Evaluación del efecto estacional sobre la morfología ultraestructural de ligulas de cempaxúchil (Tagetes erecta)

CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS

T E S I S

Que para obtener el grado de Maestría en Ciencias en Desarrollo de Productos Bióticos

P R E S E N T A:

IBQ. LUZ BEHANEY CORTES RODRIGUEZ

DIRECTORA: DRA. MARTHA LUCIA ARENAS OCAMPO DIRECTOR: DR. MIGUEL ANGEL SERRATO CRUZ

YAUTEPEC, MORELOS. DICIEMBRE, 2009.

EVALUACION DEL EFECTO ESTACIONAL SOBRE LA MORFOLOGIA ULTRAESTRUCTURAL DE LIGULAS DE

CEMPAXUCHIL (Tagetes erecta)

El presente trabajo de tesis se realizo en el Laboratorio de Proteínas del Departamento de Biotecnología, así como en el Campo Experimental del Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional, bajo la tutoría de la Dra. Martha Lucia Arenas Ocampo. Este trabajo es parte del proyecto SIP20080986, SIP20080336 y CONACYT 61034 “Estudio cinético-fractal del efecto de la luz sobre la expresión de genes carotenogénicos y la acumulación de carotenoides en cempaxúchil (Tagetes erecta L.)”.

El procesamiento, manipulación de muestras, así como los cortes y observación en el Microscopio Electrónico de Transmisión (MET) se realizo en la Central de Instrumentación de Microscopia de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas (ENCB-IPN), bajo la tutoría de la Biol. Esp. En M. E. Ma. Esther Sánchez Espíndola.

D E D I C A T O R I A S

A mis Padres por brindarme su confianza, apoyo y comprensión, pero sobre todo por estar a mi lado en cada etapa de mi vida.

A mis Hermanos por la confianza que me han tenido y por la valiosa amistad.

A mis Sobrinos a todos gracias por estar compartiendo sus buenos momentos y por los días de alegría y felicidad.

A mi Esposo Jesús Antonio por su apoyo incondicional, por los bellos momentos que hemos compartido juntos y por ser además un gran amigo. TE AMO

Principalmente a mi Hija gracia por la alegría que me has dado desde el momento en que venias a mi vida. Te quiero con todo mi Corazón, mi muñequita Vania Lisseth “Mi Regalo de Dios”.

Al comité tutorial y revisor Dra. Martha Lucia Arenas Ocampo, Dr. Miguel Ángel Serrato Cruz, Dra. Gabriela Trejo Tapia, Dr. Carlos López González, Dra. Alma Angélica del Villar Martínez y a la Dra. Perla Osorio por sus buenas aportaciones y comentarios los cuales fueron de gran utilidad para enriquecer este trabajo.

Al Dr. Miguel Ángel Serrato Cruz por su paciencia en la elaboración del escrito pero sobre todo por la comprensión y gran apoyo durante este tiempo que estuvimos trabajando juntos.

A Biól. Esp. En M. E. Ma. Esther Sánchez Espíndola por su asesoría, colaboración y apoyo, pero principalmente por su valiosa amistad y por la confianza que me brindo desde el primer día que la conocí.

A la Dra. Martha Lucia Arenas Ocampo y al Dr. Antonio R. Jiménez Aparicio por su apoyo en la escritura de este trabajo y por las valiosas aportaciones.

A la Dra. Silvia Evangelista Lozano por la proporción del material biológico y por darme las facilidades de mantener los cultivos necesarios en el campo para la realización de este proyecto.

A mi gran amiga Adriana Ma. Hernandez por su apoyo y colaboración al termino del trabajo pero sobre todo pos su ayuda cuando más la necesite.

A Rita, Viridiana y María Luisa por sus buenos consejos, por escucharme y por su amistad.

A mis compañeros de Maestría: Alondra, Vicente, Nayeli, Norma Leticia, Mauricio, Verónica, Elizabeth, Carolina, Rosa Elena y mi Comadre Maribel Ovando Gracias por apoyarme siempre y sobre todo por su valiosa amistad.

GRACIAS A TODOS

Índice

I N D I C E

INDICE i

INDICE DE FIGURAS iv

INDICE DE TABLAS vi

ABREVIATURAS Y SIMBOLOS vii

RESUMEN 1

ABSTRACT 3

1.- INTRODUCCIÓN 5

2.- MARCO TEORICO 8

2.1.- Genero Tagetes 8

2.2.- Cempaxúchil (T. erecta ) 9

2.2.1.- Distribución 9

2.2.2.- Porte de la Planta 9

2.2.3.- Principales usos 11

2.3.-Carotenoides 12

2.4.-Plastidios 14

2.5.-Respuesta de las plantas a las diferentes condiciones ambientales

16

2.5.1.- Efecto de la luz 17

2.5.2.- Efecto de la fecha de trasplante en el desarrollo de T.

erecta

19

2.6.- Estudios recientes realizados en T. erecta 20

4.1.- Objetivo General 24

4.2.- Objetivos Particulares 24

5.- MATERIALES Y MÉTODOS 25

5.1.Diagrama General de trabajo 25

5.2.- Material Vegetal 27

5.3.-Monitoreo de los factores climáticos 27

5.4.- Cultivo de T. erecta 28

5.4.1.- Desinfección y germinación de semillas 28 5.4.2.- Aclimatación de las plántulas 29

5.4.3.-Preparación del sustrato 29

5.4.4.-Colecta del material y realización de cortes 29

5.5.- Métodos 30

5.5.1.-Procemiento de la muestra 30

5.5.2.-Contraste de la muestra 32

5.5.3.-Toma de micrografías y resolución (tamaño de escala) 32 5.5.4.- Procesamiento de las micrografías 33

5.6.-Analisis Morfometrico 33

5.5.-Analisis Estadístico 35

6.- RESULTADOS Y DISCUSION 37

6.1.- Fluctuación de los factores climáticos 37 6.2.- Etapa de floración y crecimiento de las cabezuelas 41

Índice 6.3.- Análisis de la composición celular en los cortes de las lígulas

de T. erecta

44

6.4.- Análisis ultraestructural de plastídios en lígulas de T.

erecta

49

6.5.- Ultraestructura de plastídios en lígulas de T. erecta 43

6.6.- Morfometría de los Plastídios 56

7.- CONCLUSIONES 61

8.-PERSPECTIVAS 64

9.- BIBLIOGRAFIA 65

10.- ANEXOS 73

INDICE DE FIGURAS

Figura Título Pag

. 1 Distribución Geográfica de cultivos de Tagetes erecta en la República

Mexicana 10

2 Plantas de Tagetes erecta de Porte bajo

11 3 Síntesis de carotenoides a partir del Isopentenil pirofosfato (IPP). 13

4 Ciclo de desarrollo de los plastídios. 14

5 Ciclo de desarrollo de los plastídios con respecto al tiempo.

15 6 Micrografías electrónica de transmisión de cromoplastos 16 7 Espectro de ondas electromagnéticas, con escala de longitud de onda. 19 8 Micrografías electrónicas de transmisión de tres variedades de

cempaxúchil 21

9 Esquema General de Trabajo

26 10 Diagrama del procesamiento de las muestras para Microscopia

Electrónica de Transmisión (MET). 31

11 Ilustración descriptiva de las mediciones morfométricas

35 12 Diámetro de las cabezuelas colectadas en marzo, agosto y octubre del

2008. 43

13 Micrografías ópticas representativas de lígulas de T. 45 14 Micrografías panorámicas de las células presentes en los cortes de

lígulas de T. erecta del mes de marzo 46

15 Micrografíaspanorámicas de las células presentes en los cortes de

Indice de figuras 17 Micrografías panorámicas de las células presentes en los cortes de

lígulas de T. erecta del mes de octubre 48

18 Micrografías panorámicas de células presentes en cortes de lígulas

de de T. erecta del mes de octubre 48

19 Micrografías de los plastídios, obtenidos de cortes de lígulas del mes

de marzo. 50

20 Micrografías de los plastídios, completamente desarrollados 53 21 Micrografías de plastídios desarrollados en el mes de agosto. 53

22 Micrografías de cromoplastos maduros 54

23 Micrografías de cromoplastos maduros y con abundantes

plastoglóbulos 55

INDICE DE TABLAS

Tabla Título

Pag.

