INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE MEDICINA Y HOMEOPATIA
SECCION DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACION
EVALUACION DE LA PRESENCIA DE LA MOLECULA COESTIMULADORA CD86 EN NIC I Y
SU RELACION CON VPH
T E S I S
Que para obtener el grado de Maestro en Ciencias en Biomedicina Molecular
Presenta: Q.B.P. Teodora Castro Martínez
Director de tesis: Dr. J. Efraín Garrido Guerrero Co-directora de tesis: Dra. Paula Figueroa Arredondo
Agosto, 2005
Este trabajo se realizó con financiamiento del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), con número de proyecto 38516- N.
El trabajo se desarrolló en el Laboratorio No. 1
del Departamento de Genética y Biología
Molecular del CINVESTAV, bajo la dirección
del Dr. J. Efraín Garrido Guerrero.
Durante la realización de éste trabajo se contó con una beca para gastos de manutención otorgada por el Programa Institucional de Formación de Investigadores (PIFI) del IPN.
Estas becas se otorgaron en apoyo a los
proyectos CGPI 2003-0521 y CGPI 2004-0743.
AGRADECIMIENTOS
Agradezco de manera especial al Dr. J. Efraín Garrido Guerrero, Jefe del Laboratorio No.1 del Departamento de Genética y Biología Molecular del CINVESTAV, por haber dirigido este trabajo y sobre todo por haberme permitido formar parte de su grupo de investigación.
Agradezco a la Dra. Paula Figueroa Arredondo, a la Dra. Laurence Marchat Marchau, a la Dra.
Claudia Benítez Cardoza, y al Dr. Juan Salas Benito, sus críticas y sugerencias durante la realización de este trabajo.
Agradezco enormemente a la Dra. Vilma Reyes, Jefa del Servicio de Patología del Hospital de la Mujer de la Ciudad de México, D. F., por haberme apoyado al proporcionarme el material biológico necesario para realizar este trabajo.
Agradezco a la Servicios Estatales de Salud en Guerrero, por haberme otorgado el permiso correspondiente para poder realizar mis estudios de Maestría en la Ciudad de México, D.F.
Agradezco a mi amiga y compañera, la M. en C. Elizabeth Ortiz Sánchez, todo el apoyo que me proporcionó durante mi estancia en el laboratorio, gracias por tus enseñanzas, asesorías y sugerencias.
Agradezco al Biólogo Pedro Chávez Olmos, el apoyo que me prestó durante mi estancia en el laboratorio, gracias por sus enseñanzas, sugerencias y “asesorías”.
Agradezco a todos los compañeros del Laboratorio No.1 del Depto. de Genética y Biología Molecular del CINVESTAV, su amistad, compañía y los gratos momentos que compartimos.
DEDICATORIAS
A mis padres
Gracias por su cariño y por el apoyo incondicional que siempre me han brindado en todas mis decisiones.
Gracias por existir.
A mis Hermanos
Gracias por su cariño y apoyo.
Gracias por existir.
A ti, Dios
Gracias por todas tus bendiciones.
INDICE
Página
GLOSARIO i
INDICE DE FIGURAS ii
INDICE DE TABLAS iv
RESUMEN v
ABSTRACT vii
I. INTRODUCCION 1
I.1 Cáncer Cervical 1
I.1.1 Zona de transformación 1
I.2. Lesiones premalignas del Cáncer Cervical 2
I.2.1 Clasificación de las lesiones premalignas del Cáncer Cervical 3
I.2.2 Factores de riesgo para el desarrollo del Cáncer Cervical 4
I.3. Virus del Papiloma Humano (VPH) y el Cáncer Cervical 6
I.3.1 Virus del Papiloma Humano 6
I.3.2 Funciones de las proteínas virales 7
I.3.3 Proteínas virales implicadas en la transformación e inmortalización Celular 8
I.3.4 Blancos celulares de las proteínas virales E6 y E7: p53 y Rb 9
I.3.5 Clasificación de VPH 10
I.3.6 Prevalencia de VPH en México 11
I.3.7 Células blanco de VPH 12
I.3.8 Ciclo replicativo de VPH 13
I.4 Factores de regresión/progresión de las lesiones premalignas del Cáncer Cervical 14
I.5 Respuesta Inmune contra células infectadas por virus y células tumorales 14
I.5.1 Células Dendríticas 15
I.5.2 Linfocitos T 15
I.5.3 Activación de Linfocitos T 16
I.5.4 Estructura de las moléculas coestimuladoras: CD80 y CD86 17
I.5.5 Receptor de las moléculas coestimuladoras en el Linfocito T: CD28 20
I.5.6 Receptor inhibitorio de las moléculas coestimuladoras en el Linfocito T: CTLA-4 21
I.5.7 CD80 y CD86 en la diferenciación de Linfocitos T 21
I.5.8 Anergia en el Linfocito T 21
I.5.9 Inmunidad a tumores 22
I.5.10 IFN: citocina importante en la respuesta inmune celular contra células infectadas por virus 23
I.6 Mecanismos de evasión de la respuesta inmune desarrollados por el VPH 23
II. ANTECEDENTES 27
III. JUSTIFICACION 29
IV. HIPOTESIS 30
V. OBJETIVO GENERAL 31
VI. OBJETIVOS ESPECIFICOS 31
VII. MATERIAL Y METODOS 32
VII.1 Estrategia experimental 33
VII.2 Purificación de DNA por fenol 34
VII.3 Purificación de DNA por QIAamp DNA Mini Kit 35
VII.4 Reacción en Cadena de la Polimerasa: PCR 39
VII.5 Inmunohistoquímica 40
VIII. RESULTADOS 42
IX. ANALISIS 54
X. CONCLUSIONES 60
XI. PERSPECTIVAS 61
XII. REFERENCIAS 62
XIII. ANEXOS 71
GLOSARIO
APC Célula Presentadora de Antígenos ATP Trifosfato de adenosina
CD Célula Dendrítica
CDK Cinasa dependiente de ciclina CL Célula de Langerhans
DNA Acido desoxiribonucléico EGF Factor de Crecimiento Epidermal
EGFR Receptor del Factor de Crecimiento Epidermal GAG Glicosaminoglicanos
GAPDH Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa HSIL Lesión Intraepitelial Escamosa de Alto Grado IFN Interferon
IHQ Inmunohistoquímica IL Interleucina
KDa Kilodaltones
LCR Región Larga de Control
LSIL Lesión Intraepitelial Escamosa de Bajo Grado LT Linfocito T
MHC Complejo Mayor de Histocompatibilidad NIC Neoplasia Intraepitelial Cervical
PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa RE Retículo Endoplásmico
TBP Proteína de unión a TATA TCR Receptor del Linfocito T TNF Factor de Necrosis Tumoral VPH Virus del Papiloma Humano
INDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1. Corte histológico de la zona de transformación 1
Figura 2. Neoplasias Intraepiteliales Cervicales 4
Figura 3. Fotomicrografía de una partícula viral de VPH 6
Figura 4. Mapa del genoma de VPH 7
Figura 5. Respuesta inmune contra células infectadas por virus 16
Figura 6. Modelo de activación de linfocitos T 17
Figura 7. Estructura del gen que codifica para la proteína CD86 18
Figura 8. Estructura de las moléculas coestimuladoras CD80 y CD86 18
Figura 9. Estrategia Experimental 33
Figura 10. Gel de agarosa con productos de PCR del gen GAPDH 44
Figura 11. Gel de agarosa con productos de PCR del gen GAPDH 45
Figura 12. Gel de agarosa con productos de PCR para detectar al VPH 46
Figura 13. Gel de agarosa con productos de PCR para detectar al VPH 47
Figura 14. Resultados de Inmunohistoquímicas para CD86: controles + y - 49
Figura 15. Resultados de Inmunohistoquímicas para CD86 en lesiones NIC I, VPH - 50
Figura 16. Resultados de Inmunohistoquímicas para CD86 en lesiones NIC I, VPH + 51
Figura 17. Gráfico de los Resultados de las Inmunohistoquimicas para CD86 52
INDICE DE TABLAS
Página
Tabla 1. Clasificación de las lesiones premalignas del Cáncer Cervical 3
Tabla 2. Clasificación de VPH por su poder oncogénico 11
Tabla 3. Resultados de IHQ para CD80, CD86, B7H e IL-10 28
Tabla 4. Mezcla de reacción para amplificar el gen GAPDH por PCR 37
Tabla 5. Mezcla de reacción para detectar VPH por PCR 39
Tabla 6. Escala para evaluar la presencia de CD86 en NIC I por ensayos de Inmunohistoquímica 48
RESUMEN
El cáncer cervical es la primera causa de muerte en las mujeres mexicanas y es el segundo cáncer más común a nivel mundial. El principal factor de riesgo para el desarrollo del cáncer cervical es la infección por el Virus del Papiloma Humano (VPH). Actualmente se han descrito más de 100 tipos virales de los cuales aproximadamente 30 infectan el tracto genital. Por su capacidad oncogénica se han clasificado en dos grupos: tipos virales de bajo riesgo (VPH 6 y 11) y tipos virales de alto (VPH 16 y 18).
