UNIVERSIDAD PABLO DE OLAVIDE DE SEVILLA TRABAJO DE FIN DE MÁSTER

UNIVERSIDAD PABLO DE OLAVIDE DE SEVILLA

MÁSTER DE BIOTECNOLOGÍA AMBIENTAL, INDUSTRIAL Y ALIMENTARIA

TRABAJO DE FIN DE MÁSTER

“Papel del regulador transcripcional Tex bajo condiciones de estrés en Lactococcus lactis”

NOHEMY ELVIRA REGALES PEREZ

Julio, 2018

AGRADECIMIENTOS

Quisiera agradecer a todas aquellas personas que de una forma u otra han aportado algo y han he- cho posible la realización de este trabajo.

En primer lugar, me gustaría agradecer a la Dra. Belén Floriano Pardal y a la Dra. Ana Rodríguez González, la oportunidad brindada, ya que sin ellas nada de esto habría sido posible. Muchas gracias

por sus aportaciones, ayuda, paciencia (sobre todo a Belén), dedicación y por transmitirme el senti- miento de siempre hacer las cosas lo mejor posible.

En segundo lugar, pero no menos importante, agradezco enormemente a la Dra. Beatriz Martínez Fernández. Gracias por confiar en mí, por darme la oportunidad de aprender de ella, por la paciencia

y por no cansarse de mis millones de preguntas. Gracias por la dedicación, las correcciones y por siempre mantener la chispa de la curiosidad encendida.

También, quiero agradecer a todas las compañeras del “grupo AR”, por sus aportaciones, charlas y cafés compartidos. Gracias a AnaB, por transmitirme la importancia de los pequeños detalles, y a Ro

y DianaTec, por la bala dorada y los viajes de buena mañana.

Agradezco al resto del equipo que conforma el IPLA, por generar un ambiente de trabajo agradable y colaborar y ayudar siempre que fuera posible.

A mi familia. A mi padre por su certeza y confianza en mí, a mi hermano por su paciencia, sus ganas de hacerme sonreír y su apoyo. A mi madre por su fe ciega desde que puedo recordar, por ser el pilar

que nunca tiembla y por confiar que después de mi nació todo. A mi abuelo, que siempre soñó con que tuviera una carrera.

A mis amigos, que estando lejos o cerca, siempre me han apoyado, entendido y compartido conmigo muchos momentos buenos y duros también. Gracias por estar ahí a pesar de los kilómetros.

A Vanesa, Tamara y Mari, por ser mi familia fuera de casa y por las horas, las lecciones de vida, las charlas y los tés en el salón.

A mis compañeros de máster, de los cuales he aprendido mucho y con los que también he reído mu- chísimo. Especialmente, a Sergio, por su ayuda incondicional, exigencia y las ganas de enseñar a los

demás.

Por todos los aviones, las maletas, las llamadas, el tiempo, la comprensión, la confianza y apoyo firme. A Miguel.

Muchas gracias a todos por la ayuda, tiempo y dedicación.

ÍNDICE

RESUMEN --- 1

ABSTRACT --- 2

1.INTRODUCCIÓN --- 3

2.MATERIAL Y MÉTODOS --- 6

2.1 MICROORGANISMOS, PLÁSMIDOS, OLIGONUCLEÓTIDOS Y CONDICIONES DEL MEDIO DE CULTIVO --- 6

2.2 CONSTRUCCIÓN DE MUTANTES DE SOBREEXPRESIÓN DE tex y tex::6His --- 7

2.2.1 CONSTRUCCIÓN DE MUTANTE DE SOBREEXPRESIÓN DE tex::6His --- 9

2.3 CONSTRUCCIÓN DE MUTANTES CARENTES DE tex --- 10

2.4 CURVAS DE CRECIMIENTO DE MUTANTES DE SOBREEPRESIÓN DE tex --- 11

2.5 ESTUDIO DEL FENOTIPO DE MUTANTES DE SOBREEPRESIÓN DE tex FRENTE A NACL, OXACILINA, PUROMICINA Y LCN972 --- 12

2.6 RT-PCR CUANTITATIVA --- 12

2.7 SDS-PAGE --- 13

2.8 MICROSCOPÍA ÓPTICA--- 14

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN --- 15

3.1 ESTUDIO IN SILICO DE tex --- 15

3.2 INDUCCIÓN DE LAEXPRESIÓN DE tex EN CONDICIONES DE ESTRES --- 19

3.3 CONSTRUCCIÓN DE MUTANTES DE tex ---22

3.3.1 ESTUDIO EN MUTANTE CARENTE DE tex ---22

3.3.2 ESTUDIO EN MUTANTE DE SOBREEXPRESIÓN DE tex ---22

3.3.2.1 ANÁLISIS DE LOS EFECTOS DE LA SOBREEXPRESIÓN ---23

3.3.2.2 ANÁLISIS FENOTÍPICO DE MUTANTES DE SOBREEXPRESIÓN ---25

3.4 SÍNTESIS DE PROTEÍNA DE FUSIÓN TEX::6His ---30

4. CONCLUSIONES ---32

5. BIBLIOGRAFÍA --- 33

1 RESUMEN

Lactococcus lactis es una especie bacteriana ampliamente utilizada en la industria quesera y sobre la cual se han realizado estudios de su respuesta a condiciones de estrés, como a la presencia de la bacteriocina lactococina 972 (Lcn972). En su respuesta, se activa el sistema CesSR que controla un regulón de múltiples genes, entre los que se encuentra ftsH, que codifica para una proteasa de membrana. Estudios anteriores sobre L. lactis ftsH y L. lactis

∆ftsH, demuestran que en la cepa mutante aumentan los niveles de determinadas proteínas como Tex, un regulador transcripcional del que se desconoce su función en L. lactis. También, basado en estudios previos, se conoce que L. lactis ∆ftsH cuenta con determinados fenotipos como resistencia a lisozima y sensibilidad a NaCl. En este trabajo, debido al escaso conocimiento en L. lactis, se ha estudio el papel del regulador transcripcional Tex en la respuesta estrés para dicha bacteria. La sobreexpresión de tex parece tener un efecto tóxico para la bacteria, mientras que para caracterizar los efectos de su ausencia se necesitan estudios posteriores. Se ha demostrado que el alto nivel de Tex en el mutante ΔftsH no es la causa de los fenotipos observados en el mismo. Además, la inducción del gen tex no depende de las condiciones de estrés. Parece, por tanto, que Tex no está involucrado en los fenotipos, su mayor expresión es independiente de las condiciones de estrés y no se descarta una posible relación con FtsH, como sustrato de esta proteasa.

2 ABSTRACT

Lactococcus lactis is one of the most used microorganism related to the food industry, being the main component of the starters used in cheese making. Some subspecies produced antimicrobians as lactococin 972 (Lcn972), generating cell envelope stress that consequently activates a cell stress response from L. lactis. The two-component system CesSR orchestrates the response upregulating various genes such as ftsH, that encodes a membrane protease involved in protein stability. Based on previous knowledge, it has been shown an increase the level of some proteins in L. lactis ∆ftsH, Tex among them. Tex is a transcriptional regulator of unknown function in L. lactis. In addition, L. lactis ∆ftsH presents some distinct phenotypes such as lysozyme resistance and NaCl sensitivity. In this work, the role of Tex in the cell stress response in L. lactis has been investigated. Overexpression of tex gene seems to have a deleterious effect whereas the characterization of a deletion mutant need further studies.

Tex is not responsible of the ∆ftsH phenotypes. Moreover, induction of tex does not seem to be related to the stress conditions. Therefore, Tex seems not be related to the ΔftsH, it is expressed independently of the stress conditions and a role as substrate of FtsH cannot be ruled out.

3 1.INTRODUCCIÓN

La fermentación representa uno de los procesos más antiguos de procesado de los alimentos, transformando material crudo en el producto final deseado, gracias a la acción de los microorganismos. Mayoritariamente las biotransformaciones han sido llevadas a cabo por Saccharomyces cerevisiae, responsable de la fermentación etanólica, y por un amplio grupo de bacterias acido lácticas (BAL), responsables de la fermentación láctica. Debido a las cualidades de las BAL y su relación con la fermentación de alimentos, conforman uno de los primeros grupos bacterianos en ser estudiados entre los microorganismos (Papadimitriou et al., 2015; Papadimitriou et al., 2016). Las BAL son organismos importantes a nivel industrial debido a su relación con la producción de alimentos fermentados utilizando materiales crudos tales como leche, carne, vegetales y cereales (Doyle et al., 2016). Además, algunas BAL se utilizan como productores de enzimas aromatizantes, de péptidos con propiedades antimicrobianas o metabolitos que contribuyen al sabor, la textura y conservación de los alimentos (de Vos, 1999).