1 Factores climáticos medidos durante los meses incluidos en los diferentes períodos de desarrollo de las plantas de Tagetes erecta L. 38

2 Fluctuación de los factores climáticos durante el mes de floración y

colecta de las cabezuelas 40

3 Días a la floración y diámetro de las cabezuelas de un genotipo de T.

erecta de porte bajo trasplantado en diferentes fechas 42 4 Relación entre el número de cromoplastos presentes por célula,

plastoglóbulos en los cromoplastos y diámetro de los mismos. 51 5 Descriptores morfométricos adimensionales obtenidos por TDI

56 6 Descriptores morfométricos adimensionales obtenidos por TDI

correspondientes a cromoplastos 58

7 Descriptores morfométricos dimensionales obtenidos por TDI

correspondientes a células 59

8 Descriptores morfométricos dimensionales obtenidos por TDI

correspondientes a cromoplastos 60

Abreviaturas y Simbolos

ABREVIATURAS Y SIMBOLOS

A Área

ADI Análisis Digital de Imágenes

DMAPP Dimetilalil Pirofosfato

Fe Factor Elíptico

GGPP Geranilgeranil Pirofosfato

IPP Isopentenil Difosfato

MET Microscopio Electrónico de Transmisión

NADPH Nicotiamida-Adenina Dinucleótido Fosfato

nm Nanometros

OsO4 Tetraóxido de Osmio

P Perímetro

Pb Plomo

PBS Buffer de Fosfatos

PDS Fitoeno Desaturasa

PSY Fitoeno Sintasa

Rpm Revoluciones Por Minuto

TDI Tratamiento Digital de Imágenes

μm Micras

Ur Uranilo

UV Ultravioleta

h Hora

UV/Vis Ultra Violeta / Visible

% Porcentaje

HR (%) Porcentaje de Humedad Relativa

CaCl2 Cloruro de Calcio

cm Centímetros

EPON 812 Resina de inclusión

Min Minutos

ABA Acido Abscisico

GA Giberelinas

µmol/m²s Micromol/metros cuadrados *segundo

Lb Libras

Resumen R E S U M E N

El Cempaxúchil (Tagetes erecta L.) es una planta originaria de México, cuyas lígulas de las cabezuelas son fuente de carotenoides cuya biosíntesis se localiza en los plastídios.

Se empieza a conocer qué factores físicos como la temperatura, cantidad y calidad de luz o humedad relativa pueden influir la síntesis y acumulación de carotenoides en los cromoplastos, estos factores ambientales, junto con otros como el fotoperiodo y precipitación pluvial, definen condiciones climáticas de un lugar que adquiere especificidad según estaciones del año, a su vez, estas poco se han estudiado en relación con cambios morfológicos, ultraestructurales en cromoplastos de lígulas. En el presente trabajo se propone evaluar el efecto estacional sobre la morfología de células y cromoplastos en lígulas de cabezuelas de plantas de T. erecta cultivadas en Yautepec, Morelos. A partir de plantas en floración en los meses de marzo, agosto y octubre de 2008 correspondientes a fechas de cultivos establecidos en campo (diciembre 2007, mayo y julio respectivamente) se cosecharon cabezuelas con diámetro de 3-4.5 cm después de 8 días de la apertura del botón floral, de las que se obtuvieron lígulas las cuales fueron incluidas en resina para realizar cortes finos y ultrafinos para observación por microscopia óptica y electrónica de transmisión. Los resultados demostraron que las fluctuaciones climatológicas afectan el desarrollo de las cabezuelas en plantas de Tagetes erecta principalmente la humedad relativa y la radiación solar. Esta particularidad fue observada tanto en la composición celular como en la morfología de células (tanto en tamaño como en el numero de cromoplastos) y plastídios, así como en la presencia de plastoglóbulos; siendo evidentes en la abundancia de estos en los plastídios de agosto y octubre. La respuesta de la floración fue de 98 días como máximo obtenida del trasplante en mayo (floración tardía), la plantación de julio fue de 80 días (floración intermedia) y para la plantación de diciembre se obtuvo una floración de 72 días (floración precoz). Los parámetros adimensionales calculado en células y en plastídios determinó que las células del mes de octubre son más esféricas, menos elípticas y rugosas respecto a las de marzo y

de los otros meses. Con este estudio se concluye que como ya se mencionó, la humedad relativa y la radiación solar afectan directamente el desarrollo de la planta de Tagetes, así como el desarrollo de la cabezuela, sin embargo no se sabe cual factor es el que produce los cambios ultraestructural por lo que se sugiere realizar estudio en el que se manipulen las variables mencionadas, así como variar ambas y determinar los cambios a nivel ultraestructural.

Abstract A B S T R A C T

Marigold (Tagetes erecta L.) plant is a native of Mexico, whose ligules of flowers heads are a source of carotenoids, whose biosynthesis is localized in plastids. You start to know which physical factors such as temperature, amount and quality of light or relative humidity may affect the synthesis and accumulation of carotenoids in the chromoplasts, these environmental factors along with others such as photoperiod and rainfall, define the climatic conditions of a place that takes specificity as the seasons turn, these have been studied little in relation to the morphological and ultrastructural changes in the chromoplasts of the ligules. In the present study aims to evaluate the seasonal effect on the morphology of cells and chromoplasts in ligules of flowers heads of plants of T. erecta that are grown in Yautepec, Morelos. From flowering plants in the months of March, August and October 2008 for dates established in field crops (in December 2007, May and July respectively), were harvested flower heads with a diameter of 3-4.5 cm after 8 days flower bud opening, the ligules were obtained which were included in resin for thin and ultrathin sections for observation by optical microscopy and electron microscopy. The results showed that climate fluctuations affect the development of the flowers heads of Tagetes erecta plants, mainly the relative humidity and solar radiation. This feature was observed both in cell composition and the morphology of cells (both in size and the number of chromoplasts) and plastids, and in the presence of plastoglobuli; still evident in the abundance of these in the plastids in August and October. The response of flowering was 98 days maximum from the transplant in May (late flowering), July plantingwas 80 days (mid flowering) and for the December planting was obtained 72 days flowering (early flowering). The dimensionless parameters measured in cells and plastids determined that cells of October are more spherical, less elliptical and rough compared to the March and August, however these were not larger. While generally chromoplasts was observed that collected in August had a lower roughness were the roundest and collected in March were the most elliptical regarding the collection of the other months. This study concludes that as already mentioned, the relative

aforementioned variables and vary both and determine changes at the ultrastructural level.

Introducción 1.-I N T R O D U C C I Ó N

El cempaxúchil (Tagetes erecta L.) es una planta herbácea que alcanza una altura de entre 50 y 100 cm, es originaria de México y actualmente se distribuye de forma silvestre desde México hasta Centroamérica. Esta planta anual, completa su ciclo de vida en un año, a lo largo del cual crece (a partir de semillas), se desarrolla, florece (desde finales de primavera hasta otoño) y, finalmente, muere. En la naturaleza el ciclo, de vida de las plantas está sincronizado con los cambios estacionales, los cuales afectan su desarrollo y la floración, entre otros aspectos.