Las células blanco de VPH son los queratinocitos basales, a los cuales el virus tiene acceso por lesiones en el epitelio.
Las proteínas virales relacionadas con la inmortalización y transformación de las células infectadas son las proteínas E6 y E7, las cuales alteran diferentes vías celulares para generar un ambiente favorable para la replicación viral así como el bloqueo de los sistemas de vigilancia de la célula, lo que garantiza la persistencia de la infección. Las interacciones de E6 y E7 con sus blancos celulares desregulan el ciclo celular, favorecen la proliferación, la inmortalización y la transformación celular.
El cáncer cervical tiene un inicio gradual, ya que involucra la progresión por lesiones precursoras llamadas Neoplasias Intraepiteliales Cervicales (NIC) o Lesiones Intraepiteliales de bajo y alto grado. No todas las lesiones precursoras avanzan a un carcinoma, existen factores que favorecen la regresión o la progresión de éstas. Uno de estos factores es la respuesta inmune del individuo.
Para estimular adecuadamente a un linfocito T se requieren dos señales. La primera señal está dada por la interacción del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) asociado con el antígeno, expresado sobre la membrana de la célula APC y el TCR del linfocito T. Esta primera señal es específica de antígeno. La segunda señal es generada por el reconocimiento de moléculas de coestimulación expresadas por la APC, estas moléculas interactúan con el receptor CD28 expresado por el linfocito T. Esta segunda señal no es específica de antígeno. En presencia de estas dos señales el linfocito T entra en un proceso de proliferación, activación y diferenciación, iniciando así sus funciones efectoras. Cuando alguna de estas dos señales falta o no se da de manera adecuada, el linfocito T entra en un proceso de anergía o no respuesta al contacto con el antígeno.
En diferentes tipos de cáncer se ha reportado la disminución de moléculas coestimuladoras.
En este trabajo se evaluó la presencia de la molécula coestimuladora CD86, en Neoplasias Intraepiteliales Cervicales grado I (NIC I) con y sin infección por VPH, mediante ensayos de inmunohistoquímica. Nuestra hipótesis fue que en lesiones NIC I con infección por VPH, hay pérdida de la molécula CD86 en la superficie de las células epiteliales cervicales.
Se analizaron un total de 60 muestras, todas con diagnóstico histopatológico de Neoplasia Intrapitelial Cervical grado I: 30 muestras NIC I, VPH + y 30 muestras NIC I, VPH -. En todas las muestras se observó disminución de CD86, esta disminución fue mayor en las muestras asociadas a infección por VPH. En algunas muestras además de mostrar disminución de CD86 también mostraron localización alterada de CD86, esta molécula se localizó en citoplasma.
Estos hallazgos sugieren la existencia de mecanismos de procesamiento alternativo de CD86 que afectan su disponibilidad, sobre la membrana de las células epiteliales cervicales.
A partir de los resultados obtenidos en este estudio y respaldados por estudios anteriores realizados en nuestro grupo de investigación, se propone como conclusión que VPH probablemente presenta un mecanismo adicional para evadir la respuesta inmune, dicho mecanismo consiste en la disminución de la molécula CD86 sobre la membrana de las células epiteliales cervicales.
ABSTRACT
Cervical cancer is the first cause of death in Mexican women and second worldwide. The main risk factor for this disease is the HPV infection. At the present time, more than 100 viral types have been described and approximately 30 of them are able to infect the genital tract. Because of its oncogenic capacity they have been classified as low-risk (HPV 6, 11) and high-risk viral types (HPV 16, 18).
HPV infects basal keratinocytes having access to these cells by epithelial lesions. Inside the cells HPV begins its genome replication using the cellular replication machinery and this process is associated to the keratinocytes differentiation program.
The viral genes E6 and E7 encode proteins that disrupt the cell cycle control, promoting in this way the proliferation, immortalization and cellular transformation.
Cervical cancer has a gradual development from lesions called Cervical Intraepithelial Neoplasia (CIN). Few of these lesions progress to carcinoma because of different factors that may promote the regression or progression of the lesions. One of these factors is the immune response, playing an important role in the elimination of virus-infected cells.
In this work we evaluated by immunohistochemistry the presence of the costimulatory protein CD86 in HPV-positive and negative CIN-I. Our hypothesis was that the CD86 costimulatory molecule level should be lower in HPV-infected lesions than in HPV-negative CIN. We analyzed sixty biopsies CIN-I, thirty of them HPV-positives and thirty HPV-negatives. All the evaluated CIN-I biopsies showed a decrease in the presence of the CD86 protein on the membrane of cells from the spinous layer, compared with the amount observed in normal cervical epithelia. However, the presence of CD86 protein was even lower in the CIN-I HPV- positive samples than in that HPV-negative. In addition some CIN-I samples showed altered cytoplasmic localization of CD86 protein. Is very possible that HPV induces the acceleration in the decrease of CD86 in the cervical epithelial cells.
I. INTRODUCCION
I.1. Cáncer Cervical
Los tumores malignos representan la segunda causa de muerte en México y de estos el cáncer cervical es la primera causa de muerte en la población femenina. Es el segundo cáncer más común a nivel mundial y el primero reconocido por la Organización Mundial de la Salud que es atribuible a una infección viral (1,21).
El cáncer cervical es una enfermedad neoplásica maligna que se origina en el cérvix uterino y cuya progresión natural lleva a la muerte. Aún cuando el conocimiento de la enfermedad es incompleto, los estudios realizados han mostrado que la mayoría de estos tumores tienen una progresión gradual y sus lesiones precursoras pueden mantenerse en fase reversible o in situ por varios años en la mayoría de las pacientes. El cáncer cervical es el estadio final de un conjunto de alteraciones epiteliales progresivamente más atípicas, en las que un estadio da lugar al siguiente de manera imperceptible (63).
I.1.1 Zona de Transformación
Más del 90% de los casos de cáncer cervical se desarrollan en la zona de transformación (unión escamo-columnar), que se define como el sitio de unión entre el epitelio cilíndrico simple que recubre el canal endocervical y el epitelio plano estratificado que recubre el exocérvix (55) (Fig.
1). Presumiblemente en esta zona de transformación actúan los agentes con potencial carcinogénico dando origen a la metaplasia atípica, lesiones intraepiteliales cervicales y carcinomas invasores (2).
Fig. 1. Corte histológico de la zona de transformación.
La zona de transformación se localiza en la boca cervical externa, es un sitio dinámico que cambia por procesos fisiológicos propios de la mujer como: la pubertad, el embarazo y la menopausia (68).
El epitelio escamoso estratificado que forma parte de la zona de transformación, consta de 4 capas:
Capa basal. Constituída por una sola fila de células inmaduras con capacidad proliferativa. Son células pequeñas y redondas con un núcleo grande y escaso citoplasma. También llamado estrato germinativo.
Capa parabasal. Abarca de dos a cuatro filas de células inmaduras, ligeramente más grandes que las células basales, son células con núcleo grande y escaso citoplasma.
Capa intermedia. Abarca de cuatro a seis filas de células de forma poliédrica, son células grandes de núcleo pequeño y abundante citoplasma. También llamado estrato espinoso.
Capa superficial. Abarca de cinco a ocho filas de células aplanadas con núcleos picnóticos y abundante citoplasma. También llamado estrato córneo.
El epitelio del endocérvix tiene una sola capa de células cilíndricas mucosecretoras (68).
