Estudio de estabilidad de refresco de mortiño (Vaccinium floribundum)

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA EQUINOCCIAL

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA INGENIERÍA E

INDUSTRIAS

CARRERA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS

ESTUDIO DE ESTABILIDAD DE REFRESCO DE MORTIÑO

(Vaccinium floribundum)

TRABAJO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO

DE INGENIERO DE ALIMENTOS

CRISTIAN ALEXANDER GUERRERO CASTILLO

DIRECTORA: BIOQ. MARÍA JOSÉ ANDRADE CUVI

DECLARACIÓN

Yo CRISTIAN ALEXANDER GUERRERO CASTILLO, declaro que el trabajo aquí descrito es de mi autoría; que no ha sido previamente presentado para ningún grado o calificación profesional; y, que he consultado las referencias bibliográficas que se incluyen en este documento.

La Universidad Tecnológica Equinoccial puede hacer uso de los derechos correspondientes a este trabajo, según lo establecido por la Ley de Propiedad Intelectual, por su Reglamento y por la normativa institucional vigente.

_________________________ Cristian Alexander Guerrero Castillo

CERTIFICACIÓN

Certifico que el presente trabajo que lleva por título “Estudio de Estabilidad de Refresco de Mortiño (Vaccinium floribundum)”, que, para aspirar al

título de Ingeniero de Alimentos fue desarrollado por Cristian Alexander Guerrero Castillo, bajo mi dirección y supervisión, en la Facultad de Ciencias de la Ingeniería e Industrias; y cumple con las condiciones requeridas por el reglamento de Trabajos de Titulación artículos 19, 27 y 28.

____________________________

Bioq. María José Andrade Cuvi

DIRECTORA DEL TRABAJO

DEDICATORIA

Dedico de manera especial este trabajo a mi mamá Tania, pues ella ha sido no tan solo una madre, sino también un padre y una fiel amiga, que pese a todos mis errores fue el pilar principal para construir mi vida profesional. Supo apoyarme en los peores momentos sin perder la fe en mí, ella es el motivo por el cual deseo superarme cada día y por su corazón, coraje y manera de ser cada día siento que la amo más.

Gracias por todo mamá, agradezco a Dios por concederme una de las mejores mamás.

A mi abuelito o mejor dicho mi padre, que desde el cielo me observa y no puedo defraudarlo, supo formarme como un buen hombre, me brindó su amor, afecto y apoyo mientras estuvo presente, siempre quiso lo mejor para mí, sin duda alguna... Muchas gracias por todo papá.

AGRADECIMIENTOS

Agradezco primeramente a Dios por concederme a la madre que tengo, puesto que fue ella quien me dio la oportunidad de estudiar en esta hermosa Universidad, en ella conocí a personas que supieron brindarme su conocimiento y amistad durante todo este tiempo.

Gracias a toda mi familia, especialmente a mi padre por construir los cimientos para ser un hombre de bien, gracias a mis primos el Ing. Christian Alcocer y Físico Frank Alcocer por ayudarme siempre y desinteresadamente cuando los necesité tanto en mi vida personal como estudiantil.

Gracias a la Bioq. María José Andrade por ser mi directora de tesis y siempre brindar una solución a mis problemas, ayudarme, guiarme y brindarme su amistad en todo este proceso. Al Dr. Juan Bravo, que pese a varias diferencias ha sabido aconsejarme tanto en el ámbito emocional y del aprendizaje, y a la Ing. Teresa Guerrero que con su excepcional manera de ser siempre estuvo pendiente de mí alentándome y brindando sus consejos.

FORMULARIO DE REGISTRO BIBLIOGRÁFICO PROYECTO DE TITULACIÓN

DATOS DE CONTACTO

CÉDULA DE IDENTIDAD: 1725508020

APELLIDO Y NOMBRES: Guerrero Cristian Alexander

DIRECCIÓN: Cdl. Ibarra S41e y Oe10I

EMAIL: alexanderguerrero0509@gmail.com

TELÉFONO FIJO: 3051261

TELÉFONO MOVIL: 0983346413

DATOS DE LA OBRA

TITULO: ESTUDIO DE ESTABILIDAD DE

REFRESCO MORTIÑO (Vaccinum

floribundum)

AUTOR O AUTORES: Cristian Guerrero Castillo

FECHA DE ENTREGA DEL PROYECTO

DE TITULACIÓN: Junio, 2016

DIRECTOR DEL PROYECTO DE

TITULACIÓN:

Bioq. María José Andrade Cuvi

PROGRAMA PREGRADO POSGRADO

TITULO POR EL QUE OPTA: Ingeniería de Alimentos

RESUMEN: El objetivo del presente estudio fue

determinar la estabilidad físico-química, microbiológica y sensorial del refresco de mortiño. Las muestras de refresco envasadas en botellas de vidrio color ámbar se mantuvieron almacenadas en ausencia de luz durante 45 días a temperatura ambiente y 90 días en refrigeración. A los 0, 7, 15, 30, 45 y 90 días (únicamente en las muestras refrigeradas) se realizaron análisis físico químicos (sólidos solubles totales -SST-, pH, acidez total -AT- y color (L*, Cr* y Hue), microbiológicos (coliformes totales -CT-, coliformes fecales -CF-, aerobios mesófilos totales -RT-, mohos y levaduras) y

PALABRAS CLAVES: Capacidad antioxidante, antocianinas, estabilidad, microbiología.

ABSTRACT: The objective of the present study was to

reduced in a 45 and 10 % for the last day of storage of refrigerated drinks and environment, respectively. The global analysis of result indicates that the drink maintains their physical-chemical, microbiological and sensory during 45 days at temperature ambience and during 90 days under refrigeration, in addition to providing with compounds with antioxidant activity being a healthy alternative for consumers.

KEYWORDS Antioxidant capacity, anthocyanins,

stability, microbiology.

Se autoriza la publicación de este Proyecto de Titulación en el Repositorio Digital de la Institución.

f:__________________________________________ Guerrero Castillo Cristian Alexander

DECLARACIÓN Y AUTORIZACIÓN

Yo, GUERRERO CASTILLO CRISTIAN ALEXANDER, CI.: 1725508020 autor del proyecto titulado: Estudio de estabilidad de refresco de mortiño (Vaccinum floribundum) previo a la obtención del título de GRADO ACADÉMICO COMO APARECE EN EL CERTIFICADO DE EGRESAMIENTO en la Universidad Tecnológica Equinoccial.

1. Declaro tener pleno conocimiento de la obligación que tienen las Instituciones de Educación Superior, de conformidad con el Artículo 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior, de entregar a la SENESCYT en formato digital una copia del referido trabajo de graduación para que sea integrado al Sistema Nacional de información de la Educación Superior del Ecuador para su difusión pública respetando los derechos de autor.

2. Autorizo a la BIBLIOTECA de la Universidad Tecnológica Equinoccial a tener una copia del referido trabajo de graduación con el propósito de generar un Repositorio que democratice la información, respetando las políticas de propiedad intelectual vigentes.