Por el tipo de flores que presenta, esta planta se clasifica en la familia botánica Asteraceae (antes Compositae), generalmente, la flor compuesta en forma de pompón- llega a medir hasta 7 cm de diámetro y sus inflorescencia, presenta cabezuelas solitaria, en una gama de tonalidades que van desde el anaranjado hasta amarillo. Sus colores se deben a la presencia de un grupo de pigmentos conocidos como carotenoides, de los cuales el principal es la luteína (Soule, 1993; Bartley and Scolnick.

1995; Delgado-Vargas and Paredes-López, 2003; Martínez-Peña et al., 2004;

Navarrete-Bolaños et al., 2005). En plantas de T. erecta los carotenos se acumulan en las lígulas y se sintetizan en los plastídios celulares, los cuales exhiben una variedad de funciones dentro de la célula, como es el caso de los cromoplastos y los cloroplastos, estos últimos responsables de la fotosíntesis.

Los cambios en ultraestructura y la función de los plastídios durante el desarrollo, se ha estudiado en una variedad de órganos y plantas. Estos cambios siguen típicamente varios caminos, que pueden llevar a la formación de amiloplastos (Bechtel and Wilson, 2003), o de cromoplastos y cuando se trata del desarrollo de pétalos y frutas (Pyke and Howells, 2002, Pyke, 1999; Weston and Pyke, 1999, Pyke and Page, 1998, Camara et al., 1995).

En T. erecta se ha encontrado que los cambios en la morfología y desarrollo de los

botón inmaduro tiene lígulas con menor contenido de carotenoides y presencia de cloroplastos, mientras que las cabezuelas abiertas con las lígulas expuestas tienen células con mayor contenido de cromoplastos y carotenoides (Del Villar-Martínez et al., 2005).

Así mismo, la coloración de las lígulas se ha encontrado que está asociada con el contenido de carotenoides y la morfología de los cromoplastos (Del Villar-Martínez et al., 2005). En este sentido se ha reportado la presencia de vesículas lipidicas donde se concentran los carotenoides (Pérez-Escalante 2008, Del Villar-Martínez et al., 2005), pero no se ha precisado una asociación entre la concentración de carotenoides y el numero de “vesículas lípidicas”.

Con respecto a la referida a longitudes de onda especificas,se ha encontrado que éstas influyen en la concentración de carotenoides y la morfología de los plastídios en T. erecta (Pérez-Escalante 2008, Ubaldo-Suarez 2007). Sin embargo es muy escasa la información existente con relación al efecto de los factores ambientales, de manera individual o en conjunto, tanto sobre la dinámica de producción de carotenoides, como en cambios sub-celulares relacionados con las estructuras que los contienen.

Sánchez-Ocampo (2008) estudió el efecto de algunos factores ambientales como la temperatura, la luz y el fotoperíodo, los cuales se modifican con las estaciones climáticas a lo largo del año, sobre la altura de las plantas, el número de primordios florales, el diámetro, el peso fresco y seco, el índice de color y la acumulación de carotenoides en las inflorescencias, destacando que el fotoperiodo y la intensidad de la radiación solar afectan la acumulación de xantofilas en las inflorescencias así como el color de las mismas, mientras la humedad relativa influyó particularmente sobre los parámetros de crecimiento (Zimmer, 1989).

Introducción relación con el trabajo realizado por Sánchez-Ocampo (2008), se abordó el estudio de algunos cambios en el desarrollo de los órganos florales y la morfología de las estructuras acumuladoras de carotenoides en las inflorescencias de plantas de T. erecta cultivadas bajo las condiciones ambientales imperantes relativas a las estaciones del año, en el campo experimental Emiliano Zapata del CEPROBI ubicado en el municipio de Yautepec, Morelos, haciendo uso de la Microscopía Electrónica de Transmisión y el Análisis Digital de Imágenes para realizar el estudio ultraestructural de las lígulas-

2.-M A R C O T E Ó R I C O 2.1.- Género Tagetes

Las plantas pertenecientes al género Tagetes, se caracterizan por ser hierbas anuales o perennes, o bien, subarbustos con tallos ramificados y aromáticos al estrujarse. Las hojas son opuestas en la sección inferior de la planta, volviéndose alternas en la superior, simples o pinnatisectas, sus lóbulos son dentados o partidos y las glándulas oleíferas abundantes.

Las cabezuelas se presentan solitarias o agrupadas en cimas y los pedúnculos ligeramente ensanchados hacia el ápice; el calículo ausente; los involucros cilíndricos, turbinados o campanulados, las brácteas dispuestas en una sola hilera, connadas parcial o casi totalmente, las glándulas en dos o más hileras, el receptáculo convexo a cónico, desnudo.

Las flores son liguladas, pistiladas y fértiles, de limbos cortos o bien desarrollados, de color amarillo, anaranjado, blanco o rojizo, variables en número y infundibuliformes; el estilo con ramas truncadas. Aquenios lineares a oblanceolados, ligeramente comprimidos y negros; vilano de escamas y/o de aristas, rara vez ausente (Turner, 1996).

Este género (Tageteae; Asteraceae) se compone de alrededor de 55 especies distribuidas principalmente en el continente americano, la mayoría de las cuales se localizan en México (Turner and Nesom, 1993). En la actualidad, algunas especies de Tagetes, como el cempaxúchil, son un importante recurso genético con un gran potencial de uso en la agroindustria, horticultura ornamental y medicina en México (Serrato y Quijano, 1994).

Marco Teórico 2.2.- Cempaxúchil (T. erecta)

Cempaxúchil es un vocablo de origen náhuatl que se usó en la época prehispánica para referirse de forma genérica a un grupo de plantas con características comunes: flores vistosas por su forma y tamaño, con diversidad aromática y de colores llamativos como amarillo, anaranjado y rojo; tales peculiaridades le facilitaron al hombre prehispánico la identificación y clasificación en variedades: cempoalxóchitl, macuilxóchitl, tepecempoalxóchitl, oquichtli, tlapalcozatli, zacaxochitlcoztic y tlapaltecacayactli (Hernández, 1959).

2.2.1.- Distribución

El cempaxúchil o flor de muerto (T. erecta) es una planta originaria de México (Tosco, 1970) que está presente casi en toda la República Mexicana (Figura 1), en estados como : Aguascalientes, Campeche, Chiapas, Coahuila, Colima, Distrito Federal, Durango, Guerrero, Hidalgo, Jalisco, Estado de México, Michoacán, Morelos, Nayarit, Oaxaca, Puebla, Querétaro, Quintana Roo, San Luis Potosí, Sinaloa, Sonora, Tabasco, Tamaulipas, Tlaxcala, Veracruz, Yucatán y Zacatecas (Villaseñor y Espinosa, 1998). Sin embrago, la mayor producción a nivel mundial se localiza en China, India y Perú (Serrato-Cruz et al., 2008).

2.2.2.- Porte de la Planta

En general, el germoplasma mexicano de T. erecta tiene porte alto (1 a 1.5 m o más) y mediano (60-90 cm) (Gómez, 1981), lo que representa algunos inconvenientes para su manejo en maceta o jardín, los cuales no favorecen su aspecto ornamental; sin embargo esta última es una característica apropiada para armar “racimos”, que es la forma como actualmente se usan para la festividad de Días de Muertos y Todos los Santos.

Figura 1: Distribución Geográfica de cultivos de Tagetes erecta en la República Mexicana (Villaseñor y Espinosa, 1998).

Por lo tanto, las variedades comerciales para ornamentales deben presentar portes enanos (25-38 cm), con diámetro de inflorescencia (8-10 cm) y no poseer una ramificación abundante, lo que las hace idóneas para maceta o jardín (Serrato et al., 2003). Existen genotipos experimentales de 40 cm, obtenidos a partir de germoplasma mexicano (Serrato-Cruz, 2003) y particularmente un germoplasma nativo de la Sierra Madre Oriental con porte de 40 a 60 cm (Serrato-Cruz, 2003), con lo cual se pudiera emprender la selección de portes bajos (Figura 2).