I.2. Lesiones premalignas o precursoras del Cáncer Cervical
La historia natural del cáncer cervical implica la progresión gradual por etapas preinvasoras llamadas lesiones precursoras o premalignas, las cuales son estrictamente intraepiteliales es decir, se encuentran por encima de la membrana basal que separa el epitelio escamoso del estroma (63).
Cuando se afecta el control de la división celular y se pierde gradualmente el control de otras funciones básicas, como la diferenciación celular, se produce la transformación neoplásica. Las células retienen su capacidad mitótica pero no se diferencian adecuadamente conforme ascienden en el epitelio, por lo que dicha proliferación es desordenada (63).
Histológicamente estas lesiones intraepiteliales se caracterizan por:
- pérdida de estratificación y polaridad de las células - ausencia de diferenciación y maduración
- alteración en la relación núcleo-citoplasma
- alteraciones nucleares (hipercromatismo y distribución anormal de la cromatina) - mitosis anormales
I.2.1. Clasificación de las lesiones precursoras del Cáncer Cervical
Uno de los avances más importantes en el tratamiento del cáncer cervical ha sido la identificación de las lesiones precursoras, las cuales han sido objeto de diferentes clasificaciones. La primera clasificación se realizó en 1950 y se designó con el término de displasia. De acuerdo a su gravedad se denominaba: leve, moderada o severa. En 1968 se acuñó el concepto de Neoplasia Intraepitelial Cervical (NIC), con diferentes grados: NIC I, NIC II, NIC III o carcinoma in situ. En estas dos últimas clasificaciones el porcentaje de epitelio involucrado en la lesión define el grado de la misma. La clasificación más reciente es la desarrollada en 1988 y se conoce como el Sistema Bethesda. Con ella se originó el concepto de lesiones escamosas intraepiteliales, subdividiéndose en lesiones escamosas intraepiteliales de bajo grado (LSIL) y lesiones escamosas intraepiteliales de alto grado (HSIL). En las LSIL quedan incluidas las infecciones por el Virus del Papiloma Humano (VPH) y la displasia leve o NIC I. Las displasias moderada (NIC II) y severa (NIC III) quedan agrupadas en las HSIL (63), así como el carcinoma in situ. (Ver tabla 1).
Carcinoma in situ
NIC III
Displasia grave Lesión Intraepitelial de Alto Grado (HSIL, siglas en inglés)
NIC II Displasia moderada
Lesión Intraepitelial de Bajo Grado ( LSIL,siglas en inglés)
NIC I Displasia leve
Bethesda Richart
Papanicolaou
Tabla. 1. Clasificación de las lesiones precursoras del cáncer cervical (55, 63).
Neoplasia Intraepitelial Cervical o NIC
Cuando las alteraciones celulares se encuentran predominantemente en el tercio basal del epitelio, son poco acentuadas y se produce maduración de las células más allá del tercio inferior del epitelio: la lesión corresponde a una Neoplasia Intraepitelial Cervical I o NIC I.
Cuando estas alteraciones son más acentuadas y abarcan hasta los dos tercios inferiores del epitelio se trata de una Neoplasia Intraepitelial II o NIC II.
Cuando las alteraciones son aún más acentuadas y comprometen más allá de los dos tercios inferiores del epitelio, pero no todo el espesor, la lesión corresponde a una Neoplasia Intraepitelial Cervical III o NIC III y cuando compromete el 100% del epitelio, sin ningún signo de maduración de las células hacia los estratos superiores se trata de un carcinoma in situ (18).
El cáncer invasor es aquel tumor que ha rebasado la membrana basal que separa el epitelio del estroma. (Fig.2).
Fig. 2. Neoplasias Intraepiteliales Cervicales. Los cánceres invasores del cuello uterino vienen precedidos generalmente por una larga fase de enfermedades preinvasoras.
I.2.2. Factores de riesgo para el desarrollo de Cáncer Cervical
El cáncer cervical es una enfermedad multifactorial que está relacionada con agresiones y múltiples lesiones en el cérvix. Actualmente se conocen varios factores de riesgo para el desarrollo de esta enfermedad (2).
Edad de riesgo. La etapa reproductiva de la mujer se considera entre los 30 y 50 años. Es la etapa en la que se usan anticonceptivos y el número de compañeros sexuales se vuelve relevante.
Inicio de vida sexual a temprana edad. La zona de transformación del epitelio cervical es la más proliferativa durante la pubertad y la adolescencia, es especialmente más susceptible a alteraciones que pueden ser inducidas por agentes de transmisión sexual como el VPH. Una infección por VPH en adolescentes tiene una alta probabilidad de convertirse en infección
crónica lo que aumenta el riesgo de desarrollar cáncer cervical. El epitelio cervical en mujeres muy jóvenes es aún inmaduro por lo que VPH tiene acceso a sus células blanco fácilmente (51).
Infecciones de transmisión sexual recurrentes. Las infecciones de transmisión sexual comprometen la integridad del epitelio, lo que favorece la infección por otros patógenos como el VPH.
Multiparidad (más de 5 partos). El embarazo provoca un estado traumático y de inmunosupresión que puede aumentar la susceptibilidad del organismo a los agentes infecciosos.
Se ha señalado que la neoplasia cervical aparece con mayor frecuencia en el labio anterior del cérvix, zona donde el traumatismo obstétrico es más intenso (51, 54).
Múltiples parejas sexuales. Entre mayor sea el número de compañeros sexuales se incrementa el riesgo de contraer infecciones por virus como el VPH.
Tabaquismo. Existe una acción oncogénica directa sobre el cérvix, ya que metabolitos de la nicotina pueden ser encontrados en el moco cervical de mujeres fumadoras (54).
Bajo nivel socioeconómico. Las mujeres de bajos recursos económicos tiene poco o nulo acceso a los servicios de salud, es común que en ellas el cáncer cervical se diagnostique en etapas avanzadas, por lo que al no tener acceso a los más modernos y eficientes tratamientos contra la enfermedad, el pronóstico es malo y la calidad de vida es muy pobre (54).
Uso de anticonceptivos orales por más de 5 años. Los hormonales podrían afectar a los elementos genéticos del VPH que responden al estímulo de progesterona. En células infectadas por VPH ya ha sido demostrado que la estimulación esteroidea puede disparar eventos que involucran a los oncogenes virales, los cuales podrían culminar en la integración del genoma de VPH en el genoma celular. Estas mujeres son más activas sexualmente y recurren menos al uso del condón o de otros métodos de barrera que bloquean la transmisión de la infección por VPH (54).
Deficiencia de vitaminas A, C y E. Los carotenoides, tocoferoles y el ácido ascórbico son potentes antioxidantes que pueden inactivar a los radicales libres intracelulares evitando el daño al DNA (54).
Infección por el Virus del Papiloma Humano (VPH). A la fecha se considera al VPH como el principal factor de riesgo para el desarrollo de cáncer cervical, ya que en más del 99% de los casos de cáncer invasor se ha encontrado genoma viral (58).
I.3. VPH Y EL CANCER CERVICAL
I.3.1. Virus del Papiloma Humano
Es un virus de DNA de doble cadena, no envuelto que tiene una cápside icosahédrica de 72 cápsomeros. La partícula viral mide de 55-60 nm. Pertenece a la familia Papillomaviridae. Su genoma es de aproximadamente 8000 pb, codifica 8 marcos de lectura abierta, 6 de tipo temprano: E1, E2, E4, E5, E6, E7 y dos de tipo tardío: L1 y L2 (Fig. 3 y 4). La nomenclatura E y L de las proteínas se debe al vocablo en inglés: early y late respectivamente.
Fig. 3. Partícula viral del VPH. La partícula viral mide de 55-60 nm.
En el genoma viral se localiza una región reguladora llamada: Región Larga de Control (LCR) que contiene el origen de replicación y secuencias que controlan la transcripción de los diferentes genes virales, estas secuencias no son traducidas. LCR controla la expresión de los genes virales al interactuar con una gran variedad de proteínas que se unen al DNA como los factores de transcripción celulares: AP1, NF1, KRF, Oct1 y Sp1 (64).