Las bacterias acido lácticas (BAL), desde un punto filogenético, son bacterias Gram positivas aerotolerantes que producen ácido láctico como el producto principal de la fermentación de azúcares. Los géneros más comunes de BAL relacionados con los alimentos son Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus, Pediococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Tetragenococcus, Carnobacterium y Weissella (Papadimitriou et al., 2016). Una de las especies más utilizadas de este grupo es Lactococcus lactis, una bacteria homofermentativa utilizada principalmente para la fermentación de la leche, generando productos tales como leches fermentadas, mantequillas y diversas variedades de quesos blandos y duros (Mierau & Kleerebezem, 2005). Asimismo, aparte de ser ampliamente utilizada para la fermentación en lácteos, sirve como un organismo modelo de estudios fisiológicos de las BAL.

Aparte de su participación en la fermentación, es sabido que las BAL son capaces de producir determinados compuestos de carácter antimicrobiano dentro de los que se encuentran las bacteriocinas (Nes et al., 1996). Las bacteriocinas son péptidos antimicrobianos heterogéneos, que a bajas concentraciones presentan inhibición microbiológica efectiva (Beshkova, 2012). Dicha característica ha hecho que la industria alimentaria se interese por su aplicación en la conservación de los alimentos. La mayoría de los estudios se centran en bacteriocinas producidas por BAL. En general, estas bacteriocinas

4 producidas mayoritariamente por lactococos, lactobacilos, pediococos, son seguras para el consumo humano, no presentan un efecto tóxico para las células eucarióticas y además presentan un espectro de inhibición más amplio respecto a las sintetizadas por bacterias Gram negativas (Beristain-Bauza et al., 2012). La producción de bacteriocinas ocurre de forma natural durante la fase exponencial del crecimiento bacteriano, donde son secretadas al medio extracelular, y tienen una alta actividad bactericida o bacteriostática sobre cepas relacionadas y sobre microorganismos patógenos y deteriorantes de alimentos (Cotter et al., 2005). Dentro de las bacteriocinas encontramos varios ejemplos tales como la nisina, ampliamente utilizada como conservante alimentario (Cleveland et al., 2001). Debido al incremento en el desarrollo de resistencias a antibióticos existe un creciente interés en encontrar otros antimicrobianos con nuevos modos de acción como las bacteriocinas.

Este es el caso de la lactococina 972 (Lcn972) que, al contrario que la mayoría de las bacteriocinas BAL, no forma poros en la membrana plasmática. Lcn972 es un no lantibiótico peptídico producido por Lactococcus lactis IPLA972 (Martínez et al., 1996), que inhibe la síntesis del peptidoglicano a nivel de formación del septo, bloqueando así el proceso de división celular (Martínez et al., 2000). Como respuesta al daño sobre la pared celular provocado por Lcn972, L. lactis activa el regulón CesR (Cell Envelope Stress Regulon) que depende del sistema de dos componentes CesSR (Martínez et al., 2007). Entre los genes que se inducen tras la activación de CesSR, se encuentra el gen ftsH que codifica la proteasa FtsH, por lo que se le presupone un papel en la respuesta de L. lactis al daño sobre la pared celular.

FtsH es una proteína integral de membrana (Tomoyasu et al., 1993; Nilsson et al., 1994) que pertenece a la familia de proteasas de las AAA+ (Bittner et al., 2017), un conjunto de ATPasas que intervienen en diversos procesos celulares tales como la replicación de ADN o la proteólisis (Ogura & Wilkinson, 2001). Las principales funciones de FtsH son controlar los niveles de proteínas aberrantes, degradándolas, y regular la vida media de proteínas generalmente con funciones reguladoras (Ito & Akiyama, 2005). Asimismo, se han descrito diversos sustratos de FtsH en Escherichia coli (algunos ejemplos son LpxC, RpoH, YfgM), lo que demuestra que FtsH está involucrada en una amplia variedad de procesos celulares, tales como la síntesis de la membrana externa, la dirección hacia lisis o lisogenia del fago Lambda y participa en varias respuestas celulares al estrés (Bittner et al., 2017). En el caso concreto de L. lactis, se desconocen por completo los sustratos de FtsH y que función fisiológica desempeña esta proteasa.

5 Al contrario que en E. coli, FtsH no es esencial en L. lactis. Sin embargo, mutantes carentes de la misma, son, en general, más sensibles a diferentes estreses ambientales (Nilsson et al., 1994). Debido a la escasa información respecto a los sustratos de FtsH en L.

lactis, se realizó un estudio comparativo del proteoma de una cepa salvaje, L. lactis fstH, y la cepa mutante, L. lactis ∆ftsH, ambas tratadas con Lcn972 para identificar aquellas proteínas implicadas en la respuesta a Lcn972 que tuviesen una mayor vida media en la cepa mutante L. lactis ∆ftsH. Es decir, una mayor abundancia de una proteína determinada seria indicativo de una síntesis inducida por el estrés y una posible regulación por FtsH. Las proteínas identificadas fueron 3 isoformas de la proteína AdhE (alcohol- acetaldehído deshidrogenasa), implicada en la glicolisis y en el metabolismo del piruvato, una proteína de función desconocida denominada Psp y la proteína Tex con posibles funciones en regulación transcripcional (datos no publicados). Entre estas proteínas, la proteína transcripcional Tex es la que presentó mayor abundancia en los extractos de L. lactis ∆ftsH tratado con Lcn972. Tex es un regulador transcripcional, descubierto en Bordetella pertussis, donde está involucrado en la expresión génica de toxinas (Fuchs et al., 1996). Sin embargo, su función en L. lactis se desconoce. Los datos proteómicos preliminares parecen indicar que Tex podría formar parte de la respuesta al estrés en L. lactis y que FtsH regulase su concentración citoplasmática.

Por otro lado, se ha determinado la sensibilidad de L. lactis y su mutante ∆ftsH frente a determinados compuestos como el cloruro sódico y compuestos líticos. L. lactis ftsH es resistente a NaCl (0,3 M) mientras que L. lactis ∆ftsH es sensible (Nilsson et al., 1994). A su vez, respecto a la Lcn972, L. lactis ∆ftsH es más resistente que la cepa salvaje (datos no publicados). Existe, por tanto, la posibilidad de que estos fenotipos observados en L. lactis

∆ftsH sean resultado de la mayor concentración de Tex en esta cepa.

Por todo, y teniendo en cuenta todo lo anterior expuesto, se plantean las bases de este trabajo, donde se examina el papel del regulador transcripcional Tex en la respuesta a estrés en Lactococcus lactis. Con este propósito, se plantean los objetivos, que se desglosan en: 1) el estudio in silico de la proteína Tex y su contexto genético en L. lactis, 2) comprobar si tex se induce en condiciones de estrés, y, por último, 3) generar mutantes de deleción de tex para conocer su fenotipo.

6 2. MATERIAL Y MÉTODOS

2.1 MICROORGANISMOS, PLÁSMIDOS, OLIGONUCLEÓTIDOS Y CONDICIONES DE CULTIVO

Para realizar este trabajo se han utilizado las cepas, plásmidos y oligonucleótidos siguientes, contenidos en las Tabla 1, Tabla 2 y Tabla 3, respectivamente:

Tabla 1. Cepas utilizadas en este trabajo.

CEPAS OBSERVACIONES REFERENCIAS

Lactococcus lactis NZ9000

L. lactis ∆fstH-ELC

Cepa derivada de MG1363; contiene los genes nisRK para la expresión inducible de genes

Carece del gen ftsH

Kuipers et al., 1998

Roces et al., 2013

Tabla 2. Plásmidos utilizados en este trabajo.

PLÁSMIDOS CARACTERÍSTICAS REFERENCIAS

pNZ8020

pGHost9

pBL95

pBL93

pBL90HP

Vector de expresión inducible con el promotor de nisina (Pnis). Cm^R

Vector de replicación termosensible. Ery^R

pNZ8020 con el gen tex bajo el control de Pnis. Cm^R

pGHost9 conteniendo el gen tex.

Intermediario para interrupción de tex. Ery^R

pNZ8020 con el gen tex::6xHis Cm^R

Kuipers et al., 1998

Maguin &Ge, 1996

Este trabajo

Este trabajo

Este trabajo

7 Tabla 3. Oligonucleótidos utilizados en este trabajo.

El medio de cultivo utilizado para el crecimiento de L. lactis fue M17 (Scharlau, España), suplementado con glucosa (medio GM17) a una concentración final de 0,5%. La temperatura de incubación fue de 32°C sin agitación. El medio sólido para el crecimiento en placa se suplementó con agar al 2%. Además, se añadieron los antibióticos respectivos, para el cual el plásmido utilizado tiene la resistencia, utilizándose así para selección: cloranfenicol (Cm) (10 µg/ml), y eritromicina (Ery) (5 µg/ml).

