LOS SENSORES QUÍMICOS

La necesidad de análisis de diferentes com-ponentes a tiempo real en áreas cada vez más diversas ha promovido en estos últimos años que los esfuerzos realizados en el desa-rrollo de instrumentación analítica se dirijan hacia la construcción de dispositivos cuya utilización no requiera la supervisión profe-sional, cuyo manejo sea sencillo y cuyo coste sea menor. Como resultado de esta demanda de información relacionada con el análisis de forma rápida, fiable y descentra-lizada se ha favorecido el desarrollo de sen-sores químicos y biosensen-sores como alterna-tiva de análisis a la instrumentación analítica convencional

Los sensores químicos existen desde hace mucho tiempo. Se han estudiado en

profun-didad y han encontrado durante todo este tiempo un gran campo de aplicación. Se conocen muy bien por su uso cotidiano en

el laboratorio los electrodos redox, los elec-trodos selectivos a iones, especialmente el de pH, entre otros muchos. Simultánea-mente al avance de los sensores, y debido al gran impulso de la informática, se viene des-arrollando del mismo modo instrumentación capaz de realizar el seguimiento continuo de procesos complejos mediante ordenador de los parámetros físicos y/o químicos basados en sensores químicos. Mediante este tipo de instrumentación es posible intervenir en el control de procesos de forma rápida y segura.

Los biosensores, de aparición más reciente, constituyen un campo multidisciplinario de I+D y un mercado muy atractivo. Originaria-mente la investigación en este campo

pro-Los biosensores

en la industria alimentaria,

el control medioambiental y la salud humana

María Isabel Pividori*, Emanuela Zacco, Anabel Lermo y Salvador Alegret. Grup de Sensors i Biosensors (GSB), Departament de Química, Universitat Autònoma de Barcelona María Pilar Marco, Francisco Sánchez Baeza. Grupo de Receptores Moleculares Aplicados (AMRg), Departamento de Química Orgánica Biológica, IIQAB-CSIC Barcelona

El Grupo de Sensores y Biosensores de la Universitat Autònoma de

Barcelona (GSB) y el Grupo de Receptores Moleculares Aplicados del

CSIC (AMRg) vienen dirigiendo alguna de sus líneas de investigación hacia

el desarrollo de biosensores electroquímicos robustos, económicos, de

uso simple, y dirigidos a su aplicación principalmente en la industria

alimentaria y el control medioambiental y la salud humana. Las agencias

reguladoras y los laboratorios de control de calidad podrán, en

un futuro, disponer de biosensores portátiles capaces de

realizar análisis de manera más rápida y económica.

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LOS SENSORES QUÍMICOS EXISTEN DESDE HACE MUCHO TIEMPO

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PROFUNDIDAD Y HAN ENCONTRADO DURANTE TODO ESTE TIEMPO UN GRAN CAMPO DE APLICACIÓN

venía principalmente del sector clínico y bio-médico. Las inversiones realizadas en el desarrollo de biosensores para la aplicación en el campo clínico fueron compensadas en un corto plazo con la aparición de los bio-sensores para la determinación y control de glucosa en pacientes diabéticos. Los bio-sensores demostraron así su capacidad de realizar análisis fuera del ámbito del labora-torio y por personas no entrenadas, por ejemplo, en la consulta médica por el mismo paciente.

Actualmente los biosensores no son patri-monio exclusivo de la investigación biomé-dica. La industria alimentaría demanda métodos rápidos para estimar la identidad, la caducidad, el deterioro o la contamina-ción de los alimentos. A la industria en general, y a la alimentaria en particular, le es necesario controlar de manera confiable los productos en matrices muy complejas. Con la consolidación de la Unión Europea, las medidas dirigidas hacia el control de ali-mentos cada vez son más estrictas y gene-ran necesidades analíticas muy variadas.