Quito, 29 de Abril del 2014.

f:__________________________________________ Guerrero Castillo Cristian Alexander

i

ÍNDICE DE CONTENIDOS

PÁGINA

RESUMEN vii

ABSTRACT viii

1.INTRODUCCIÓN 1

2.MARCO TEÓRICO 3

2.1.MORTIÑO 3

2.1.1. GENERALIDADES 3

2.1.2. COMPOSICIÓN QUÍMICA 5

2.1.3.USOS 6

2.1.4.COMERCIALIZACIÓN 7

2.1.5.CULTIVO Y UBICACIÓN GEOGRÁFICA EN ECUADOR 8

2.1.5.1.Poscosecha 10

2.2.BEBIDAS NO ALCOHÓLICAS 11

2.2.1.COMPOSICIÓN 12

2.2.2.BEBIDAS REFRESCANTES 13

2.3.VIDA DE ANAQUEL EN LOS ALIMENTOS 14

2.3.1.DETERMINACIÓN DE LA VIDA EN ANAQUEL 15

2.3.2.ANÁLISIS SENSORIAL 16

2.4.ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE 18

2.4.1.ANTIOXIDANTES 18

2.4.2.CAPACIDAD ANTIOXIDANTE 19

ii

PÁGINA

2.4.3.1.Antocianinas 20

3.METODOLOGÍA 22

3.1.ELABORACIÓN DE LA BEBIDA DE MORTIÑO 22

3.2.ESTUDIO DE ESTABILIDAD DE LA BEBIDA 23

3.2.1.ANÁLISIS FÍSICO-QUÍMICO 23

3.2.1.1.Sólidos Solubles (SS) 23

3.2.1.2.Potencial de Hidrógeno (pH) 23

3.2.1.3.Acidéz Titulable (AT) 24

3.2.1.4.Colorimetría 24

3.2.2.ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS 25

3.2.2.1.Preparación de la muestra 25

3.2.2.2.Recuento de Coliformes Totales y Fecales 26 3.2.2.3.Recuento de Aerobios Mesófilos Totales 26

3.2.2.4.Recuento de Mohos y Levaduras 27

3.2.3.ANÁLISIS DE ANTIOXIDANTES 27

3.2.3.1.Concentración de antocianinas 27

3.2.3.2.Actividad antioxidante 28

3.2.4.ANÁLISIS SENSORIAL 28

4.ANÁLISIS DE RESULTADOS 30

4.1.ESTABILIDAD FÍSICO-QUÍMICA DEL REFRESCO DE MORTIÑO 30 4.1.1. SÓLIDOS SOLUBLES (SS), pH Y ACIDEZ TITULABLE (AT) 30

iii

PÁGINA

4.2.PARÁMETROS MICROBIOLÓGICOS DEL REFRESCO DE

MORTIÑO 36

4.3.CONCENTRACIÓN DE ANTOCIANINAS EN EL REFRESCO DE

MORTIÑO 39

4.4.ESTABILIDAD EN ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EN EL REFRESCO

DE MORTIÑO 41

4.5.ESTABILIDAD SENSORIAL DEL REFRESCO DE MORTIÑO 43

5.CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 45

5.1.CONCLUSIONES 45

5.2.RECOMENDACIONES 47

BIBLIOGRAFÍA 48

iv

ÍNDICE DE TABLAS

PÁGINA Tabla 1. Clasificación taxonómica del mortiño (Vaccinium

floribundum Kunth)

3

Tabla 2. Composición química del mortiño 5

Tabla 3. Requerimientos para el cultivo de mortiño 9

Tabla 4. Formulación de Refresco de Mortiño (Vaccinium floribundum)

22

Tabla 5. Valores Z para una prueba triangular 29

Tabla 6. Efecto del tiempo de almacenamiento en los sólidos solubles del refresco de mortiño

31

Tabla 7. Efecto del tiempo de almacenamiento en estabilidad del pH del refresco de mortiño

31

Tabla 8. Efecto del tiempo de almacenamiento en acidez

titulable del refresco de mortiño 32

Tabla 9. Recuento microbiológico de coliformes totales (CT), coliformes fecales (CF), aerobios mesófilos (RT), mohos y levaduras (M+L) en refresco de mortiño almacenado a temperatura ambiente y en refrigeración.

37

Tabla 10. Efecto del tiempo de almacenamiento sobre contenido de antocianinas totales en el refresco de mortiño

40

Tabla 11. Efecto del tiempo de almacenamiento sobre la capacidad antioxidante del refresco de mortiño

42

Tabla 12. Efecto del tiempo de almacenamiento en la estabilidad sensorial del refresco de mortiño

v

ÍNDICE DE FIGURAS

PÁGINA

Figura 1. Frutos de mortiño 4

Figura 2. Efecto del tiempo de almacenamiento sobre la

vi

ÍNDICE DE ANEXOS

PÁGINA

Anexo I. Panel sensorial 68

Anexo II. Pasteurización de la bebida de mortiño 69

vii

RESUMEN

viii

ABSTRACT

1

1. INTRODUCCIÓN

El mortiño (Vaccinum floribundum) es un fruto de origen andino, se produce de forma silvestre en las partes elevadas de la cordillera de Los Andes, su cultivo es realizado entre los 3400 hasta los 4500 m.s.n.m. Datos proporcionados por el Parque Nacional Cotopaxi señalan que el mortiño puede adaptarse desde los 1000 hasta los 4500 m.s.n.m. (Pérez & Valdivieso, 2007). El fruto es recolectado de forma manual por miembros de las comunidades indígenas en los meses comprendidos entre octubre y diciembre de cada año, en algunas zonas se ha obtenido una segunda cosecha entre los meses de Enero a Marzo (Sanjinés, Oliigaard, & Balslev, 2006).

Según al Departamento de Agricultura de los Estados Unidos en Ecuador se ha registrado tan solo una especie, Vaccinium floribumdum (Ramirez & Williams, 2003), sin embargo la Pontifica Universidad Católica del Ecuador señala que se encuentran registradas tres variedades de mortiño Vaccinium distichum, Vaccinium crenatum y Vaccinium floribundum siendo éste último el

más común (Pérez & Valdivieso, 2007).

De acuerdo a su comportamiento respiratorio, el mortiño es un fruto climatérico con una tasa de respiración moderada (10 – 20 mg CO2 kg-1 _h-1_{) y} de baja producción de etileno (0.1-1.0 µL C2H4 kg-1 _h-1_{). Además es} considerado un fruto no susceptible a las bajas temperaturas luego de su cosecha (Ávila & Cuspoca, 2007; Kader, 2002). Puede ser almacenado en un entre 10 a 14 días a temperaturas de 1 a 2 °C (Ávila & Cuspoca, 2007; Thiele, 1999).

2 humedad entre 84.2 y 85.6 % (Vallejo, 2000), además su consumo reduce los niveles de azúcar (Morales, 2000).

El mortiño ha sido utilizado desde la antigüedad por los campesinos, principalmente para la elaboración de la tradicional colada morada, es un fruto inusual el cual es consumido directamente en jugos, dulces, flanes, tortas, helados y vinos (Morales, 2000). De acuerdo a varios estudios, el mortiño posee propiedades físico-químicas las cuales le otorgan la ventaja de ser refrigerado y no sufrir ningún tipo de alteración en sus características organolépticas y nutricionales, ni variación alguna en su peso o volumen (Coba et al., 2012). En Ecuador, no se registran estudios publicados sobre el uso del mortiño como materia prima de un refresco Proaño (2015), ha desarrollado una formulación para este producto desconociéndose la vida útil del producto.

