Adhesión bacteriana sobre una resina de cementación de brackets tratada con dos enjuagues bucales Estudio experimental In Vitro

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(1)ADHESIÓN BACTERIANA SOBRE UNA RESINA DE CEMENTACIÓN DE BRACKETS. TRATADA. CON. DOS. ENJUAGUES. BUCALES.. ESTUDIO. EXPERIMENTAL IN VITRO BACTERIAL ADHESION ON A BRACKET CEMENTING RESIN TREATED WITH TWO MOUTH RINSES. IN VITRO EXPERIMENTAL STUDY. Erika Katherinne Velásquez Chaparro. OD. Universidad Santo Tomas De Aquino. Estudiante Posgrado de Ortodoncia Universidad Cooperativa de Colombia. Sede Bogotá. [email protected] Jennifer Danitza Yela Meneses. OD. Colegio Odontológico Colombiano Estudiante posgrado de Ortodoncia Universidad Cooperativa de Colombia. Sede Bogotá. [email protected] Asesores científicos Linda Piedad Delgado Perdomo, OD. Ortodoncista Pontificia universidad Javeriana Jefe de Programa de Especialización en Ortodoncia. Docente de Postgrado ortodoncia Maxilar. [email protected] Alejandro Peláez Varga, Odontólogo, BMEs, MSc, doctor en ingeniería biomédica. Docente de pregrado y posgrado. [email protected] Asesora metodológica Adiela Ruiz Gómez. OD. Docente de Investigación Postgrado de Odontología. UCC, Sede Bogotá..

(2) RESUMEN En el procedimiento de cementacion de aparatos fijos, el exceso de adhesivo predispone la formación de biopelícula y otras consecuencias sobre el esmalte dental. Los enjuagues bucales a base de plantas medicinales presentan potencial de acción bacteriostatica u bactericida sobre microorganismos orales.Objetivo: Comparar los efectos de los enjuagues de caléndula officinalis y clorhexidina digluconato sobre la adhesión bacteriana in vitro de Streptococcus mutans usando como modelo de sustrato una resina de ortodoncia. Métodos: Se realizó un estudio experimental in vitro sobre discos de resina compuesta (Transbond XT®). Para evaluar la capacidad antimicrobiana se realizaron ensayos de difusión de disco y curvas de crecimiento en presencia de caléndula officinalis y clorhexidina; la adherencia bacteriana fue calculada a partir del número de UFC, ensayo de MTT y Microscopia Electrónica de Barrido. Se analizaron datos con pruebas de análisis de varianza ANOVA. Un post test con la prueba de Tukey valores de p≤0.05 son estadísticamente significativas. Resultados: Los discos tratados con caléndula officinalis 0.2% no mostraron efecto inhibitorio frente a Streptococcus mutans, tampoco se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los enjuagues de caléndula officinalis y clorhexidina digluconato en los tiempos de incubación (4h p=0,321, 6h p=0,956 y 24h p=0,7216). Conclusiones: El enjuague a base de caléndula officinalis al 0.2% demostró un control bacteriostatico que podría ser eficiente en la prevención de la lesión de mancha blanca, por lo que se sugiere examinar el aceite esencial de caléndula en su forma original y determinar la concentración necesaria para lograr un control adecuado clínico..

(3) Palabras clave: Carga bacteriana, Streptococcus mutans, resina compuesta, enjuague bucal, caléndula officinalis, clorhexidina..