Marco Teórico

Figura 2: Plantas de Tagetes erecta de Porte bajo

2.2.3.- Principales usos

Se le ha dado un uso ritual en la ceremonia de Día de Muertos, pero también se cultiva ampliamente para fines ornamentales (especialmente en ceremonias religiosas), como planta medicinal y complemento en alimentos alimento para aves de corral o como tintórea (Rzedowski and Rzedowski, 2001).

Como planta de ornato, la venta de cempaxúchil se realiza en macetas, pero también es cada vez frecuente la venta de semilla en los mercados y centros comerciales, tanto de T. erecta como T. patula de porte bajo para jardín, lo cual es un excelente indicador del uso potencial que se puede dar a este recurso genético, aún fuera de la temporada tradicional de Días de Muertos (Serrato-Cruz, 2004).

Por otra parte, la diversidad biológica de estas especies es conveniente para su aprovechamiento ornamental; hoy en día se puede tener plantas cuyo tamaño va de 40 hasta 180 cm, con formas de crecimiento globular o ramificada, con distintos periodos de floración (precoz, intermedia o tardía), número de inflorescencias por planta que puede ir de 20 a 120, tamaño de inflorescencia de 4 a 16 cm; y coloraciones de las inflorescencias variadas (Serrato-Cruz, 2004).

Así mismo se ha desarrollado un mercado internacional de pigmentos (carotenoides) de T. erecta, los cuales son extraídos a partir del conjunto de lígulas de la cabezuela y utilizados en la elaboración de productos antioxidantes y anticancerigenos (Slattery et al., 2000; Young and Lowe, 2001).

Para el aprovechamiento agroindustrial de los pigmentos florales se usan principalmente las cabezuelas de tipo doble, las cuales presentan colores que varían desde el amarillo débil al anaranjado intenso, esta gama de colores se debe principalmente a la presencia de diversos carotenoides, en donde el compuesto principal es la luteína (Soule, 1993; Bartley and Scolnick. 1995; Delgado-Vargas and Paredes-López, 2003; Martínez-Peña et al., 2004; Navarrete-Bolaños et al., 2005)

2.3.- Carotenoides

Los carotenoides son compuestos isoprenoides distribuidos en la naturaleza como parte de diversos sistemas, de bacterias y plantas. Estructuralmente estas moléculas presentan 40 átomos de carbono con anillos de seis miembros en los extremos y un esqueleto central con dobles enlaces conjugados, siendo esta característica un componente importante para determinar sus propiedades químicas y funcionales. Esta moléculas además de formar parte de los pigmentos accesorios (antena) del sistema fotosintético, también tienen otras funciones en las fisiología de las plantas porque participan en la captura de radicales libres y disipan el exceso de energía luminosa (Hirschberg, 2001)

En las plantas, los carotenoides son sintetizados dentro de los plastídios a partir del isopentenil pirofosfato (IPP), Los compuestos isoprenoides son producidos a partir de unidades isoprenoides C5 y la clasificación de las diferentes familias de isoprenoides está basada en el número de unidades de isoprenoides C5 presentes en el

Marco Teórico

Los terpenoides tienen distintas funciones en las plantas como hormonas (giberelinas, ácido absícico), pigmentos fotosintéticos (fitol, carotenoides) (Gershenzon and Croteau, 1993).

Figura 3: Síntesis de carotenoides a partir del Isopentenil pirofosfato (IPP).

2.4.- Plastidios

Muchos metabolitos de las plantas, entre los que se encuentran los carotenoides, son sintetizados en los plastídios, que son orgánulos limitados por una doble membrana, que contienen parte del genoma necesario para codificar algunas de sus proteínas.

En las plantas estos experimentan cambios morfológicos dependiendo del tipo de plastídios (Camara et al., 1995) y pueden seguir diferentes rutas de diferenciación como se presenta en la Figura 4. En ésta se observan los proplastidios que son relativamente indiferenciados, se encuentran en tejidos meristematicos y en plantas etioladas; miden aproximadamente 0.2-1.0 µm, por lo general son de forma esférica u ovoides. (Hoober, 1984; Buchanan et al., 2000).

4. Ciclo de desarrollo de los plastídios. . ( → ) representa los pasos normales del desarrollo del cloroplasto. ( - -› ) muestra la transformación plastídica que ocurre bajo

Marco Teórico

Los amiloplastos son otros plastidios que se caracterizan por no presentar color y almacenar almidón. Estos carecen de membranas internas análogas a las membranas fotosintéticas (tilacoides) de los cloroplastos (Lehninger et al, 2005). De igual manera, cuando son expuestos a la luz pueden rediferenciarse para transformarse en cloroplastos (Hoober, 1984; Rey et al., 2000). Tanto los amiloplastos como los proplastidios pueden transformarse en cloroplastos (Lehninger et al, 2005) y estos a su vez pueden convertirse en proplastídios con la pérdida de sus membranas internas

Finalmente, los cromoplastos que son los plastídios que acumulan altos niveles de los pigmentos carotenoides, forman diversas estructuras descritas como:

cristaloides (frutas del tomate), fibrillas (frutas de la pimienta) o membranosas (pétalos del narciso) (Camara et al., 1995).

Las proporciones relativas de los tipos de plastídios dependen del tipo de tejido vegetal y de la intensidad de la iluminación (Figura 5)(Lehninger et al, 2005).

Figura 5: Ciclo de desarrollo de los plastidios con respecto al tiempo. Las líneas simbolizan el proceso de desarrollo del cloroplasto, el cual puede estar influenciado por ciertas condiciones ambientales (citado por Ubaldo-Suarez, 2007 y adaptado de

Vásquez-Caicedo et al., (2006) realizaron un estudio con respecto a la morfología de los cromoplastos en mango y zanahoria y observaron diferencias ultraestructurales en los plastídios, demostrando que los plastoglóbulos presentes en el cromoplasto de mango son de diversos tamaños, además de tener una estructura tubular, mientras que la estructura del cromoplasto presente en zanahoria fue del tipo cristalino (Figura 6). Esta peculiaridad en los cromoplastos está relacionado con la clase de carotenos presentes en ambas frutas, ya que en mango se identificaron - carotenos en forma cis y en zanahoria predominó la forma trans.

Figura 6: Micrografía de cromoplastos obtenida por Microscopia Electrónica de Transmisión. a) cromoplasto tubular de mango y b) cromoplasto cristalino de zanahoria. (*) Cristales, (pg) plastoglóbulos, (m) mitocondria, (l) cuerpos lipidicos, (w) pared celular, (v) vacuola, (t) membrana tubular con contenido electrodenso, (f) cristales de fitoferritina y (flechas) membranas tubular solas.

2.5.- Respuesta de las plantas a las diferentes condiciones ambientales

Cualquier organismo puede compararse de forma secuencial con una serie de programas de desarrollo: embriogénesis, estado juvenil, fase reproductora, senescencia y muerte. Aunque las plantas también cumplen esta secuencia de eventos, sus programas muestran una gran plasticidad, lo que se traduce en una amplia

a b

Marco Teórico

especies distintas como individuos de la misma especie o clones mantenidos en condiciones ambientales diferentes (Segura, 2008)

Hay muchos factores que afectan el crecimiento y desarrollo de las plantas en un ambiente. Las condiciones ambientales durante el establecimiento de las plantas determinan su crecimiento y desarrollo, debido a los efectos sobre la estructura y composición de la planta (Putman et al., 1993).

