Desarrollo de técnicas electroforéticas de proteínas e isoenzimas para la caracterización de germoplasma de ajo (Allium sativum L )

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(1)SECCION AGRICOLA ARTICULOS CIENTIFICOS DESARROLLO DE TECNICAS ELECTROFORETICAS DE PROTEiNAS E ISOENZIMAS PARA LA CARACTERIZACION DE GERMOPLASMA DE AJO (Allium sativum L.). Gustavo A. Ugorrelo M. I.A. MSc.; Rodrigo Artunduaga S. I.A. Ph. D.•. RESUMEN Debldo a clertas limltaclones que presentan los marcadores morfol6glcos para la Idenllflcacl6n de matenales cercanos genetlcamente (en colecclones de germoplasma), se hace necesano recurnr a metodos mas confiables tales como los marcadores bloqwmlcos (Pro!einas e Isoenzlmas) que dlscnmlnan cuilivares comparando los productos de la acllvldad genlca En esta trabajo la electroforesls en gel de polyacnlamlda lue desarrollada para delermlnar eleclroforegramas de proteinas e Isoenztmas esterasas en cuilivares de ajO (AllrumsatlVumL) como marcadores potenClales de genotlpos Extractos de dtlerenles tejldos (hoja, raiz y bulbillos) fueron probados En general, los extractos de butbillos dan patrones de proteinas con mayor numero de bandas, en relacl6n con los de ralz y hOjas, en el caso de Isoenzlmas los mejores patrones se presentaron con extractos de hOlas Los electroforegramas de protelnas e IsoenZlmas permlheron detectar vanacl6n mtervanetal entre los 14 cull1vares estudlados, se encontr6 que hay dos grupos de vanedades que dlfieren en la morfologia de la planta, un grupo representado por los a)os sin tUOIca envolvente de los bulbos y el otro por los genotlpos de bulbo cublerto por tUOIcas, a la vez, conformado por los subgrupos a)os Peruanos pequenos, Chllenos, y ajos de bulbo grande "Glgantes· Palabras claves adicionales: electrof6resls, gel de polYGicnlamtda, proteina lolal, esterasas, a,o. ABSTRACT. DEVELOPMENT OF ELECTROPHORETIC TECHNIQUES BY ISOZYME AND PROTEINS FOR CHARACTERIZATION OF GARLIC (Allium sativum L.) GERMOPLASM Due to some limitatIons of the morphologic characters In the Identlfrcatlon of the closely related genetical matenals (presentend In germoplasm collection), It has been necessary to appeal to most trusting methods such as Ihe Isozyme and proteins patterns wlch can dtscnmlnate cullivars by companng the products from the genetic achvlty In this experiment the polyacrylamIde gel electrophoresIs, was developed for determining Isozyme and proteins eleteclrophoregrams (patterns) of garlic (AII/um satIVum L ) culllvars as potentJal genotype markers Extracts of dlHerent tissues (leaf, root an cloves) were examined. SeccI6n Legurnlnosas. ICA C I Tlbaltata A A 151123, Eldorado, Santafe de 80gota. 91.