2.2 CONSTRUCCIÓN DE MUTANTES DE SOBREEXPRESIÓN DE tex y tex::6xHis

El gen tex fue amplificado por PCR utilizando el ADN cromosómico de L. lactis NZ9000, utilizando los oligonucleótidos Tex5S-F y Tex3P-R (Tabla 3) a una concentración final de 10 µM. Ambos oligos incluían el sitio de restricción de SpeI y PstI. Se utilizaron dNTPs a una concentración de 2,5 µM cada uno y 0,25 unidades de enzima Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Thermo Fisher Scientific, España). El programa consistió en una desnaturalización inicial a 98°C durante 30 segundos (s); 35 ciclos de 98°C 10 s, 58°C 30s y 72°C 1 minuto (min) y 30 s; y una extensión final de 7 min. Tras el último ciclo se prosiguió con una incubación a 72°C durante 10 min. El producto de PCR (2211pb) se purificó

OLIGONUCLEÓTIDO SECUENCIA (5’ 3’) OBJETIVO Tex5S

Tex3P

Tex3HP

Texq_F

Texq_R

llmg0169 F

llmg0169 R

Tuf F

Tuf R

ATTGCTGACAAAAAAACTAGTTAAGGA

AACTGCAGTTTCATCTAACGGAACTG

AACTGCAGTTAATGATGATGATGATGA TGATCTTCTTCGCGAGGATTC

ACCAAAGCAACGATTGCTAAGG

ATTTCACCAGTCAGCCATGAAC

TGATAATGTCGCTCCTAATG

CTgaGCTCATGACGCGATG

GGTAGTTGTCGAAGAATGGAGTGTGA

TAAACCAGGTTCAATCACTCCACACA

Amplificación de tex e inserción sitio SpeI

Amplificación de tex e inserción sitio PstI

Amplificación de tex 6XHis; C-terminal fusióne inserción sitio PstI

PCR cuantitativa

PCR cuantitativa

PCR cuantitativa; control positivo

PCR cuantitativa; control positivo

PCR cuantitativa; control interno

PCR cuantitativa; control interno

8 utilizando. GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare, Reino Unido), se digirió con SpeI y PstI y se realizó la ligación con 2 µl vector, 4 µl de inserto, 4 µl T4 DNA Ligase Buffer (Thermo Fisher Scientific, España) y 0,2 µl de T4 DNA ligase (Thermo Fisher Scientific, España).

Se clonó en el vector pNZ8020 (proporción vector: inserto de 1:2), previamente digerido con SpeI y PstI. La construcción resultante se denominó pBL95 (5358pb) (Fig. 1). El vector pBL95 se introdujo en las cepas L. lactis NZ9000 y L. lactis ∆fstH-ELC mediante electroporación (2000 V, 25 µF, 200 Ω) utilizando Gene Pulser Xcell Microbial System (BioRad, España). Los transformantes se seleccionaron en placas de GM17 con cloranfenicol (10 µg/ml) e incubaron a 32°C durante 48h.

Fig. 1. Representación esquemática de la construcción pBL95 (5358 pb). La construcción se obtiene a partir de la ligación entre el plásmido pNZ8020 y el producto de PCR, tex, ambos previamente digeridos por SpeI X PstI y se transforma en L. lactis NZ9000.

Para comprobar que efectivamente las cepas albergan la construcción se siguió un protocolo de extracción del ADN plasmídico basado en el método descrito por O’Sullivan y Klaenhammer (1993), con ciertas variaciones. Se partió de 1,5 ml de cultivo en medio M17 liquido suplementado con glucosa al 20% y cloranfenicol 10 µg/ml de L. lactis NZ9000 y L.

lactis ∆fstH-ELC incubado durante 16 horas. La lisis bacteriana se realizó utilizando 100 µl de la solución A para Lactococcus (Glucosa 50 nM, EDTA 10 mM con un pH de 8, Tris-HCl 25nM con un pH de 8) junto con lisozima (30mg/ml) e incubado a 50°C durante 10 min. Tras la lisis bacteriana, se añadió 200 µl de la solución II (NaOH 0,2 N y SDS 1%) y se mantuvo en hielo durante 5 min. Seguidamente se añadió 150 µl de solución III (acetato sódico 5 M, pH 5,2) y se mantuvo la muestra en hielo 15 min. Tras centrifugar la muestra, se conservó el sobrenadante y se añadió 1ml de etanol 100% frio y se mantuvo la muestra a -20°C durante

9 30 min. Tras centrifugar de nuevo, se lavó el pellet con 1 ml de etanol 70% a temperatura ambiente y se volvió a centrifugar. El pellet recuperado se secó al vacío y se resuspendió en tampón TE (Tris-HCl 10 nM y EDTA 0,1 Mm) más RNAsa (40 µg/ml).

El perfil plasmídico se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8% y tampón 1X TAE (Tris 40 mM, de ácido acético 20 mM y EDTA 1mM) a 100 voltios durante 60 min y se visualizaron utilizando la tinción de bromuro de etidio (5 gotas/ 500 ml agua, 15 min tinción)

2.2.1 CONSTRUCCIÓN DE MUTANTE DE SOBREEXPRESIÓN tex::6XHis

Se crearon cepas mutantes de sobreexpresión de tex fusionado, en su extremo 3’, a 6 codones que codifican una cola de 6 histidinas. El proceso de amplificación del gen tex fue idéntico al descrito anteriormente y se utilizaron los oligonucleótidos Tex5S-F y Tex3HP (Tabla 3). El producto de PCR (2205 pb) siguió los mismos procesos de purificación, digestión y clonación que para los mutantes de sobreexpresión de tex y se obtuvo la construcción pBL90His (pBL90HP) (5333 pb) (Fig.2). Este vector se introdujo en las cepas L. lactis NZ9000 y L. lactis ∆fstH-ELC mediante electroporación con el programa acorde a Lactococcus. Las transformantes fueron seleccionadas en placas de GM17 con cloranfenicol (10 µg/ml) e incubaron a 32°C durante 48h, obteniendo las cepas L. lactis NZ9000 pBL90HP y L. lactis ∆fstH- ELC pBL90HP. Se comprobó que efectivamente las cepas albergan la construcción mediante el protocolo de extracción de ADN plasmídico y la tinción en bromuro de etidio.

Fig. 2. Representación esquemática de la construcción pBL90HP (5333pb). Se muestra el tamaño del producto de PCR y el vector pNZ8020, donde se clona, digeridos previamente con SpeI X PstI. pBL90HP es el producto final.

10 2.3 CONSTRUCCIÓN DE MUTANTES CARENTES DE tex

Para generar el mutante de deleción del gen se utilizó pBL95, donde se liberó tex por digestión con KpnI y PstI (2213pb). Este fragmento se clonó en el vector pGHost9, digerido previamente con las mismas enzimas de restricción, obteniendo la construcción pBL93 (5896pbs). El vector pGHost9 tiene un replicón termosensible capaz de replicarse a 28°C, pero si la temperatura aumenta hasta los 37°C, se recombina con el cromosoma o es eliminado de la célula. La construcción pBL93 se introdujo en la cepa L. lactis NZ9000 mediante electroporación. Los transformantes se seleccionaron en placas de GM17 2% con eritromicina (5 µg/ml) e incubaron a 28°C durante 48-72h. La extracción de ADN plasmídico se realizó con el método de O’ Sullivan incluyendo ciertas variaciones (O’Sullivan & Klaenhammer, 1993).

pBL93 se digirió con EcoRI, generando 3 fragmentos, donde el fragmento de interés (4887 pbs) carece de un fragmento interno de tex. Este fragmento se liga consigo mismo y da lugar a la construcción pBL94 (Fig.3). pBL94 se introduce en L. Lactis NZ9000 por electroporación y se seleccionaron los transformantes en placa GM17 con eritromicina (5 µg/ml) e incubaron a 28°C durante 48-72h. En este paso se detuvo el proceso de obtención del mutante.

Fig. 3. Representación esquemática de los pasos intermedios necesarios para generar el mutante knockout.

Partiendo del plásmido pGHOST9, y utilizando el fragmento tex presente en pBL95 se genera la construcción pBL93. Tras digestión con EcoRI, se religa el único fragmento de interés (4887 pb), generando pBL94.