(4) ABSTRACT In the cementing procedure of fixed appliances, the excess adhesive predisposes to biofilm formation and other consequences on the tooth enamel. Mouthwashes in a base of medicinal plants have a potential for bacteriostatic or bactericidal action on oral microorganisms.Objective:. compares. the effects. of. calendula. officinalis. and. chlorhexidine digluconate on the bacterial in vitro Streptococcus mutans. orthodontics. Methods: An in vitro experimental study was carried out on composite resin discs (Transbond XT®). To test the antimicrobial capacity, disc diffusion tests and growth curves are performed in the presence of calendula officinalis and chlorhexidine; Bacterial adhesion was calculated from the number of CFU, MTT assay and Scanning Electron Microscopy. The data will be analyzed with ANOVA analysis of variance tests. A post test with the Tukey test values of p≤0.05 are statistically significant. Results: The discotheques with calendula officinalis 0.2% did not affect inhibitory against Streptococcus mutans, nor the statistically significant differences in the rinse of calendula officinalis and chlorhexidine digluconate in the incubation times (4h p = 0.321, 6h p = 0.956 and 24h p = 0.7216). Conclusions: 0.2% Calendula officinalis rinse showed a bacteriostatic control that could be efficient in the prevention of white spot injury, so the essential oil of the calendula in its original form is recommended and the concentration for achieve adequate clinical control. Key words: Bacterial load, Streptococcus mutans, composite resin, mouthwash, calendula officinalis, chlorhexidine..

(5) INTRODUCCIÓN Según el IV Estudio Nacional de Salud Bucal (ENSAB 2014) la prevalencia de lesión de mancha blanca -LMB- en dentición permanente sin aparatos fijos en Colombia es de 8,3 % entre los 15 y 34 años (1); con respecto a la prevalencia de LMB en pacientes tratados con aparatos fijos, se han encontrado aumentos entre 70% y 90% (2–5); Enaia y col encontraron en pacientes de 14 años un aumento de 32,3% antes de iniciar el tratamiento a 73,5% al finalizar el mismo (6); se puede asociar que una deficiente higiene oral sumada a una inadecuada técnica de cementación con excesos de adhesivo alrededor del bracket, son las principales causas de la patología, debido a un aumento significativo del Streptococcus mutans coadyuvante en la desmineralización del esmalte dental, hasta un 300% en saliva, durante la fase activa del tratamiento de ortodoncia, convirtiéndose en un reto para el ortodoncista (7). Ho y col, describen que una forma de controlar el S. mutans, es eliminando adecuadamente el exceso de adhesivo en la interfaz bracket-esmalte (8), inclusive cuando se usan adhesivos que presenten características de acción antimicrobiana como los ionómeros de vidrio, o con baja energía superficial y baja rugosidad como las resinas compuestas (Transbond XT), comúnmente usadas en ortodoncia (9–12). Por otro lado, Claffey asocia la mala práctica en las técnicas de higiene oral, mecánicas (cepillado dental y seda dental) y químicas (enjuague bucal) como un coadyuvante en la formación de la LMB (13); el Subsistema de Vigilancia Epidemiológica de la Salud Oral -SISVESO- en Bogotá en el 2011 encontró que el 77.5% de la población no usa seda dental, el 55.8% usa cepillo y crema dental dos veces al día y el 91.7% no usa enjuague bucal, haciéndolos propensos a la adhesión.

(6) de microorganismos patógenos como el S. mutans (14); Davis y col resaltan que la presencia de aparatos ortodónticos fijos aumenta la retención de biopelícula, reduciendo la efectividad de las prácticas tradicionales de higiene oral (15); esto obliga al paciente a asumir mayor tiempo en autocuidado, modificación en las técnicas y al uso de nuevos insumos y productos que complementen el control bacteriano (16). Es relevante que el odontólogo informe al paciente que el uso del enjuague bucal no sustituye el cepillado dental, sino que actúa como antiséptico eliminando bacterias que no se logran retirar de forma mecánica. De acuerdo a la evidencia, algunos de los efectos secundarios pueden ser pigmentaciones, disgusia entre otros los cuales se han asociado al uso prolongado de enjuague de clorhexidina digluconato, es por esto que se prefiere el uso de plantas medicinales y aceites esenciales debido a su baja toxicidad y sus beneficios antiinflamatorios y antimicrobianos (17,18). Chen y col, en dos diferentes experimentos in vitro demostraron el efecto inhibitorio y bactericida de las plantas medicinales sobre el S. mutans; en uno de ellos usaron el Fructus mume, evidenciando la disminución en la adhesión de S. mutans sobre brackets metálicos (19); y en el otro compararon dos enjuagues bucales, uno a base de aceites esenciales (Listerine®) y clorhexidina; encontraron que el primero produce un mayor efecto bactericida y un menor efecto inhibitorio respecto al segundo enjuague (20). Debido a la poca evidencia del efecto antimicrobiano de enjuagues a base de plantas medicinales sobre materiales de cementación en ortodoncia (21) la necesidad de bajar la prevalencia de LMB después de los tratamientos de.