(2) REVISTA leA, Vol. 28, Abril- Junio 19H3 In general. the cloves gave proteins patterns with the largest number of bands and Icaf gavo the best Isozyme patterns On the basis of the Isozyme and protein patterns waS possible to detect Intervarietal vanation among tho 14 cullivars used In thiS study It was found In the collection two varietal groups. with different plant's morphology. one of them IS represent end by the garlics without shoated tunics and the olherone represented by the garlics with their cloves covered by tumcs At the same time the lalest group was conformed by the lollowlng sub-groups Small peruanos. chllenos and garlics with big cloves called "Gig ants' Additional key words: electrophoresis, polyacrylamide gel, total proteins, esterases, garlic. La producclon mundlal de 8)0 es de 2 8 millones de tone ladas, en un total de 460.000 ha cultlvadas. La exportaclon de esta especle esta hderada principalmente por Espana, Italla y Argentina. Los palses latrnoamencanos producen volumenes apreciables, destinados al consumo interno 0 a su comercializaclon en los mercados internacionates. Segun FAD (1991), se cultlvan 32.000 ha en America del Sur y America Central, con rendlmiento promedio de 5.9 tlha. Et ajo (AllIUm sativumL.) es una especie horticola de importancla en Colombia por el uso en la dleta allmentlcia, la alta demanda de mano de obra y por el volumen y el valor de la producclon generada de la slembra de cerca de 1200 ha, con rendlmiento promedlo de 6.0 tJha, ICA (1991). Alliumes un genera muy d,verso de la famIlia de las Alhaceas (antes Lihaceas). Entre los AlllUmdomestlcados y mas populares estan la cebolla (A. cepa L ), el puerra (A porrum L ) Y el a)o (A. sa/lVum L.), ongl· nanos del Cercano Oriente a del Asia Central y Onental, Astley et. al (1982).. Se descanocen farmas silvestres de alo, y su paslble ancestro es A. long/cusp/s. En la domestlcaclon el aja sigUlo un camino distlnto al de la cebolla y el puerro, que poseen grandes cantldades de semllla sexual para su prapagaclon; aquel, es exclusivamente de propagaclon por bulbillos 0 "dientes". EI alo presenta variablhdad genetica que se encuentra en los matenales cultivados en el mundo, dlferencladas en madu-. 92. rez, requerimlentos de frIO, tamano de bulba, tamano y numero de bulbiilas, etc. No se sabe cuanta varrabihdad fue selecclanada cuanda A satlVum 0 su ancestro se multI ph caban sexual mente, a cuanto ha surgldo por mutaclanes en las yemas despues de que se convlrtlera en una planta agamlca, vivlpara y esteril, FAD (1991). La eXlstencla de un banco de germoplasma y la dlstribuclon regional 0 internaClonal de matenal sin prevIa evaluaci6n 0 caractenzacion, puede conducir a mantener y dlstnbuir duplicaclones a costos elevados Igualmente es necesaria la permanente y constante comprobaci6n de que no ha eXlstldo una erosIon genetica en el matenal conservado, tanto debldo a propagacion In VItro, como a multipilcaclones en areas ecologlcas dlferentes a su origen, Huaman (1986). La caracterizacion morfologica por varios ciclos de cultivo para eliminar el efecto ambiental 0 variacion fenotlpica, es un eficiente sistema de evaluacion de las colectas de ajo. Sin embargo, estos mEHodos no slempre permiten una clara dlferenclacion entre tipOS comerclales, ecotlpoS, biotlpos y genotlpos, Burba (1988)_ Idealmante, las diferenclas entre los genotipos deberlan basarse en la comparaclon directa de genes, pero resulta muy costoso y toma mucho bempo. No obstante, las diferencias de los cultivares se pueden medir en forma indirecta comparando los productos de la activldad gemca, es declr, usando las protelnas como marcadores genotiplcos, Hussain e/. al. (1986). '.

