DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD BIOLOGIA EXPERIMENTAL

DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD

BIOLOGIA EXPERIMENTAL

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ALUMNO

ALEJANDRO HERNÁNDEZ LÓPEZ 96336848

ASESORES

DRA. ALDA ROCÍO ORTIZ MUÑIZ M. EN C. EDITH CORTES BARBERENA M. EN C. MARIA TERESA FONSECA FAVELA

NOMBRE: Alejandro Hernández López. MATRICULA: 96336848.

CLAVE: BE.003.04 TELEFONO: 56561520.

LICENCIATURA: Biología Experimental. DIVISIÓN: Ciencias Biológicas y de la Salud.

UNIDAD UNIVERSITARIA: Universidad Autónoma Metropolitana- Iztapalapa. TRIMESTRE LECTIVO: 04-I.

TITULO DEL TRABAJO: “Estudio cinético de la descondensación nuclear del

espermatozoide a través del citómetro de flujo.”

LUGAR DE REALIZACIÓN: Laboratorio S-257. Depto. Ciencias de la Salud. División de

Ciencias Biológicas y de la Salud Iztapalapa.

FECHA DE INICIO: 14 de febrero 2004. FECHA DE TÉRMINO: 14 de agosto 2004.

RESPONSABLE.

Dra. Alda Rocío Ortiz Muñiz. Profesora Titular “C”. Laboratorio de Biología Celular y

Citometría. Edif. S-255. Depto. de Ciencias de la Salud. UAM-I

ASESORES:

M. en C. Edith Cortes Barberena. Laboratorio de Biología Celular y Citometría. Edif.

S-255. Depto. de Ciencias de la Salud. UAM-I

M. en C. Maria Teresa Fonseca Favela. Profesora Titular“C”. Laboratorio de fisiología y

ESTUDIO CINÉTICO DE LA DESCONDENSACIÓN NUCLEAR DEL

ESPERMATOZOIDE A TRAVÉS DEL CITÓMETRO DE FLUJO.

Nombre: Alejandro Hernández López (Mat. 96336848) Licenciatura: Biología experimental.

Fecha de Inicio: 14 de febrero 2004. Fecha de Término: 14 de agosto 2004.

Responsable: Dra. Alda Rocío Ortiz Muñiz. Profesora Titular “C”. Laboratorio de Biología Celular y Citometría. Edif. S-255. Depto. de Ciencias de la Salud. UAM-I

Asesores: M. en C. Edith Cortes Barberena. Laboratorio de Biología Celular y Citometría. Edif. S-255. Depto. de Ciencias de la Salud. UAM-I

M. en C. Maria Teresa Fonseca Favela. Profesora Titular“C”. Laboratorio de fisiología y diferenciación del espermatozoide. S-257. Depto. De ciencias de la salud. UAM-I.

Durante la espermatogénesis que se lleva a cabo la conformación nuclear, que conlleva a la sustitución de las histonas somáticas por protaminas con la capacidad de formar

puentes disulfuro, las que le confieren una gran resistencia a los agentes físicos y químicos.

En los mamíferos euterinos, la condensación del espermatozoide se lleva a cabo en dos etapas. La primera, que ocurre en el testículo, la segunda etapa tiene lugar durante el transito del espermatozoide por el epidídimo y hacia la cola del mismo.

La condensación de la cromatina esta directamente relacionada con la capacidad de fertilizar al ovocito, en cambio, durante el proceso de fertilización se requiere que los puentes disulfuro sean rotos de manera eficiente, para la formación del pronúcleo masculino.

El objetivo de este trabajo fue establecer la técnica para cuantificar la descondensación espermática mediante el citómetro de flujo.