11 2.4 CURVAS DE CRECIMIENTO DE MUTANTES DE SOBREEXPRESIÓN DE tex

Utilizando las cepas L. lactis NZ9000 pBL95 y L. lactis ∆fstH-ELC pBL95 se realizó el estudio de inducción de la expresión de tex en placa microtituladora, utilizando concentraciones crecientes de nisina (0,15- 5 ng/ml). Se inoculó en GM17Cm líquido una colonia de las cepas L. lactis ∆fstH-ELC pBL95, L. lactis NZ9000 pBL95 y de las cepas con vector vacío L. lactis NZ9000 pNZ8020 y L. lactis ∆fstH-ELC pNZ8020 e incubaron a 32°C durante 16 h. En GM17Cm se realizó un inoculó al 1% para las cepas L. lactis NZ9000 y al 2% para las cepas L. lactis ∆fstH-ELC, y se incubaron a 32°C , hasta alcanzar una densidad óptica a 600nm (DO600) de 0,5. Se dispusieron 180 µl de cada cultivo en pocillos de la placa microtituladora, frente a 20 µl de nisina a varias concentraciones ( 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12,5 ng/ml, 6 ng/ml, 3 ng/ml y 1,5n ng/ml) y se utilizaron los lectores Microplate Reader 200 Pro Infinite M Nano (Tecan, Suiza) y Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer (BioRad laboratorios, Hercules, CA, USA), para medir el efecto de la expresión de tex. Se utilizó como control negativo medio GM17Cm y como control positivo GM17Cm con cultivo bacteriano.

A partir de los datos obtenidos, se seleccionó un punto de la curva para cada cepa cuando estas alcanzaron una DO600 de 0,8, se observó su crecimiento relativo y se representó en diagramas de barras.

2.5 ESTUDIO DEL FENOTIPO DE MUTANTES DE SOBREEXPRESION DE tex FRENTE A NACL, OXACILINA, PUROMICINA Y LCN972

El estudio del fenotipo para los mutantes de sobreexpresión de tex se llevó cabo en medio GM17Cm al 2% de agar, junto con nisina (0,5 ng/ml) como agente inductor de la expresión y con diferentes suplementos: NaCl (0,3 M, 0,5 M, 0,8 M y 1 M), oxacilina (0,5 µg/ml), puromicina (20 µg/ml). Una colonia de L. lactis NZ9000 pNZ8020, L. lactis NZ9000 pBL95, L. lactis ∆fstH-ELC pNZ8020 y L. lactis ∆fstH-ELC pBL95 se inoculó en GM17Cm y se incubaron a 32°C durante 16h. Se prepararon 6 diluciones decimales seriadas de cada cepa, en solución ringer (solución isotónica compuesta de NaCl, KCl, CaCl2, NaHCO3), de las cuales se depositaron 5 µl sobre las placas y se incubaron a 32°C durante 24h.

En cuanto a Lcn972, se determinó su sensibilidad mediante diluciones seriadas de Lcn972, en placa frente a cultivos en fase estacionaria (diluidos 1:10 en ringer) y fase exponencial (DO600 0,5). Ambos cultivos de las cepas en estudio se inocularon al 0,1 % en 20 ml de medio GM17Cm semisólido (agar 1,25%) y suplementado con nisina a 0,5 ng/ml como

12 inductor. Se dispusieron 8 gotas de 5 µl de Lcn972 diluida en tampón fosfato 50 mM pH 6,8 a diferentes concentraciones (320- 2,5 UA/ml). Las concentraciones se marcan del 1 al 8, distribuyéndose de mayor a menor (1= 320 UA/ml, 2= 160 UA/ml, 3= 80 UA/ml, 4= 40 UA/ml, 5= 20 UA/ml, 6= 10 UA/ml, 7= 5 UA/ml, 8= 2.5 UA/ml) y se incubaron las placas a 32°C durante 24h.

2.6 RT-PCR CUANTITATIVA

Las cepas L. lactis NZ9000 y L. lactis ∆ftsH-ELC, utilizando triplicados biológicos de cada, se inocularon en GM17Cm e incubaron a 32°C durante 16 h. Cultivos en fase estacionaria de ambas cepas se inocularon al 1% y 2% e incubaron a 32°C hasta alcanzar una densidad DO600 de 0,2. En este momento se separaron dos alícuotas de 1,9 ml, de las cuales, una se centrifugó (14000 rpm 10 min) y el pellet obtenido se mantuvo a -20°C y a la otra alícuota se le añadió Lcn972. Tras añadir 10 µl de Lcn972 (130 UA/ml), se incubó a 32°C durante 10 min y centrifugó (14000 rpm 10 min), guardando el pellet. Los pellets congelados se lisaron con lisozima (10 mg/ml) y solución TE, e incubaron a 37°C durante 30 minutos. A partir de las células lisadas se extrajo el ARN. El RNA total se purificó con illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit (GE Healthcare, Reino Unido), se trató con Superase-In RNAse Inhibitor (Termo Fisher Scientific, España) y se sintetizó cDNA utilizando iScript RT Supermix (BioRad, España) en un volumen final 20 µl (RNA 0,05 µg/µl). Como control negativo de la reacción se utilizaron las muestras carentes de transcriptasa inversa. El programa de PCR consistió en 25°C 5 min; 1 ciclo a 46°C 20 min, 95°C 1 min y finalmente 4°C 30 min. El cDNA obtenido se diluyó 1/25 en agua libre de RNAsa (0,002 µg/µl).

Los ensayos de PCR cuantitativa (PCRq) se llevaron a cabo utilizando un termociclador ABI Prism Fast 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Reino Unido) y usando SYBR Green Master Mix Kit (Applied Biosystems, Reino Unido). Se utilizó una mezcla de reacción consistente en 2,5 µl del templado de 1/25 cDNA, 12,5 µl SyberGreen, 9 µl agua y 0,5 µl de los oligonucleótidos específicos para cada gen: tex, tuf, llmg0169 (Tabla 3). Como control negativo se utilizó la mezcla de reacción sin cDNA y como control positivo se utilizó la mezcla con DNA cromosómico de L. lactis MG3163. Se llevaron a cabo dos replicados biológicos para cada muestra y para cada gen en estudio. El programa de PCR consistió en una fase primera a 50°C durante 2 min y 95°C 10 min; 40 ciclos de 95°C 15S y 60°C 1 min; y una fase final de 95°C 15s, 60°C 1 min, 95°C 30 s y 60°C 15s.

13 A partir de los datos de la PCRq, se calculó la media del ciclo umbral (Ct) utilizando las reacciones por triplicado para cada gen y se normalizó utilizando el standard interno. Se utilizó como control positivo de inducción por Lcn972 el gen llmg0169, como gen reportero tuf y el gen de interés en cuestión tex. Se obtuvo el ratio de expresión para los genes, inducidos y sin inducir, utilizando el método de -2^∆∆Ct (Livak & Schmittgen, 2001).

2.7 SDS-PAGE

El análisis de las proteínas presentes en L. lactis NZ9000 pBL90HP y L. lactis ∆ftsH-ELC pBL90HP se llevó a cabo utilizando geles de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS) (Laemmli, 1970). Cultivos en fase exponencial (DO600 0,5), separados en alícuotas de 1,9 ml, se indujeron con nisina 2 ng/ml y se incubó a 32°C y se tomaron muestras a 1, 2, 3 y 24 horas tras la inducción. Además, se tomó una alícuota no tratada con nisina como muestra de 0 horas. Las células se precipitaron centrifugando 10 minutos a 14000 rpm y se guardaron a - 20°C.

Los extractos proteicos se obtuvieron siguiendo un protocolo de extracción rápida de proteínas y utilizando geles SDS-PAGE 10%. El protocolo de extracción consistió en resuspender las células en 100 µl del tampón de carga (Laemmli, 1970) para proteínas y de una cucharilla de bolitas de vidrio (0,001 g). Para la lisis bacteriana se utilizó un homogeneizador Fast Prep-24 Classic Instrument (MP Biomedicals, Estados Unidos), se hirvieron las muestras a 100°C durante 5 min y se recogió el sobrenadante tras la centrifugación. Para la preparación del gel, se prepararon las dos fases utilizando agua miliQ, Tris-HCl 1,5 M a pH 8 (Tris-HCl 0,5 M a pH 6,8 para el gel compactador), SDS 10%, solución acrilamida/ bisacrilamida 40%, persulfato amónico 10% (PAS) y N, N,N',N'- tetrametiletilenodiamina (TE-MED). Para la electroforesis se utilizó tampón de electroforesis 5X (Tris-HCl, Glicina y agua miliQ) con SDS 10% y agua miliQ, a 150 V durante 50 min. El marcador proteico utilizado fue Prestained SDS-PAGE Standars, broad range (BioRad, España). La tinción se realizó con Comassie Brilliant Blue G-250 (BioRad, España) al 0.25%

(p/v), metanol al 50% (v/v) y acético al 10 % (v/v) durante 30 min en agitación y se lavó con solución de desteñido de metanol 20% (v/v), acético 5% (v/v) y glicerol 2,5% (v/v) en agua, durante 20 min en agitación.