Los estímulos ambientales incluyen a parámetros físicos como la luz, temperatura y la gravedad, los cuales ejercen el mayor impacto en las plantas. Así mismo como el campo magnético, el sonido y el viento (el cual es un estímulo físico) pueden tener efectos más sutiles, aunque éstos pueden ser más difíciles de establecer experimentalmente. Otros factores ambientales como la humedad del suelo, la humedad relativa y la nutrición pueden también influenciar el desarrollo de las plantas en algunos casos. El ambiente es demasiado complejo para describirlo, pero si nos limitamos a factores que son parte del ambiente operacional de la plantas, la tarea puede ser menos compleja (Hopkins, 1999).

2.5.1.-Efecto de la luz

La luz puede afectar el crecimiento y desarrollo de las plantas como fuente de energía mediante la fotosíntesis, como fuente de calor y como fuente de información. La cantidad de luz (fotones) que incide sobre las plantas por unidad de tiempo y de superficie (irradiancia), su composición espectral, la dirección en que incide y su duración diaria (fotoperiodo) son aspectos del ambiente luminoso que cambian en condiciones naturales y proporcionan información sobre una serie de condiciones (época del año, presencia de plantas vecinas, etc.). Las plantas poseen fotoreceptores que les permiten utilizar dicha información; Estas moléculas cambian su estado en función del ambiente luminoso y, como consecuencia de ello, modulan distintos

La fotomorfogénesis se define como el efecto de los cambios en la cantidad o composición espectral de la luz (Casal, 2008) sobre las plantas.

Las respuestas de crecimiento denominadas tropismos se refieren a la dirección del crecimiento que responde a estímulos externos. El fototropismo es el crecimiento en el sentido de la luz o en sentido contrario a ella (Nabors, 2006).

Con respecto a esto, existen varios receptores ligados a la respuesta fototrópica, que proporcionan información que incide sobre aspectos del desarrollo los cuales van desde la floración hasta el crecimiento del tallo por la exposición a determinadas longitudes de onda, las cuales son componentes de la luz solar (Nabors, 2006).

La luz azul regula un número de fenómenos de desarrollo en los vegetales, incluidos la apertura de los estomas, la inhibición de la elongación del hipocotilo y el fototropismo, mientras que la verde impide la apertura de los estomas. En el caso de la absorción de luz roja y luz roja lejana indican cuando tendrá lugar la germinación de las semillas, el crecimiento del tallo y raíz y la floración (Figura 7) (Nabors, 2006).

Marco Teórico

Figura 7: Espectro de ondas electromagnéticas, con escala de longitud de onda. La radiación luminosa ocupa una pequeña franja del espectro, que va desde los 400 nm a los 700 nm, y se sitúa entre las radiaciones ultravioleta (UV) e infrarroja (IR).

(Tomada de: http://ar.geocities.com/weblaelectrica/images/espectro.jpg).

2.5.5.-Efecto de la fecha de trasplante en el desarrollo de T. erecta

La fecha de plantación es una práctica agrícola que también afecta el crecimiento y desarrollo de T. erecta. La mejor época para la expresión de variables biológicas de ciertos genotipos, puede no ser la mejor para otros (Chanda and Roychoudhury, 1991; Mohanty et al., 1993); el crecimiento también puede verse afectado por el trasplante en una época especifica de acuerdo con la ubicación geográfica del lugar de evaluación (Armitage, 1983; Male and Ivan, 1984; Jeong and Hong, 1987; Yadar and Bose, 1988; Kobza, 1993; Mohanty et al., 1997). De igual manera el transplante en diferentes épocas del año, en la misma localidad, tiene diferente efecto sobre los periodos de crecimiento vegetativo y reproductivo

Serrato-Cruz y Rivera-Méndez (2002) reportaron el efecto de la densidad y fecha de transplante en T. erecta L de porte bajo en Chapingo, México (Valles Altos), observando cambios en el periodo a floración, el cual se acortó hasta 55 días con fechas de plantación tardías (julio) respecto a plantaciones tempranas (marzo).

2.6.- Estudios recientes en T. erecta

Considerando la importancia actual del aprovechamiento de las flores de T.

erecta para extracción de pigmentos, en el ceprobi se ha procurado avanzar en el entendimiento de los procesos involucrados en la producción de estos.

Ya que se considera como buena fuente de carotenoides, así mismo se puede utilizar como modelo de estudio en la pigmentación la cual es causada por la luteína y para ultraestructura durante el desarrollo de la cabezuela.

Del Villar-Martínez et al., (2005) consignan cambios ultraestructurales de T.

erecta durante la diferenciación del plastídio y acumulación del pigmento en lígulas de algunas variedades. Al comparar la ultraestructura del plastidio entre las flores completamente abiertas de tres variedades en diferente color (amarillo, anaranjado y blanco). Encuentran que el número y la distribución de vesículas lipidicas es la diferencia principal entre variedades. En Crackerjack (anaranjada), se obtuvo una mayor producción de luteína, y se encontró la presencia más abundante de vesículas.

Mientras que para Snowdrift (blanca) la producción de luteína fue baja y el color de las lígulas era ausente, las vesículas eran escasas y más pequeño de tamaño con respecto a Alcosa y de Crackerjack. Los cromoplastos fueron drásticamente diferente según la variedad: en Alcosa (amarilla), los cromoplastos eran de forma rectangular a esférico; mientras que en Crackerjack (anaranjada), demostraron una forma irregular.

Marco Teórico

Figura 8: Micrografías electrónicas de transmisión de tres variedades de cempaxúchil a) Alcosa, b) Crackerjack y c) Snowdrift. (chr) cromoplasto, (cw) pared celular, (li) vesículas lipidicas y (cy) citoplasma (Del Villar-Martínez et al.,2005).

Ubaldo-Suárez (2007) efectúa un estudio de extracción y cuantificación de carotenoides (xantofilas) así como análisis ultraestructural de plastídios crecidas en diferentes condiciones ambiéntales, en el cual se cultivó T. erecta y se evaluaron dos ambientes de Radiación Fotosintéticamente Activa (RFA); para esto algunas plantas se expusieron directamente a la luz natural y otras recibieron la luz a través de una malla de media sombra. Observaron que el cultivo que estuvo sin malla recibió mayor RFA, radiación UV y presentó una disminución en el contenido de carotenoides (luteína y zeaxantina) en las cabezuelas, debido fundamentalmente a que son moléculas que están sujetas a transformaciones fotoquímicas. Los resultados reportados son 4.393±0.138g/kg de harina de xantofilas totales a un irradiación de 220.30 mol/día (con malla) y cromoplastos los cuales contenían en su estructura membranas de tilacoides apiladas así como la presencia de almidón, sin embargo a una intensidad mayor (628.79mol/día) estos disminuyen (3.013±0.020g/Kg de harina) y los cromoplastos presentaron una mayor acumulación de almidón, así como la presencia de membrana de tilacoides pero en algunos casos estas eran desordenados y poco apilados. En general, el análisis ultraestructural de los plastídios de lígulas de T. erecta bajo los dos ambientes de RFA mostró diferencia en cuanto a la disposición del sistema membranoso de los tilacoides y una mayor apilación de grana en los plastídios,

a b c

En ambos ambientes se observó la presencia de gránulos de almidón siendo más abundantes en las lígulas sin malla.

Pérez-Escalante (2008) realiza un estudio con plantas de T. erecta donde se evaluó el efecto de diferentes longitudes de onda en el desarrollo de plantas, estas fueron crecidas en invernadero y expuestas a luz blanca, roja, azul y luz natural como control. Los resultados indican que el tratamiento con luz azul disminuye la inducción de botones y la producción de inflorescencias, en general para los tratamientos aplicados se observaron cambios ultraestructural en las etapas de desarrollo evaluados (desde botón cerrado hasta flor completamente abierta). Así mismo se muestra que los plastídios desarrollados bajo el tratamiento de luz roja tienen una forma elíptica e irregular y un borde sinuoso respecto al desarrolla bajo luz blanca.