La descondensación nuclear se indujo in vitro, con el objeto de evaluar la estabilidad de la cromatina, tratando mediante la incubación del espermatozoide en presencia de

Ditiotreitol (DTT) 2µM por 45 minutos y lauril sulfato de sodio (SDS) al 1% por 0, 2, 5, 10, 15 y 20 min., ambos disueltos en amortiguador de borato 0.05M, pH 9.0. Posteriormente se tiñeron con Naranja de Acridina disuelta en buffer de citratos pH6, 6µg/mL, se fijaron con glutaraldehido al 2.5%. Las muestras fueron analizadas en el citómetro de flujo FACScan detectando la intensidad de dos fluorescencias (rojo-verde), se adquirieron 10,000 células por tiempo.

Para el análisis de los datos se usaron los programas WinMdi 2.8 y FCSExpress 2.

El análisis de varianza con un alfa 0.05 muestra que existe una diferencia significativa entre

los porcentajes de descondensación con respecto a los tiempos, en general se incrementa el

porcentaje de espermatozoides que muestran descondensación. Mientras que el mismo

análisis entre las muestras, no muestra diferencias signi

ACTIVIDADES REALIZADAS:

Durante el período del Servicio Social, se realizaron experimentos con el objeto de estandarizar las condiciones del análisis de la descondesación del núcleo del espermatozoide de cerdo, con este fin, se realizo la revisión bibliográfica, se recibió entrenamiento para el análisis la de las muestras espermáticas utilizando los parámetros de la WHO , se recibió un curso de citometría en el laboratorio S-205 a cargo de la Dra. Rocio Ortiz Muñiz, impartido por M. en C Edith Cortes Barberena, se implemento la técnica de descondensación nuclear del espermatozoide a través del citómetro de flujo. Así como interpretación de los resultados obtenidos en el citómetro de flujo y el análisis estadístico de los datos.

META.

Ø La meta es adquirir los conocimientos teóricos y prácticos para aplicarlos posteriormente al estudio de la capacitación.

OBJETIVOS.

Ø El establecimiento de la técnica para cuantificar la descondensación espermática mediante el citómetro de flujo.

Ø

Estandarización de la técnica de la descondensación química del núcleo del espermatozoide de cerdo en el citómetro de flujo.

Ø Establecimiento de las condiciones para estudiar una cinética de descondensación en el citómetro de flujo.

ESTUDIO CINÉTICO DE LA DESCONDENSACIÓN

NUCLEAR DEL ESPERMATOZOIDE A TRAVÉS DEL

CITÓMETRO DE FLUJO.

INTRODUCCIÓN.

El espermatozoide es el gameto masculino, producto final del proceso de la espermatogénesis que se lleva a cabo en los túbulos seminíferos de lo testículo. Este proceso involucra una serie de divisiones mitóticas de las espermatogonias, dos divisiones meióticas de los espermatocitos, una extensa remodelación de las espermátides durante la espermiogénesis y la liberación de estos a los túbulos seminíferos (Eddy, 1994).

Durante la diferenciación de la espermátida ocurren de manera secuencial varios procesos morfogénicos, que incluyen, la formación del acrosoma, del flagelo, la reorganización mitocondrial, la eliminación del citoplasma residual por la absorción de las células de Sertoli, y la conformación nuclear, que conlleva a la sustitución de las histonas somáticas por protaminas con la capacidad de formar puentes disulfuro, las que le confieren una gran resistencia a los agentes físicos y químicos. El proceso a veces, involucra un grupo de proteínas conocidas como proteínas de transición. Este reemplazo constituye uno de los cambios mas marcados en la estructura de la cromatina de los eucariontes.

La adecuada morfogénesis del núcleo de la espermátida es importante para la formación de un espermatozoide que sea capaz de desplazarse hacia el ovocito y fertilizarlo. Los defectos en dicha conformación, por ejemplo, forma anormal o condensación nuclear incompleta, conllevan a una baja fertilidad (Meistrich, 1993 ;

Eugene

, 2000).

Protaminas.

Las protaminas son proteínas relativamente pequeñas y extremadamente básicas, a pesar de su tamaño, cubren una vuelta del DNA y están constituidas por arginína en un 55 -70%, además de algunos residuos de cisteina, que forman puentes disulfuro en las moléculas de la protamina, los cuales proporcionan estabilidad a la cromatina espermática.