(7) ortodoncia fija, se eligió la caléndula officinalis por ser de una de las plantas medicinales más representativas en el control antimicrobiano, efecto fungicida y anti-inflamatorio aplicable en salud oral(22). Es por esto que el objetivo de este estudio fue evaluar la eficacia antimicrobiana del enjuague a base de caléndula officinalis al 0.2% (K-trix – Farpag – Bogotá, Colombia), con respecto a la clorhexidina Digluconato al 0.2 g (Clorhexol – Farpag – Bogotá, Colombia), sobre la adhesión bacteriana de S. mutans in vitro en una resina de ortodoncia como modelo de sustrato..

(8) MATERIALES Y MÉTODOS. Para la preparación de 118 discos de resina (Transbond XT, 3M Unitek, Monrovia, CA, USA), se construyó un molde de acrílico (3mm de diámetro por 1 mm de profundidad) a partir de CAD/CAM sustractivo por manufactura de corte láser. Un solo operador fabricó todos los discos y los fotocuró por 20s por cada cara a una distancia de 2mm con una lámpara halógena (OPTILUX 501, Kerr, USA. Potencia = 850 Mw/cm2). Posteriormente, los discos fueron sometidos a un control de calidad en un estereomicroscopio antes de ser esterilizados en solución de glutadina 2% (Holandina, Colombia) durante 20 min, luego fueron divididos y sumergidos por 2h así: Grupo 1, en una solución de clorhexidina digluconato 0,2g (Farpag, Colombia), Grupo 2 en una solución de caléndula officinalis 0,2% (K-trix, Farpag, Colombia) y Grupo control en agua destilada.. Caracterización biológica Para evaluar los efectos del crecimiento de S. mutans (Cepa ATCC 25175) sobre los enjuagues bucales se realizaron dos pruebas, una de ellas son las curvas de crecimiento realizadas en placas de 96 pozos de poliestireno sin tratamiento (Costar, USA) con inóculos iniciales en medio BHI (Brain Heart Infusion, Scharlau, España) a una concentración de 1x108UFC/ml, fueron procesados durante 12 horas para identificar las fases del crecimiento de la bacteria, los enjuagues se diluyeron en diferentes concentraciones a partir de su formula comercial el de clorhexidina digluconato 0.2g en (4ppm - 0.002g; 40ppm – 0.02g; 120ppm – 0.06 g; 200ppm – 0.1 g y 280ppm – 0.14g) y caléndula officinalis 0.2% (400ppm – 0.002%; 4000ppm,.

(9) - 0.02%; 12000ppm – 0.06% 20000ppm – 0.1% y 28000ppm – 0.14%) con el fin de obtener la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de cada producto. Se hizo medidas de absorbancia cada 30min durante 12h a 600nm en un espectrofotómetro de microplacas (Multiskan GO, Thermo Scientific, USA). Y el otra prueba fue el método de difusión por disco de ambos enjuagues evaluados bajo la metodología de Kirby-Bauer (23). Se preparó un inóculo de S. mutans en solución salina, se midió la turbidez hasta obtener 750NTU (1x10 9UFC/mL) y luego se realizó una dilución de 1:10 (1x108UFC/mL) que fue empleada para inocular placas de Agar Mueller Hinton sobre las que se sembraron tres discos de resina compuesta impregnados con 10μL de cada enjuague, paralelamente se sembraron discos de papel filtro de 5mm de diámetro (Advantec, Japón) impregnados con 10μL clorhexidina digluconato 0,2g y caléndula officinalis 0.2% y como control negativo se empleó solución salina. Las placas se incubaron a 37°C y 5% CO 2 durante 24h. Se tomaron fotografías digitales y se midió el diámetro de la Zona de Inhibición de crecimiento (IZ) con el programa Image J. Todos los ensayos se realizaron por duplicado (24). Para la cuantificación de la adhesión bacteriana se llevó a cabo mediante el método de plateo por recuento de Unidades Formadoras de Colonias (UFC/mL), el ensayo de MTT y microscopia electrónica de barrido. Para las tres pruebas se colocaron ocho discos de cada grupo experimental con sus respectivos controles en placas de 24 pozos según los tiempos de incubación de 4h, 6h y 24h. Para evitar que se agoten los nutrientes en los pozos de 24h fue adicionado 1ml de medio BHI transcurridas 10h. Para el recuento de unidades formadoras de colonias en cada tiempo se hicieron.