Otra característica primordial de los plastídios desarrollados con luz blanca fue más grande e irregular que el control, mientras que los desarrollados en luz azul fueron más pequeños. Así mismo se demostró que las diferentes longitudes de onda afectan el proceso de desarrollo de las plantas así como el desarrollo de los plastídios.

Sánchez-Ocampo (2008) en un acercamiento sobre la acumulación de luteína en flores de cempaxúchil en diferentes épocas del año en condiciones ambientales de Morelos (Yautepec) encuentra además de diferencias en altura, número de primordios florales, diámetro pesos fresco y seco de las cabezuelas según época de trasplante, existe mayor acumulación de xantófilas totales de 13.6 y 8.2 g/kg en noviembre y diciembre (respectivamente), característica que se asocia con una menor radiación solar, temperatura, humedad relativa baja y un fotoperiodo corto; las flores de noviembre y diciembre mostraron índice de color amarillo intenso y amarillo pálido a anaranjado intenso respectivamente. Que en el mes de julio se presenta mayor altura, diámetro de cabezuela, peso fresco y seco, respecto a los meses de trasplante en julio y septiembre se obtuvo mayor diámetro de las cabezuelas, mientras que las de menos

Justificación 3. J U S T I F I C A C I Ó N

En la actualidad se cuenta con diversa información sobre la síntesis y acumulación de carotenoides, así como sobre las plantas productoras de estos; una de ellas es T. erecta que se aprovecha por la industria alimentaria en gran escala.

Existe referencia de que la concentración de carotenoides en T. erecta está influenciado por el periodo estacional en el cual es cultivada y cosechada; por tal motivo, en el Centro de Desarrollo de Productos Bióticos (CeProBi), se está buscando alternativas para su estudio, estableciendo esta especie en el Campo Experimental Emiliano Zapata del CeProBi (Yautepec, Morelos) en diferentes periodos del año, donde eventos climatológicos como la intensidad luminosa, Temperatura y Humedad Relativa, entre otros.

Si bien poco a poco se va conociendo la influencia que ejercen factores físicos climatológicos sobre la biosíntesis de carotenoides en lígulas de T. erecta no se cuenta con estudios que demuestren que las condiciones estacionales promuevan cambios en los organelos acumuladores de pigmentos en lígulas de cabezuelas de plantas de T.

erecta establecidas en intemperie, condición en la que actualmente se pudiere estar esta especie.

4. O B J E T I V O S

4.1.-Objetivo General

Evaluar posibles cambios en el desarrollo de órganos florales y la morfología de estructuras acumuladoras de carotenoides en lígulas de plantas de T. erecta crecidas condiciones estacionales diferentes en Yautepec, Morelos.

4.2.-Objetivos Específicos

 Evaluar el periodo a floración y tamaño de las cabezuelas relacionadas con condiciones estacionales diferentes.

 Describir la morfología celular y ultraestructura de cromoplastos de lígulas de plantas de T. erecta crecidas en tres condiciones estacionales diferentes.

 Describir la morfometría de células y cromoplastos de lígulas de plantas de T.

erecta crecidas en tres condiciones estacionales diferentes.

.

Materiales y métodos

5.-M A T E R I A L E S Y M É T O D O S 5.1.- Diagrama General de Trabajo

En la Figura 9 se representa el diagrama general de trabajo. Las plantas de T.

erecta se desarrollaron en el Campo Experimental del CeProBi bajo las diferentes condiciones ambientales correspondientes a cada estación del año. Durante el crecimiento de las plantas se contabilizaron los días a floración para cada época.

El material biológico se colecto a los ocho días de haberse iniciado la floración, en donde se analizó la composición celular a través de microscopia óptica y la estructura de las células y los plastídios por microscopia electrónica de transmisión (MET), a las micrografías obtenidas por MET se les realizó el análisis morfometrico obteniendo área, perímetro, factor forma (Ff), factor de compactación (Fc) y factor elíptico (Fe) a través del programa Sigma Scan Pro. También se realizo la contabilización de número de cromoplastos por células y de plastoglóbulos por cromoplastos a los cuales se les determino el diámetro.

Materiales y métodos 5.2.-Material Vegetal

Para el presente trabajo se utilizaron plantas de Tagetes erecta L. de porte bajo cultivadas en campo, a partir de una selección previa de semillas que se germinaron bajo condiciones controladas. Estas provienen de dos retrocruzamientos (cruce de un descendiente hibrido de primera generación con padres o genotipo idéntico al paterno) proporcionadas por el Dr. Miguel Ángel Serrato Cruz Profesor Investigador de la Universidad de Chapingo.

El experimento se realizó en el campo experimental Emiliano Zapata del Centro de Desarrollo de Productos Bióticos (Ceprobi-IPN) ubicado en la población de San Isidro, municipio de Yautepec, Morelos. El municipio se localiza en la parte norte del estado, colinda con los municipios de Cuautla y Atlatlahucan al este, al sur con los municipios de Ayala, Tlaltizapán y Emiliano Zapata; al oeste colinda con los municipios de Jiutepec y Tepoztlán y finalmente al norte colinda con el municipio de Tlayacapan. Su localización geográfica es 18° 53´ de latitud norte y 99° 04´ de longitud este con una altura a nivel del mar de 1,210 metros, donde la temperatura media anual es de 22.7 °C y el tipo de clima es cálido sub-húmedo con lluvias en verano; la precipitación pluvial es de 945.7 milímetros anuales (INEGI, 2007).

5.3.-Monitoreo de los factores climáticos

Se registraron los factores climáticos de temperatura, humedad relativa y radiación solar en los cuales se desarrollaron las plantas de T. erecta desde el traspaso de las plántulas al campo de CeProBi hasta la colecta de las cabezuelas.

La Radiación solar (RadS µmol/mes m²) se midió con un cuantómetro (Apogee Instruments Inc. Modelo QMSW-55), la humedad relativa (%HR) así como las temperaturas máxima y mínima (°C) con un higrotermómetro ( Taylor modelo 06A00),

condiciones se registraron diariamente durante todo el ciclo de los cultivos. El procesamiento de las muestras se realizó en el laboratorio de Proteínas del departamento de Biotecnología, perteneciente al Centro de Desarrollo de Productos Bióticos (CeProBi), mientras que el análisis de la ultraestructura de los plastidios se llevo a cabo en el Laboratorio Central de Instrumentación de Microscopia de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas-IPN.

El estudio realizado comprende el análisis de plantas cultivadas en el periodo de diciembre del 2007 a octubre del 2008. ya que de acuerdo con lo reportado por Sanchez-Ocampo, 2008 las flores sembradas en diciembre se obtuvo. Mayor concentración de xantofilas y luteína.

Las etapas de siembra y colecta fueron diciembre del 2007 a marzo 2008, mayo a agosto y julio a octubre.

5.4.- Cultivo de las plantas de T. erecta

5.4.1.-Desinfestacion y germinación de las semillas

La germinación de las semillas se llevó a cabo por el método descrito por Ubaldo- Suarez (2007). Se seleccionaron semillas de tamaño uniforme, estructura rígida, con buen espesor y de color blanco y se desinfectaron de la siguiente manera:

 Se sumergieron en etanol al 100 y 75 % durante 1 y 5 min respectivamente con agitación constante y se realizaron lavados de 1 min con agua desionizada estéril entre cada etapa.

 Posteriormente fueron sumergidas en hipoclorito de sodio al 2 y 1 % durante 15 min con agitación constante. Los lavados se realizaron de la misma manera

Materiales y métodos

Así mismo se desinfectaron charolas utilizando hipoclorito de sodio al 10 % y se dejaron secar; el área de trabajo también se limpió con hipoclorito de sodio al 2 %.