14 2.8 MICROSCOPÍA ÓPTICA

L. lactis NZ9000 y L. lactis ∆ftsH-ELC tratadas o no con Lcn972 (130 AU/ml), se observaron en Microscopio Invertido Plataforma DMi8 S (Leica Microsystems, España), aumento 100 X, para visualizar los efectos de Lcn972 sobre las cepas.

15 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1 ESTUDIO IN SILICO DE tex

Tex, es un regulador transcripcional descrito por primera vez en Bordetella pertussis, donde recibió su nombre por su relación con la expresión de toxinas, influyendo en la expresión de genes ptx y cyaA, que codifican la toxina pertussis y la toxina adenilato ciclasa respectivamente (Fuchs et al., 1996). En un principio su función no pudo ser descrita ya que los intentos de la deleción mutagénica resultaron letales y por tanto se consideró que podría ser un gen esencial para B. pertussis. Además, esta esencialidad va acompañada de un alto grado de conservación y es por ello por lo que puede encontrarse en un amplio rango de bacterias, tanto Gram negativas como Gram positivas. Incluso, se conoce un ortólogo eucariótico, Sp6t, el cual está implicado en los procesos de transcripción y empalme del ARN (Johnson et al., 2008). Debido a su alto grado de similitud, se considera que ambos genes podrían tener funciones celulares similares. El hecho de encontrarse en varios grupos bacterianos, además de ser una proteína conservada implicada en la regulación génica son las pistas para considerar que el gen tex puede tener una función importante (Fuchs et al., 1996; Johnson et al., 2008).

En cuanto a su estructura proteica, Texlactis está compuesta de 713 aminoácidos, se divide en varios dominios con diferente actividad, y su principal función es la unión a ácidos nucleicos (He et al., 2006). Dichos dominios y la capacidad de influir en la transcripción de genes codificantes de toxinas sugieren que Texlactis también actúe como un regulador transcripcional y que pertenezca, por tanto, a la familia proteica Tex. En dicha familia, todas las proteínas son posibles reguladores transcripcionales, con los mismos dominios de unión y, junto con otras proteínas, son capaces de regular expresión génica (He et al., 2006). En el caso de Texlactis se observan los mismos dominios de unión correspondiente a la familia Tex, y en este caso concretamente uno de sus dominios es capaz de unirse de forma inespecífica a ácidos nucleicos, con una fuerte preferencia por RNA de cadena simple (Johnson et al., 2008). Se han llevado a cabo estudios sobre la estructura de Tex de Pseudomonas aeruginosa, que a pesar de no tener el máximo porcentaje de similitud de secuencia con Tex de L. lactis, sirve como base general para la definición de los dominios de Tex(Johnson et al., 2008). En primer lugar, se conoce que su estructura proteica es principalmente elongada, constituida por un 53% de alfa-hélices y un 10% de láminas beta, y donde se pueden distinguir varios dominios, tales como: HtH, YqgF, HhH y S1 (Fig. 5) (Johnson et al., 2008). El primer dominio,

16 HtH, se encuentra en el extremo N-terminal y su función es unirse a ADN de cadena doble, desenrollándolo primero y luego uniéndose a las hebras de cadena simple de ADN. En este extremo N-terminal se encuentra la región Tex_N, que sirvió como referencia para distinguir esta nueva familia de factores transcripcionales procariótico vista por primera vez en Bordetella (Fuchs et al., 1996). El siguiente dominio, YqgF, constituye una región altamente conservada, presente en variedad de genomas bacterianos, y cuya supuesta función es como ribonucleasa o resolvasa según Aravind et al., (2000), sin embargo, la proteína Tex de Pseudomonas aeruginosa no presenta actividad nucleasa (Johnson et al., 2008). HhH es el tercer dominio proteico y se encarga de la unión inespecífica a DNA. Por último, se encuentra el dominio S1, una región conservada que cuenta con gran cantidad de residuos hidrofóbicos que son los responsables de la unión a ácidos nucleicos, y que presentan preferencia por el ARN de cadena simple.

Fig. 4. Estructura de la secuencia aminoacídica de la proteína Texaeruginosa, incluyendo los dominios estructurales HtH, YqgFc, HhH y S1 (subrayados). La estructura se colorea desde el extremo N-terminal (azul) hasta el extremo C-terminal (rojo) y se señalan tantos las regiones ɑ-hélice como las laminas β. (Fuente:

Modificado de J. Johnson et al., 2008).

En cuanto a su secuencia génica, el gen texlactis tiene un tamaño de 2.142 pares de bases (pb) y ocupa la posición 286.158 nt hasta 288.299 nt en el genoma de L. lactis NZ9000. Una vez conocida su localización, se realizó el estudio de su similitud entre especies y para ello se se construyó el árbol filogenético también utilizando COBALT (Fig.5) (NCBI), y se alineó

el gen tex mediante las herramientas SmartBLAST

17 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/smartblast/smartBlast.cgi) y COBALT (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Fig.6) (NCBI). A partir de los resultados se observa que este genpresenta homología de secuencia con especies fuera de la familia Lactococcus, tales como Streptococcus pneumoniae, Clostridium difficile, Streptomyces coelicolor, Neisseria meningitidis y Pseudomas aeruginosa De entre estas especies, la que presenta mayor similitud es S. pneumoniae seguida de C. difficile, presentando además un tamaño génico muy similar al gen en L. lactis. El resto de las especies presentan mayores diferencias a nivel de secuencia génica y secuencia aminoacídica y para este caso el organismo más lejano fue S. coelicolor, una gram positiva con altos niveles de uniones guanina y citosina (Fig. 6).

Fig. 5. Árbol filogenético del gen tex de L. lactis tras alineamiento múltiple con las especies Streptococcus pneumonia, Clostridium difficile, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa y Streptomyces coelicolor.

tex de L. lactis es muy cercano a Streptococcus pneumoniae, con quien comparte un tamaño de secuencia aminoacídica similar, con una diferencia única de dos aminoácidos. Seguidamente, compartiendo la misma rama se encontraría Clostridium difficile, mientras que en situación más lejana encontramos a Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa y al menos similar de todos, Streptomyces coelicolor. Herramienta COBALT, plataforma NCBI.

18 Fig. 6. Representación del alineamiento múltiple de la secuencia aminoacídica del gen tex de L. lactis (primera barra) frente a Streptococcus pneumoniae, Clostridium difficile, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa y Streptomyces coelicolor (respectivamente). Se observan de arriba a abajo los organismos de mayor a menor similitud respecto al gen tex de L. lactis, al igual que el tamaño de la secuencia aminoacídica del gen en cada especie. En las tres últimas especies, se observan las mayores diferencias, correspondientes principalmente a ambos extremos de las secuencias expuestas. Herramientas SmartBLAST y COBALT, plataforma NCBI.9

Asimismo, también se analizó el entorno génico de texlactis (Fig. 7) utilizando la base de datos Nucleotide y utilizando el formato Graphics (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore) (NCBI), con la finalidad de conocer su localización (Fig. 7A) y que su entorno arrojase luz sobre las posibles funciones de nuestro gen, teniendo en cuenta las funciones de los genes colindantes. Para este caso se analizaron las funciones de genes vecinos tanto aguas arriba como aguas abajo de nuestro gen (Fig. 7B). En primer lugar, corriente abajo, se encontró el gen rpsD, que codifica la proteína ribosomal S4 30S responsable de unirse a 16S ARN y media en la exactitud del proceso de traducción, seguido del gen LLNZ_01550, que codifica para una proteína hipotética con una región conservada glucosil transferasa II mediadora en la seroconversión en Shigella flexneri. Corriente arriba se encontró en primer lugar otra proteína hipotética, LLNZ_01565, una metalopeptidasa perteneciente a la familia M48 involucrada en la expresión de genes reguladores transcripcionales implicados en la respuesta al estrés.

Seguidamente se encontró una adenosina deaminasa (LLNZ_01570) dependiente de zinc que cataliza la deaminación hidrolítica irreversible de adenosina y desoxiadenosina a amonio e inosina.

19

Fig. 7. Genoma de Lactococcus lactis NZ9000 y situación del gen tex. A) Genoma de L. lactis NZ9000 (1- 2.530.294 nt), señalando la situación del gen tex (barra superior verde). B) Amplificación desde la región 270 K a 300 K del genoma de L. lactis. Señalado el gen tex (LLNZ_01560), situado entre 286.158 nt hasta 288.299 nt. Entorno a tex, se encuentran los genes rpsD y LLNZ_01550 (corriente abajo) y los genes LLNZ_01565 y LLNZ_01570 (corriente arriba), posteriormente analizados. Base de datos Nucleotide, formato Graphics, plataforma NCBI.