Existen varias clasificaciones de protaminas. Bloch en 1969, las clasifico en cinco tipos: Tipo I: Verdaderas protaminas. Pequeñas y ricas en arginína.

Tipo II: Protaminas estables o queratinosas. Ricas en arginina, pero que también contienen cisteina. Los mamíferos presentan este tipo de protamina.

Tipo III: Protaminas espermáticas intermedias. Contienen histidina y/o lisina, además de arginina.

Tipo IV: Parecidas a histonas somáticas

Tipo V: Proteínas no básicas detectadas en el núcleo de espermatozoides de forma ameboidea.

Protaminas estables (Tipo II).

La característica esencial de estas protaminas es la presencia de 6 a 9 residuos de cisteina por mol, lo cual permite la formación de puentes disulfuro, confiriéndole a la estructura de la cromatina espermática su gran estabilidad.

Existen varias subclasificaciones más de protaminas de acuerdo a su composición de aminoácidos, tales como la P1 y P2. De estas, la P1 se ha aislado en mamíferos y en aves, muchas de estas proteínas tienen una secuencia tetrapeptídica en el extremo amino terminal Ala-Arg-Tyr-Arg (ARYR), la cual va seguida por un motivo conservado Ser-Arg-Ser-Arg (SRSR), después por un grupo de cinco a siete argininas, en suma en esta región la posición 8, tiene serina o treonina, ambos son hidroxiaminoácidos, polares y susceptibles de ser fosforilados.

La P2 resulta muy interesante, pues comprende del 50 al 60% de las protaminas presentes en el humano y los estudios sugieren que esta puede interactuar con el DNA con una estructura parecida a dedos de zinc (Fuentes, 1996).

Una característica de las protaminas es que son fosforiladas rápidamente, solo un poco después de ser sintetizadas. La carga negativa de los residuos de fosforilados puede servir como punto clave para formar enlaces con otras protaminas y para la estabilización de las interacciones electrostáticas proteína-proteína, que pueden ser realizados con los residuos de arginina cargados positivamente. Este hecho ha conducido a la proposición de que la presencia de residuos de serina fosforilados le confieren a la protamina una carga negativa que podría modular la interacción de estas proteínas con el DNA, facilitando la formación de un complejo proteína-DNA.

Condensación del núcleo espermático.

En los mamíferos euterinos, la condensación del espermatozoide se lleva a cabo en dos etapas. La primera, que ocurre en el testículo, involucra la sustitución de las histonas somáticas por protaminas y esta vinculada con la morfogénesis del espermatozoide. En la segunda etapa, que tiene lugar durante el transito del espermatozoide por el epidídimo y hacia la cola del mismo, es donde finalmente se completa la formación de los puentes disulfuro, lo que concluye su conformación (Eddy,1994; Chapman, 2003). Esta nueva estructura de la cromatina, condensa al núcleo del espermatozoide y le confiere resistencia a una gran variedad de agentes químicos: ácidos fuertes, proteasas, DNAsas y detergentes (Chapman, 2003).

Se sabe que en ratas hay aproximadamente 6.9 nM de grupos sulfidrilo (SH) + disulfuro (S-S)/ 1x106 espermatozoides, de los cuales el 84% se encuentran en la forma de tioles en la cabeza del epididimo, mientras que en la cola ya solo se encuentra el 14%. Esta diferencia indica que durante su transito por las dos regiones epididimarias se forman 1.5 billones de puentes disulfuro/espermatozoide (Chapman, 2003).

La condensación de la cromatina esta directamente relacionada con la capacidad de fertilizar al ovocito. Por ejemplo, los espermatozoides tanto de la cabeza y del cuerpo proximal carecen de la habilidad de fertilizar; mientras que los espermatozoides del cuerpo distal y de la cola ya han adquirido esta habilidad (Chapman, 2003).

Descondensación Nuclear Espermática.