La problemática de los contaminantes en la salud humana. La seguridad alimentaria y medioambiental

El concepto de seguridad alimentaria implica garantizar la producción y comercia-lización de alimentos que no supongan un riesgo potencial para la salud del consumi-dor.

La innovación y el desarrollo de la industria agroalimentaria pasan de forma general por

dos ejes fundamentales: la seguridad y la calidad de los alimentos. La cada vez mayor complejidad de la cadena alimentaria exige, por otra parte, el desarrollo de eficaces sis-temas de trazabilidad que aseguren la soli-dez de todos los eslabones.

Tanto el VI Programa Marco de la Unión

Europea a través de su Prioridad temática de Calidad y Seguridad de los alimentos, como el Plan Nacional de Ciencia y Tecno-logía 2004-2007 a través de sus programas nacionales de Biotecnología y Recursos y Tecnologías Agroalimentarias, recogen la necesidad de desarrollar e implantar

siste-mas de control encaminados a aumentar la seguridad y la calidad de los alimentos y a mejorar los sistemas de trazabilidad, que se define como la capacidad de rastrear un ali-mento, desde sus orígenes hasta al consu-midor, dando lugar a una identificación fia-ble de sus componentes, un control sanitario y un seguimiento del alimento en toda la cadena de producción.

Para poder cumplir con estos programas preventivos, se establece como prioridad el desarrollo de métodos de detección, de análisis y diagnóstico que sean rápidos, de alta sensibilidad y que permitan el análisis automatizado de un amplio espectro de agentes que amenazan la salud humana. Los contaminantes alimentarios –y medioambientales– pueden agruparse de acuerdo a su origen y naturaleza. Esencial-mente, se pueden clasificar en contaminan-tes microbiológicos (bacterias, virus y pará-sitos), material exógeno, toxinas naturales, y otros compuestos químicos tales como pes-ticidas, metales tóxicos, dogas y residuos veterinarios, entre otros muchos. Algunos contaminantes alimentarios provienen de fuentes naturales del medioambiente, mien-tras que otros son aditivos agregados deli-beradamente. De la misma forma que la detección y el control de aditivos tuvieron su importancia con anterioridad, en la actuali-dad la mayor problemática en salud alimen-taria lo constituyen las contaminaciones microbiológicas, seguidos de los pesticidas y los residuos de medicamentos en produc-tos animales, así como resistencia a antimi-crobianos. No son pocos los consumidores preocupados por el impacto a largo plazo del consumo crónico de aditivos químicos (tales como pesticidas, metales tóxicos, resi-duos de drogas veterinarias, saborizantes, colorantes y conservantes), así como los efectos agudos en grupos vulnerables. Las metodologías de análisis de contami-nantes en alimentos deben ser capaces de llegar a detectar concentraciones en el orden de µg/kg o inferiores. Los métodos analíticos instrumentales convencionales consisten en HPLC, cromatografía de gases y electroforesis capilar y se basan en las siguientes etapas: I) toma de muestra; II) tra-tamiento; III) extracción; IV) purificación; V) análisis cromatográfico y, VI) obtención de resultados. Además de métodos instrumen-tales de análisis, en el caso de antibióticos en leche o carne se pueden llevar a cabo ensayo microbiológicos que se basan en la de inhibición del crecimiento bacteriano debida a la presencia del antibiótico. FIGURA 2. Diagrama esquemático del funcionamiento de un sensor. El “elemento de reconocimiento” o

“receptor” sólo reconoce un componente de la muestra. La señal proveniente del proceso de reconocimiento se convierte en una señal eléctrica mediante el transductor. Esta señal es amplificada y posteriormente procesada y presentada en forma digital. El receptor puede interactuar con el analito mediante mecanismos físicos, químicos o biológicos.