De forma general se encuentra en un entorno de genes que codifican enzimas y proteínas que median en diferentes procesos. Con la información obtenida sobre los genes del entorno, algunos de ellos con un producto proteico hipotético, y la escasez de conocimiento en cuanto a las funciones del gen tex, en este caso no se cuenta con suficiente información como para establecer o descartar una relación entre las funciones de estos genes, y es por ello que estudios posteriores no deben ser descartados.

3.2INDUCCIÓNDE LA EXPRESIÓN DE tex EN CONDICIONES DE ESTRÉS

Basado en los resultados de proteómica para L. lactis ∆ftsH-ELC, se podría sugerir que Tex es sustrato de FstH y que por tanto esta proteasa regule los niveles de Tex. Partiendo de esta hipótesis, era necesario descartar que la mayor abundancia de Tex en L. lactis ∆ftsH-ELC fuese debida a la inducción del gen. Para ello, se realiza la RT-qPCR reproduciendo el experimento realizado para proteómica y se propone determinar los niveles de expresión del gen tex tras el tratamiento con Lcn972. Se utilizó el gen llmg0169 (LLNZ_00895 en L. lactis NZ9000) como control positivo, cuya expresión se induce tras el tratamiento con la bacteriocina (Martínez et al., 2007) y el gen tuf como control interno. Además, se comprueba la inhibición del crecimiento del cultivo en presencia de Lnc972 mediante la elaboración de curvas de crecimiento y se utiliza microscopia óptica para visualizar el efecto de Lnc972 a nivel celular.

A

B

20 En primer lugar, el crecimiento de L. lactis NZ9000 y L. lactis ∆ftsH tras el tratamiento con Lcn972 se siguió mediante curvas de crecimiento, utilizando Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer (BioRad laboratorios, Hercules, CA, USA) y tomaron las medidas durante5 horas en Microplate Manager 5.0 PC Software (BioRad, España) con los parámetros determinados (Fig. 8). Se observa como para ambas cepas, con sus correspondientes triplicados, la bacteriocina afecta negativamente al crecimiento bacteriano. La presencia de Lcn972 causa retraso en el crecimiento de las muestras de L. lactis NZ9000 y L. lactis ∆ftsH- ELC (Fig. 8B), siendo más acusado para la primera. Hay que destacar que para L. lactis NZ9000 el retraso fue más acusado (Fig. 8A) y muestra mayor variabilidad entre los replicados.

Fig. 8. Representación gráfica del efecto de Lnc972 en el crecimiento de los cultivos de L. lactis NZ9000 (A) y L. lactis ∆ftsH-ELC (B). Datos desde las 0 horas hasta las 5 horas de incubación con el bactericida y donde se reflejan las diferencias de crecimiento entre cultivos no tratados con la bacteriocina (NZ1, NZ2, NZ3, ∆ftsH1,

∆ftsH2 y ∆ftsH3) y los tratados (NZ1,2,3 Lcn972 y ∆ftsH1,2,3 Lcn972).

Por otra parte, acompañando a estos resultados, se analizaron las imágenes obtenidas por microscopia óptica para L. lactis NZ9000 y L. lactis ∆ftsH-ELC, tras 2 horas sin y con tratamiento bactericida (Fig.9). Se observó claramente el efecto de la bacteriocina sobre ambas poblaciones microbiana, disminuyendo esta drásticamente y afectando a la morfología celular. En el caso de las muestras de ambas cepas sin tratar (Fig. 9a, 9c), se pudo distinguir diplococos regulares que presentaban una estructura propia de L. lactis en condiciones normales. En cambio, en las muestras tratadas con Lcn972(Fig. 9b,9d), se presentaron formas diplococicas alargadas e irregulares, algunas de ellas no llegaron a dividirse del todo y por ello constituyen formas alargadas.

A B

21 Fig. 9. Efecto de Lcn972 sobre muestras de L. lactis NZ9000 y L. lactis ∆ftsH-ELC tratadas y sin tratar. L. lactis NZ9000 (a y b) a) cultivo en medio GM17, b) cultivo tratado con Lcn972; L. lactis ∆ftsH-ELC (c y d) c) cultivo en medio GM17 d) cultivo tratado con Lcn972. Para ambas cepas se observa que en medio con bactericida (b y d) se reduce la población y adoptan formas irregulares.

Estos cambios morfológicos coinciden con los previamente descritos por Martínez et al. (2000) por lo que el tratamiento realizado con Lnc972 ha sido efectivo.

Posteriormente, se procedió al estudio mediante RT-qPCR con el objetivo de comparar la expresión del gen tex en las cepas L. lactis NZ9000 y L. lactis ∆ftsH-ELC en presencia de la bacteriocina Lcn972. Como control positivo, se utilizó el gen llmg0169 (LLNZ_00895 en L. lactis NZ9000) cuya expresión se induce tras el tratamiento con la bacteriocina (Martínez et al., 2007). Mediante el análisis de los datos se obtuvieron las diferentes medias de Ct para cada gen, respectivamente para la cepa salvaje y la cepa mutante, con y sin la condición. Una vez halladas las medias Ct para los genes respectivos, se obtuvo el ratio de expresión relativa de cada uno de los genes siguiendo el método matemático -2^∆∆Ct (Livak & Schmittgen, 2001) (Tabla 4). Se obtuvo que para la cepa L. lactis NZ9000, el gen llmg1069 contó con una media de 35,42 que correspondería al ratio de expresión existente entre la muestra tratada y sin tratar como se había observado previamente (Martínez et al., 2007). Por el contrario, no se observó inducción del gen tex (Tabla 4). Al tener una diferencia tan pequeña se entiende que para este caso la presencia de Lcn972 no está provocando ningún cambio en la expresión del gen. En lo que respecta a la cepa L. lactis ∆ftsH-ELC, se observó que la media de expresión

22 para llmg0169 es de 7,63. El grado de inducción es menor que en NZ9000, pero para el gen tex, la media de expresión fue de 0,72, una diferencia de expresión mínima entre muestra tratada y sin tratar.

Tabla 4. Datos finales, obtenidos de PCRq, con ratio de los triplicados biológicos de los genes inducidos y sin inducir, siguiendo el método 2^-∆∆Ct.

De estos resultados, por un lado, se entiende que la Lcn972 actuó correctamente y que está ejerciendo su efecto, ya que el gen llmg0169 se induce mucho más en ambas cepas en presencia de la bacteriocina. Por otro lado, en cuanto al gen tex se observa que, en ambas cepas, no existe inducción en presencia de la bacteriocina. Por tanto, la mayor abundancia de Tex en la cepa L. lactis ∆ftsH-ELC tras el tratamiento con Lcn972 no se debe a una inducción de la expresión del gen tex como respuesta al estrés, sino que la proteína Tex presentaría una vida media más larga en el mutante L. lactis ∆ftsH-ELC en comparación con la cepa silvestre L. lactis NZ9000. Esta mayor vida media de la proteína podría explicarse por la ausencia de la proteasa de membrana FtsH, cuya principal función es la proteólisis y la cual podría ser responsable de la degradación de Tex. Por consiguiente, gana peso la hipótesis de que la proteína Tex sea sustrato de la proteasa FtsH y que exista una relación reguladora entre ambas proteínas.

3.3 CONSTRUCCIÓN DE MUTANTES DE tex

Tex ha sido estudiado en diversas especies bacterianas lo que ha permitido comprender su función y en que procesos interviene en dichas bacterias. Sin embargo, su función en L. lactis se desconoce. Es por ello por lo que se plantea, como primer paso, la generación de mutantes de sobreexpresión, con la finalidad de observar el efecto que ejerce sobre L. lactis, y de mutantes defectivos, para evaluar la esencialidad de este gen. Además, conociendo los fenotipos observados anteriormente para L. lactis NZ9000 y L. lactis ∆ftsH- ELC, existe interés en conocer si estos fenotipos se mantienen o revierten, tanto en sobreexpresión como en ausencia del gen tex.