La descondensación del núcleo espermático, se realiza de forma natural en el ovocito posteriormente a la fertilización. El primer cambio visible que ocurre en el núcleo del espermatozoide después de su incorporación en el huevo, es el rompimiento de la envoltura nuclear, y se ha especulado la acción de fosfolipasas. Después, el material perinuclear comienza mezclarse con el citoplasma antes de la descondensación se haga aparente.

Los factores citoplásmicos, que causan la descondensación, parecen no ser especie especifico, debido a que diversos autores han logrado la descondesación in vitro del espermatozoide con factores procedentes de diferentes especies. El núcleo del espermatozoide humano puede descondensarse y transformarse en pronúcleo masculino en ovocitos de hamster, rana y sus extractos.

Contrario a lo que ocurre en la espermiogénesis, durante el proceso de fertilización se requiere que los puentes disulfuro sean rotos de manera eficiente, para la formación del pronúcleo masculino. Para que se realice este rompimiento, se necesitan equivalentes reductores, y se han propuesto varias fuentes de estos, entre los que se encuentra el glutatión, presente en el citoplasma del huevo.

Descondensación Nuclear Espermático In Vitro.

La descondensación nuclear puede ser inducida, también in vitro, sin la presencia del ooplasma, y la estabilidad de la cromatina puede ser evaluada por tratamiento con diferentes quelantes como el EDTA, aunque también mediante la incubación del espermatozoide en presencia de un detergente aniónico y un agente reductor (Bedford y Calvin, 1974;Cherrie y Yanagimachi, 1975; Rodríguez, 1985).

ANTECEDENTES.

El espermatozoide, para fertilizar al ovocito, necesita de una serie de condiciones tales como una morfología adecuada, característica de la especie, una buena movilidad y que se encuentren presentes los mecanismos de reconocimiento con el ovocito (Eddy, 1994), una vez que se ha llevado a cabo el reconocimiento y se inicia la fusión de las membranas, se requiere que el DNA se encuentre intacto, debidamente compactado y con una buena susceptibilidad a su posterior descompactación por parte de los factores específicos presentes en ooplasma (Calvin, 1971; Chenoweth, 2000;

Eugene

, 2000). El estudio de la condensación del núcleo espermático en las diferentes regiones del epidídimo, ha sido analizada in vitro, mediante la utilización del intercalante naranja de acridina (NA) y se ha podido correlacionar el grado de compactación de los núcleos espermaticos con su grado de madurez (Yossefi, 1994), también se ha determinado que deleciones o asincronías en la trascripción de los genes que codifican para protaminas inducen una baja en la fertilidad (Rhim, 1995; Keesook, 1995; Chenoweth, 2000;

Eugene

, 2000) e incluso detienen el desarrollo de los espermatozoides afectados (Lee, 1995). La detección de rompimientos en el DNA debido al mecanismo de reparación “nick translation” ha permitido establecer un ensayo de la estructura de la cromatina (SCSA), para medir la calidad del semen con fines de reproducción asistida, así como establecer la posibilidad de que un compuesto sea mutágeno (Potts, 1999; Sailer, 1995; Lewin, 1999; Evenson, 2000).

Sin embargo, el grado de condensación del núcleo sólo nos habla de una conformación prerequisito para la fertilización, en cambio la susceptibilidad a la descondensación nos hablaría de un parámetro directo de la eficiencia con la que se realizaría la descondensación del núcleo en el ovocito para la formación del pronúcleo masculino y el posterior reconocimiento de las cromátidas hermanas.

Como ya se menciono anteriormente, el estudio de la susceptibilidad a la descondensación del núcleo espermático, se propone como un parámetro adicional a los estándares tradicionales, que permita evaluar la fertilidad de una muestra espermática. Sin embargo, si este análisis es realizado por microscopia óptica resulta muy elaborado y tedioso, por lo cual se plantea la posibilidad de utilizar la citometría de flujo, que nos permite hacer un estudio del estado de la cromatina y de la célula en general de forma rápida y confiable.