En el presente trabajo se determinó la estabilidad del refresco de mortiño (Vaccinium floribundum).

Los objetivos específicos planteados fueron:

 Realizar una caracterización físico-química y microbiológica del

refresco obtenido a partir del mortiño durante el almacenamiento.  Determinar la estabilidad de la capacidad antioxidante y contenido de

antocianinas en el refresco de mortiño durante el almacenamiento.  Determinar la estabilidad sensorial del refresco de mortiño durante el

3

2. MARCO TEÓRICO

2.1. MORTIÑO

2.1.1. GENERALIDADES

El mortiño es conocido como una fruta climatérica ancestral que proviene de una planta silvestre característica de climas fríos en países como Colombia, Bolivia, Venezuela y Ecuador, en éste último proveniente específicamente de la parte alta de la Cordillera de los Andes. Este producto también es conocido como uva de los Andes, manzanilla de cerro, raspadura quemada, lingoberry, blueberry, arándano, uva de monte, congama, entre otros (Andrade, 2012; Coba et al., 2012; Sanjinés et al., 2006).

La clasificación taxonómica del mortiño se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1. Clasificación taxonómica del mortiño.

Reino Plantae

División Magnoliophyta

Clase Magnoliopsida

Orden Ericales

Familia Ericaceae

Género Vaccinium Especie floribundum

(Pérez & Valdivieso, 2007)

4 450 especies, las cuales son muy comunes en países pertenecientes al Hemisferio Norte y las zonas montañosas de Centroamérica y Norte de Suramérica (Abreu, Cuéllar, & Prieto, 2008).

El mortiño (Vaccinium floribundum) crece como arbustos pequeños algunas ocasiones de forma ramificada, de 1.5 hasta 2.5 m de alto. Sus hojas son pequeñas alternadas entre sí midiendo 2 cm de largo, son duras, lanceoladas y con borde aserrado, sus flores miden 8 mm de largo, se presentan solitarias o en racimos poseen una corola cilíndrica con 4 o 5 dientes de color blanco o rosado rojizo, poseen de 8 a 10 estambres (Aguilar et al., 2009).

Los frutos son bayas que miden entre 5 a 8 mm de diámetro (Aguilar et al., 2009), cuyo color cambia de verde a azul – morado y morado oscuro cuando han alcanzado cierto grado de madurez, con pulpa de color verde (Figura 1) y su contenido de antocianinas se localiza en la cáscara (Sanjinés et al., 2006), cuya característica es la textura cerosa gracias a la presencia de pruinas. Su sabor es agridulce y bastante aromático (De La Cruz, 2011; Barrios de León, 2007).

5

2.1.2. COMPOSICIÓN QUÍMICA

El mortiño ha sido catalogado como una baya con alto contenido de vitaminas y fibra, totalmente libre de colesterol y bajo contenido de grasa y sodio (USDA, 2010). En la Tabla 2, se presenta la composición química del fruto de mortiño.

Tabla 2. Composición Química del mortiño.

Componente Cantidad / 100 g

pH 2.92

Análisis Proximal

Humedad (g/100 g) 81.0 ± 2.00 Grasa (g/100 g) 1.0 ± 0.04 Proteína (g/100 g) 0.7 ± 0.02 Ceniza (g/100 g) 0.4 ± 0.03 Carbohidratos totales (g/100 g) 16.9 ± 0.10 Fibra dietética total (g/100 g) 7.6 ± 2.20 Fibra dietética soluble (g/100 g) 1.2 ± 1.00 Fibra dietética insoluble (g/100 g) 6.5 ± 2.50

Azúcares solubles

Fructosa (g/100 g) 4.4 ± 0.4 Glucosa (g/100 g) 2.6 ± 0.3

Valor calórico (Kcal/100 g PF) 84 ± 0.4

Ácidos orgánicos

Ácido cítrico (mg/100 g) 3142 ± 614 Ácido málico (mg/100 g) 1823 ± 274

6

Minerales

Fe (mg/100 g) 0.64 ± 0.20 K (mg/100 g) 607 ± 73.00 Ca (mg/100 g) 17.0 ± 2.30 Mg (mg/100 g) 10.2 ± 1.1 Cu (mg/100 g) 0.12 ± 0.02 Zn (mg/100 g) 0.13 ± 0.02

Componentes antioxidantes

Ácido ascórbico (mg/100 g) 9.0 ± 2.0 β-caroteno (µg/100 g) 36.0 ± 6.0 Contenido fenólico soluble total (mg

AG/100 g) 882 ± 38 Capacidad antioxidante TEAC (mg

Trolox/100 g) 1203 ± 94 (Vasco, 2009)

Según Vasco (2009), las hojas del mortiño también pueden contribuir con flavonoides derivados de la quercetina, en un 6 a 10 % taninos catéquicos, ácidos fenólicos, ácidos triterpénicos y 9 ppm de leucoantocianidinas y cromo.

2.1.3. USOS

7 hojas sirven para la recuperación de bosques quemados en la reforestación de páramos además de ser alimento para ganado bovino (Aguilar et al., 2009). El fruto destaca por su alto contenido de antioxidantes (vitaminas del complejo B y C) y minerales (K, Ca y P) (Arjona, 2001), estudios han determinado que los frutos del género Vaccinium tienen un contenido de antioxidantes tres veces superior al de frambuesas o fresas (Kalt, Forney, Martin, & Prior, 1999). Por su alto contenido antioxidantes su consumo reduce y evita la oxidación de otras moléculas por esa razón el mortiño ha sido utilizado farmacológicamente para el tratamiento de accidentes cerebro-vasculares y enfermedades neurodegenerativas. De acuerdo a investigaciones, el consumo de altas cantidades de antocianinas y polifenoles en alimentos reduce el riesgo de padecer cáncer, enfermedades cardiacas y neurológicas (Noboa, 2010). El consumo de mortiño se recomienda a personas con diabetes, puesto que reduce los niveles de azúcar en la sangre (Morales, 2000). A los 143 días de su formación, el fruto cuenta con los niveles más altos de fenoles, es decir que un fruto maduro posee valores más altos de fenoles totales (INIAP, 2006). Además de su consumo en fresco, el mortiño es un ingrediente importante en la elaboración de mermeladas, jaleas, jugos, vinos, helados, harina, productos de panificación y como alimento principal en algunos platillos gastronómicos (Gallardo, 2015; Coba et al., 2012); en Ecuador es utilizado de forma tradicional en la elaboración de colada morada en el Día de Difuntos (Estrella, 1986) y recientemente Proaño (2015) ha empleado el extracto del fruto para la elaboración de un refresco con capacidad antioxidante.

2.1.4. COMERCIALIZACIÓN

8 químicas, las bajas temperaturas no alteran ninguna de sus características (incluyendo peso y volumen) manteniéndose así el comercio fuera de la época de cosecha. En Ecuador se comercializa en mercados locales para luego ser procesado y consumido tanto en jugos como coladas y debido a su estacionalidad; en la actualidad se prueba la reproducción in-vitro para mantener la venta de fruto fresco a lo largo del año (Coba et al., 2012).