Región conservada y expresada en cáncer cervical y líneas
celulares
Sitio donde se rompe la cadena de DNA viral para integrarse al genoma celular
Región perdida o no expresada cuando hay integración
Fig. 4. Mapa del genoma del VPH. Su genoma es de aproximadamente 8000 pb, codifica 8 marcos de lectura abierta, 6 de tipo temprano: E1, E2, E4, E5, E6, E7 y dos de tipo tardío: L1 y L2.
I.3.2. Funciones de las proteínas virales
E1: Tiene actividad de helicasa y ATPasa, participa en replicación. La interacción física entre E2 y E1 favorece el reclutamiento de E1 al origen de replicación. E1 interactúa con subunidades de la DNA polimerasa alfa y con componentes del complejo Swi/Snf para activar la replicación del DNA (58).
E2: Regula la replicación y transcripción de genes virales. E2 regula la actividad del promotor viral, controlando la expresión de los genes E6 y E7 (52).
E4: Se expresa sólo en células ya diferenciadas, induce la ruptura de redes de citoqueratina, lo que permite la liberación de los viriones. E4 detiene el ciclo celular en la fase G2/M, permitiendo la síntesis de DNA y la división nuclear en ausencia de división celular (52).
L1 : Es una proteína de 57 kDa, es el principal componente de la cápside viral (56).
L2: Es una proteína de 78 kDa, es el componente menor de la cápside viral. La formación de una partícula viral requiere el ensamble de las proteínas L1 y L2 para formar una estructura proteica cuya función es proteger el genoma viral (56).
I.3.3. E5, E6 y E7: PROTEINAS VIRALES IMPLICADAS EN LA TRANSFORMACION E INMORTALIZACION CELULAR
Proteína E5 de VPH
E5 es una proteína pequeña hidrofóbica que se asocia a membranas intracelulares, E5 se une a una subunidad formadora de poros de 16 kDa de la ATPasa vacuolar (v-ATPasa) e inhibe la acidificación endosomal en los queratinocitos humanos, esto impide la degradación del receptor (internalizado) del factor de crecimiento epidermal (EGFR), potenciando su reciclamiento a la superficie de la célula, amplificando la señal del factor de crecimiento sobre la célula (31).
La vacuola eucariótica es un organelo central en numerosos procesos celulares esenciales como:
la internalización ligando-receptor así como el reciclamiento del mismo, el transporte de proteínas recién sintetizadas en el retículo endoplásmico, así como en la homeostasis de iones.
La actividad de la ATPasa es acidificar el lumen vacuolar, esto es necesario para que se lleve a cabo de manera adecuada cada uno de los procesos que tienen lugar en este organelo celular. E5 inhibe el procesamiento de péptidos antigénicos dependiente de pH, alterando la presentación de antígenos a las células del sistema inmune (1). La alteración de las actividades de la ATPasa por E5 de VPH puede tener efectos importantes sobre el crecimiento, la respuesta a señales extracelulares, la producción y el procesamiento de proteínas recién sintetizadas (31).
Proteína E6 de VPH
Durante la infección por VPH, E6 juega múltiples papeles, interfiriendo con varias vías celulares, creando un ambiente favorable para la replicación viral y neutralizando los controles de vigilancia celulares (6).
E6 es una proteína de 151 aminoácidos que contiene dominios de dedos de zinc, bloquea la apoptosis dependiente de p53 y promueve la degradación de p53 por la vía de la ubiquitina (32).
Este proceso es mediado por una proteína ligasa de ubiquitina: E6AP de 100 kDa. La proteína viral E6 inactiva a p53 con la consecuente anulación del control ejercido por ésta sobre el ciclo celular. La célula no detiene su ciclo ante cualquier daño sufrido en el DNA, tampoco se induce
apoptosis para eliminar a las células alteradas lo que genera inestabilidad genética y permite acumular mutaciones en diversos genes (6).
E6 puede unirse a CBP/p300, alterando la transcripción dependiente de este cofactor y puede inducir la degradación de Bak (38). E6 inhibe la diferenciación y la senescencia celular al estimular la inmortalización, afecta el contacto célula-célula así como la polaridad celular conduciendo al fenotipo metastático e invasivo (6).
Proteína E7 de VPH
Es una proteína nuclear de 18 kDa, de 98 aminoácidos, su extremo amino interacciona con sus proteínas blanco, muchas de las cuales son importantes reguladores del ciclo celular especialmente en la transición G1-S del ciclo celular. E7 se une a la proteína Rb, que regula negativamente la progresión del ciclo celular. La interacción de E7 con Rb provoca la liberación de los factores de transcripción necesarios para la progresión del ciclo celular, anulándose el mecanismo de freno que asociado a la activación de los complejos cdk/ciclina llevan a la desregulación del ciclo celular. Estudios bioquímicos muestran que E7 se asocia con otras proteínas supresoras de tumores como p107 y p130, puede unirse a desacetilasas de histonas (HDAC), a factores de transcripción como AP-1, a la proteína TBP, a ciclinas, a cdks y con inhibidores de cdk (32). Estas interacciones son las que desregulan el ciclo celular, potencializan la proliferación, inmortalización y finalmente provocan la transformación de la célula (8).
I.3.4. Blancos celulares de las proteínas virales E6 y E7 de VPH
Las proteínas virales E6 y E7 tienen varios blancos celulares, pero los más conocidos son las proteínas supresoras de tumores p53 y Rb respectivamente.
Proteína p53
Se le denomina el “guardian del genoma” dado que su función consiste en responder a situaciones en que las condiciones no son adecuadas para el progreso del ciclo celular en el punto de control G1-S. Esta proteína tiene como función especial controlar la progresión del ciclo celular monitoreando la integridad del DNA. La concentración de p53 en la célula, normalmente es baja pero cuando la célula es sometida a estrés o el DNA sufre daño, p53 se estabiliza y aumenta su concentración en la célula, al disminuir su tasa de degradación. Una vez detectado el daño p53, actúa como factor de transcripción induciendo la expresión de genes
necesarios para reparar el daño, así como proteínas encargadas de generar un paro en el ciclo celular como p27 y p21. Estas proteínas se encargan de regular negativamente el ciclo celular al bloquear a los complejos ciclina/cdk. El paro en el ciclo celular tiene como finalidad que el daño sea reparado, pero si este daño no es susceptible de reparación, p53 induce la apoptosis de la célula para evitar que el daño pase a la descendencia. De esta forma p53 impide que se acumulen mutaciones que podrían llevar a la transformación celular (67).
Proteína Rb
Esta proteína cumple un papel importante en el control de la división y la diferenciación celular.
Esta proteína secuestra factores de transcripción como E2F y DP1 los cuales son necesarios para la progresión del ciclo celular. La concentración de Rb se mantiene constante a lo largo del ciclo celular y sólo se regula por fosforilación.
Rb se encuentra bajo dos formas: subfosforilada e hiperfosforilada; en el primer caso la proteína se encuentra activa secuestrando a los factores de transcripción E2F y DP1 que al no estar disponibles, se genera un paro en el ciclo celular, pero cuando la célula recibe señales mitogénicas el complejo cdk/ciclina se encargan de fosforilar a la proteína Rb inactivándola, liberando así a los factores de transcripción necesarios para que el ciclo celular continue (67).
I.3.5. CLASIFICACION DEL VPH
Los Papilomavirus son una familia extensa de virus que causan varias enfermedades proliferativas, han sido clasificados en base a las especies que infectan, en base a su tropismo celular, en base a la homología en su secuencia de DNA y por su potencial oncogénico, esta última es la clasificación más importante desde el punto de vista clínico.
Potencial oncogénico de VPH
A la fecha se han descrito más de 100 tipos virales. Aproximadamente 30 pueden infectar el tracto genital. Las proteínas E6 y E7 de los diferentes tipos virales no poseen la misma afinidad por sus blancos celulares. Los tipos virales con baja afinidad por sus blancos, tienen bajo poder oncogénico por esto se han agrupado como tipos virales de bajo riesgo y los tipos virales cuyas oncoproteínas tienen gran afinidad por sus blancos, son potencialmente oncogénicos por lo que se les agrupa como tipos virales de alto riesgo (7,16).
Tabla 2. Clasificación de VPH por su poder oncogénico.
