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Introducción
Western Blotting (o inmunotransferencia) es un procedimiento estándar de laboratorio que permite a los investigadores verificar la expresión de una proteína, determinar la cantidad relativa de la proteína
presente en diferentes muestras, y analizar los resultados de los experimentos de
coinmunoprecipitación. En este método, una proteína diana se detecta con un sistema de gel y un anticuerpo primario específico en una muestra dada de tejido homogeneizado o extracto. La separación de proteínas según el peso molecular se consigue utilizando el desnaturalizante
SDS-PAGE. Después de la transferencia a una membrana, la proteína diana se probara con un anticuerpo primario específico y sera detectado por quimioluminiscencia.
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Western Blotting Procedure
Preparación de las muestras de proteinas
Preparación de las muestras de proteinas
- El cultivo celular se lava varias veces con PBS (tampón fosfato salino). * Para ayudar a mantener un pH constante.
- Centrifugar el cultivo a 2500 rpm durante 5 minutos. * Para el precipitado celular.
- Añadir 150 uL de reactivo para la extracción de proteínas.
* La purificación de las proteínas extraídas de una muestra a partir de células o tejido.
-Esperar 5 minutos a temperatura ambiente.
-Centrifugar a 15000rpm durante 5 minutos. * Recogida de proteína del sobrenadante.
-Mezcla de proteína con LDS (dodecilsulfato de litio) muestra buffer.
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* Tampón de muestra LDS (4X) se utiliza para preparar las muestras de proteína para desnaturalizar el gel
electroforesis con los geles.
-Calentar en el calentador a 95-100ºC durante 5 minutos. * Para romper la estructura 3-dimensional.
Fig. 2: Rompiendo la estructura 3-dimensional de la proteína
Empleando el sistema de gel vertical
- Mida la concentración de proteínas para cargar la misma cantidad de proteína.
Cargue 1X-MES o 1XMOPS de solución tampón al depósito de gel.
- Las muestras se cargan en pocillos en el gel. Uno de los carriles se reserva normalmente para un
marcador o una escalera es una mezcla disponible comercialmente de proteínas que tienen pesos
moleculares definidos, teñidos para formar bandas de líquido coloreado.
* Las muestras que contienen múltiples proteínas requieren de 10-15 ug de proteína por pocillo. Muestras purificadas que contienen proteínas simples o muy pocas proteinas requieren menos (2-5
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Fig.2: Sistema Vertical de gel
- Ejecute el gel a 200 V durante 45-50 minutos.
* Cuando se aplica tensión al gel, las proteínas migran en él a diferentes velocidades * Puede modificarse la tensión de acuerdo con el tamaño del gel.
* Permitir la migración continua hasta que el frente del colorante azul está en el extremo de las placas de vidrio, pero evite que migre fuera del gel.
Uso del sistema de transferencia en seco
-Retirar el gel para la transferencia después de la electroforesis.
* No hay necesidad de ningún tratamiento previo del gel después de la electroforesis. Lavar brevemente el gel en agua desionizada para eliminar cualquier resto de piezas pequeñas unidas al gel.
- Colocar la pila de ánodo y mojar la membrana Blot con agua desionizada. Eliminar las burbujas de
aire utilizando el rodillo de transferencia.
-Colocar el gel en la membrana y colocar el filtro de papel en el gel. Eliminar las burbujas de aire
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- Coloque la pila de cátodo, sin la bandeja en la parte superior del espaciador de metal con el lado del
electrodo de cobre hacia arriba.
* Asegúrese de que todas las capas se alinean a la derecha para que se lleve a cabo de manera
eficiente, elimine las burbujas.
Figura 3: Sistema de Transferencia en seco
- Colocar la esponja desechable en el lado interior de la tapa.
* La esponja absorbe cualquier exceso de líquido generado durante el Blot y ejerce una presión uniforme sobre la superficie de la pila.
- Cerrar la tapa y asegurar el cierre. Si la luz roja está encendida indica un circuito cerrado. Asegúrese de que el programa correcto está seleccionado. Seleccione el programa adecuado.