(10) tres lavados y los discos fueron transferidos a viales de 2ml con solución salina y sometidos a un pulso de 125kHz por 3s en un sonicador vertical (Q-Sonica, USA). Posteriormente, se prepararon diluciones seriadas y se cultivaron con un medio solido BHI bacitracina (0,1%, BD Difco, USA) por 24 h, 37°C y 5% CO 2. Todos los ensayos se realizaron por duplicado. Cumplidos 24h de incubación como fue descrito previamente, se descartó el medio y se realizaron dos lavados durante 5min con solución salina al 0,9% (Baxter, USA). Se agregó 1ml de BHI con una solución de MTT 5mg/ml como ha sido descrito previamente (25) y se incubó durante 4 horas a 37°C, 120 rpm y 5% CO 2 en ausencia de luz. Se descartó el medio, se agregaron 500µl de DMSO (Emplura, Japón) y se incubó durante 30min a 37°C y 120rpm en ausencia de luz. Se transfirieron 200 µl de la solución de DMSO a una placa de 96 pozos de poliestireno para medir absorbancia a 550nm en un espectrofotómetro de microplacas (Multiskan GO). Todos los ensayos se realizaron por duplicado. Por último, para la caracterización por microscopia electrónica de barrido al finalizar cada tiempo de incubación se descartó el medio y se realizaron dos lavados durante 5 minutos con solución salina al 0,9% (Baxter, EE. UU.). Se agregaron 100µl de Formaldehído 4% para cada disco durante 30min. Los discos se deshidrataron usando un gradiente de Etanol partiendo de una concentración de 50% v/v hasta 100% v/v, se metalizaron con una capa de 15nm de oro/paladio. Se realizaron observaciones en modo Electrones Secundarios a 15kV (26). Para el análisis estadístico se usó una prueba de análisis de varianza ANOVA con un post test con la prueba de Tukey para comparación entre medias, los valores de p≤0.05 fueron considerados como diferencias estadísticamente significativas..

(11) Todos los análisis fueron realizados usando los programas MATLAB (R2018, USA) y R (R studio. versión 3.5.1, Boston, Illinois, USA)..

(12) RESULTADOS. En la curva de crecimiento de S. mutans la concentracion minima inhibitroria fue de 40ppm (0.02g) para la solución de clorhexidina digluconato (C.D) y 20000ppm (0.1%) para caléndula officinalis (C.O). (Figura1). Los efectos obtenidos bajo estas concentraciones son similares en los dos enjuagues. Los discos de resina tratados con clorhexidina digluconato 0,2g mostraron un efecto inhibitorio significativo respecto al control negativo (P<0,001), por el contrario, el C.O a bajas concentraciones no mostro ningún efecto frente al S. mutans. (Figura 2 y 3).. Para la cuantificación de la adhesión de S. mutans a los discos de resina se emplearon tres pruebas para el método de conteo de Unidades Formadoras de Colonias (UFC/mL), los resultados mostraron diferencias estadísticamente significativas entre los promedios de los dos grupos evaluados respecto al control negativo en los diferentes tiempos de incubación (4h, 6h y 24h) (p<0,001). No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los discos tratados con C.O y C.D (4h p=0,321, 6h p=0,956 y 24h p=0,7216). (Figura 4). Para los valores de densidad óptica, que se midieron mediante un ensayo de cuantificación con MTT demostraron viabilidad celular a partir de biopelículas de S. mutans después de 2 horas de exposición a los diferentes agentes de prueba, con diferencias estadísticamente significativas entre los discos tratados control negativo y los de clorhexidina digluconato 0.2g (p=0,022). Sin embargo, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre el grupo control y el grupo de discos tratados con caléndula officinalis 0.2% (p=0,483) y entre el grupo de clorhexidina.