El citómetro de flujo (CF) se utiliza ampliamente en la investigación y en la clínica, para la detección de enfermedades y evaluación de daño a nivel celular (Goetman,1993). En el caso de la investigación en células reproductivas, el CF tiene un gran potencial pues permite hacer análisis tanto del contenido de ácidos nucleicos (Terrence, 1990) como de la localización y cuantificación de moléculas especificas en el citoplasma y en la superficie celular (Goetman,1993) asimismo analizar el estado de las membranas plasmática y de los diferentes organelos; estudiar la estructura de la cromatina y también el daño a la misma por rompimientos del DNA, así como el grado de condensación de la cromatina. permitiendo además, recopilar de manera simultanea varios de estos datos (Goetman,1993; Ortiz, 2000).

Con este objetivo utilizamos al Ditiotreitol (DTT),un agente reductor que permite el rompimiento de los puentes disulfuro de las protaminas, relajando la estructura de la cromatina (Cherrie, 1975; Mahi; 1975; Rodríguez, 1985). Esta nueva estructura de la cromatina puede ser revelada sí al medio se le adiciona lauril sulfato de sodio (SDS) permitiendo la relajación de la membrana y un colorante especifico para el DNA nuclear como la NA, el cual al irse rompiendo los puentes disulfuro se intercalará con mayor facilidad en el DNA, incrementando la fluorescencia cuando la célula sea expuesta a la luz con la longitud de onda adecuada (láser de 488nm) (Yossefi, 1994).

OBJETIVOS: General:

Ø Establecer la técnica para cuantificar la descondensación espermática mediante el citómetro de flujo.

Particulares:

Ø Estandarizar la técnica de la descondensación química del núcleo espermático. Ø Establecer las condiciones para estudiar una cinética de descondensación en el

MATERIAL Y METODOS.

Para las mediciones de la cinética de descondensación se utilizaron 6 muestras de semen de cerdos considerados fértiles, normoespermicos de entre 8-42 meses de edad, de diferentes razas, provenientes de una granja comercial.

El análisis de las muestras de semen se realizo por microscopia óptica de contraste de fases, a 400X se analizo la cuenta de espermatozoides por mL, la morfología, la viabilidad con azul tripano y la movilidad (datos no mostrados).

Los eyaculados fueron lavados con amortiguador PBS (pH 7.3) (Figura 1) y centrifugados a 600 x g por 5 min. La pastilla se resuspendió en PBS (pH 7.3) y para ajustar la concentración celular a 1X106. se contó el número de espermatozoides usando hemocitometro.

Descondensación nuclear. Se realizo la técnica propuesta por Rodríguez y cols. ,en

1985, con modificaciones por Fonseca y colaboradores. Se indujo la descondensación nuclear mediante el rompimiento de los enlaces disulfuro de las protamínas, incubando una población de 10X106 por mL de una suspensión de espermatozoides en DTT 2µM por 45 min y relajando la membrana con SDS 1% por 0, 2, 5, 10, 15 y 20 min. disueltos ambos en amortiguador de borato 0.05M, pH 9.0. Posteriormente se tiñeron con Naranja de Acridina disuelta en buffer de citratos pH6, 6µg/mL, se fijaron con glutaraldehido al 2.5% (Figura1).

Citometria de flujo. Las muestras fueron analizadas en el citómetro de flujo FACScan

detectando la intensidad de dos fluorescencias (rojo-verde), se adquirieron 10,000 células por tiempo. Se realizo el análisis de los tubos que contenían a los espermatozoides tratados, ubicando a la población general, identificada como el pico mas alto de fluorescencia, en los canales 400 y 140 para las fluorescencias verde y roja respectivamente utilizando como referencia la adquisición de una muestra, a la cual no se le adiciono DTT ni SDS, pero si el resto de los reactivos.

Posteriormente, se adquirieron el resto de las muestras que con todos los reactivos necesarios para realizar la descondensación. Los resultados se administraron y registraron mediante el programa CellQuest.

Análisis de los datos. Para el análisis de los datos se usaron los programas WinMdi 2.8

y FCSExpress 2.