ACTUALMENTE LOS BIOSENSORES NO SON PATRIMONIO EXCLUSIVO DE LA INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA

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CONTAMINACIÓN DE LOS ALIMENTOS

Los ensayos inmunológicos representan una alternativa de screening rápida y fiable. En las últimas décadas, la detección inmunoló-gica de bacterias, células y esporas, virus y toxinas, y pequeñas moléculas orgánicas ha comenzado a ser cada vez más sensible, específica, y reproducible. Así, cada vez se encuentran en el mercado más kits basados en la detección inmunológica.

La detección de ácido nucleicos de microor-ganismos patógenos es cada vez más espe-cífica y sensible que los métodos inmunoló-gicos. El desarrollo de técnicas de amplificación in vitro del DNA -tal como es la PCR- ha contribuido de manera decisiva a aumentar la sensibilidad y selectividad de los ensayos basados en ácidos nucleicos. Estos métodos tienen ventajas distintivas sobre los métodos de cultivo e inmunológicos tales como una mayor especificidad, la sensibili-dad, la rapidez y la capacidad de detectar pequeñas cantidades de ácido nucleico en una muestra. Además son capaces de detec-tar varios patógenos simultáneamente en un único ensayo. Un problemas asociado es que el DNA puede permanecer intacto en ali-mentos procesados, en forma libre o pre-sente en bacterias muertas pudiendo dar su amplificación y posterior detección resul-tando falsos positivos. Este método requiere, por tanto, un período de enriquecimiento que retrasa los resultados pero que asegura la sensibilidad al orden de 3 UFC por 25 g de alimento.

Para certificar la seguridad alimentaria, los laboratorios de control oficiales deberían ser capaces de procesar un gran número de muestras en un período corto de tiempo. De acuerdo con estos requerimientos, es de importancia el desarrollo de nuevas técnicas rápidas, económicas, sensibles y capaces de realizar medidas de campo, cuyo resultado pueda ser usado como alarma para la detec-ción rápida del ‘riesgo’ de contaminadetec-ción. Debido a sus características, los biosensores se constituyen en los principales candidatos y herramientas de análisis con numerosas aplicaciones en la industria agroalimentaria, control medioambiental y salud humana. Las características más destacables de estos dis-positivos que los convierten en opciones altamente atractivas son: I) su especificidad, II) alta sensibilidad, III) corto tiempo de análi-sis, IV) capacidad de inclusión en sistemas integrados, V) facilidad de automatización, vi) capacidad de trabajar en tiempo real, VI) ver-satilidad, que permite el diseño de dispositi-vos a la carta, y su bajo coste: VII) no des-tructivos, lo que permite el control de

procesos in situ, VIII) no contaminantes, ami-gables con el medioambiente.

Sensores químicos y biosensores

Si queremos imaginar como funciona un sensor, debemos tener en cuenta que está formado por dos partes. Una de dichas par-tes es el denominado “elemento de recono-cimiento molecular” o “receptor” que inter-acciona con un determinado componente de la muestra, el que se quiere determinar, de manera “específica”, es decir, sin que el resto de la muestra interfiera en la medida. El otro componente, se conoce como “transductor” (Figura 2). Cuando el compo-nente que se busca determinar en la mues-tra compleja interacciona con el “receptor”

del sensor, se produce un cambio que es detectado por el “transductor” y transfor-mado en una señal eléctrica que es medida por un instrumento.

Esta configuración tan simple de reconoci-miento y transducción es la que ha permitido el diseño de una instrumentación con carac-terísticas prácticas e innovadoras en el campo del análisis. Mediante este esquema analítico tan sencillo fue posible eliminar numerosas etapas necesarias en un proceso analítico convencional tales como el trata-miento de la muestra o la separación del componente que se quiere determinar del resto de la muestra, que complican un pro-cedimiento clásico de análisis basado en equipamiento analítico tradicional. Un aspecto fundamental de este diseño es la generación de una señal suficientemente intensa entre el componente que se desea analizar (el analito) y el “receptor” selectivo de éste o “elemento de reconocimiento”. Mientras más simple y confiable sea el

pro-ceso de reconocimiento, más lo será el dis-positivo resultante. Los demás aspectos aso-ciados al proceso y al sensor, como la con-versión (transducción) de las señales, su procesamiento y transmisión son igualmente importantes pero ya poseen un tratamiento mucho más desarrollado y efectivo gracias a los adelantos constantes y continuos de la micro y optoelectrónica.