PCR Cuantitativa Cepas

Media SD Media SD

L. lactis NZ9000 35.42 33.92 1.64 1.14

L. lactis ∆ftsH-ELC 7.63 3.13 0.72 0.75

Tratados respecto a no tratados Expresión de 0169 Expresión de tex

23 3.3.1 ESTUDIO EN MUTANTE CARENTE DE tex

El proceso de generación del mutante de deleción, mediante la construcción de vectores intermedios y una posterior doble recombinación con el genoma, resultó complejo de seguir, complicando así la obtención del knockout. La construcción intermedia, pBL93, se obtuvo, pero luego no fue posible obtener la construcción con el gen tex truncado, pBL94, ya que tras la transformación no salían colonias transformantes. Una posible explicación seria que la ligación no estuviese funcionando correctamente, ya sea por la ligasa y el buffer de la ligasa utilizados, o quizás la proporción vector: inserto utilizada no fuera la más adecuada o incluso que la digestión previa con EcoRI no haya sido del todo eficiente. Por tanto, no fue posible llevar a cabo un estudio de la esencialidad del gen y por ende no pudo hacerse un estudio de los fenotipos que generaría. A partir de la imposibilidad de su generación se plantea la búsqueda de otras opciones para la obtención de este mutante, como utilizar un vector diferente a pGhost o utilizar otra enzima en lugar de EcoRI. También se podría seguir la misma estrategia, pero comprobando cuales serían los puntos críticos en la obtención de pBL94 y tener la mayor exactitud posible a su vez que comprobar que todo el material funciona perfectamente.

3.3.2 ESTUDIO EN MUTANTE DE SOBREEXPRESIÓN DE tex

A diferencia del mutante de deleción, la obtención de cepas de L. lactis NZ9000 y L.

lactis ∆ftsH-ELC que sobreexpresarán el gen tex sí fue posible. De esta manera se crearon las cepas L. lactis NZ9000 pBL95 y L. lactis ∆ftsH-ELC pBL95, que albergan un plásmido que contiene el gen tex bajo el control de un promotor de expresión inducible activado por nisina (Pnis). Partiendo de las dos cepas se planteó, por un lado, el estudio de los efectos de la sobreexpresión del gen tex y, por otro lado, el análisis de los fenotipos frente a NaCl (0,3 M, 0,5M, 0,8M y 1M), Oxacilina (0,5 µg/ml), Puromicina (20 µl/ml) y Lcn972.

3.3.2.1. ANÁLISIS DE LOS EFECTOS DE LA SOBREEXPRESIÓN

El estudio de los efectos de la sobreexpresión de tex en L. lactis NZ9000 y L. lactis ∆ftsH -ELC en principio se intentó llevar a cabo clonando el gen bajo un promotor fuerte constitutivo (p36), pero no se obtuvieron transformantes. Quizás, es posible que altos niveles de tex fueran tóxicos para la célula, teniendo un efecto deletéreo sobre la población, pero no se descartan otras alternativas no pueden ser descartadas, tales como la perdida posterior del plásmido o que sea tóxica la función de tex. Por esta razón, se procedió a su clonación bajo

24 un promotor inducible y así poder medir el efecto del aumento paulatino de la concentración de tex ajustando la concentración de nisina en el medio.

A partir de los datos obtenidos se observa que para L. lactis NZ9000 pBL95, a DO600

0,8, existe retraso en el crecimiento a medida que aumenta la concentración del inductor nisina, por tanto, a mayor concentración mayor retraso (Fig. 10). Para ratificar que la molécula responsable del retraso es Tex, se observaron los resultados obtenidos para L. lactis NZ9000 pNZ8020 en las mismas condiciones, a una DO600 de 0,8, y se observó que crece correctamente acorde a la concentración del inductor en el medio, y por ende, gana peso la hipótesis de que la sobreexpresión del gen sea la causa del retraso (Fig. 10). Este retraso podría explicarse desde el punto de vista de que la maquinaria celular está siendo forzada a dirigirse a la sobreexpresión, por tanto, el resto de los procesos moleculares se ralentizan, influyendo esto en el proceso de multiplicación celular. A pesar de esta posible explicación, tampoco puede descartarse rotundamente la posibilidad de que la inducción de tex sea tóxica por su función.

Esta posibilidad existe, pero sería necesario un mayor conocimiento de tex en L. lactis como para decantarse firmemente por cualquiera de las opciones.

Fig. 10. Representación gráfica del efecto de la sobreexpresión del gen tex en L. lactis NZ9000 pNZ8020 y L.

lactis NZ9000 pBL95, a diferentes concentraciones de nisina. L. lactis NZ9000 pBL95 parece afectarle más la sobreexpresión respecto a L. lactis NZ9000 pNZ8020, y por ello se observa un porcentaje de DO600 inferior.

Este mismo estudio se realizó sobre L. lactis ∆ftsH-ELC pNZ8020 y L. lactis ∆ftsH-ELC pBL95, teniendo en cuenta la ausencia de la proteasa FstH, y que por tanto esta cepa cuenta con niveles más altos de Tex. Como consecuencia, cabría esperar que a mayor cantidad de Tex habría un mayor retraso en el crecimiento según lo observado en los mutantes de L. lactis NZ9000. Sin embargo, se observó que el crecimiento bajo la inducción de nisina en L. lactis

∆ftsH-ELC pBL95 y L. lactis ∆ftsH-ELC pNZ8020 es muy similar, por tanto, no había una dife- rencia latente entre cepas (Fig. 11).

25 Fig. 11. Representación gráfica del efecto de la sobreexpresión del gen tex en L. lactis ∆ftsH-ELC pNZ8020 y L.

lactis ∆ftsH-ELC pBL95, a diferentes concentraciones de nisina. Ninguna de las cepas parece verse afectada por la sobreexpresión del gen, observándose un crecimiento muy similar entre ambas.

A partir de que L. lactis ∆ftsH-ELC pNZ8020 y L. lactis ∆ftsH-ELC pBL95 presentan un crecimiento similar se interpreta que en este caso la sobreexpresión de tex no está afectando al crecimiento. Esto puede deberse a que el aumento de expresión del gen active otros sistemas alternativos de regulación que controlen las altas concentraciones de Tex, en ausencia de FstH, , o también es posible que se pierda el plásmido o que aparezcan mutantes espontáneos lo que podría comprobarse mediante extracción de DNA plasmídico. A su vez, esto apoya la idea de que la expresión descontrolada del gen tenga un efecto deletéreo y que por ello se activen otros medios de regulación como sistema de protección.

3.3.2.2. ANÁLISIS FENOTÍPICO DE MUTANTES DE SOBREXPRESIÓN

El estudio fenotípico realizado sobre L. lactis NZ9000 pBL95 y L. lactis ∆ftsH-ELC pBL95 se basó en estudios anteriores de resistencia y sensibilidad de las cepas L. lactis NZ9000 y L.

lactis ∆ftsH-ELC frente a NaCl (0,3 M) y a Lcn972 en el medio (datos no publicados). Sobre estos resultados, se sabe que L. lactis NZ9000 es resistente a NaCl, mientras que L. lactis

∆ftsH-ELC es sensible. Respecto a Lcn972, la cepa mutante resultó resistente, al contrario que la cepa salvaje. Teniendo en cuenta que L. lactis ∆ftsH-ELC presenta altos niveles de Tex, se planteó si este aumento de la concentración sería responsable de los fenotipos descritos para esta cepa, y si es así, la cepa L. lactis ∆ftsH-ELC pBL95 podría generar los mismos fenotipos observados anteriormente, pero más acusado. También, es una posibilidad, el hecho de que el fenotipo se mantenga tal como para L. lactis ∆ftsH-ELC.

26 Resistencia a NaCl

Se realizó un estudio de la sensibilidad a NaCl (0,3 M) por parte de las cepas L. lactis NZ9000 pNZ8020, L. lactis NZ9000 pBL95, L. lactis ∆ftsH-ELC pNZ8020 y L. lactis ∆ftsH-ELC pBL95, y se incluye como control el crecimiento en GM17Cm y en medio GM17Cm+ 0,5 ng/ml Nis (Fig. 12). Se observa que, tras 24h, las cepas L. lactisNZ9000 pNZ8020 (NZ8020) y L. lactis NZ9000 pBL95 (NZ95) crecen adecuadamente en el control GM17Cm (Fig. 12A), al igual que en GM17CmNis + 0,3 M NaCl (Fig. 12B), y la sobreexpresión del tex no le confirió ninguna ventaja o fenotipo diferente a la cepa con el plásmido vacío (Fig. 12C). Para L. lactis ∆ftsH-ELC pNZ8020 (∆8020) y L. lactis ∆ftsH-ELC pBL95 (∆95) tras 24 h en NaCl (0,3 M) se observó que la sensibilidad es la misma para ambas cepas (Fig. 12C), por tanto, la sobreexpresión de tex en L. lactis ∆ftsH-ELC pBL95 no le da un carácter de mayor sensibilidad respecto a L. lactis

∆ftsH-ELC pNZ8020.

Fig. 12. Evaluación de los fenotipos de resistencia y sensibilidad de las cepas, tras 24 horas de incubación, en GM17Cm (A), en GM17Cm + 0,5 ng/ml Nis (B) y GM17CmNis + 0,3 M NaCl (C), mediante diluciones seriadas.