Con el programa WinMdi, se ubicaron diferentes regiones en una grafica de densidad de puntos, donde se contabilizaron los eventos ocurridos en cada una de estas(Figura 2). En el caso de FCSexpress 2, el programa tiene estas mismas regiones y ubica a los datos recopilados dentro de la que le corresponde de manera automática.

Regiones:

Las regiones de análisis (Figura 2) fueron desde la 0 hasta la tres, polígonos con sus vértices ubicados en:

R0=0,0 ; 1023,0 ; 1023,1023 ; 0,1023. R1=0,160 ;1023,0 ; 1023,1023 ; 0,1023. R2=55,88 ; 388,1023; 1023, 1023 : 0, 1023 120, 0. R3 en FCSexpress =0, 700 ; 700,0 ; 1023, 1023 ; 0, 1023 R3 en WinMdi = 0, 600 ; 600,0 ; 1023, 1023 ; 0, 1023 RESULTADOS.

Las muestras de espermatozoides de cerdo fueron analizadas en el citómetro de flujo FACScan de Becton Dickinson, detectando la intensidad de dos fluorescencias (rojo-verde), se adquirieron 10,000 células por tiempo.

El análisis numérico de los resultados obtenidos se realizó inicialmente mediante el programa FCS Express2 facilitado por la Dra. Betsabet Quintanilla del laboratorio de toxicología reproductiva del CINVESTAV. Sin embargo, debido a que en la UAM-I no se cuenta con la licencia para dicho programa, se adecuaron las regiones de análisis en el programa de WinMdi, corroborándose que no existen las diferencias importantes entre los resultados de ambos programas.

En el caso del programa FCSExpress2 los resultados fueron analizados ubicando la región 3 (verde alta) en el canal 700. En la Tabla 1 se muestran los datos numéricos del porcentaje de eventos que sobrepasaron este valor de intensidad de fluorescencia verde los cuales se consideran como descondensados.

En el caso del programa WinMdi la región 3 (verde alta) se ubicó en 600, en la Tabla 2 se muestran los datos numéricos del porcentaje de eventos que sobrepasaron este valor de intensidad de fluorescencia verde los cuales se consideran como descondensados.

Análisis estadístico.

Para verificar si existen diferencias en la descondensación nuclear de las muestras debido al tiempo de exposición a SDS se realizó un ANOVA utilizando el programa Excell. Los resultados se muestran en las Tablas 3 y 4. En donde se observa que la F calculada (F) es mayor que la F de tablas (valor critico para F) cuando se calcula para la diferencia entre tiempos (ver celdas resaltadas) por lo tanto existen diferencias significativas entre los porcentajes de descondensación de los núcleos espermáticos que corresponden a los diferentes tiempos de exposición a SDS.

Discusión.

En la figura 3 se grafican todos los valores de descondensación, con respecto al tiempo de exposición a SDS en ella se observa que algunas muestras tienen mejor respuesta a la descondensación, dicho efecto puede deberse más a la diferencia en la susceptibilidad de la cromatina de cada una de las muestras, reportada ya con anterioridad por otros autores (Evenson y cols., 1991; Huret, 1986; Molina y cols.,1995) que a una error en la metodología.

El análisis de varianza muestra que existe una diferencia significativa entre los porcentajes de descondensación con respecto a los tiempos, en general se incrementa el porcentaje de espermatozoides que muestran descondensación.

Mientras que el mismo análisis entre las muestras, no muestra diferencias significativas. Adicionalmente, se realizó un experimento donde se modificaron las concentraciones de DTT, (Figura 4), y se observa que en la concentración 3X el porcentaje de descondensación se eleva mas rápidamente que en 1X. En 3X tiene un pico máximo a los 2 minutos, 65 % y desciende a 40 % a los 5 minutos, mientras que en la concentración 1X el pico máximo en el porcentaje de descondensación es a los 5 minutos con 18 %. Sin embargo, la disminución en el porcentaje de espermatozoides identificados como descondensados después de los 5 minutos es más evidente en la concentración 3X que en 1X.