(3) LIGARRETO M., G.A., ARTUNDUAGA S.R., Germoplasma de ajo De acuerdo can su potencial genetico, las diversas especies vegetales desarro!Ian sustancias qui micas especificas a un especie 0 variedad, detectables segun un adecuado proceso eletrofonHico. De este modo, la estabilidad de proteinas y enzimas solubles en agua, ha brindado una excelente posibilidad de ser utilizadas en estudios taxonomicos, Contreras y Mansilla (1989). Las tecnlcas electroforeticas estan basad as en la migraci6n diferencial de moleculas, que varian en carga y tamafio, a traves de un campo elect rico usado como soporte, generalmente un gel de poliacrilamida, agarosa 0 almid6n. Las proteinas codificadas par diferentes genes pueden tener distinta carga 0 tamano molecular y de esta forma tener diferentes movihdades en un campo electrico, Gonzalez y Gomez (1987). La electroforesis ha side adaptada a una variada gama de aphcaciones. En biologia se usa para comparar relaciones evolutivas entre organismos, asumiendo que tipos relacionados pueden tener un gran numero de proteinas del mlsmo grupo. En bioquimica se ha utlllzado, para analizar proteinas y aCI-. dos nucleicos virales, componentes celulares y atros sistemas biol6gicos. La utilidad de las isoenzimas como marcadores se encuentra bien documentada, y las variantes geneticamente deflnidas de las isoenzlmas han demostrado su importancia en la evaluaci6n de la variabihdad genetica en varias especies como arroz, cebada, maiz, frijol, papa, trigo y soya entre otras, Tanksley y Orton (1983). EI objetivo del presente estudio fue desarro liar una metodologia electroforetlca de proteinas y esterasas que pueda ser usada para Identificar cultlvares de aJo (AllIUm sativum L.). MATERIAlES Y METODOS Se trabajaron 14 cultlvares de ala, colectados en las principales zonas productoras en los departamentos de Cundinamarca y Nanna durante el pnmer semestre de 1990, los cuales fueron evaluados en el . campo en el CI Tibaltata durante los semestres B de 1990 y A de 1991, para formara grupos de genotlpos como simi landad morfologica y de rendlmlento (Tabla 1).. TABLA 1. Cultivares de ajo estudiados en el desarrollo de la electrof6resis. Grupo 1. Caracteristicas. Cultivar. AJos "Pata de perro'. Costa Alca Cnollo. (CA) (C). 2. Peruanos pequeiios. AreqUipa Morado pequeno. (A) (MP). 3. Chllenos. Chilena rOjo Chilena blanco. (CA) (CB). 4. AJos "Glganles". Morado claro Peruano Aonsuno Cnollo rosado Blanco (sabana) Ronseiio morado Induslnal Morado cnollo. (ML) (P) (A) (Cl) (B) (AM) (I) (MC). bulbos sin tunlcas, dlentes pequeniios, 130 dias de cicIo de vida bulbos can tunlcas. suscept pudn ralz, 140 dias cIcio de Vida bulbos con tUnicas y umformes. 140 dlas de cicIo de Vida. bulbos gran des con tUnlcas. y de forma ovoidal, 160 d'ias de Cicio de Vida. Vease Ligarreto (1992). 93.

(4) REVISTA leA, Vol. 28, Abril- Junio 1993 Los 14 cultJvares se pudieron procesar en un mismo gel tanto para proteinas como para esterasas. En el desarrollo de la le~nica de eleclroforesis se utilizaron 11 soluclones de extracci6n de dlferenle concenlracion y pH (Tabla 2), para selecclonar.la que ongi.~a ra electroforegramas con meJor resoluclon, segregaclon y claridad de las bandas. TABLA 2. Soluclones buffer empleadas en la electroforesls.. Sistema Extraccl6n. Solucl6n Agua desttlada SOSl% SDS5% TriS • Hel 0 5 M, pH 6 B Tns - Hel 0 05 M + 1% ME, pH68 Tns· Hel 0 05 M + 1% ME. pHB3. Gel separador Gel concentrador Electrodos. Tns • Her 0 05 M. pH 6 8 Tns • Hel 005 M. pH B 3 Urea 8M Sacarosa al 20% Elanol al 70% Tns Hell 5 M, pH 8 B Tns Hel 0 5 M pH 68 Tns ghcrna 0 025 M. pH 8 3. Tanto para espectro proteinico como para esterasas, se trabaJo con tejido de raices, hojas y bulbillos a dientes madur~s. Las muestras fueron preparadas por maceracion manual de un gramo de teJldo fresco en aproximadamente dos ml de nitr0geno IiqUldo, luego se agre90 un ml de buffer de extracclon, se agllo por dos minutos y se adlclono 20 mlcrolltros (Ill) de sulflto de Sodlo (10 g Na2 SO:l7.S g Na 2S20slS0 ml de agua); la mezcla 0 pasta cruda fue centrrfugada a 145000 rpm (20904 g) a 4° C. durante 30 mlnutos. EI sobrenadante fue usado para 1a separacion de proteinas e Isoenzimas. EI eqUipo utllizado fue una unrdad vertical de electroforesis Protean II de Blo-Rad y una fuenle de poder Blo-Rad modelo 400.. 