB-231)

REMODELAMIENTO DE LA MATRIZ

EXTRACELULAR

Nature Rev Mol Cell Biol 2004; 5: 2647

REMODELAMIENTO DE LA MATRIZ EXTRACELULAR

1. Migración celular 2. Estructuras derivadas del citoesqueleto y la membrana 3. Proteasas de la matriz extracelular

MIGRACIÓN CELULAR

E INVASIVIDAD

INTRAVASACIÓN

TRANSPORTE

EXTRAVASACIÓN

CRECIMIENTO DE

TUMOR 2

EVENTOS ASOCIADOS A LA METÁSTASIS

Nat Rev Mol Cell Biol 2004; 5: 816 Mutation Research 2011; 1-12

VÍA

MIGRACIÓN CELULAR

E INVASIVIDAD

INTRAVASACIÓN

TRANSPORTE

EXTRAVASACIÓN

CRECIMIENTO DE

TUMOR 2

CRECIMIENTO DE TUMOR SECUNDARIO

MICROMETÁSTASIS METÁSTASIS CLÍNICAMENTE DETECTABLE COLONIZACIÓN Asentamiento reciente En estado de “dormancia” No detectable mediante técnicas convencionales Técnicas convencionales de detección macroscópicas Características similares al tumor primario

EL PROCESO DE COLONIZACIÓN INVOLUCRA DIVERSOS EVENTOS:

Interacción con el nuevo estroma (ECM, células parénquima, etc) Adquisición (o re-adquisición de hallmarks observados en tumor primario): viabilidad, proliferación

Modificaciones en el programa migratorio

APROXIMACIONES

EXPERIMENTALES Y MODELOS DE

ESTUDIO EN LA INVESTIGACIÓN

DEL CÁNCER

Adhesión y migración celular

MODELOS DE ESTUDIO:

in vitro versus in vivo

Técnicas de estudio

in vitro

Proliferación, viabilidad y muerte celular

Proteínas de señalización

Ensayos de transformación celular

√

√

√

√

Técnicas de estudio

in vivo

Tumorigenicidad

Modelos experimentales de metástasis

√ √

Ensayos de Transformación Celular

Tumorigenicidad

Agar blando

Modelos de Estudio

in vitro

Los ensayos de proliferación y viabilidad celular son ampliamente usados en la caracterización de nuevos

fármacos antineoplásicos Sal tetrazolium Formazán (A490-500nm)

Ensayos de Viabilidad

El taxol (paclitaxel) actúa estabilizando microtúbulos. ¿Qué efecto tendrá sobre el histograma de DNA?

Proliferación y Ciclo Celular

¿qué sucede si la célula es privada de factores de crecimiento (mitógenos)?

Histograma de DNA (ciclo celular) DNA content C el l nu m b er Otras Técnicas: Incorporación de 5-bromo-2-desoxiuridina

Marcación con 3_H-timidina Microscopía de Fluorescencia Expresión de Ciclinas

Muerte Celular / Apoptosis

DNA content C el l S iz e viable apoptosis necrosis Citometría de Flujo

Tinción de DNA vs tamaño celular

DNA laddering Microscopía de

Fluorescencia NT APOP TOSIS Microscopía Electrónica Apoptosis Autofagia Otras Técnicas: Activación de caspasas Proteínas señalización (WB)

Modelos de Estudio

in vitro

MIGRACIÓN CELULAR

Parámetros cinéticos, como velocidad de migración, polarización y direccionalidad

Ensayo de cierre de herida EXP 1

EXP 2

t=0h t=12h

t=0h t=12h

¿Qué se puede decir de EXP2 en relación a EXP1?

Ensayos de Migración e Invasión Celular

Cámara Boyden Matrigel

Matriz compuesta de múltiples proteínas ECM Depende de MMP‛s Sustrato ECM

Migración celular

(quimiotaxis – haptotaxis)

Invasión

Modelos de Estudio

in vivo

ANGIOGÉNESIS

Membrana corioalantoide de pollo

(Chick CAM assay)

Imagen membrana corioalantoide ¿Qué agente contiene este disco? Disco de papel filtro

Modelos de Estudio

in vivo

MODELOS EXPERIMENTALES DE METÁSTASIS 1. Metástasis Espontánea 2. Metástasis Experimental 14-21 días Análisis Análisis

¿qué ventajas y desventajas destacan?

Modelos de Estudio

in vivo

Sembrar células de tumor humano sobre la CAM de embriones de 10 días 7-8 días Cosechar el tumor Extraer pulmones y médula ósea Metástasis Tumor primario PCR de secuenciaAlu MODELOS EXPERIMENTALES DE METÁSTASIS 3. Micrometástasis

Chick CAM Assay

Nat Rev Mol Cell Biol 2004; 5: 816 Mutation Research 2011; 1-12 Cell 2000: 100: 57-70

Cell 2011: 144: 646-674