(13) digluconato y caléndula officinalis (p=0.1958) (Figura 5). Y por último la mediante microscopia electrónica de barrido, se observó adherencia de S. mutans en todos los tiempos y tratamientos. Cualitativamente, se evidencia una menor adherencia en los discos tratados con clorhexidina digluconato 0.2g. (Figura 6).

(14) DISCUSIÓN los materiales usados en ortodoncia (brackets, resina, ácidos desmineralizantes) y la dificultad que presenta el paciente para removerla biopelicula promueve la colonización de S. mutans siendo un agente causal de la LMB (8,26) Para el odontólogo es importante el control del S. mutans en boca con técnicas de prevención como lo son las mecánicas (cepillado y la seda dental) (27) o los aceites esenciales sintéticos o naturales (20,28) coadyuvantes en la remoción de la biopelicula (29) de estos, los enjuagues a base de clorhexidina, con una efectividad bactericida indiscutible el cual no se aconseja usar a largo plazo por efectos adversos como disgusia, sensación de boca quemada, pigmentación dental y de restauraciones, (16,28). El uso de la fitoterapia en salud oral se ha propuesto durante los últimos años pues se han demostrado propiedades bactericidas, bacteriostáticas, antimicrobianas y antifúngicas por parte de plantas medicinales (17,19,30) por lo tanto los enjuagues bucales se recomiendan cuando la higiene oral mecánica se dificulta; las investigaciones se han enfocado en el control bacteriano de pacientes sin aparatos fijos, este estudio evaluó pacientes con brackets controlados con un enjuague a base de caléndula officinalis la inhibición de la adhesión bacteriana in vitro del S. mutans. (20,31) A nivel de curva de crecimiento el enjuague a base de caléndula officinalis 0.2% (C.O), demostró disminución en el crecimiento bacteriano a las 2 horas, en el estudio de Shankar y col (2017) la evaluación de la curva de crecimiento se realizó en tiempos menores y a una concentracion diferente del principio activo del enjuague, el cual no es equiparables con este estudio, encontrando detención del crecimiento bacteriano a los 5 minutos de iniciada la prueba..

(15) En el presente estudio la concentración mínima inhibitoria (CMI) para el S. mutans de los enjuagues de clorhexidina digluconato (C.D) y caléndula officinalis (C.O) fue de 40ppm y 20000ppm respectivamente, siendo sus concentraciones similares. Shankar y col, demostraron que la CMI de caléndula officinalis C.O para S. mutans fue de 3.12 ppm y la clorhexidina digluconato CD fue de 6.25 ppm, teniendo mayor sensibilidad de inhibición la caléndula officinalis C.O a menor concentración relacionada con la clorhexidina digluconato C.D.(32) Con respecto al método de difusión de disco, en el presente estudio no se observaron halos inhibitorios en la caléndula officinalis C.O conservando los diámetros de 3mm correspondientes al disco de resina y de 5mm de los discos de papel y respecto a la clorhexidina digluconato C.D se encontraron en promedio halos de 16.01mm de diámetro, resultados que concuerda con Gauniyal P y Col (2015) quienes evalúan el efecto del extracto de caléndula officinalis C.O y como control la clorhexidina digluconato C.D sobre S. mutans donde los halos inhibitorios fueron de 0mm y 30.3±2mm respectivamente(30) y con el estudio de Anushree B y Col (2015) que evalúan el efecto de pasta dental con caléndula officinalis C.O, demostrando que no fueron efectiva contra el estreptococo exhibiendo ausencia de halos(33), por otro lado, Shankar y col (2017) demuestra una alta efectividad inhibitoria de la caléndula officinalis C.O sobre esta bacteria, formado halos de 15mm y bajo el efecto de la clorhexidina digluconato C.D con halos de 20mm (32) Todos los estudios tienen protocolos ligeramente diferentes para la preparación de caléndula officinalis CO, por lo tanto, las diferencias deben considerarse teniendo en cuenta los protocolos, presentación comercial y concentraciones, hacen que cada diseño de estudio sea diferente a pesar de usar la misma planta medicinal..