94. Se empleo la metodologia propuesta por Stegemann el. a/. (1985) para determinar la concenlracion de proteinas porprueba de gotas, 10 mismo que para la preparacion del gel de separacion al 10% Ygel de concenlracion aI4%. La muestra aplicada a cada una de las ranuras del gel fue de 7.5 a 30 microhtros de soluci6n (compuesta por 250 III de extracto de tejido, 62.5 III de soluci6n de sacarosa al 60% y dos III de azul de bromofenol) dependiendo de la concentracion de proleinas detectada en la prueba de gotas. Para la electroforesis en geles de polyacnlamida (PAGE) se utilizo e1 sistema discontinuo de Laemmll, Stegemann el. at. (1985). EI corrimiento se realize dentro de una nevera can recirculaci6n de agua fria; se aplico una corriente de 14 a 44 mA, con vo\taje de 60 v. incrementado gradualmente hasta 380 v., el proceso duro cinco horas. La tincion de proteinas se realizo con azul brillante de coomassie al 0.025% de acuerdo al procedimiento descrito por Stegemann el. a/. (1985). En la tincion de las IsoenZlmas esterasas se uso el procedimiento recomendado por Hussain el. al. (1986). Una vez destenidos los geles fueron fotografiados y sec ados. La electrof6resis fue repetida cinco veces para estar seguros de la establlidad y repetiblhdad del patron.. RESULTADOS Y DISCUSION Despues de cinco corrimientos de la electroforesis de proteina por el sistema dlscontinuo (PAGE), usando varios sistemas de buffer, se determlno que la calidad de la separacion de las proteinas depende de la soluclon buffer empleada. De acuerdo con los resultados preliminares se encontro que de los 11 buffers probados, Trls Hel 0.05 M + ME al1 %, pH 6.8 presento mayor movilidad y mejor calidad de las bandas en los electroforegramas de teJido de bulbillos..

(5) LIGARRETO M" G.A., ARTUNDUAGA S.R., Gcrrnoplasrna de ojo. _. o. • .0. e:Q§. -. o. ... :; o~ .. = == :=. Q. .~ · a~. -05. -10. 1.0 -. PRO.T EL. -rOT.. FIGURA 1. Patrones eletectroforeticos de proteinas totales en geles de poliacrilamida al 10% para determinar tejido y la cantidad de extracto. EI patron de albumina (referencia) aparece en los extremos derecho e izquierdo de los geles y las migraciones interiores son del cultivar de ajo CriolloRosado (Cl).. La Figura 1 muestra los electroforegramas de extracclon de protelnas de ralZ, hoJas y bulbillos usando el buffer Tns HCI 0.05 M + ME al 1%, pH 6.B. De los tejidos utlhzados, las hojas y bulbillos produJeron patrones de protelnas mas intensos y claros, en relaclon a los de tejldo no pigmentado 0 ralces. Por la facilidad en la disposicion del material vegetal se uso bulbillos como muestra de tejldo para posteriores electroforesis. Comportamlento distmto se obtuvo en la detecclon de esterasas, donde el extracto de hOjas presento palrones mas c1aros. Los resultados antenores estan de acuerdo can los reportados par el prograrna de papa del CI Tibaitata utlhzando tuherculos y hojas de papa en la caracterizacion de germoplasma (informacion personal), y con Simmonds (1990) en la Identificacion de vanedades de arroz mediante esterasas de teJldos folia res Lo cual dlflere con 10 Indicado por Siqueira el. al. (1985), qUlenes enconlraron buena resolucion de las bandas al usar teJldo de rakes. Y bulbllios de ajo en electrororesls hOrizontal en geles de almldon. En la delermmacl6n de la concentracIon optIma de proteinas del extracto para obtener buenos electroforegramas, se reaho comparaclon cuahlativa de manchas de los extractos y manchas de seroalbumlna de concentraclon conoclda (como refeTencla) sobre papel de cromatografia. La concentraclon de proteinas en extracto de hOjas oscllo entre 40 y 160 I1g, can Incrementos sucesrvos de 20 I1g La prueba permltlo establecer que 120 )1g de prolerna en la muestra de hOJa es la canlldad adecuada para el desarrollo de las eleclroforesrs de cultlvares de aJo (FIgura 1). De la mlsma forma, se cuantrflco la concentraclon de proternas en los extractos de bulbillos, se vano drcha concentracl6n entre 27 y 51 ~lg can Intervalos de 4 )1g Se logr6 establecer que 47 ~lg de proterna y una allcuota de aproxlmadamente 10 ul de exlracto son cantldades adecua-. 95.