Poder oncogénico Tipos virales Lesiones
Bajo Riesgo 6,11,40,42,43,44,57 Proliferaciones benignas: condilomas, verrugas y Lesiones Intraepiteliales
de Bajo grado (LSIL) Alto Riesgo 16,18,30,31,33,35,39,
45,51,52,56,58,59,66
Lesiones Intraepiteliales de Alto grado (HSIL), carcinomas y
adenocarcinomas
Actualmente la detección y tipificación de VPH adquiere gran importancia ya que tiene como objetivo la detección de pacientes con mayor riesgo de desarrollar cáncer cervical, dada la fuerte asociación de algunos tipos virales con tumores malignos. Basados en sus secuencias nucleotídicas o de aminoácidos se han construido árboles filogenéticos o evolutivos de VPH.
Los árboles filogenéticos han ido creciendo y ramificándose a medida que se encuentran nuevos tipos virales. Ahora se sabe que muchos de los VPH infectan de manera específica un cierto tipo de células epiteliales. Los análisis de secuencias genómicas muestran que los tipos virales que infectan el mismo epitelio o alguno similar, están más cercanamente relacionados que con aquellos que infectan epitelios diferentes. De esta manera se observa que la evolución viral está ligada no solamente a la especie que infectan, si no a su tejido blanco específico (65).
I.3.6. Prevalencia de VPH en México
La asociación de VPH con el desarrollo de cáncer cervical es específica para tipos virales de alto riesgo. De los 30 tipos que infectan cérvix, el VHP 16 está relacionado con la mayor proporción de tumores cervicales ya que es responsable del 53% de los casos a nivel mundial. El VPH 18 es responsable del 15%, el VPH 45 del 9% y el VHP 31 del 6% (32). La frecuencia de otros tipos de alto riesgo puede variar de acuerdo a factores geográficos, demográficos y clínico- patológicos (11).
En México, la prevalencia de VPH varía ligeramente en cada reporte, por ejemplo, en 1998 Torroella-Kouri y colaboradores analizaron lesiones intraepiteliales de bajo grado (LSIL) y alto grado (HSIL), encontrando los siguientes resultados:
21 LSIL 33 % VPH + 24 HSIL 83 % VPH + 69 CA 87 % VPH +
Los tipos virales más comunes fueron: 16, 18, 45, 39, 58, 59 (44). (Ver tabla 1: equivalencia de nomenclatura).
González-Losa y colaboradores en 2004, analizaron 104 LSIL, 67 HSIL y 15 carcinomas invasores. Del total de las muestras analizadas el 56.4% fue VPH +. Los tipos virales más comunes fueron: VPH 58 (28.5%), VPH 16 (25.7%), VPH 18 (13.3%), VPH 33 (11.4%), VPH 31 (8.5%) (45). (Ver tabla 1: equivalencia de nomenclatura).
La infección por VPH es sin duda el factor más importante en el desarrollo de cáncer cervical, la mayoría de las lesiones NIC II y III y virtualmente todos los carcinomas de cérvix poseen VPH.
En aproximadamente el 99.7% de los carcinomas cervicales se ha encontrado genoma viral, particularmente VPH 16 (3,18).
En la mayoría de los carcinomas cervicales los VPH oncogénicos se encuentran integrados en el genoma de la célula infectada, mientras que en los estados preinvasivos VPH está presente predominantemente en forma episomal (18).
I.3.7. Células blanco de VPH
Los Papilomavirus infectan queratinocitos de las capas basales del epitelio estratificado, en diferentes sitios anatómicos, por ejemplo: piel, mucosas, conjuntivas, cavidad oral, laringe, árbol traqueo bronquial, esófago, vejiga, ano y tracto genital (33). Su ciclo replicativo está estrechamente relacionado con la diferenciación de la célula infectada. VPH puede generar estados productivos y no productivos (6).
Los viriones penetran a través del epitelio por microabrasiones o a través de un epitelio inmaduro e infectan a los queratinocitos basales. En estas células el virus se replica usando la maquinaria de la célula (1). El receptor específico no ha sido identificado, pero hay evidencias que sugieren que la familia de α6 integrina y glicosaminoglicanos (GAG) como el heparán sulfato podrían cumplir con esta función (5,57).
VPH tiene la capacidad de inmortalizar e inhibir la diferenciación de los queratinocitos humanos. Los virus productores de tumores a menudo inducen transformación al neutralizar a proteínas supresoras de tumores como p53 y/o Rb causando proliferación celular descontrolada, además generan proteínas transformantes que activan vías de estimulación del crecimiento, un mecanismo llamado “transformación virocrina” (19).
I.3.8. Ciclo replicativo de VPH
Después de que VPH alcanza su célula blanco (queratinocito basal), empieza a replicar su DNA en forma episomal (usando la maquinaria de la célula), en este proceso están implicadas dos proteínas virales: E1 y E2. La expresión de proteínas virales E6 y E7 (no estructurales) retrasan o bloquean el arresto del ciclo celular así como la diferenciación. El bloqueo del arresto del ciclo celular promueve la replicación episomal del virus, generando proliferaciones benignas como las verrugas o los condilomas. Posteriormente son sintetizadas las proteínas estructurales L1 y L2 las cuales permiten el ensamble de los viriones en el núcleo de la célula, para ser liberados del epitelio (1). Los tipos virales llamados de bajo riesgo están asociados con este tipo de replicación, sin embargo en la infección por tipos virales de alto riesgo, generalmente el DNA del virus es integrado en el DNA de la célula infectada (18). Esta integración rompe el marco de lectura del gen viral E2 cuyo producto proteico regula la expresión de las oncoproteínas E6 y E7. Al perderse E2, los niveles de expresión de E6 y E7 aumentan, induciendo la proliferación descontrolada de las células infectadas (9).
La integración del DNA de VPH en la célula es indicador de un mal pronóstico para las pacientes (10).
La progresión de epitelio normal a epitelio cervical maligno durante una infección por VPH se caracteriza por el desarrollo de inestabilidad genómica la cual se evidencia por el número anormal de cromosomas: aneuploidia (7).
Desde el punto de vista clínico, VPH puede generar tres tipos de infección:
* Infección clínica.- la infección se evidencia a simple vista (condiloma exofítico)
* Infección subclínica.- la infección es evidenciada a través del colposcopio * Infección latente.- la infección es detectada sólo por técnicas moleculares
Las observaciones de varios estudios hacen evidente que después de la infección por VPH muchos individuos no desarrollan signos o síntomas pero guardan el virus por periodos variables, algunas lesiones revierten espontáneamente pero un pequeño porcentaje progresa a una lesión intraepitelial de alto grado (NIC II, NIC III Y Ca. Invasor). Se estima que se requieren de 4-5 años para la transición de NIC I a NIC III, de 9-10 años para la progresión de NIC III a cáncer invasor.
La tasa de progresión varía ampliamente, la formación de un tumor no es una consecuencia inevitable de la infección por VPH, más bien refleja que el proceso de oncogénesis se desarrolla
en múltiples pasos, donde cada paso constituye un cambio genético independiente que contribuye a la desregulación, crecimiento y sobrevivencia celular. La infección por VPH representa uno de estos pasos y sólo si otros pasos ocurren en la misma célula, se puede generar el cáncer (3,8,18,21).
I.4. Factores deregresión o progresión de las lesiones premalignas del Cáncer Cervical
Un gran porcentaje de las lesiones intraepiteliales de bajo grado (NIC I) regresan espontáneamente y sólo algunas lesiones persisten o progresan a lesiones intraepiteliales de alto grado (NIC II, NIC III y carcinomas). Se estima que alrededor del 10-20% de las lesiones NIC II y III eventualmente progresan a cáncer invasor. Las lesiones NIC II y III generalmente son removidas por cirugía para evitar su progresión a cáncer cervical cuando son detectadas a tiempo (18).
Existen cofactores que favorecen la progresión o la regresión de las lesiones premalignas, entre estos están:
* Virales: genotipos, variantes virales, integración y la carga viral
* Ambientales: edad, tabaco, anticonceptivos y la paridad
* Genéticos: susceptibilidad genética y la respuesta inmune.
I.5. RESPUESTA INMUNE CONTRA CELULAS INFECTADAS POR VIRUS Y CELULAS TUMORALES
Sin duda, la actividad inmunológica más importante contra células infectadas por virus y células tumorales está dada por la respuesta inmune celular. Aunque existen ejemplos de antígenos de superficie reconocidos por anticuerpos, estos tienen una mayor importancia en la detección y tipificación de los tumores más que en el aspecto terapéutico.