Con base en los resultados anteriores, se plantea la posibilidad de que las fluctuaciones en los porcentajes de espermatozoides considerados descondensados, se deban a propiedades intrínsecas del espermatozoide que le permitan revertir el efecto de los agentes reductores. Aunque, también puede deberse a que la velocidad de descondensación dependa de la concentración de DTT por lo que en las concentraciones mayores se lleve a cabo tan vertiginosamente que posteriormente ya no se detecten a los espermatozoides descondensados dentro del área de análisis en el citómetro de flujo. Los resultados obtenidos muestran que en un futuro se pueda normalizar la técnica si se resuelven algunos factores, tales como:

v Calibrar el citómetro de flujo, con las perlas de calibración de naranja de acridina para evitar que el testigo sea afectado por la variabilidad biológica.

v Determinar, la intensidad de fluorescencia mínima de la cromatina completamente condensada, con la utilización de agentes oxidantes con el objeto de oxidar la mayor cantidad de sulfidrilos, eliminando las posibles diferencias en la compactación debidas a la variabilidad biológica.

v Sería importante, comparar el coeficiente de correlación entre los valores de forward ligth scatter (FLC) contra la intensidad de fluorescencia, con el objeto de verificar si las discrepancias del coeficiente de correlación entre el tiempo y la intensidad de fluorescencia no se deben a un artefacto provocado por los detritos. v La posibilidad de usar un software que permita analizar el coeficiente de

correlación entre FLC, SLC (Side ligth scatter) y la intensidad de fluorescencia, tal como el Consort 30 de Becton Dickinson sugerido por Molina y colaboradores (1995).

CONCLUSIONES.

Del análisis de los resultados, se concluye que, se alcanzaron los objetivos de establecer una técnica que permita medir la descondensación del espermatozoide mediante el citómetro de flujo, tanto de una metodología adecuada para la reacción, tinción y cuantificación mediante el citómetro de flujo como del análisis de los resultados obtenidos mediante el sofware FCS Express2.

PERSPECTIVAS.

Se tiene que reconocer, que se pueden abordar algunas variaciones en la técnica de descondensación con el objeto de hacer mas evidentes los resultados.

Específicamente para la técnica de descondensación, un manejo mas eficiente de las muestras, que reduzca el tiempo de exposición de los espermatozoides al liquido seminal y por tanto la super estabilización de la cromatina, Así como, una determinación de la concentración de DTT mas adecuada con propósitos de citometría, permitirán reducir las diferencias en la respuesta de los espermatozoides a la descondensación.

En el caso de la citometría de flujo, se considera que la mejora en la calibración del equipo y la determinación de la región de fluorescencia basal de espermatozoides sin descondensar, con las consideraciones anotadas en el apartado de discusión, ayudarían a disminuir en lo posible el efecto de la variabilidad biológica.

La región 0 proporciona

el valor de todos los

datos adquiridos

por el citometro de flujo

La región 1 proporciona el

porcentaje de

espermatozoides descontando

los que tienen un valor muy

bajo que pueden ser basura.

La región 2 proporciona el

porcentaje de espermatozoides que presentan desnaturalización.

La región 3 ubica el porcentaje

de espermatozoides que

presentan descondensación.

Tabla 1.Porcentaje de descondensación de núcleos espermaticos analizados con FCS Express2.

Tiempo *

(min) 29 de Ene 25 de jun 10 de oct 24 de oct 13 de nov

0 2.29 2.16 43.1 7.66 29.93 2 3.24 16.09 17.08 11.12 26.92 5 3.08 19.87 20.78 10.21 18.95 10 5.75 30.63 26.54 12.04 30.55 15 9.55 22.01 38.15 14.67 26.03 20 17.91 31.76 30.03 11.98 39.7

*Tiempo de exposición a SDS, 0,5,10,15,y 20 min.

Tabla 2:. Porcentaje de descondensación de núcleos espermáticos analizados con

WinMdi.