(6) REVISTA ICA, Vol. 28, Abril- Junio 1993 das para apreciar bandas claras en los electroforegramas (Figura 1). Una vez estandarizada la melodologia se realiz6 la electroforesis con los extractos de bulbillos de los 14 cultivares estudiados; posteriormente se evaluo la mOVIlidad de las bandas en los electroforogramas usando la combinacion del numero y localizacion de las mismas. EI metodo de electroforesis de proteinas de bulbillos mostro discriminacion de los culIlvares estudiados (Figura 2). En la evaluacion se tome como referencla el patron de albUmin a (clara de huevo); se dlstinguen dos patrones bien definidos, el de los materiales Costa Rica (CR) y Cnollo (C) patr6n A, el cual presenta las bandas Intensas 1F con movilidad de 0.4 y 2F con mOVIlidad de 0.73, ambas ausentes en el complejo de bandas homogeneas a los otros cultivares que contorman el patr6n B. De igual forma, el patron A presenta un conjunto de 12 bandas detimdas, mlentras que el otro patron (8) solo posee entre acho a nueve, algunas de las cuales son. de baja intensidad (Figura 2), 10 que sugiere que los cultivares dentro de cada patron pueden tener pedigrees simllares. La base genetica estrecha del ajo por descender de un solo tipo ancestral, su incapacidad para producir semilla sexual, el hecho de ser una especie introducida a Colombia y el reducido numero de cultivares evaluados, inducen a pensar en la poca variabilidad presente en esta colecci6n. Sin embargo, el desarrollo de las tecnicas electroforEWcas refJeja la existencia de diversidad genetica entre los materiales examinados. Ugarrreto (1992), en la caracterizacion morfologica y de rendimiento de los mismos cultivares de ajo, tambien encontro diterenciaci6n genetica entre las aceeslones (Costa Rica y Criollo) de patron electroforEHico A y los demas eultivares de patron 8. EI primer grupo se caracteriza por tener bulbos sin tunicas envolventes y dlentes pequenos de tamano inferior a 5 x 15 mm y el segundo grupo son cultivares de bulbos protegides per tlinicas y con. o. o !. .i. Ip'"-. 0.5. __. _~~ _ _ _..~4(D hOj-a " 10. __., __ - : 2:1l. "-. 1~. blIlbiUo. -fl'. 1.0. FIGURA 2. Patrones electroforelicos de proteinas totales de bulbillos y esterasas de hojas en geles de polyacrilamida de 10%.. 96.