2.1.5. CULTIVO Y UBICACIÓN GEOGRÁFICA EN ECUADOR

Según datos de la USDA (U.S. Department of Agriculture) en Ecuador se registra a Vaccinium floribundum como la única especie de mortiño existente mientras que el Herbario de la Universidad Católica del Ecuador registra otras dos especies más: Vaccinium distichum y Vaccinium crenatum (especies localizadas en las provincias de Azuay y Loja) atribuyéndose esta variabilidad a la diversidad de suelos y materia orgánica existente en la zona (Coba et al., 2012; Luteyn, 2002).

La especie Vaccinium floribundum se puede encontrar en las provincias de Carchi (en la parte más alta del Ángel), Imbabura, Cotopaxi, Tungurahua, Bolívar, Chimborazo, Cañar, Azuay y Loja (Coba et al., 2012). De acuerdo a el Ministerio de Comercio Exterior (MCE, 2015) el mortiño es considerado un fruto de características silvestres por lo que no requiere ningún tipo de tratamiento. La producción de mortiño en Ecuador se limita a la recolección en los páramos de la región andina puesto que no existe un cultivo racional del fruto y únicamente crece de forma silvestre (Fuentes, 2008).

9 (2006), la recolección óptima de los frutos mortiño es a los 143 días puesto que el fruto está completamente maduro y presenta la mayor cantidad de fenoles totales. La cosecha de mortiño presenta un rendimiento promedio de 1000 kg/ha (Collazos, 2000).

El Parque Nacional Cotopaxi ha proporcionado datos acerca de la adaptación del mortiño desde los 1000 m.s.n.m. hasta los 4500 m.s.n.m.; sin embargo debido a la extensión de las áreas agrícolas se ha desplazado a esta especie a las zonas con una atura desde los 3400 a los 4500 m.s.n.m. (MAGAP, 1998). El mortiño se desarrolla en climas típicos de páramo, es decir en ambientes fríos y húmedos con temperaturas que oscilan entre los 0 a 30 °C. El cultivo de mortiño al ser un fruto silvestre no requiere de productos agroquímicos para su desarrollo (Noboa, 2010). En la Tabla 3, se resumen los requerimientos para el cultivo de mortiño:

Tabla 3. Requerimientos para el cultivo de mortiño.

Altitud 1400 – 4500 m.s.n.m.

Clima Frío – templado

Temperatura 8 – 16 °C

Humedad 60 – 80 %

Suelo Arenoso, húmedo drenado, suelto, rico en

materia orgánica y con buen drenaje.

pH 4.0 – 5.0

Tiempo de vida Perdurable

Pluviosidad 800 – 2000 mm

10

2.1.5.1. Poscosecha

Tras la cosecha, la venta artesanal del mortiño en mercados consiste en un fruto libre de pedúnculo, en algunas ocasiones lavado, que comúnmente se halla conglomerado en cestos de mimbre, carrizo o cajas de madera, y donde el consumidor obtiene el fruto empacado por peso en fundas plásticas y a temperatura ambiente; mientras tanto el comercio destinado a micromercados y supermercados seleccionan el fruto, lo empacan y refrigeran en envases plásticos tipo “clamshell” que permiten mejor manejo del producto disminuyendo el daño poscosecha y en otras ocasiones el empaque se lleva a cabo en canastillas de poliestireno con celofán cuyo peso no debe sobrepasar los 500 g (Andrade, 2012; SICA, 2001).

11 El transporte en envases con orificios permite al fruto respirar evitando su fermentación y la pérdida de agua. Bajo condiciones adecuadas de respiración el mortiño puede conservarse fresco por un periodo de tiempo de hasta 10 días sin necesidad de refrigeración. En condiciones óptimas de refrigeración y debidamente envasado su tiempo de vida útil puede extenderse hasta 20 días, en congelación el mortiño puede mantener sus propiedades funcionales hasta por periodos de un año (Patiño, 2013). Un control de temperatura de 4 °C y humedad relativa entre 80 – 90 % permite una vida útil entre 14 y 28 días (De la Cruz, 2011; Riveros & Santacoloma, 2006). Como se mencionó anteriormente, el mortiño se ha utilizado principalmente para la elaboración de la colada morada, además es consumido directamente en jugos, dulces, flanes, tortas, helados y vinos (Morales, 2000); debido a su alto contenido de antioxidantes ha sido utilizado para el desarrollo de un refresco usando extracto del fruto como parte de la formulación (Proaño, 2015).

2.2. BEBIDAS NO ALCOHÓLICAS

Según la FAO (1997) las bebidas no alcohólicas se clasifican en dos tipos:  No carbonatadas: jugo de frutas, refrescos de fruta, néctares de

fruta, café y té.

 Carbonatadas: sodas y agua tónica.

12 algunos refrescos o jugos se deben consumir en su totalidad una vez abiertos (FAO, 1997).

A nivel nacional, la norma ecuatoriana INEN 2 304 describe a un refresco como aquel producto elaborado con agua potable, ingredientes y aditivos permitidos describiendo que podrían tener en suspensión alguna parte de la pulpa (excluye cáscaras, semillas, otros restos gruesos y duros) y deben cumplir con las normas de seguridad según el Codex Alimentario y la FDA.

2.2.1. COMPOSICIÓN

Un refresco contiene aditivos como saborizantes, colorantes, estabilizantes, edulcorantes y agua.

- Saborizantes.- Son compuestos de origen natural o sintético con características aromatizantes y sápidas capaces de añadir e intensificar el sabor o el aroma de un alimento (SICE, 2006).

- Colorantes.- Son pigmentos naturales o artificiales que si bien no contribuyen con nutrientes a la dieta, mejoran el aspecto de un producto y se dividen en dos grupos:

 Colorantes certificados: aquellos producidos artificialmente y que necesitan ser controlados y analizados en cada lote hasta catalogarse como seguros para el consumo humano.

 Colorantes exentos de certificación: aquellos derivados de fuentes naturales cuyo control consiste en el cumplimiento de especificaciones químicas y de pureza (FDA, 2006).

13 - Estabilizantes.- Son gomas hidrocoloides que alteran la movilidad del agua cuya adición directa o indirecta durante el procesamiento de un alimento afecta la textura, funcionalidad física o la estabilidad física del mismo. Los estabilizantes deben ser utilizados en cantidades muy bajas para no causar diferencias significativas en un alimento o bebida (Tharp & Yound, 2009).

- Edulcorantes.- El edulcorante calórico más conocido es el azúcar de mesa o sacarosa. Industrialmente este compuesto se disuelve y se filtra ya sea por gravedad o presión para eliminar cualquier tipo de impureza que pueda transferirse a la bebida (Salinas, 2002). De acuerdo al tipo de bebida no alcohólica, también se pueden emplear edulcorantes no calóricos permitidos por la ley como Acesulfame K, aspartame, ciclamatos, sucralosa, entre otros.

- Agua.- La adición de agua en una bebida no alcohólica es opcional dependiendo del tipo de producto final a obtener, por ejemplo el interés de ciertos consumidores puede basarse en concentrados de una fruta, jugos puros, entre otros, pero en casos de néctares, refrescos y algunos jugos la adición de agua es un parámetro de alto control durante el procesamiento ya que es un componente que al igual que el resto de ingredientes debe asegurar la inocuidad del producto y la salud humana (Salinas, 2002). Así, el agua empleada debe ser potable (diferente al agua de uso local), inodora, incolora, insípida y libre de impurezas físicas, químicas y biológicas para lo cual pasa por un proceso de depuración hasta cumplir con rigurosas normas de calidad (Hirsheimer, 2008).