La investigación y el desarrollo de los senso-res químicos están dirigidos principalmente a la obtención de receptores cada vez más selectivos de moléculas.

También es necesario inmovilizar los recep-tores sobre los transducrecep-tores más adecua-dos, sin que unos ni otros pierdan sus carac-terísticas funcionales. Hay todo un espectro de posibilidades de inmovilización de recep-tores sobre los transducrecep-tores, desde inmovi-lizaciones simples por adsorción, retención del receptor en geles o membranas polimé-ricas, o por entrecruzamiento de los recepto-res entre sí mediante agentes bifuncionales, hasta inmovilizaciones más complejas por unión química entre el receptor y el trans-ductor. Por otro lado, existe un abanico de posibilidades en el desarrollo de nuevos transductores mediante nuevos materiales de complejidad creciente. De todas formas, los esfuerzos se dirigen hacia el diseño de nuevos materiales de reconocimiento sufi-cientemente selectivos.

Los elementos de reconocimiento o recep-tores de naturaleza sintética presentan un grado de reconocimiento limitado. A pesar de esto se consiguen cada vez más materia-les adecuados para el desarrollo de sensores en aplicaciones muy concretas. Esta limita-ción hizo que se consideraran como “ele-mentos de reconocimiento” los receptores de naturaleza biológica o biorreceptores, para la construcción de transductores con materiales biológicos de reconocimiento molecular, mucho más selectivos que los de naturaleza sintética. Estos sensores químicos que incorporan materiales biológicos en su construcción se conocen como biosensores. Un biosensor es un sensor químico cuya parte receptora está constituída por material biológico para el reconocimiento molecular de la muestra.

Receptores y transductores

El componente receptor de un sensor quí-mico transforma selectivamente determinada información química contenida en una mues-tra en una forma de energía susceptible de ser medida por el transductor. El compo-nente transductor es un elemento capaz de

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RECEPTORES CADA VEZ MÁS SELECTIVOS DE MOLÉCULAS

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transformar la energía que codifica la infor-mación química procedente de la muestra en una señal analítica útil.

El componente receptor puede interaccionar con el analito mediante un mecanismo físico sin que haya una reacción. Es el caso en el que se detecta la interacción mediante un cambio de absorbancia, en el índice de refracción, en la conductividad, en la tempe-ratura o en la masa. Más común es que el receptor reconozca al analito mediante una reacción química o bioquímica.

Se conoce la selectividad limitada de la mayoría de las reacciones utilizadas en el análisis químico, que obliga a tratar previa-mente la muestra a fin de eliminar las

interfe-rencias. Este hecho ha ocasionado que sólo un número reducido de reacciones químicas sean aprovechadas como sistemas recepto-res en los sensorecepto-res químicos, ya que éstos se diseñan para funcionar en determinaciones directas sin tratamiento de la muestra. En la actualidad se están utilizando elegantes procedimientos sintéticos de arquitectura molecular para la obtención de reactivos muy innovadores, formadores selectivos de complejos receptor-analito (host-guest), cuando las especies implicadas se comple-mentan en forma y dimensiones (geometría) y en grupos enlazantes (energía). Por otro lado, se sabe que el reconocimiento mole-cular es la base de la vida celular, de su orga-nización y mantenimiento. La comunicación química entre células mediante sistemas moleculares complementarios es un proceso de vital importancia, responsable de la orga-nización y la protección de organismos y de la regulación de su metabolismo. Este tipo de reconocimiento, optimizado por la evolu-ción biológica, es el que se ha estado utili-zando para el desarrollo de los biosensores. FIGURA 3. La interacción de dos hebras de ADN (constituyente principal del genoma de organismos vivos),

o de un anticuerpo con su antígeno específico (constituyente principal del sistema inmune), o de una enzima con su correspondiente sustrato (efectoras biológicas más importantes mediante la catálisis de reacciones bioquímicas a nivel celular) son algunos modelos de interacciones biológicas en las que se inspiran los biosensores.