Los linfocitos T CD4+ Th1 y CD8+ son el principal componente de la respuesta inmune mediada por células. Las células CD4+ Th1 activadas producen citocinas como IFN-γ e IL-2.
IFN-γ actúa directamente para eliminar el virus al inducir un estado antiviral en la célula mientras que IL-2 actúa directamente asistiendo la activación de LT CD8+ en células efectoras.
Ambas citocinas IFN-γ e IL-2 activan a las células NK, las cuales son importantes en los primeros días de infección mientras se desarrolla una respuesta inmune específica de LT CD8
(5). La regresión de una lesión premaligna se caracteriza por el infiltrado de macrófagos, células NK y linfocitos T (30).
I.5.1. Células Dendríticas: Células profesionales presentadoras de Antígenos
La inducción de una respuesta mediada por linfocitos T requiere de una presentación antigénica en un contexto celular especial dado por las células presentadoras de antígenos (APC). Estas son células especializadas que pueden iniciar una respuesta inmune primaria y entre ellas se incluyen a los macrófagos, a los linfocitos B y a las células dendríticas (CD). Las CD también llamadas APC profesionales, se encuentran estratégicamente localizadas en los sitios de concentración antigénica y son las más eficientes en la inducción de una respuesta primaria antitumoral de Linfocitos T ya que poseen la capacidad de capturar antígenos tumorales y presentarlos asociados a las moléculas MHC I y II. Además expresan gran cantidad de moléculas coestimuladoras, las que proveen señales cruciales que garantizan la efectividad de la respuesta mediada por linfocitos T (20).
I.5.2. Linfocitos T
Las células T CD4+ reconocen péptidos antigénicos sobre complejos MHC II los cuales son expresados sobre la superficie de células como linfocitos B, macrófagos y células dendríticas exclusivamente. Los antígenos presentados sobre MHC II son de origen extracelular, los cuales son endocitados por vesículas en las células APC.
Los linfocitos T CD8+ o citotóxicos reconocen péptidos de 8-10 aminoácidos, los cuales son presentados sobre la superficie de las células infectadas o transformadas en el contexto MHC I.
Estos péptidos son generados de proteínas virales que son generadas por una compleja vía de degradación intracelular, este proceso de degradación involucra varios componentes del proteosoma y complejos TAP (3). La expresión ubicua de los complejos MHC I, permite la eliminación de cualquier célula infectada o neoplásica (2) (Fig. 5).
Célula infectada por virus
Perforinas, TNF, FasL
Fig.5. Respuesta Inmune Celular contra células infectadas por virus. Los linfocitos T CD4+ Th1 y CD8+
son el principal componente de la respuesta inmune mediada por células.
I.5.3. ACTIVACION DE LOS LINFOCITOS T
Una característica de los linfocitos T, es que requieren de dos señales diferentes (extracelulares) para iniciar su prolieración y diferenciación en células efectoras, la primera señal es provista por el reconocimiento del complejo MHC-péptido sobre las APC y el receptor del linfocito T, dicha interacción es responsable de asegurar la especificidad de la respuesta inmune. El reconocimiento del antígeno inicia una secuencia de señales bioquímicas en los linfocitos T que resulta en la activación transcripcional de genes particulares así como la entrada del linfocito T en el ciclo celular. La segunda señal es provista por el reconocimiento de moléculas coestimuladoras. Estas moléculas son esenciales en la comunicación de la célula T con virtualmente todas las otras células del organismo (20,29,42) (Fig.6). Las moléculas coestimuladoras son los primeros elementos de respuesta del sistema inmune frente a los antígenos, una característica de estas moléculas es que sus funciones dependen completamente de la señalización realizada por el TCR del linfocito T. En ausencia de ésta señal la célula T que
encuentra el antígeno falla para responder y muere por apoptosis o entra en estado de anergia (24).
Apoptosis Apoptosis Anergía Anergía
Proliferación Proliferación Diferenciación Diferenciación Función efectora Función efectora
Arresto en el ciclo celular Arresto en el ciclo celular
Fig.6. Modelo de activación de los linfocitos T. Una característica de los linfocitos T, es que requieren de dos señales diferentes para iniciar su prolieración y diferenciación en células efectoras, la primera señal es provista por el reconocimiento del complejo MHC-péptido sobre las APC y el receptor del linfocito T. La segunda señal es provista por el reconocimiento de moléculas coestimuladoras, las cuales son esenciales en la comunicación de la célula T con virtualmente todas las otras células del organismo.
La moléculas coestimuladoras mejor caracterizadas son un par de glicoproteínas: CD80 (B7-1) y CD86 (B7-2) que son expresadas sobre las APC (24). Estas moléculas coestimuladoras son reconocidas por receptores específicos sobre los linfocitos T (17,24).
I.5.4. Estructura de las moléculas coestimuladoras: CD80 y CD86
Los genes que codifican para CD80 y CD86 se encuentran en el cromosoma 3, en estrecha vecindad (Fig.7). Las moléculas CD80 y CD86 poseen una región extracelular con dos dominios tipo I, homólogos al dominio variable y constante de las inmunoglobulinas, una proporción transmembranal y una cola citoplasmática corta. CD80 y CD86 comparten sólo el 25% de homología en su secuencia. Dicha homología se localiza principalmente en la cola citoplasmática, donde CD86 tiene tres dominios potenciales de fosforilación por la PKC (Fig.8).
5´ 3´
Fig. 7. Estructura del gen que codifica para la proteína CD86. Este gen consta de 8 exones: en el 1 y 2 se localiza la región 5’ no traducida, el 3 codifica para el péptido señal, el 4 y 5 codifica para los dominios tipo V y C, el 6 codifica para la región transmembranal y el 7 y 8 codifican para el dominio citoplasmático.
CD80 y CD86 se expresan de manera constitutiva y abundante en células presentadoras de antígenos activadas, como linfocitos B, células dendríticas, células de Langerhans, monocitos activados y linfocitos T (18).
Fig. 8. Estructura de las moléculas coestimuladoras CD80 y CD86. Las moléculas CD80 y CD86 poseen una región extracelular con dos dominios tipo I, homólogos al dominio V y C de las inmunoglobulinas, una proporción transmembranal y una cola citoplasmática corta.
CD80 y CD86 son moléculas inducibles por productos microbianos como endotóxinas, por citocinas como IFN-γ y por la unión de CD40L (linfocito T) a CD40 (APC). La interacción receptor-ligando esta mediada predominantemente por residuos en el dominio IgV, aunque también el dominio IgC parece estar involucrado (29). La expresión de ambos receptores y ligandos es finamente regulada, permitiendo diferenciar entre señales que activan o inhiben una
1 2 2 3 4 5 6 7 8
5’ no traducida
péptido dominio dominio región dominio
transmem-
señal tipo V tipo C citoplasmático
branal
respuesta inmune (36). CD80 y CD86 muestran cinéticas funcionales diferentes, CD80 comienza a detectarse a las 24 horas de activación y alcanza niveles máximos a las 48 y 72 horas después de la estimulación, CD86 experimenta una regulación positiva más rápida, detectándose a las 6 horas y llegando a una expresión máxima a las 24 horas. CD86 es la molécula coestimuladora primaria responsable del inicio de las respuestas de las células T.
CD80 parece predominar en las respuestas inflamatorias crónicas, como se ha observado en algunos modelos de enfermedades autoinmunes. La coestimulación de LT CD4+ con CD80 y CD86 incrementa la producción de IL-2 e INF-γ . Sin embargo la coestimulación sólo con CD80 da lugar al incremento en la producción de GM-CSF, mientras la coestimulación con CD86 incrementa la producción de IL-4 y TNF-β (39). Se ha reportado que la expresión in vitro de moléculas CD80 en tumores promueve las funciones efectoras de los linfocitos T CD8+
favoreciendo la eliminación del tumor (35).
En la eficiente activación de los Linfocitos T, el papel que juegan las moléculas coestimuladoras en la iniciación de la respuesta inmune ha sido ilustrado claramente en modelos animales.