Tiempo 09-Ago 11-Jul 18-Jul 25-Jul 22-Ago 24-Oct

0 1.25 16.13 9.67 8.13 5.59 11.37 2 3.59 11.64 12.81 16.42 5.93 21.43 5 5.24 8.76 12.13 22.05 13.32 3.94 10 3.91 14.59 13.05 20.95 4.39 12.53 15 5.2 11.73 13.91 15.14 2.85 12.53 20 5.2 12.92 14.25 97.27 4.38 12.53

*Tiempo de exposición a SDS, 0,5,10,15,y 20 min.

Tabla 3.Análisis de varianza con Excel de los resultados obtenidos con FCS Express2.

Origen de las variaciones Suma de cuadrados Grados de libertad Promedio de los cuadrados F Probabilidad Valor crítico para F Muestras 532.77 5 106.55 2.15 0.100 2.71 Tiempos* 2431.11 4 607.77 12.26 3.35E-05 2.86 Error 990.80 20 49.54 Total 3954.69012 29

*Tiempo de exposición a SDS, 0,5,10,15,y 20 min.

Tabla 4.Análisis de varianza con Excel de los resultados obtenidos con WinMdi.

Origen de las variaciones Suma de cuadrados Grados de libertad Promedio de

los cuadrados F Prob

Valor crítico para F

Muestras 40.03 5 10 0.56 0.69 2.86

Tiempos* 541.87 5 108.37 6.09 0.001 2.71

Porcentaje de descondensación de la muestra del 27 de mayo expuesta a 3 diferentes concentraciones de DTT por 45 minutos.

0 10 20 30 40 50 60 70 0 5 10 _{Tiempo (min)} 15 20 25 % de espermatoz oides descondensados.

1x

2x

3x

FIGURA 4 Porcentaje de descondensación de la misma muestra expuesta a tres

concentraciones de DTT por 45 minutos y a 0, 2, 5, 10, 15 y 20 minutos con SDS.

% de espermatozoides descondensados en todos los tiempos.

0 20 40 60 80 100 120 0 _{5 10 15 20 25} tiempo % de desconden sados 29 de Enero 03

25-Jun 10-Oct 24-Oct

13-Nov 09-Ago 11-Jul 18-Jul

25-Jul 22-Ago 24-Oct

Figura 3 Se muestra la grafica de todos los valores de porcentaje de descondensación

LUGAR DE REALIZACIÓN: Laboratorio S-257. Depto. Ciencias de la Salud. Div.

Ciencias Biológicas y de la Salud. UAM- Iztapalapa.

DURACIÓN Y ETAPAS. 1er Bimestre:

Ø Búsqueda y actualización bibliográfica.

Ø Estandarización de la técnica de la descondensación química del núcleo del espermatozoide de cerdo.

2º Bimestre.

Ø Búsqueda y actualización bibliográfica.

Ø Establecimiento de las condiciones para el estudio de la descondensación química del núcleo del espermatozoide de cerdo en el citómetro de flujo.

3º Bimestre

Ø Búsqueda y actualización bibliográfica.

Ø Análisis e interpretación de los resultados obtenidos en el citómetro de flujo. Ø Análisis estadístico de los datos.

Ø Escritura del reporte final.

TIEMPO DE DURACIÓN: Este proyecto de Servicio Social se realizó en 6 meses,

cubriendo 20 hrs a la semana, hasta completar 480 horas totales.

Cronograma de actividades.

Actividades enero febrero marzo abril mayo junio

Búsqueda y actualización bibliografía x x x x x x Estandarización de la técnica de la

descondensación química del núcleo del espermatozoide de cerdo

x

Establecimiento de las condiciones para el estudio de la descondensación química del núcleo del espermatozoide de cerdo en el citómetro de flujo

x x x

Análisis e interpretación de los resultados obtenidos en el citómetro de flujo

x x

Análisis estadístico de los datos x

Escritura del reporte final. x

CRITERIOS DE EVALUACIÓN:

Los criterios de evaluación considerados en el presente trabajo fueron: v El cumplimiento de los objetivos particulares.

v Desempeño y trabajo realizado durante el periodo de Servicio Social. v El análisis de resultados.

LITERATURA CITADA.

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