FIGURA 4: Estrategia seguida por el grupo de de Receptores Moleculares Aplicados para la producción de anticuerpos anti sulfonamida usados como biorreceptor en los biosensores electroquímico.

FIGURA 7. Representación esquemática de la estrategia de detección electroquímica de sulfonamidas basada en un magneto sensor. (A) Luego de la reacción inmunológica, las partículas magnéticas modificadas con el anticuerpo específico son captadas por el sensor magnético (I). El sensor se polariza a _0.150 V (II) y se detecta electroquímicamente la señal luego de la adición de los reactivos necesarios (III). Aspecto macroscópico del sensor con las partículas magnéticas en la superficie (IV). (B) Aspecto microscópico de la superficie del sensor con las esferas magnéticas, obtenidas mediante microscopía electrónica de barrido tomada a una resolución de 0.5 (mm) (I) y 100 _m (II a IV). (C) Imagen del prototipo desarrollado para medidas en el laboratorio. EN LA ACTUALIDAD SE ESTÁN UTILIZANDO ELEGANTES PROCEDIMIENTOS SINTÉTICOS DE ARQUITECTURA MOLECULAR PARA LA OBTENCIÓN DE REACTIVOS MUY INNOVADORES

Efectivamente, las interacciones entre enzi-mas y sustratos o inhibidores, entre anticuer-pos y antígenos o haptenos, entre diversos receptores y hormonas, fármacos y neuro-transmisores y entre fragmentos de ADN han servido de modelo a variados sistemas bio-sensores, algunos ya comercializados (Figura 3).

El Grupo de Receptores Moleculares Aplica-dos ha producido anticuerpos policlonales anti sulfonamidas de clase, así como anti atrazina, luego del diseño y síntesis de los haptenos inmunógenos, preservando la geo-metría, la conformación, y la distribución electrónica del analito (Figura 4). Estas molé-culas son receptores específicos ideales para biosensores.

Metodologías y tecnologías

La determinación de componentes en medios complejos mediante sensores y bio-sensores se ha promovido extensamente debido a su simplicidad. En algunos casos son los mismos laboratorios quienes constru-yen sus propios sensores para aplicaciones muy particulares.

Los sensores y biosensores son ideales para ser utilizados en mediciones directas, es decir, sin un tratamiento preliminar de la muestra. Son particularmente adecuados en los procesos industriales, sin necesidad de tomar muestras, in situ. Por ser portátiles y robustos, los sensores químicos también son apropiados en mediciones de procesos, junto a reactores industriales o en circunstan-cias especiales. Los sensores pueden conec-tarse de algún modo con el proceso a seguir o controlar muestras en forma continua. Es

decir, el sensor está acompañado de un sis-tema de toma de muestra automatizado. Los sensores y biosensores pretenden ser dispositivos cuya fabricación se realice de forma masiva a muy bajo coste. Así, con una fabricación económica, estos dispositivos podrían ser de “uso personal” y

desecha-bles, es decir, de usar y tirar.