2.2.2. BEBIDAS REFRESCANTES

14 dentro de esta clasificación se excluyen: los zumos puros de frutas, agua, leche y sus bebidas derivadas, bebidas energéticas o estimulantes y nutricionalmente se puede destacar su aporte calórico siendo de 20 a 40 kcal por cada 100 ml de bebida, además del contenido de agua presente considerándose bebidas hidratantes junto con el transporte de vitaminas y minerales (De Rufino, 2013).

Según la RTS (Reglamentación Técnica Sanitaria) de España (1992) la clasificación de las bebidas refrescantes se divide en los siguientes tipos:

 Agua carbonatadas

 Aguas aromáticas incoloras

 Gaseosas incoloras carbonatadas

 Bebidas refrescantes coloreadas, turbias o transparentes  Bebidas refrescantes de extractos

 Bebidas refrescantes de zumos de fruta  Bebidas refrescantes disgregados de fruta  Bebidas refrescantes mixtas

 Bebidas refrescantes para diluir  Polvos o granulados

Actualmente la tendencia del uso de materias primas locales como el mortiño para el desarrollo de nuevos productos ha permitido la formulación del refresco de mortiño, sin embargo con el objetivo de evaluar la factibilidad técnica de elaboración de este tipo de refrescos es necesario conocer el tiempo de vida de anaquel del producto.

2.3. VIDA DE ANAQUEL EN LOS ALIMENTOS

15 calidad del producto para ser consumido sin afectar la salud humana; cualquier cambio en estos factores, ya sea por influencia de los materiales empleados o el medio donde este se encuentran, dan paso a la pérdida de vida útil o falta de estabilidad del mismo.

2.3.1. DETERMINACIÓN DE LA VIDA EN ANAQUEL

Cada producto tiene en su composición un elemento o característica que, al cambiar en el tiempo ocasiona una pérdida de calidad en el mismo y, en algunos casos, de forma más notoria crean reacciones de rechazo en el consumidor, es así que para la determinación de la vida útil se necesita determinar aquella(s) variable(s) que puedan afectar de manera directa en la calidad del producto (Brody, 2003). Algunas de estas variables de análisis pueden ser: color, textura, sabor, pérdida de un nutriente específico, incremento en la presencia de un compuesto no deseado o la proliferación bacteriana (Enríquez & Vilcapoma, 2012).

Definida la variable de importancia, el alimento debe someterse a un estrés bajo condiciones controladas de almacenamiento y muestreo con el objetivo de determinar una cinética de reacción que establezcan los límites de tiempo para su consumo y comercialización. Las herramientas empleadas tienen un propósito específico, así por ejemplo:

 Los modelos matemáticos son de gran utilidad para la determinación del crecimiento microbiano y muerte celular.

 El empleo de pruebas en tiempo real se aplican a productos cuya vida

de anaquel estimada es corta o alimentos que se comercializan frescos.

16 condiciones severas para posteriormente emplear predicciones de condiciones reales (Charm, 2007).

2.3.2. ANÁLISIS SENSORIAL

Uno de los análisis para determinar la estabilidad de un alimento es el análisis sensorial, una técnica que emplea los sentidos del cuerpo humano para terminar calidad y lo lleva a cabo un panel de jueces entrenados para calificar el alimento en cuestión (Enríquez & Vilcapoma, 2012).

El objetivo general de estas pruebas es obtener resultados confiables sobre aspectos de interés de un producto como pueden ser el color, sabor, aroma, textura, aceptabilidad global, entre otros, por lo que se debe tener especial cuidado en aquellas condiciones externas que pueden influir psicológicamente en el juez además de sus condiciones mentales y físicas (Navas, 2007). Hough (2005) y Anzaldua (1994) describen algunos parámetros a tener en cuenta al realizar una prueba sensorial:

 Puesto de evaluación: debe diseñarse como un puesto individual, libre de distracciones externas, que no permita compartir opiniones con otro evaluador y donde se controlen todas las condiciones externas. Además deberá disponer de iluminación adecuada que no afecte el ánimo del juez, en algunos casos se emplean lámparas para enmascarar cambios de color; deberá contar con extractores de aromas.

17  Muestras: deberán preparase en una zona anexa al lugar de análisis, mantener una temperatura igual y adecuada y mantener características similares.

 Codificación: cada muestra tiene un código diferente usualmente de tres dígitos elegidos.

 Agente neutralizante: agua pura para enjugar la boca y eliminar cualquier residuo de una muestra que pueda afectar en la evaluación de otra. En algunos casos las galletas pueden jugar el papel de un neutralizante.

 Entrenamiento: tiene como finalidad desarrollar la capacidad de detectar, reconocer y describir estímulos sensoriales relacionados al producto que se evaluará.

Dependiendo del tipo de resultado deseado, las pruebas sensoriales se pueden clasificar en tres tipos:

 Pruebas de diferencia: establece diferencias entre dos o más muestras mediante pruebas triangulares, dúo-trío, comparación apareada y ordenamiento.

 Pruebas descriptivas: aquí se determina la magnitud o importancia de los atributos de un producto sin ser medidas de preferencia. Se aplican análisis cuantitativo descriptivo y análisis cualitativo descriptivo.

 Pruebas de preferencia: permiten conocer la preferencia de un juez sobre una muestra u otra mediante pruebas de aceptación, escala hedónica y ordenación por preferencia (Anzaldúa, 1994).

18

2.4. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

Un proceso natural del organismo es el envejecimiento celular, como una consecuencia de la acumulación de radicales libres generados de forma natural por metabolismo celular (teniendo como fuente principal las mitocondrias) o por factores químicos o medio ambientales (Vargas, Rivas, Nursamaa, & Zoltan, 2007). Los radicales libres se definen como moléculas inestables altamente reactivas que en su estructura atómica tienen un electrón desapareado y por su configuración espacial se combinan con facilidad con la mayoría de biomoléculas celulares provocando daño en sus membranas por oxidación. La combinación de radicales libres con proteínas provocan la ruptura de las cadenas de aminoácidos impidiendo su adecuado desarrollo y aún más grave en la cadena de ADN produce bases modificadas principales responsables de cáncer y mutaciones (Criado & Moya, 2009; Gilca, Staian, Atanasiu, & Virgolici, 2007; Halliwell, 1999).

El daño o estrés oxidativo se caracteriza por conllevar una alteración en el funcionamiento celular provocando enfermedades relacionadas a la muerte celular. Este daño se produce cuando no existe un equilibrio entre la producción de radicales libres y su neutralización ya sea por sobreproducción de estos, déficit de sistemas antioxidantes o un conjunto de ambas causas (Criado & Moya, 2009).

2.4.1. ANTIOXIDANTES

19 las estructuras afectadas y al igual que los agresores oxidativos, éstos pueden originarse de manera natural por el cuerpo humano o pueden ingerirse en alimentos (NIC, 2014; NIH, 2016).