(16) Se deben considerar todos los factores que interactuantes en la formación de biopelícula y evaluarlo in vivo considerando las técnicas de higiene oral, dieta, adhesivo ortodóntico y método de ligado. El clínico debe conocer esta relación y en consecuencia, prestar atención a todas las variables para identificar la causante de una mayor adhesión de colonias de S. mutans..

(17) CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES. •. La caléndula officinalis no mostró efecto antimicrobiano de S. mutans en su concentración comercial (0.2%-K-trix – Farpag – Bogotá, Colombia).. •. La caléndula officinalis al 0.2% demostró un control antibacterial que podría ser eficiente en la prevención de la lesión de mancha blanca, por lo que se sugiere examinar el aceite esencial de caléndula en su forma original y de esta manera determinar la concentración necesaria para lograr un control adecuado clínicamente.. •. Debido a la poca evidencia científica en el control antibacterial de las plantas medicinales enfocado en la cuantificación de adhesión bacteriana con pruebas como UFC y MTT sobre materiales de uso en ortodoncia, es necesario seguir investigando en el tema para establecer los cuidados necesarios en el control de la LMB durante el tratamiento de ortodoncia..

(18) BIBLIOGRAFIA. 1.. Ministerio de Salud y Protección Social, MINSALUD. IV Estudio Nacional De Salud Bucal - ENSAB IV. Bogotá, Colomb. 2014;3:381.. 2.. Bishara SE, Ostby AW. White Spot Lesions: Formation, Prevention, and Treatment. Semin Orthod. 2008;14(3):174–82.. 3.. Boersma JG, Van Der Veen MH, Lagerweij MD, Bokhout B, Prahl-Andersen B. Caries prevalence measured with QLF after treatment with fixed orthodontic appliances: Influencing factors. Caries Res. 2005;39(1):41–7.. 4.. Kim S, Katchooi M, Bayiri B, Sarikaya M, Korpak AM, Huang GJ. Predicting improvement of postorthodontic white spot lesions. Am J Orthod Dentofac Orthop [Internet]. 2016;149(5):625–33. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/j.ajodo.2015.10.025. 5.. Richter AE, Arruda AO, Peters MC, Sohn W. Incidence of caries lesions among patients treated with comprehensive orthodontics. Am J Orthod Dentofac Orthop [Internet]. 2011;139(5):657–64. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/j.ajodo.2009.06.037. 6.. Enaia M, Bock N, Ruf S. White-spot lesions during multibracket appliance treatment: A challenge for clinical excellence. Am J Orthod Dentofac Orthop. 2011;140(1):e17–24.. 7.. Rosenbloom R, Tinanoff N. Salivary Streptococcus mutans levels in patients before, during, and after orthodontic treatment. Am J Orthod Demofac Orthop. 1991;100:35–7.. 8.. Ho CSF, Ming Y, Foong KWC, Rosa V, Thuyen T, Seneviratne CJ..