L. lactis NZ9000 pNZ8020 (NZ8020); L. lactis NZ9000 pBL95 (NZ95); L. lactis ∆ftsH-ELC pNZ8020 (∆8020); L. lactis

∆ftsH-ELC pBL95 (∆95).

Para confirmar que la inducción de tex no conlleva una mayor sensibilidad al NaCl de la cepa L. lactis NZ9000, se repitió el experimento en condiciones más restrictivas (NaCl 0,5 M, 0,8 M y 1 M) (Fig. 13) y en presencia del inductor nisina en el medio para L. lactis NZ9000 pNZ8020 (NZ8020) y L. lactis NZ9000 pBL95 (NZ95). Se determinó que la concentración limitante era de 1 M (Fig. 13D). Se observó que las dos cepas se comportaron de la misma manera frente a las concentraciones de NaCl, viéndose igualmente afectadas (Fig. 13A, 13B, 13C y 13D). Al comportarse de la misma forma la cepa que sobreexpresa tex respecto a la que cuenta con un plásmido vacío, se entiende que una mayor concentración de Tex no confirió ninguna ventaja frente a una concentración basal de la proteína, en NaCl restrictivo.

En el futuro sería necesario realizar estudios, por ejemplo, de análisis del proteoma, que 4

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27 ratifiquen que efectivamente en el mutante de sobreexpresión de NZ9000 existe una mayor concentración de la proteína respecto al salvaje, lo que permitiría entender mejor el pale de Tex.

Fig. 13. Fenotipos de sensibilidad frente el aumento de la concentración de NaCl por parte de L. lactis NZ9000 pNZ8020 (NZ8020) y L. lactis NZ9000 pBL95 (NZ95) en GM17Cm + 0,5 ng/ml Nis (A), GM17CmNis + 0,5 M NaCl (B), GM17CmNis + 0,8 M NaCl (C) y GM17CmNis + 1 M NaCl (D). Triplicados biológicos para cada cepa (1,2,3).

Basado en los resultados, se entiende que la hipótesis inicial que planteaba que la hipersensibilidad al NaCl de L. lactis ∆ftsH-ELC fuese debida a los altos niveles de Tex no se sostiene ya que en mayor presencia de Tex no se genera un fenotipo más acusado de sensibilidad en L. lactis. Por tanto, la sobreexpresión de tex no genera ningún cambio y se entiende que por ende la proteína Tex no es responsable del fenotipo de sensibilidad a NaCl en L. lactis ∆ftsH-ELC pBL95. Una explicación alternativa a este fenotipo podría ser una posible desregulación de los niveles de c-di-AMP (Commichau et al., 2017). c-di-AMP es una molécula mensajera secundaria que parece estar implicada en la adaptación bacteriana al medio ambiente mediante el control indirecto de la envuelta celular, regulando el turgor celular, y la regulación del transporte de osmolitos. La abundancia de este mensajero inhibe el transporte de osmolitos impidiendo que las células los acumulen en su interior para contrarrestar la perdida de agua en condiciones hiperosmóticas. En este escenario, las células se contraen y pierden viabilidad (Mehne et al., 2013; Commichau et al., 2017). Teniendo en cuenta esto, el fenotipo de sensibilidad a NaCl podría ser debido a que exista una alta

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28 concentración de c-di-AMP en el mutante L. lactis ∆ftsH-ELC. Esta situación podría tener lugar si los niveles del enzima adenilato ciclasa CdaA, responsable de la síntesis de c-di-AMP, estuviesen controlados por FtsH. En ausencia de FtsH no existiría degradación de CdaA y, consecuentemente, aumentarían los niveles intracelulares de c-di-AMP.

Resistencia a Lcn972

Respecto al estudio de las cepas L. lactis NZ9000 y L. lactis ∆ftsH-ELC frente a Lcn972, no se observaron diferencias en los resultados entre los cultivos en fase estacionaria (incubados durante la noche) (Fig. 14A) y los cultivos en fase exponencial (Fig. 14B) utilizados (con una DO600 0,5). La respuesta al estrés fue la misma, independientemente de la fase.

Fig. 14. Fenotipo de sensibilidad a diluciones de Lcn972, tras 24h de incubación, de L. lactis NZ9000 pNZ8020 (NZ8020); L. lactis NZ9000 pBL95 (NZ95); L. lactis ∆ftsH-ELC pNZ8020 (∆8020); L. lactis ∆ftsH-ELC pBL95 (∆95) en GM17CmNis. Cultivos en fase exponencial (B) y en fase estacionaria (A) embebidos en medio GM17CmNis.

Utilización de diluciones de Lcn972, donde cada una era la mitad respecto al anterior (Lcn972 1: 320 UA/ml;

2: 160 UA/ml; 3: 80 UA/ml; 4: 40 UA/ml; 5: 20 UA/ml; 6: 10 UA/ml; 7: 5 UA/ml; 8: 2.5 UA/ml).

Se observó que para L. lactis NZ9000 pNZ8020 la concentración mínima inhibitoria de bactericida (concentración mínima necesaria del bactericida para impedir el crecimiento bacteriano, CMI) fue de 40 UA/ml mientras que para L. lactis NZ9000 pBL95 fue de 20 UA/ml (Fig.14A, 14B). Para L. lactis ∆ftsH-ELC pNZ8020 CMI fue 80 UA/ml y para inhibir a L. lactis

∆ftsH-ELC pBL95 se necesitó 40 UA/ml. De estos resultados se entiende, en primer lugar, que L. lactis ∆ftsH-ELC es más resistente a Lcn972 que la salvaje para las cepas con pNZ8020.

Cuando se sobreexpresa tex, ambas cepas son más sensibles a Lcn972, y por ende, se descarta la hipótesis de que los altos niveles de Tex en L. lactis ∆ftsH-ELC sea responsable del fenotipo de resistencia a Lcn972.

En ambas cepas, aquella que sobreexpresa tex necesitó menos cantidad Lcn972 para inhibir el crecimiento bacteriano, entonces se entiende que a mayor concentración de Tex la

29 cepa es más sensible al bactericida. Por tanto, la hipótesis de que el aumento de Tex generaría una mayor resistencia a la bacteriocina, basada en estudios anteriores, es errónea, ya que por el contrario a mayor cantidad de Tex hay una mayor sensibilidad a Lnc972.

El hecho de que la inducción de tex repercuta en una mayor sensibilidad a Lcn972 podría deberse simplemente a que su sobreexpresión afecte a la bacteria, como se observó en los resultados previos de inhibición del crecimiento en mutantes sobreproductores, a lo que hay que sumar, además, el estrés generado por la bacteriocina en sí misma. También, podría ser que, aparte de Tex, existan otras proteínas responsables y que el fenotipo sea el resultado de un conjunto de cambios proteicos. Esto puede apoyarse con la observación de 21 genes que se sobreexpresan, como respuesta a Lnc972 (Martínez et al., 2007), codificando a varias proteínas de las que se desconoce exactamente su función y papel en la respuesta a estrés. Además, basado en datos de proteómica para L. lactis ∆ftsH-ELC, existen más proteínas que se sobreexpresan a parte de Tex (datos no publicados), que quizás puedan intervenir en el mecanismo molecular de generación del fenotipo. Por tanto, son necesarios más experimentos para conocer la base molecular de la resistencia a Lcn972 de L. lactis ∆ftsH- ELC.

Resistencia a oxacilina y sensibilidad a puromicina

Recientemente se ha descrito que L. lactis ∆ftsH-ELC es resistente a la infección por bacteriófagos debido a cambios en la estructura y/o composición de la pared celular que inhiben la actividad de la endolisina fágica (Roces et al. 2016). Las endolisinas fágicas son las responsables de la hidrólisis del peptidoglicano de la pared celular, un paso necesario para liberar los fagos que se han multiplicado en el citoplasma de la bacteria infectada (Loessner, 2005).

A partir de esto, se planteó si también podría ser resistente a la acción de un antibiótico de pared como la oxacilina. En este caso (oxacilina 0,5 µg/ml), se obtuvo que ninguna de las cepas (L. lactis NZ9000 pNZ8020, L. lactis NZ9000 pBL95, L. lactis ∆ftsH-ELC pNZ8020 y L. lactis ∆ftsH-ELC pBL95) presentó dificultad para crecer (Fig.15C). Esto quiere decir que la concentración de oxacilina no fue limitante para ninguna y por tanto los datos obtenidos no son suficientes para declarar alguna relación entre el incremento de Tex y la generación de un fenotipo de mayor resistencia para L. lactis ∆ftsH-ELC pBL95. En cuanto a la puromicina (20 µg/ml), se observó que las 4 cepas crecieron a la par sin diferencias y que la presencia de un vector de sobreexpresión del gen no confirió ningún fenotipo destacable ni a