Ratones deficientes en CD80 y CD86 tienen importantes alteraciones en sus respuestas inmunes tanto celulares como humorales (36). La vía CD28-CD80/CD86 parece tener implicaciones importantes en enfermedades autoinmunes, en el rechazo a órganos transplantados y en la inmunidad de tumores (29). El argumento de que esta vía es responsable de la coestimulación del linfocito T surgió cuando varias líneas celulares se transfectaron con CD80 y CD86 para activar la coestimulación, la cual pudo ser bloqueada posteriormente de manera específica con anticuerpos anti-CD80 y anti-CD86 o al adicionar uno de sus ligandos naturales: CTLA-4 (29).
El bloqueo de la interacción CD28 y sus ligandos usando anticuerpos neutralizantes anti-CD28 o anti-CD86 induce anergia en las células T (17). Esto tiene implicaciones terapéuticas, ya que el bloqueo de CD28 puede tener efecto supresor, previniendo la inducción de respuestas de LT patógenas en un modelo de enfermedad inmune (36).
Cuando se inyectaron tumores CD80+ y CD80- en un mismo ratón, las células T específicas de tumores preferencialmente eliminaron a los tumores CD80+, cuando se suspendió la inyección de CD80 o de moléculas MHC I, los tumores se desarrollaron nuevamente en aquellos ratones donde los tumores estaban controlados, lo que comprueba el importante papel que juega las moléculas coestimuladoras en la destrucción de células tumorales por los linfocitos T citotóxicos (14).
Ratones “knockout” para CD86 (que tienen eliminado el gen para CD86) no producen anticuerpos del tipo IgG1 e IgG2a y son incapaces de formar centros germinales, pero en ratones
“knockout” para CD80 se producen anticuerpos de manera normal, lo anterior confirma que CD86 participa en el switch de clase de inmunoglobulinas (29).
La identificación de CD80 y CD86, así como de sus respectivos receptores CD28 y CTLA-4 como modelo de moléculas coestimuladoras, ha permitido el acceso a la inmunoterapia de tumores, incluyendo la expresión de moléculas de la familia B7 y el uso de anticuerpos anti- receptor. El entendimiento de la función de los receptores de B7 sobre las células T facilitaría el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas (29).
I.5.5. Receptor de las moléculas coestimuladoras en el linfocito T: CD28
El receptor para CD80/CD86 es la proteína CD28 y se expresa de manera constitutiva sobre los linfocitos T (en más del 90% de las células CD4+ y en aproximadamente el 50% de las células CD8+ (39).
CD28 es una glicoproteína (44 kDa) que posee 5 sitios potenciales de glicosilación. El dominio extracelular muestra 31% de homología con el receptor CTLA-4 y ambas moléculas están codificadas en el cromosoma 2 (2q33 y 2q34 respectivamente). CD28 posee una región muy conservada: Met-Tyr-Pro-Pro-Pro-Tyr (MYPPPY) y es a través de este sitio que interactúa con CD80 y CD86, esta región es prácticamente idéntica en humanos, ratones, ratas y pollos, lo que evidencia su importancia en la unión del ligando y consecuentemente en la transducción de señales (29).
La interacción CD80/CD86-CD28 libera señales en los linfocitos que inducen la expresión de factores de crecimiento con acción autocrina y paracrina. Se incrementa la producción de las citocinas: IL-2rα, IL-2rβ, IL-2rγ, IL-2, IL-4, IL-5, IL-13, IL-8, CD40L, IFN-γ, TNF-α,GM-CSF y RANTES, se estimula la proliferación, diferenciación y supervivencia de linfocitos T al incrementarse la expresión de la proteína anti-apoptótica Bcl-xL. Disminuye el umbral de respuesta de los linfocitos T, requiriéndose un número menor de TCRs que deben ser estimulados para obtener una activación completa (17,29).
Ratones deficientes de CD28 tienen mayor producción de citocinas Th1 y menor producción de citocinas Th2 en un modelo de diabetes-autoinmune. Estos resultados evidencian la importancia de la señalización dependiente de CD28 para la adecuada polarización hacia una respuesta Th2 a partir de linfocitos T naive diabetogénicos en etapas tempranas de la enfermedad (29).
King y colaboradores usaron un modelo de equistosomiasis que mostró que ratones deficientes de la molécula CD28 muestran una respuesta Th2 disminuida contra huevos de Schistosoma, ya que se encontraron bajos niveles de IL-4 e IL-5 (29).
Brown y colaboradores encontraron que en ratones deficientes de CD28, existen niveles normales de IFN-γ, pero niveles muy bajos de IL-4 en un modelo in vitro de Leishmania (29).
I.5.6. Receptor Inhibitorio CTLA-4
Es el segundo receptor para CD80 y CD86 es una proteína de 198 aminoácidos, miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas que muestra homología con CD28. CD28 y CTLA-4 parecen haber surgido por duplicación de genes. CTLA-4 se expresa sobre la superficie de los linfocitos T como un homodímero y sólo presenta un solo sitio de glicosilación. Esta molécula está muy conservada en diferentes especies lo que evidencia su importante función en la transducción de señales (29).
El dominio citoplasmático tiene un solo sitio de fosforilación para la PI-3 cinasa. Ratones
“Knockout” para CTLA-4 exhiben enfermedad proliferativa, en la que hay marcada infiltración linfocítica en muchos órganos lo que confirma el efecto regulatorio en la proliferación de los linfocitos T. CD80 y CD86 se unen a CTLA-4 con 20-100 veces más afinidad que con CD28 (29).
Recientemente en el laboratorio de Abul Abbas fue sugerido que la inducción de anergia en células T puede no deberse a la falta de interacción CD28-CD80/CD86 sino más bien a la interacción preferente de CD80/CD86 con CTLA-4. El bloqueo de esta interacción evita la inducción de anergia en linfocitos T, la interacción CTLA-4-CD80/CD86 disminuye la respuesta del linfocito al inducir anergia o bien al dar por terminado el proceso de activación del linfocito T (29).
I.5.7. CD80 y CD86 en la diferenciación de los linfocitos T
Estas moléculas parecen estar involucradas en la polarización de la respuesta inmune hacia un perfil Th1 o Th2. El primero se caracteriza por la producción de IL-2, TNF-β e IFN-γ y es justamente el perfil relacionado con enfermedades autoinmunes como la artritis. Por otro lado los linfocitos T Th2 producen IL-4, IL-5 e IL-10 que estimulan a los mastocitos y eosinófilos así como la producción de anticuerpos del tipo IgG1 e IgE. Recientes estudios reportan que CD86 es una molécula coestimuladora preferente de una respuesta Th2, mientras que CD80 se relaciona con una respuesta tipo Th1 (29).
I.5.8. Anergía en el Linfocito T
Una característica de los linfocitos T es que requieren de dos señales diferentes (extracelulares) para iniciar su proliferación y diferenciación en células efectoras, la primera señal es provista por la interacción del complejo MHC-péptido sobre las APC con el receptor del linfocito T, dicha interacción es responsable de asegurar la especificidad de la respuesta inmune. La segunda señal de activación es provista por moléculas coestimuladoras. Si por alguna razón esta segunda señal no se genera, el linfocito entra en un estado de no respuesta hacia ese antígeno en encuentros posteriores. A este estado de no respuesta se le denomina “ANERGIA” (29).
El fenómeno de anergia ha sido posible reproducirlo in vitro en clonas de linfocitos T Th1 murinos y en clonas de linfocitos T CD4+ y CD8+ tanto humanos como murinos (29). Una de las características de las células anergicas es que no pueden iniciar la transcripción del RNAm de IL-2. Este gen se encuentra bajo el control de un promotor y un enhancer en el extremo 5´, ambos poseen sitios de unión para el factor de transcripción AP1 (29). Cuando las células anérgicas son reestimuladas con el heterodímero c-fos/c-jun, la expresión del gen IL-2 se induce muy lentamente, lo que sugiere la existencia de una molécula represora. La anergia puede ser prevenida usando IL-2, IL-4, IL-7, lo que no sucede al usar IL-6, IL-10, IL12, IFN-γ o TNF-α (29).
La coestimulación de CD28 puede prevenir la anergia pero no parece ser capaz de revertirla. Un linfocito T que experimenta anergia ya no responde a moléculas coestimuladoras incluyendo CD80 y CD86, ICAM-1, CD24, CD40, CD72 o LFA, ni al adicionar IL-2 (29).