- Pulse el botón Start / Stop para iniciar la transferencia. La luz cambia de roja a verde. La transferencia continúa utilizando los parámetros que programó.
- El Dispositivo de Transferencia del Gel iBlot indica el final de la transferencia con pitidos repetidos, y parpadea la luz verde de la pantalla digital. Presione y suelte el botón Start / Stop para detener el pitido. La luz se convierte en una luz roja fija.
* El sistema se completó en 7 minutos.
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- Transfiera las proteínas a una membrana de nitrocelulosa. Abra la tapa del dispositivo de iBlot.. Recoga todo el material del dispositivo.
* Deseche la esponja desechable y la pila de cátodo.
* Retire con cuidado y deseche el filtro de papel y gel. Retire la membrana de nitrocelulosa de la pila y proceda con el procedimiento de bloqueo o tincion de la membrana.
* Deseche la pila de ánodo.
Bloqueo
-Puesto que la membrana ha sido escogida por su capacidad para unirse a proteínas y como los anticuerpos y la diana son proteínas, se deben tomar medidas para evitar interacciones entre la membrana y el anticuerpo utilizado para la detección de la proteína diana.
- Transferir la membrana de agua desionizada a PBS-T con leche sin grasa (5% de leche sin grasa seca en TBS). Esperar 30 minutos en el agitador.
* El bloqueo de la unión no específica se logra mediante la colocación de la membrana en una solución diluida de proteína - típicamente de leche sin grasa seca en solución salina tamponada con Tris (TBS), con un minimo porcentaje de detergente como por ejemplo el Tween 20 o Triton X-100.
7 Detección de proteínas
- Incubar el anticuerpo primario diluido (1:250 a 1:1000 en tampón de bloqueo) con la membrana durante 1 h en tampón de bloqueo en el agitador a temperatura ambiente.
- Lavar tres veces, 10 min en tampón de lavado (TBS que contiene 0,1% de Tween 20) con agitación. * Después lavar la membrana para eliminar el anticuerpo primario no unido, la membrana
es expuesta a otro anticuerpo, dirigido a una parte específica de la especie del anticuerpo primario.
- Incubar blot con el anticuerpo secundario (anti-IgG de conejo-HRP) (diluido 1:10.000 en tampón de bloqueo -1:2,000) durante 1 h en tampón de bloqueo a temperatura ambiente.
- Lavar tres veces, 10 min en tampón de lavado con agitación.
* Después de lavar las sondas no unidas, el western blot está listo para la detección de la sondas que están etiquetadas y unidas a la proteína de interés.
8 Visualización de Detección quimioluminiscente
- Los métodos de detección quimioluminiscentes dependen de la incubación de la transferencia Western con un sustrato que se ilumina cuando se expone en el anticuerpo secundario.
* El último paso se realizá en el cuarto oscuro.
-10 Ml de solución de detección según el prospecto del paquete proporcionado con el equipo de reactivos de quimioluminiscencia Blotting Substrate. Cubra la membrana del blot con una solución de detección e incube la membrana durante 20 segundos.
-Drene la solución de detección de exceso de la membrana, y envuelva el blot en plástico. Coloque una hoja de película de rayos X por encima de la membrana de plástico de envolver.
* Asegúrese de que la parte proteica de la membrana se enfrenta a la película de rayos X. Esto asegura la máxima sensibilidad.
-Cierre el casete y exponga la membrana a la película de rayos X durante 20 s.
* El tiempo de incubación puede variar dependiendo de la intensidad de las bandas de proteína y el tipo de película utilizada. Usar 20 segundos como referencia para un experimento típico.
-Eliminar la película de rayos X del casete y revele la película de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
* Si la primera película es demasiado oscura (sobreexpuesta), disminuir el tiempo de exposición a 10-20 s.
* Si la primera película es demasiado clara (subexpuestas), aumentar el tiempo de exposición a 20-60s.
9 Pelicula de rayos X del Western Blot.