(19) Streptococcus mutans forms xylitol-resistant biofilm on excess adhesive flash in novel ex-vivo orthodontic bracket model. Am J Orthod Dentofac Orthop [Internet]. 2017;151(4):669–77. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/j.ajodo.2016.09.017 9.. Mandall NA, Millett DT, Mattick CR, Hickman J, Worthington H V., Macfarlane T V. Orthodontic adhesives: A systematic review. J Orthod. 2002;29(3):205–10.. 10.. Mei L, Busscher HJ, Van Der Mei HC, Ren Y. Influence of surface roughness on streptococcal adhesion forces to composite resins. Dent Mater [Internet]. 2011;27(8):770–8. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/j.dental.2011.03.017. 11.. Millett DT, McCluskey LA, McAuley F, Creanor SL, Newell J, Love J. A Comparative Clinical Trial of a Compomer and a Resin Adhesive for Orthodontic Bonding. Angle Orthod. 2000;70(3):233–40.. 12.. Carvalho C, Castellucci M, Lorenzetti M, Frederico R. Evaluation of antimicrobial activity of orthodontic adhesive associated with chlorhexidinethymol varnish in bracket bonding. Dent Press J Orthod. 2010;15(4):62–8.. 13.. Claffey N. Essential oil mouthwashes: A key component in oral health management. J Clin Periodontol. 2003;30(SUPPL. 5):22–4.. 14.. Velasquez C lucia. Boletin epidemiologico tematico. En 2011.. 15.. Davis SM, Plonka AB, Fulks BA, Taylor KL, Bashutski J. Consequences of orthodontic treatment on periodontal health: Clinical and microbial effects. Semin Orthod. 2014;20(3):139–49.. 16.. Gürgan CA, Zaim E, Bakirsoy I, Soykan E. Short-Term Side Effects of 0.2%.

(20) Alcohol-Free Chlorhexidine Mouthrinse Used as an Adjunct to Non-Surgical Periodontal Treatment: A Double-Blind Clinical Study. J Periodontol [Internet]. 2006;77(3):370–84. Disponible en: http://www.joponline.org/doi/10.1902/jop.2006.050141 17.. Yoo H, Jwa S. inhibitory effects of β -caryophyllene on Streptococcus mutans biofilm. Arch Oral Biol. 2018;88(September 2017):42–6.. 18.. De Oliveira JR, Belato KK, De Oliveira FE, Jorge AOC, Camargo SEA, De Oliveira LD. Mouthwashes: An in vitro study of their action on microbial biofilms and cytotoxicity to gingival fibroblasts. Gen Dent. 2018;66(2):28–34.. 19.. Chen Y, Wong RWK, Seneviratne CJ, Hägg U, McGrath C, Samaranayake LP, et al. The antimicrobial efficacy of Fructus mume extract on orthodontic bracket: A monospecies-biofilm model study in vitro. Arch Oral Biol. 2011;56(1):16–21.. 20.. Chen Y, Wong RWK, Seneviratne CJ, Hägg U, McGrath C, Samaranayake LP. Comparison of the antimicrobial activity of Listerine and Corsodyl on orthodontic brackets in vitro. Am J Orthod Dentofac Orthop. 2011;140(4):537–42.. 21.. Efstratiou E, Hussain AI, Nigam PS, Moore JE, Ayub MA, Rao JR. Antimicrobial activity of Calendula officinalis petal extracts against fungi, as well as Gram-negative and Gram-positive clinical pathogens. Complement Ther Clin Pract [Internet]. 2012;18(3):173–6. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/j.ctcp.2012.02.003. 22.. Baskaran K, Marigold C, Marigold G, English PM, German B. Pharmacological Activities of Calendula Officinalis. Int J Sci Res..