Para la obtención de plántulas se colocaron 100 semillas en cámaras húmedas, manteniéndose en el cuarto de cultivo con una de Humedad Relativa de 80+10 % y Temperatura 25+4 °C (Ubaldo-Suarez, 2007).

5.4.2.-Aclimatación de las plántulas

La aclimatación se realizo en un invernadero de vidrio y para el trasplante a maceta se utilizo una mezcla de turba, la cual favorece el desarrollo de las plántulas (Serrato-Cruz, 2005).

5.4.3.-Preparación del sustrato

El sustrato se preparó con una mezcla de turba, vermiculita y Agrolita en una relación 3:1:1; Esta mezcla se ajustó a pH 5.8 y posteriormente se esterilizó en el autoclave a 15 lb de presión durante 20 minutos.

Las plantas se pasaron a las macetas con el sustrato 10 días después de la germinación y en el invernadero permanecieron durante 30 días, antes de realizar el trasplante a campo.

5.4.4.-Colecta del material y realización de cortes

La colecta de las flores de T. erecta se realizó en las horas de la mañana, entre 9:00 y 11:00. Por cada cabezuela colectada se tomaron 4 lígulas, 8 días después del inicio de la floración, tomado este como el comienzo de la apertura de los botones florales. Las lígulas se cortaron en fracciones de 500 nm y 70 nm utilizando un ultramicrotomo; los cortes de 500 nm se utilizaron para obtener las micrografías con

de las células, así como un aproximado de la densidad de los carotenoides contenidos en ellas. Los cortes de 70 nm se observaron a través de un microscopio microscopio electrónico de transmisión (MET) (JEOL-Japón), con un voltaje de aceleración de 60 kV para determinar la morfología de los organelos acumuladores de carotenoides.

Finalmente se buscó una asociación entre los cambios presentados en los organelos acumuladores de carotenoides, así como en el tamaño de las células con respecto a las condiciones ambientales en los cuales se desarrolló la flor.

5.5.-M E T O D O S

5.5.1.-Procesamiento de las muestras

En la figura 10 se muestra el proceso seguido para el tratamiento de las muestras analizadas por microscopía. En primera instancia, se fijaron los tejidos de acuerdo a la metodología descrita por Bozzola and Russell (1999). Para esto, las lígulas fueron cortadas en tamaños de 0.5 cm x 1 cm y se sumergieron por 2 horas, en una solución de glutaraldehido (C5H8O2) al 3 % (Anexo 1), preparado en solución amortiguadora (Anexo 2). Pasado este tiempo se hicieron 3 lavados de 10 min con una solución lavadora de fosfatos (PBS) (Anexo 3), seguidos de una post-fijación con una solución de tetraóxido de osmio (OsO4) al 1 % durante 2 h, de igual manera se hicieron 3 lavados de 10 min cada uno, con PBS.

La deshidratación se llevó a cabo con alcohol etílico, en diluciones seriadas del 10 al 90 %, con lapsos de 10 min en cada cambio de concentración y 3 cambios de 30 min cada uno, con alcohol al 100%. Así mismo las muestras fueron sumergidas en mezclas de alcohol-oxido de propileno en proporciones de 2:1, 1:1, 1:2 consecutivamente, así como en óxido de propileno puro durante 20 min por cada

Materiales y métodos

Este procedimiento fue seguido de una pre-inclusión la cual se realizó con una mezcla de óxido de propileno-resina, en las mismas concentraciones antes mencionadas, pero en esta ocasión los cambios fueron de 30 min hasta resina pura (Anexo 4). Finalmente se procedió a la inclusión en resina durante 24 horas a 60 °C y al estudio ultraestructural mediante el análisis de las micrografías tomadas en el MET.

Figura 10: Diagrama del procesamiento de las muestras para Microscopia Electrónica de Transmisión (MET).

Fijación con Glutaraldehído

3 %

Lavados con la solución lavadora

PBS

Post-fijación con Tetraóxido de

Osmio 1 %

Deshidratación Con etanol (10-100%)

Lavados con PBS

Oxido de propileno

Pre-inclusión con una mezcla de óxido

de propileno-resina Inclusión en Resina

Contraste de las muestras

Observación en MET

5.5.2.-Contraste de la muestra

Para preparar las muestras y obtener las micrografías por MET se utilizaron soluciones de citrato de plomo, acetato de uranilo acuoso y alcohólico, las cuales fueron centrifugadas a 10,000 rpm durante 30 min. Los cortes de 70 nm se colocaron en rejillas de cobre de 100 mesh para llevar a cabo la contrastación en cámaras húmedas, en tres etapas (Bozzola and Russell 1999):

 Como primer paso, se acondicionaron las cámaras húmedas utilizando cajas petri de vidrio, en las cuales se colocó parafilm y se agrego una gota de la solución de acetato de uranilo alcohólico. En éstas se sumergieron las rejillas durante 15 min; pasado este tiempo las rejillas se lavaron 3 veces con agua destilada y extrán. Después se pasaron a otra caja petri.

 El procedimiento antes descrito se repitió, cambiando la solución por acetato de uranilo acuoso.

 Finalmente se colocaron las rejillas en la solución de citrato de plomo por 20 min y se adicionó hidróxido de sodio dentro de la cámara, para evitar que la solución precipite. Terminado el tiempo, las rejillas se lavaron con agua con extran (limpio), seguido de otros tres lavados.

5.5.3.- Toma de micrografías y resolución (tamaño de escala)

Para la obtención de las micrografías se colocaron las rejillas en el microscopio

Materiales y métodos

a la presencia de células de mayor tamaño y plastídios más pequeños también se capturaron micrografías a 6000X y 60000X respectivamente.

5.5.4-Procesamiento de las micrografías

Para el procesamiento de las micrografías, se utilizó el programa Corel Photo Paint (V11.0, Corel Corporation, USA). Para lo cual, las imágenes fueron recortadas y trasladadas a una nueva carpeta a una escala de 8 bits y binarizadas.

5.6.-Analisis morfométrico

Una vez procesadas las imágenes en Corel, se utilizó el programa Sigma Scan Pro versión 5.0 mediante el cual se midió el Área (µm²), el Perímetro (µm), el Eje mayor (µm), el eje menor (µm), el Factor forma (adimensional), la Compactación (adimensional) y el Factor Elíptico (adimensional) descritos a continuación (Sanchez- Segura, 2008a) (Figura 11):

a) Área (A): es la medición de dos planos dimensionales limitados; calculados a partir de pixeles previamente calibrados, en una región u objeto.

A=πr²

b) Perímetro (P): es la medición de la distancia que delimita el contorno del objeto.

P= πD

c) Factor de Forma (Ff): Corresponde al grado en que un objeto se acerca al Ec. 2

Ec. 1

valor del factor de forma tiende a 0, la forma del objeto medido se vuelve alargada y plana.

d) Factor de compactación (Fc): Este factor es un descriptor de la “sinuosidad” o

“tortuosidad” del perímetro y de la irregularidad del objeto, por lo que en un circulo Fc=4 π, es decir aproximadamente 12.57.

e) Factor Elíptico (Fe): Es la relación entre el diámetro mayor y el diámetro menor.

Cabe mencionar que se realizó la calibración del programa con cada imagen (barra de escala). Esto se debió a que las imágenes fueron tomadas en diferentes escalas de observación

Ff

⁼

Fc

⁼

Fe

⁼

Ec. 4 Ec. 3

Ec. 5

Materiales y métodos

Figura 11: Ilustración descriptiva de las mediciones morfométricas.

Cabe señalar que, para efectos de comparación, se calcularon dos parámetros:

a) el perímetro teórico (Pt), es aquél que abarca el área experimental (Aexp) de las células, si éstas fueran un círculo perfecto y b) el área teórica (At), la cual de manera similar correspondería al área circunscrita por el perímetro experimental (Pexp) de las células, si éstas fueran un círculo perfecto.