(7) LIGARRETO M., G.A., ARTUNDUAGA S.R., Gerrnoplasma de ajo dientes en su mayo ria grandes de tamano superior a 5 x 15 mm. Los patrones de esterasas de hOjas correspondientes a las variedades de los grupos 2, 3 Y 4 de la clasificacion morfoagronomica (Tabla 1) aparecen en la Figura 2; en los electroforegramas no se distinguen patrones c1aros por movilidad. Solo se aprecia que los genotipos chilenos (grupo 3) pose en las dos bandas de la mitad del gel (1 G) con mayor intensidad relativa que los genotipos Peruano (P) y Morado Claro (ML) representativos del grupo 4 y de menor intensldad relatlva que los genotipos Arequipa (A) y Morado pequeno del grupo 2. Aun cuando hay baJa resoluclon para algunas bandas de los patrones de esterasas, se observa que en el genotipo Chlleno rojo (CR) hay un grupo de tres bandas seguido a las dos primeras, a diferencia del Chileno blanco (CB), que solo tiene un par de bandas; a su vez, Ja ultima banda vIsible de color "negro" esta definida en el ajo rOJo (CR) y dlfusa en el Chilena blanco (CB). No tue posible una dlferenciaci6n clara de los genotipos de los olros grupos, debldo a la falta de VIsualizaclon de las IsoenZlmas. Resultados similares son los comentados por Siquelra et. al. (1985) qUienes utlhzando las isoenzimas: PGI, ADH, EST Y PRX obtuvieron ocho patrones de bandas en la caracterizaclon de clones de a)o.. CONCLUSIONES 1.. La metodologia desarrollada es sencllIa y rapida para hacer estudlos de descnpcion electroforetlca en ajo (Allium sativum L.).. 2.. Mediante la electroforesis de proteina total de bulbillos se dlferenciaron dos grupos de cultlvares, 10 que refleja la existencla de vanabilidad genetlca.. 3.. Los cultivares que representan a los grupos 2 (Arequipa y Morado peque-. no), 3 (Chile no) y 4 (Peruano y Morado Claro) difieren en la intensldad relativa de las bandas en los patrones electroforeticos de esterasas de hojas. 4.. Para corroborar la c1asificacion entre vanedades de ajo se sugiere reahzar electroforesls con otros marcadores geneticos.. 5.. La tecnica presenta una valiosa ayuda en la dlferenciaci6n de cultivares de ajo, 10 cual es importante en el mantenimlento de los bancos de germoplasma y registro de variedades. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS. 1.. Aslley, D.; Innes, N.I.; Van Der Meer, O. 1982 Genehc resources of allium species Roma, IBPGR 38 P. 2.. Burba, J.L. 1988 Estudlo prehmmar de descnpctores moriol6glcos para caractenzacI6n de Banco de Germoplasma de aJo ( AllIum satlVum L) En Hortlcultura Argentina 7 (15) 65-70. 3.. Contreras, A.; Mansllla, R. 1989 Eleclroforesls de proleinas y esterasas como metoda qUlmlco de Identlficaclon en papas Turnalba 39 (2) 193-198. 4.. FAO.Organizacion de las Naclones Unldas para la Agncuttura y la ahmentaci6n. 1991 Manual de mtercamblo y propagaclon de gerrnoplasma de alo a traves de microbulbillos Santiago de Chile, 45 p. 5.. Gonzalez, A.S.; Gomez, P.L. 1987 Caractenzaclon blOquimlca del gusano blanco de la papa (Premnotrypes vo~ por media de separacI6n electroforetlca Bogota, ICA, Programa de papa 28p. 6.. Huaman, Z. 1986 Conservaclon de recursos genetlcos de papa en el CIP Centro Internaclonal de la papa Circular, 14 (2) 1-7. 7.. Hussain, A.; Ramirez, H.; Roca, W. 1986 Ma· nual practlco para deteccI6n electroforetlca de Isoenzlmas y otras protemas Cail Cia!, 65 p (Documento de trabaJo No 19). 8.. Instltuto Colomblano Agropecuarlo. 1991 Estadlsllcas colectadas por Creced Sabana de Bogota, ICA Seccl6n de Hortahzas (sin pubhcar). 9.. Ligarreto, G A. 1992 CJasificacl6n morfologlca. y rendlmlento de 14 cultlvares de alo (Afllum salwum L) 16 P (mlmeografiado. matenallnedlto). 97.

(8) 98. 10.. Simmonds, R. 1990. Ensayos para iden!rlicm varied.:ldcs comcrci.:llcs de arroz. Santal6 de Bogota (Colombi,,). Univcrsidod Nacional de Colombia, Tcsis Mag . Sci 84 p.. 11.. Siquelra, .J.W.: Medina, H.P.; Lisbon, R.S.; fornaslcr, J.B. 1985. Caracterlza'Y<lo tsoenzi· matica e morfologica de clones 0 introducoes de alho Aevisfa Bragantia. Carnpinas, Sao PauloBraSil). 44 (1)' 357-374. 13..

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