(21) 2017;6(5):43–7. 23.. Bernal R. M, Guzmán M. El Antibiograma de discos. Normalización de la técnica de Kirby-bauer. Biomédica. 1984;4(3–4):112–21.. 24.. Balouiri M, Sadiki M, Ibnsouda SK. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. J Pharm Anal [Internet]. 2016;6(2):71–9. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/j.jpha.2015.11.005. 25.. Brambilla E, Ionescu AC, Cazzaniga G, Ottobelli M, Mazzoni A, Cadenaro M, et al. In vitro Streptococcus mutans biofilm formation on surfaces of chlorhexidine-containing dentin bonding systems. Int J Adhes Adhes. 2017;75(January):23–30.. 26.. Sukontapatipark W, el-Agroudi MA, Selliseth NJ, Thunold K, Selvig KA. Bacterial colonization associated with fixed orthodontic appliances. A scanning electron microscopy study. Eur J Orthod [Internet]. 2001;23(5):475–84. Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11668867. 27.. Soni S, Sidhu MS, Grover S. Comparative evaluation of orthodontic tooth brush and water jet device in the reduction of dental plaque and gingival bleeding in patients with fixed orthodontic appliances. J Pierre Fauchard Acad (India Sect [Internet]. 2012;26(4):147–51. Disponible en: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0970219912640016. 28.. Anderson GB, Bowden J, Morrison EC, Caffesse RG. Clinical effects of chlorhexidine mouthwashes on patients undergoing orthodontic treatment. Am J Orthod Dentofac Orthop [Internet]. 1997;111(6):606–12. Disponible en: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0889540697703123.

(22) 29.. Takenaka S, Ohsumi T, Noiri Y. Evidence-based strategy for dental biofilms: Current evidence of mouthwashes on dental biofilm and gingivitis. Jpn Dent Sci Rev. 2018;1–8.. 30.. Gauniyal P, Teotia US. Antimicrobial Activity of Sixteen Medicinal Plants against Oral Flora and its Efficacy Comparison with 2 % Chlorhexidine. Int J Multidiscip Sci Emerg Res. 2015;4(2):12.. 31.. J JARVP. Eficacia en el control de placa de dos enjuagues bucales de origen natural vs clorhexidina. 2010;. 32.. Shankar SM, Bardvalli SG, Jyotirmayee R, Chethana, Bhushan K, Kumar S. Efficacy of Calendula officinalis extract (marigold flower) as an antimicrobial agent against oral microbes: An invitro study in comparison with chlorhexidine digluconate. J Clin Diagnostic Res. 2017;11(10):ZC05-ZC10.. 33.. Anushree B, Fawaz MA, Narahari R, Shahela T, Syed A. Comparison of antimicrobial efficacy of triclosan-Containing, herbal and homeopathy toothpastes-An invitro study. J Clin Diagnostic Res. 2015;9(10):DC05-DC08..

(23) ANEXOS Figura 1. Curva de crecimiento de S. mutans en presencia de clorhexidina digluconato (CD) y caléndula officinalis (CO). a) Curva respecto al grupo control, b) Detalle de la curva de C.D y C.O.. a). b). Fuente: Autoras.

(24) Figura 2. Zona de Inhibición (IZ) en placas de MH inoculadas con S. mutans. a) clorhexidina b) caléndula officinalis. (1-3) repeticiones, (4) solución salina (control negativo). La zona translúcida corresponde a la zona de inhibición de crecimiento del S. mutans.. Fuente: Autoras.

(25) Figura 3. Comparación de la zona de inhibición para discos de papel y discos de resina impregnados con clorhexidina digluconato (Resina+C.D) y caléndula officinalis. (Resina+C.O). ZONA DE INHIBICIÓN FRENTE A S. MUTANS C.D. 12,47. 16,01. ZONA DE INHIBICIÓN (MM). Resina+C.D. RESINA+C.D. Fuente: Autoras.

(26) Figura 4. Unidades Formadoras de Colonias (UFC/mL) en los discos tratados con clorhexidina digluconato (C.D), caléndula officinalis (C.O) y control (C-).. Fuente: Autoras.

(27) Figura 5. Ensayo MTT de discos tratados con clorhexidina digluconato (C.D), caléndula officinalis (C.O) y control (C-).. Fuente: Autoras.

(28) Figura 6. Imágenes SEM de discos de resina Transbond XT. Discos tratados con clorhexidina digluconato (C.D), discos tratados con caléndula officinalis (C.O) y discos con agua destilada (Control-).. Fuente: Autoras.

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