I.5.9. Inmunidad a tumores
La respuesta inmune hacia células tumorales está dada principalmente por los linfocitos T CD8+, estas células reconocen péptidos cuando son expresados sobre el complejo MHC clase I, cumpliendo así con su función de vigilancia, identificando y eliminando antígenos extraños (29).
Muchos tumores son infiltrados por linfocitos T (TIL) los cuales pueden ser colectados de un paciente, cultivarse y posteriormente reintroducirse en el mismo paciente donde inducen la regresión de tumores autólogos (29).
Cuando el concepto de coestimulación fue aplicado a la inmunología del tumor, se estableció una posible explicación de porque las células tumorales se hacen invisibles al sistema inmune; si las células tumorales presentan antígenos a los linfocitos T, pero la célula tumoral no expresa moléculas coestimuladoras al linfocito T, se libera la primera señal pero al no generarse la segunda señal de coestimulación el linfocito T entra en anergia (29).
La mayoría de las células tumorales tienen baja inmonogenicidad, incluso algunas carecen de moléculas coestimuladoras. Es por esto que se están buscando nuevas estrategias para lograr que las células tumorales expresen más moléculas coestimuladoras con el objetivo de hacerlas mejores células presentadoras de antígenos, así se generarían respuestas de linfocitos T más eficientes para eliminar a las células tumorales (29).
Se han realizado numerosos estudios donde se transfectan moléculas CD80 y CD86 en diferentes líneas celulares para probar esta hipótesis, obteniéndose diferentes resultados (29).
Chet y colaboradores encontraron que células de melanoma E7C3 transfectadas con CD80 e implantadas en ratones singénicos indujeron la regresión de tumores “wild-type” implantados en sitios distantes en un mismo animal. Sin embargo esta misma estrategia falló en la línea celular K1375. Otros experimentos resultaron en la completa regresión del tumor con la generación de Linfocitos T citotóxicos, en otros se obtuvieron respuestas de LTC in vitro pero no in vivo, mientras que otros investigadores no observaron regresión del tumor en ningún experimento (29).
I.5.10. IFN, una citocina importante en la respuesta inmune contra células infectadas por virus
La producción de IFN tipo I es estimulada en el inicio de infecciones virales y juega un papel importante sobre el desarrollo de la enfermedad. IFN puede actuar directamente sobre la célula infectada al interferir con la replicación viral y al bloquear la proliferación de la célula. IFN bloquea la infección a nivel de adsorción y penetración del virus, reduce la estabilidad de mensajeros y la producción de proteínas (17). IFN estimula la expresión de moléculas MHC I que contribuyen a la lisis de las células infectadas, además IFN puede activar a las células NK (21).
I.6. Mecanismos de evasión de la respuesta inmune desarrollados por el Virus del Papiloma Humano
El Virus del Papiloma Humano ha desarrollado diferentes mecanismos para evadir la respuesta inmune del hospedero. Sus oncoproteínas alteran diferentes vías de señalización celulares para permitir la replicación viral y evadir los sistemas de vigilancia, garantizando su permanencia en la célula (1).
La falla de la respuesta inmune contra VPH puede contribuir a la carcinogénesis, como se demostró por la alta prevalencia de lesiones inducidas por VPH en pacientes cuya respuesta inmune celular esta alterada (13).
VPH es un virus no lítico, sólo permisivo para replicación en los queratinocitos basales, por lo tanto la activación de una respuesta inmune adaptativa hacia VPH depende de la presentación de antígenos virales por células APC residentes del epitelio (37).
Las células de Langerhans (CL) son muy importantes para la iniciación de una respuesta inmune celular contra antígenos virales, son las APC primarias en la epidermis y estas células son mantenidas y retenidas en el epitelio con una vida media de alrededor de 9 días. En la respuesta inicial a una infección viral, las CL se movilizan y migran a los nódulos linfáticos. 5 días después de la infección el número de CL se recupera e incluso se incrementa por arriba de los niveles normales (37).
Existe un incremento en la susceptibilidad a la enfermedad cuando estas células están reducidas en número o cuando están ausentes. Por ejemplo existe una correlación inversa entre la densidad de CL en el sitio de infección y la severidad de infección por HSV. Esto también ha sido observado en individuos infectados por VIH (37).
La persistencia de la infección por VPH podría explicarse por la función alterada y/o disminución en el número de las CL. Además de la falta de expresión del potente activador de las CL, el TNF, que ha sido encontrado disminuido en algunas lesiones NIC. Recientemente se sugirió que la sobre-expresión de la proteína E7 puede inhibir la función de las células dendríticas al interferir con su diferenciación. Anteriormente se investigó la relación de la densidad de CL en la epidermis y dermis de 10 pacientes con carcinoma que se compararon con 4 muestras de piel de pacientes sanos, encontrándose una disminución significativa en el número de CL en los pacientes con carcinomas (5).
VPH tiene la capacidad de alterar la expresión de moléculas de adhesión como la cadheria E o la secreción de citocinas y quimiocinas que son esenciales para la retención y migración de las CL (37).
Varios estudios han demostrado una disminución de CL en displasias cervicales. Kate Matthews y colaboradores demostraron que en queratinocitos infectados por VPH, el número de CL esta disminuido como resultado de la infección viral (37). Esta disminución puede tener como finalidad, favorecer la persistencia del virus al limitar la presentación de antígenos virales al sistema inmune. En estos ensayos se observó una clara disminución en las CL de la epidermis infectada con VPH-16 (37). Se encontró que la cadherina E está reducida o no está presente en la superficie de los queratinocitos infectados por VPH. La proteína viral que parece
estar involucrada en la regulación de la expresión de la cadherina E es la proteína E6 de VPH.
Esta proteína interfiere con la expresión de la cadherina E reduciendo la retención de CL en el sitio de infección, disminuyendo así las posibilidades de que las células procesen los antígenos virales (37).
En verrugas genitales se ha observado una disminución notable del número de células de Langerhans, con la consiguiente disminución de la capacidad de presentación antigénica.
También se ha constatado una importante disminución en la actividad de las células NK, las cuales tienen funciones de inmunidad inespecífica, en lesiones premalignas y malignas.
Las proteínas E6 y E7 bloquean la respuesta de las células infectadas hacia interferones tipo I.
Suyang Li y colaboradores demostraron que la proteína E6 de HPV-18 tiene la capacidad de unirse a una cinasa de tirosina citoplasmática de la familia Janus: la Tyk2, impidiendo que se autofosforile y por lo tanto se vuelve incapaz de fosforilar al receptor de IFN-α, quedando así bloqueada la transducción de señales estimuladas por IFN. En estas investigaciones también se evalúo si la proteína E6 de HPV-11 tiene la habilidad de bloquear esta misma señalización pero se observó que E6 de HPV-11 interacciona con Tyk2 de manera muy débil, por lo que no fue capaz de bloquear las función de Tyk2 y la señalización estimulada por IFN no se vio afectada (33). También está reportada la disminución en la transcripción del gen de IFN-γ de manera significativa en lesiones intraepiteliales así como en carcinomas cervicales, VPH interacciona con el factor IRF-3, el cual funge como factor de transcripción estimulando la expresión del gen de IFN-γ. VPH al interaccionar con IRF-3 impide que realice sus funciones de manera adecuada por lo que la tasa de transcripción del gen de IFN-γ se ve disminuida (3).
La pérdida de expresión de MHC I se ha observado frecuentemente en células malignas de diferentes orígenes así como en células transformadas por virus, ésta pérdida permite a las células escapar de la muerte mediada por los linfocitos T citotóxicos lo que incrementa su potencial oncogénico. Alteraciones en el proceso de presentación de antígenos en células infectadas por VPH pueden favorecer la progresión de lesiones premalignas a cáncer cervical.
En carcinomas cervicales así como en lesiones intrepiteliales de bajo y alto grado se ha encontrado disminución de la expresión de moléculas MHC I (12).
La disminución de la expresión de MHC I está relacionada con la inhibición transcripcional de los genes que codifican para las cadenas pesada y ligera. En todas las células infectadas por virus, mecanismos adicionales post-transcripcionales pueden ocasionar la retención de los