Algunos tipos de antioxidantes, aparte de plantas y alimentos, incluyen microorganismos, hongos y tejidos animales (Pokomy, Yanishlieva, & Gordon, 2001) y son los compuestos fenólicos (flavonoides y ácidos fenólicos) los compuestos que se encuentran en mayor cantidad (Espín & Tomas, 2010; Muñoz, Gómez, & Gil, 2010).

2.4.2. CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

La capacidad antioxidante se entiende como la efectividad que tiene un determinado antioxidante en presencia de un radical libre. Esta característica depende de los compuestos antioxidantes que se encuentren presentes en un alimento. Debe tomarse en cuenta el sistema antioxidante, el tipo de integración al ambiente o si se es un sistema de antioxidantes heterogéneos y que compuestos predominan en el mismo (Andrade, 2012; Quintanar & Calderón, 2009), esta última característica hace importante la cuantificación de antioxidantes en los alimentos y su socialización para el mejoramiento de la salud humana.

2.4.3. COMPUESTOS BIOACTIVOS

20 la prevención del cáncer, enfermedades del corazón y otras enfermedades degenerativas (Carranco, Calvo, & Pérez, 2011).

De acuerdo a su función y estructura química, se pueden considerar como compuestos bioactivos a: polifenoles, fitoesteroles, carotenoides, flavonoides, tocoferoles, tocotrienoles, taninos, fibra soluble e insoluble y los ácidos grasos (Azcana, 2013; Tupuna, 2012; Espín & Romas, 2010).

El mortiño ha mostrado poseer gran cantidad de antocianidinas y antocianósidos sin efecto tóxico en el ser humano. Estos compuestos fortifican las paredes de los vasos capilares, son coadyuvante en la microcirculación retiniana y antiagregación plaquetaria por lo que este fruto se recomienda en casos de várices, hemorroides y flebitis, considerándose así un producto nutracéutico (cuando alcanza la madurez comercial) reduciendo el riesgo de estas enfermedades además de actuar como antioxidante (Arteaga, 2014; Coba et al., 2012; Quingalombo, 2010).

Otro compuesto significativo presente en el mortiño es la vitamina C, un poderoso estimulante del sistema inmune y a la vez antioxidante que contribuye a prevenir cáncer neutralizando radicales libres, nitritos y otras sustancias potencialmente cancerígenas protegiendo así órganos como el esófago, boca, cristalino de los ojos, corazón, mamas, entre otros (Pérez & Valdivieso, 2007).

2.4.3.1. Antocianinas

21 organismo humano (Arteaga, 2014; López et al. 2006). Sin embargo este tipo de pigmentos pueden alterarse en el fruto cuando a la par cambian las condiciones medioambientales, poscosecha, tratamientos químicos o biotecnológicos o cuando el alimento de origen no tiene el grado de madurez adecuada (Tupuna, 2012; Pascual & Sánchez, 2007; Lincoln & Zeiger, 2002) y como compuesto fácilmente oxidable en sí puede deteriorarse por su sensibilidad a los cambios de pH, temperatura, radiación UV y presencia de otros compuestos como dióxido de sulfuro, ácido ascórbico, iones metálicos, entre otros (Rivas, 2003).

22

3. METODOLOGÍA

3.1. ELABORACIÓN DE LA BEBIDA DE MORTIÑO

El proceso general de elaboración del refresco de mortiño se basó en la metodología de Proaño (2015). La formulación de la bebida se detalla en la Tabla 4.

La materia prima (mortiño) procedente del páramo El Pedregal (cantón Mejía, provincia de Pichincha), se trasladó a las instalaciones del laboratorio de Química Analítica de la Universidad Tecnológica Equinoccial. Los frutos fueron lavados, secados al aire y clasificados por ausencia de defectos para posteriormente extraer y filtrar su extracto.

Tabla 4. Formulación de Refresco de Mortiño (Vaccinium floribundum).

Componente Concentración (%)

Azúcar Blanca 10.5 Ácido cítrico 0.24 Citrato de sodio 0.02 Sorbato de potasio 0.01 Benzoato de sodio 0.01 Allura – Rojo No. 40 0.0014 Extracto de piel de uva 0.0006 Extracto de frutos rojos 0.4 Extracto de mortiño crudo filtrado 3

23

3.2. ESTUDIO DE ESTABILIDAD DE LA BEBIDA

Para la determinación de la estabilidad de la bebida se trabajó en base a la metodología de Rubilar (2006). Las muestras fueron pasteurizadas y envasadas en botellas de vidrio estériles color ámbar y se dividieron en 2 grupos: el primero se almacenó a temperatura de refrigeración (5 °C) durante 90 días y el segundo grupo se almacenó a temperatura ambiente durante 45 días. A los 0, 7, 15, 30, 45 y 90 días (para las muestras almacenadas en refrigeración) se realizaron pruebas físico-químicas (color pH, sólidos solubles, acidez total titulable, antocianinas y capacidad antioxidante), microbiológicas (coliformes totales y fecales, aerobios mesófilos, mohos y levaduras) y sensoriales.

3.2.1. ANÁLISIS FÍSICO-QUÍMICO

3.2.1.1. Sólidos Solubles (SS)

Se determinó según la metodología de la NTE INEN 380 utilizando un refractómetro marca BOECO modelo 32195, expresando los resultados en ° Brix. Los ensayos se realizaron por triplicado.

3.2.1.2. pH

24

3.2.1.3. Acidez titulable (AT)

Se determinó en base a la metodología de la NTE INEN 381, se tomaron 10 ml de muestra y se aforaron con 100 ml de agua destilada, posteriormente se tituló con solución de NaOH 0.1 N hasta alcanzar un pH de 8.3 aproximadamente (medido mediante la inmersión de un electrodo de pH). Los resultados se expresaron como porcentaje de ácido cítrico anhidro, usando la Ecuación 1.

𝐴 =(𝑉1𝑁1𝑀)10

𝑉₂

[1]

Donde:

A: gramos de ácido en 1000 mlde producto.

V1: ml de NaOH usados para titulación de la alícuota. N1: normalidad de la solución de NaOH.

M: Peso molecular del ácido usado como referencia. V2: volumen de la alícuota tomada para el análisis.

3.2.1.4. Colorimetría

El color de la bebida se caracterizó mediante las coordenadas L, a y b. Las coordenadas se obtuvieron utilizando un colorímetro Konica Minolta CR-410 directamente sobre el líquido. Los parámetros de las tonalidades a y b se utilizaron para calcular la pureza del color (Croma Cr*), según la Ecuación 2.

25 El ángulo del tono (Hue) se determinó en base a los valores obtenidos en a y b (Ecuación 3).

𝐻𝑢𝑒 ∗= 𝑡𝑎𝑛−1₍𝑏

𝑎)

[3]

Donde:

Cr*: Tonalidad del color. Hue*: Ángulo del color.

a*: tendencia de color rojo (positivo) o verde (negativo) b*: tendencia de color amarillo (positivo) o azul (negativo)

3.2.2. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS

Para la realización de las pruebas microbiológicas se aplicó el método Compact Dry de Nissui (CDN). Se utilizaron las placas Compact Dry CF para determinación de coliformes totales, Compact Dry EC para determinación de coliformes fecales, Compact Dry TC para determinación de aerobios mesófilos totales y Compact Dry YM para la determinación de mohos y levaduras. Las placas cuentan con un plato de 50 mm de diámetro y con nutrientes para el crecimiento y la detección específica de microorganismos.