Por lo tanto, la investigación y desarrollo de los sensores químicos y biosensores va tam-bién dirigida hacia diseños compatibles con tecnologías que posibiliten una gran produc-ción de dispositivos a bajo coste. En este sentido tiene una gran importancia el hecho de que los sensores se puedan desarrollan con tecnologías planas, de capas delgadas microlitográficas, como las que se utilizan en la fabricación de dispositivos microelectróni-cas y en circuitos impresos. Eventualmente pueden construirse sensores de capas grue-sas que no requieren inversiones muy eleva-das, como los producidos con técnicas seri-gráficas

Biosensores electroquímicos para el análisis rápido de residuos de antibióticos, pesticidas y bacterias patógenas en muestras

agroalimentarias y medioambientales

El Grupo de Sensores y Biosensores, en cola-boración con el Grupo de de Receptores Moleculares Aplicados, ha diseñado un sis-tema electroquímico para la detección de sulfonamidas en leche, basados en una reac-ción inmunológica competitiva. Para tal fin, los anticuerpos específicos de clase anti-sul-fonamidas se inmovilizaron covalentemente en partículas magnéticas modificadas con grupos tosil. El ensayo inmunológico com-petitivo se basó en la competencia entre el antibiótico en la muestra y un conjugado enzimático, diseñado y sintetizado por el Grupo de Receptores Moleculares Aplica-dos. Finalmente, la cantidad de antibiótico se detecta mediante una estrategia electro-química de manera muy sensible, en un esquema que se muestra en la Figura 7. El uso de las partículas, sumado a las propie-dades electroquímicas mejoradas del bio-sensor y al diseño apropiado del receptor molecular, hacen posible la detección del antibiótico en concentraciones 100 veces por debajo de los límites requeridos por UE (100 ppbs), en leche entera.

Por otro lado, el hecho de utilizar partículas magnéticas permite eliminar el efecto matriz mediante la simple dilución de la leche 4 veces en una solución amortiguada de fos-fato, tratamiento muy fácil de realizar. Los primeros prototipos han demostrado tener una excelente sensibilidad (1 ppbs), y unas excelentes características para la deter-minación de antibióticos fuera del ámbito del laboratorio, por ser de uso simple, capaces de ser operados por personal no entrenado, y de bajo coste.

Un ensayo similar se realizó para la detección de atrazina en zumo de naranja y aguas superficiales y embotelladas, que

demostra-ron excelentes límites de detección, 6•ng L-1, en zumo de naranja, muy por debajo del límite establecido por la Uniòn Esuropea (0.1 µg L-1) con un sistema electroquímico basa-dos en una reacción inmunológica competi-tiva. Para tal fin, los anticuerpos específicos de clase anti-atrazina se inmovilizaron cova-lentemente en partículas magnéticas modifi-cadas con grupos tosil. El ensayo inmunoló-gico competitivo se basó en la competencia entre el pesticida en la muestra y el conju-gado enzimático, diseñado y sintetizado por el Grupo de Receptores Moleculares Aplica-dos. Finalmente, la cantidad de pesticida se detecta mediante una estrategia similar a la que se muestra en la Figura 7. En el caso del zumo de naranja el tratamiento también es muy sencillo y consiste en la filtración y en la dilución.

Asimismo, se han diseñado estrategias de detección rápida de bacterias patógenas, tales como Salmonella y E coli, basado en su material genético y con detección electro-química. Se han diseñado unos metodolo-gías de amplificación del material genético usando primers magnéticos, que podrían ser integrados a termocicladores para la detec-ción electroquímica de la amplificadetec-ción a tiempo real.

Las perspectivas futuras se dirigen al diseño de estrategias basados en biosensores elec-troquímicos enfocados al diagnóstico de patologías en humanos y diagnóstico gené-tico, investigación que se realizará en el GSB con el apoyo de la empresa ADF Tecno-gen/Circagen. LOS SENSORES Y BIOSENSORES PRETENDEN SER DISPOSITIVOS CUYA FABRICACIÓN SE REALICE DE FORMA MASIVA A MUY BAJO COSTE LAS PERSPECTIVAS FUTURAS SE DIRIGEN AL DISEÑO DE ESTRATEGIAS BASADOS EN BIOSENSORES ELECTROQUÍMICOS ENFOCADOS AL DIAGNÓSTICO DE PATOLOGÍAS EN HUMANOS Y DIAGNÓSTICO GENÉTICO