5.7 Análisis Estadístico

Se llevo a cabo un análisis de varianza (ANOVA) de una vía y se aplicó el método de comparación de Tukey para detectar si había diferencias significativas en la respuesta de las lígulas de las flores sometidas a diferentes condiciones ambientales, dependientes de la estación climatológica del año en la que fueron

De igual manera para los factores morfométricos se aplico un ANOVA de una vía y la prueba de Tukey con un nivel de significancia de 5% (=0.05).

Resultados Y Discusion 6.-R E S U L T A D O S Y D I S C U S I O N

6.1.-Fluctuación de los factores climáticos

En la tabla 1 se muestran los datos obtenidos para los factores climáticos en el ambiente de Yautepec, determinados mensualmente, de diciembre de 2007 a octubre del 2008. Analizando en ésta los meses correspondientes a los 3 períodos considerados para el desarrollo de las plantas, desde el trasplante hasta la floración (diciembre-marzo; mayo-agosto y julio-octubre), los factores climáticos como la temperatura, la humedad relativa y la radiación solar presentaron fluctuaciones.

En el período de diciembre a marzo, la temperatura máxima (Tmax) fue más baja al inicio (27-28.05 °C), con respecto a los meses de febrero y marzo, en los cuales ésta se incrementó significativamente (P≤0.001) hasta 34.6-36.16 °C. Después de esto la Tmax bajó en el período siguiente (mayo-agosto) de 32.09 a 26.12-28.18 °C; en los meses de junio y julio respectivamente; sin embargo al final de este, en agosto, se volvió observar un incremento de 31.7 °C. en el siguiente periodo de cultivo (julio- octubre) la temperatura disminuye significativamente (P≤0.001) particularmente entre agosto y septiembre.

Es importante mencionar que entre diciembre y enero, además de la Tmax más baja, también se concentró la mayor precipitación y presencia de nubosidad (Sánchez- Ocampo, 2008)

Con respecto a la temperatura mínima (Tmin), en diciembre-marzo se registraron las más bajas (8.5-9.5 °C), mismas que después en los meses de febrero y marzo incrementaron significativamente (P≤0.001) a 11.08-12.8 °C. De mayo a agosto y de julio a septiembre, la T min se mantuvo sin cambios importantes entre 15.6 y 17 .2°C.

Sin embargo, al final de este período, en octubre la Tmin descendió

Tabla 1: Factores climáticos medidos durante los meses incluidos en los diferentes períodos de desarrollo de las plantas de Tagetes erecta L.

Meses

Parámetros Climatológicos T max (°C) T min (°C) T prom

(°C) (NS) HR prom

(%) Rad Solar (mol/mes*m²)

*Diciembre 28.050.8a 9.51.8d 17.710.2 53.723.1c 475.623c Enero 271.5a 8.51.6d 16.69.9 47.82.3c 487.88.63c Febrero 34.61.7c 11.080.7c 21.912.2 46.42.7c 535.223.3b Marzo 35.21.06c 12.81.15bc 22.612 41.43.5c 628.715.7a Abril 36.162.4c 17.52.1ab 25.411.7 56.21.5b 658.9319.5a Mayo 32.091.65b 15.91.53ab 248.98 593.15b 658.5330.88a Junio 28.183.27a 16.51.06ab 22.96.91 70.81.42a 679.3917.51a Julio 26.121.52a 15.60.65ab 20.66.02 84.12.58a 557.129.42b Agosto 31.741.03b 16.90.84a 21.39.63 76.82.5a 677.89.11a Septiembre 27.31.21a 17.21.06a 22.35.43 78.43.97a 706.111.24a

Octubre 27.71.98a 14.60.9abc 21.17.25 71.61.76a 585.819.39b

Los datos corresponden a las medias de los resultados obtenidos durante el mes correspondiente.

Letras diferentes indican diferencia significativa, aplicando un anova de 1 vía y prueba de comparación de medias de Tuckey (P≤0.001)

*diciembre 2007

La temperatura promedio estuvo entre 16.6-17.7 °C en los meses de diciembre y enero; hacia el final del período, en marzo, se incremento a 22.6 °C (P≤0.001). En el periodo siguiente (mayo-agosto) la temperatura se mantuvo con pequeñas

Resultados Y Discusion

valores altos en desviación estándar reflejan una fuerte oscilación térmica (diurna- nocturna) en Yautepec, Morelos.

La humedad relativa (HR) fue baja y se mantuvo en un intervalo de 41.4-53.72 % en los meses de diciembre a marzo. En el periodo comprendido entre mayo y agosto esta se incremento significativamente (P≤0.001) al inicio hasta un nivel intermedio de 59 % y posteriormente fue alta en julio y agosto (84.1-76.8 %). Esta HR alta se mantuvo para los cultivos del periodo julio-octubre (71.6-84.1 %).

En este último periodo Sánchez-Ocampo, (2008) reportó, derivado de un estudio realizado en el mismo lugar y en paralelo con el presente, la mayor incidencia de lluvias.

En los períodos de diciembre a marzo, la radiación solar se incrementó significativamente (P≤0.001) de 475 mol/mes*m² a 628.7 mol/mes*m², en el siguiente periodo (mayo-agosto) la Rad Solar se mantuvo entre 658.53 mol/mes*m² y 677.8 mol/mes*m² con la excepción del mes de julio en donde se observo un descenso a 557.1 mol/mes*m², lo cual coincide con la presencia de nubosidad en este mes de acuerdo con Sánchez-Ocampo, (2008). Finalmente la radiación solar para las plantas desarrolladas en el periodo de julio-octubre presento fluctuaciones que fueron desde 557.1 al inicio del periodo hasta 706.1 mol/mes*m² en septiembre; después de este la radiación volvió a bajar a 585.8 mol/mes*m².

La fluctuación de los factores climáticos registrados en áreas de Yautepec, Morelos a lo largo del 2007 y 2008 (Tabla 1), en términos generales está definida por el movimiento de traslación de la Tierra, el movimiento de precisión (inclinación del eje terrestre) y el movimiento de rotación. Las cuales confieren características estacionales particulares al área de Yautepec, Morelos donde se realizo el trabajo, por la ubicación geográfica (Cazabone y Sivoli, 1997).

Al comparar las características estacionales de los 3 períodos en los cuales se llevó a cabo el análisis de ultraestructura y morfometría sub-celular a nivel de las lígulas (tabla2), destaca el hecho de que la temperatura máxima presentó diferencias estadísticamente significativas a lo largo de todo el estudio, presentándose las más altas en los 2 primeros períodos en los meses de febrero a mayo.

De igual manera, la T min presento fluctuaciones importantes y fue menor en diciembre y enero.

Tabla 2: Fluctuación de los factores climáticos durante el mes de floración y colecta de las cabezuelas.

Meses

Parámetros Climatológicos T max (°C) T min (°C) T prom

(°C) (NS) HR prom

(%) Rad Solar (mol/mes*m²) Marzo 35.21.06c 12.81.15b 22.612 41.43.5c 628.715.7a Agosto 31.741.03b 16.90.84ª 21.39.63 76.82.5a 677.89.11a Octubre 27.71.98a 14.60.9ab 21.17.25 71.61.76a 585.819.39b

Los datos en esta tabla son las medias de los datos obtenidos durante el mes correspondiente (desviacion estandar). Letras diferentes indican diferencia significativa, aplicando un anova de 1 vía y

prueba de comparación de medias de Tuckey (P≤0.001)

El mes de marzo presentó características muy particulares, debido a se registró una T max alta, HR baja y radiación solar alta.

Sánchez-Ocampo, (2008), encontró que la acumulación de carotenoides es