3.2.2.1. Preparación de la muestra

26 condiciones estériles. Se transfirió 25 ml de muestra a un frasco con 225 ml de agua peptonada; se homogenizó la muestra (dilución 10-1 _{y posteriormente} a partir de ésta se realizaron diluciones sucesivas (10-2 _{y 10}-3_{) en tubos de} ensayo con 9 ml de agua peptonada.

3.2.2.2. Recuento de Coliformes Totales y Fecales

Se realizó según el método CDN CF (coliformes totales) y CDN EC (coliformes fecales). Las placas CDN CF contenían un sustrato enzimático cromógeno: X-Gal, con el cual las colonias de coliformes se mostraron con un característico color azul o azul verdoso. Las placas CDN EC contienen dos sustratos enzimáticos cromógenos: Magenta-GAL y X-Gluc, de tal forma que los coliformes se pueden apreciar de color rojo y las colonias de E. coli, de color azul. Se colocó 1 ml de las diluciones preparadas dentro las placas correspondientes. Se colocó las placas en incubación a una temperatura de 37 °C durante 24 horas (AOAC, 2015). Los resultados se expresaron como NMP/ml. Los ensayos se realizaron por duplicado.

3.2.2.3. Recuento de Aerobios Mesófilos Totales

27

3.2.2.4. Recuento de Mohos y levaduras

Se realizó utilizando placas CDN YM (mohos y levaduras). Las placas contuvieron sustrato cromógeno X-Phos el cual provocó una coloración azul en las levaduras y distintos colores en mohos. Se inoculó 1 ml de las diluciones preparadas y se colocó sobre las placas CDN YM.

Las muestras se incubaron 72 horas a 25.5 °C (AOAC, 2015). Los resultados se expresaron como UP/ml. Los ensayos se realizaron por duplicado.

3.2.3. ANÁLISIS DE ANTIOXIDANTES

3.2.3.1. Concentración de antocianinas

Se determinó el contenido de antocianinas según el método de Beas et al. (2011), con ligeras modificaciones. Se midió la absorbancia a 515

nm. Expresando el contenido de antocianinas totales en mg/L (como equivalentes de cianidina-3-glucósido), según la Ecuación 4.

𝐶 = (𝐴

𝜀) ( 𝑉𝑜𝑙

1000) (𝑃𝑀) (

1

𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎) (10

6₎ [4]

Donde:

C: concentración Antocianinas totales (mg/L). A: absorbancia máxima.

ɛ: absortividad actividad molar cianidina-3glucósido 25955 / cmM) Vol: volumen total de extracto.

28

3.2.3.2. Actividad antioxidante

Se determinó mediante la metodología desarrollada por (RE et al., 1999). Se obtuvo el radical ABTS (7 mM) con persulfato potásico (2.45 mM) incubados a temperatura ambiente en oscuridad durante 16 horas. Una vez formado el radical ABTS.+ _{se procedió a diluir con etanol hasta obtener una absorbancia} entre 0.70 (± 1) a 734 nm. Para la determinación de la capacidad antioxidante se diluyó la bebida hasta encontrar una inhibición del 20 al 80 % en comparación a la absorbancia del blanco. Se añadió 20 µL de la muestra y se completó un volumen de 1000 µL con ABTS.+_{. La mezcla se dejó a} temperatura ambiente y se midió su absorbancia luego de 6 min. Se elaboró una curva de calibración con el antioxidante sintético de referencia, Trolox, que se ensayó a una concentración de 0.5 mM en etanol en las mismas condiciones, se tomaron diferentes volúmenes entre 10 y 45 µL de trolox. Los resultados se expresaron como µmol de Trolox / 500 ml de bebida. El ensayo se realizó por triplicado.

3.2.4. ANÁLISIS SENSORIAL

29 Se consideró a las muestras iguales cuando el Tcalculado fue menor o igual al Ttabulado, de la misma forma se consideró a las muestras diferentes cuando el Tcalculado fue menor al Ttabulado. El Ttabulado se calculó según la NTC 2680 (Análisis sensorial) descrito en la Ecuación 5.

𝑇𝑡𝑎𝑏 = (𝑛

3) + (𝑧) (√

2𝑛

9 )

[5]

Donde:

n: número total de pares que se plantearon en la prueba. z: nivel de significancia de la prueba.

El Tcalculado es el número de aciertos por parte del panel. La Tabla 5, proporciona los valores de significancia para la prueba triangular.

Tabla 5. Valores Z para una prueba triangular. Α z

0.05 1.64 0.01 2.33

3.3. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

30

4.

ANÁLISIS DE RESULTADOS

4.1. ESTABILIDAD FÍSICO-QUÍMICA DEL REFRESCO DE

MORTIÑO

Se analizó la estabilidad físico-química, microbiológica y sensorial del refresco de mortiño durante el período de almacenamiento (90 días a temperatura de refrigeración y 45 días a temperatura ambiente). Los resultados se compararon con una muestra control (refresco sin adición de extracto de mortiño).

4.1.1. SÓLIDOS SOLUBLES (SS), PH Y ACIDEZ TITULABLE (AT)

En general, a lo largo del periodo de almacenamiento los valores de SS, pH y AT se mantuvieron contantes tanto en el refresco control como en el refresco de mortiño refrigerado.

31

Tabla 6. Efecto del tiempo de almacenamiento en los sólidos solubles del refresco de mortiño.

Temperatura

almacenamiento Refresco

Tiempo de almacenamiento (días)

0 7 15 30 45 90

Refrigeración Control 10.4

bc _10.6ab _10.7ab _10.5abc _10.9a _10.6abc Mortiño 10.6abc _10.6ab _10.6abc _10.6bc _10.6abc _10.6abc

Ambiente Control 10.4

bc _10.6abc _10.6abc _10.3c _10.7ab _---

Mortiño 10.6abc _10.7ab _10.5abc _10.6abc _10.7ab _--- Tukey= 0,369

Valor referencial Min. (NTE INEN 2 304) = 7.0

Las letras distintas indican diferencia estadística significativa entre las muestras (p<0.05)

Las muestras almacenadas a temperatura ambiente y refrigeración presentaron un comportamiento similar en cuanto a un leve incremento del pH durante los primeros 45 días. Similares resultados fueron reportados en una bebida analcóholica gasificada sabor naranja (Rubilar, 2006) y en bebidas cítricas (Moreno et al., 2007). Por otro lado, tanto muestras de refresco control y de mortiño alcanzaron los valores máximos de pH (3.5) al final del almacenamiento refrigerado (día 90). En la Tabla 7, se puede observar los resultados de la estabilidad del pH.

Tabla 7. Efecto del tiempo de almacenamiento en estabilidad del pH del refresco de mortiño.

Temperatura

almacenamiento Refresco

Tiempo de almacenamiento (días)

0 7 15 30 45 90

Refrigeración Control 3.0

ef _2.9f _3.1cd _3.1cd _3.1bc _3.5a

Mortiño 3.0def _3.0ef _3.1cde _3.1cde _3.1bc _3.5a

Ambiente Control 3.0

ef _2.9f _3.1bc _3.1bc _3.2b _---

Mortiño 3.0def _2.9f _3.1cd _3.1cde _3.2cd _--- Tukey= 0,093

Valor referencial Min. (NTE INEN 2 304) = 2.0

32 No se encontraron diferencias significativas entre las muestras y no se observó influencia de la temperatura de almacenamiento sobre este parámetro. Los cambios de pH de una bebida se deben a la formación de una solución amortiguadora o buffer debido a que la bebida cuenta en su composición con dos sustancias biológicamente compatibles (ácido cítrico y citrato de sodio) (NCBI, 2005). Para que exista una modificación del pH por medio de una sustancia buffer, esta sustancia debe contar con una concentración especifica de iones hidronio (H3O+_{) y iones hidroxilo (OH}-₎ (Fuentes & Massol, 2002). Además el refresco de mortiño contiene en su formulación benzoato de sodio, que es una sal sódica de ácido benzoico favoreciendo la formación de una sustancia reguladora de pH. Otro factor que puede afectar al pH del refresco puede ser la presencia de impurezas alcalinas provenientes del envase (Cedrón, Landa, & Robles, 2011). El pH en jugos de arándano fluctúa 2.3 a 2.5 (FDA, 2015) y para bebidas no alcohólicas el pH en promedio va desde 2.62 a 4.49 (Abulkalam & Fraunhofer, 2006); estos valores son los similares a los presentados por el refresco de mortiño a lo largo del almacenamiento. Similares resultados en cuanto al incremento de pH durante el almacenamiento fueron reportados en una bebida analcóholica gasificada sabor naranja y a diferencia de los resultados en esta investigación, el almacenamiento produjo un aumento en la acidez del producto (Rubilar, 2006).

Tabla 8. Efecto del tiempo de almacenamiento en acidez titulable del refresco de mortiño.

Temperatura

almacenamiento Refresco

Tiempo de almacenamiento (días)

0 7 15 30 45 90

Refrigeración Control 0.25

bc _0.23cd _0.23cd _0.23cd _0.23cd _0.23d Mortiño 0.28a _0.27a _0.27a _0.27a _0.27a _0.26ab

Ambiente Control 0.25

bc _0.25bc _0.21e _0.23cd _0.23cd _---

Mortiño 0.28a _0.27a _0.27a _0.27a _0.27a _--- Tukey= 0,01915

Valor referencial Min. (NTE INEN 2 304) = 0.10 (g ácido cítrico/100 ml)

33 La acidez del refresco de mortiño se redujo ligeramente en las muestras mantenidas en refrigeración durante 90 días, mientras que aquellas almacenadas a temperatura ambiente presentaron un valor de acidez constante durante 45 días (Tabla 8). Al igual que en el presente estudio, en diferentes bebidas, generalmente no se observan cambios significativos en los valores de acidez durante el almacenamiento (Aguilar & Jiménez, 2003).

4.1.2. COLOR DEL REFRESCO DE MORTIÑO

34

AMBIENTE REFRIGERACIÓN

Figura 2. Variación de los parámetros de color durante el almacenamiento: y Refresco control; y Refresco de mortiño

fg kl ab cd uk lm bc de ab a 0 5 10 15 20 25

0 7 15 30 45

L* hg kjl cd ef jkl hu mn cd ghi n ab a 0 5 10 15 20 25

0 7 15 30 45 90

L* ghi ef ghi fghi bc b fghi b hi def 0 1 2 3 4 5 6

0 7 15 30 45

C

r* _i

fgh fgh _fghi

cde fg bc bc cd a hi def 0 1 2 3 4 5 6 7

0 7 15 30 45 90

Cr*

A _B

35 Con respecto a la saturación del color (Cr *), la adición del extracto de mortiño provocó un incremento de 0.7 unidades, además se puede apreciar que independientemente de la temperatura de almacenamiento (Figuras 2C y 2D), los valores de este parámetro aumentaron ligeramente para el último día de almacenamiento siendo 6.05 y 5.27 para el refresco refrigerado y almacenado a temperatura ambiente, respectivamente.

En cuanto a la tonalidad de la bebida se puede apreciar que los ángulos de matiz (Hue) corresponden a tonos rojizos. Los valores de Hue se incrementaron en el día 15 tanto en el refresco control como en el refresco de mortiño (Figuras 2E y 2F) bajo las dos condiciones de almacenamiento. Para el final del almacenamiento se encontró un incremento de Hue en todas las muestras excepto en el refresco de mortiño almacenado a temperatura ambiente. El mayor valor de Hue se encontró en las muestras de refresco de mortiño refrigerado (día 90).

En términos generales, el almacenamiento ocasionó una pérdida de luminosidad y un leve aumento en el tono y la saturación del color del refresco de mortiño. En este sentido se ha reportado que jugo de naranja bajo condiciones de almacenamiento a temperatura ambiente y de refrigeración no afectaron al color de la bebida (Stinco et al., 2012) mientras que la aplicación de temperaturas de pasteurización de jugo de granada produjo cambios en los parámetros de color (Mena et al., 2013).

Rubilar (2006) reportó en una bebida analcohólica gasificada resultados similares a los obtenidos en este estudio, durante el almacenamiento se redujo la luminosidad de la bebida; mientras que en jugos de frutos rojos y jugo de cáscaras de uva la tonalidad se incrementó significativamente en el almacenamiento (Arispe, 2006; Baeza, Busso, & Sánchez, 2014); por otro lado en pulpas de fresa pasteurizadas el almacenamiento habría provocado una reducción en la saturación del color (Restrepo, Penagos, Patiño, & Botero, 2011).

36 Numerosos estudios se desarrollan con el fin de evaluar los cambios que pueden sufrir los parámetros de color durante el almacenamiento de una bebida tratada con diferentes tratamientos de conservación como pasteurización (Vegara, Martí, Mena, Saura, & Valero, 2013), almacenamiento hiperbárico (Pinto et al., 2016), ultracongelación (Stinco, Fernández, Heredia, Meléndez, & Vicario, 2013), entre otros. Se ha comprobado que durante el almacenamiento se produce una degradación gradual del color de bebidas isotónicas producidas con frutos tropicales (Vera & Mercadante, 2007). El cambio en el color de la bebida podría estar relacionado a la reducción de antocianinas debido a que estos compuestos tienen una relación con cambios de tonalidad y saturación en el color (Baeza et al., 2014).

4.2. PARÁMETROS MICROBIOLÓGICOS DEL REFRESCO DE

MORTIÑO

El agua es el componente esencial de todas las bebidas sin alcohol, por lo tanto se debe asegurar que cumpla con condiciones y características indispensables para la finalidad que se a la que se destina. Bebidas poco ácidas, sin gas o las preparadas con agua muy alcalina son más susceptibles a contaminación por mohos y levaduras ya que se fermentan fácilmente a causa de la neutralización del ácido (Bermúdez, 2008). En el agua principalmente se encontrar bacterias del grupo coliforme y mesófilas aerobias (Rodríguez, Rodríguez, Peréz, López, & Chimalpopoca, 2008). En la Tabla 9, se encuentran los resultados obtenidos en el análisis microbiológico del refresco de mortiño durante el almacenamiento.

37 de un tratamiento térmico y adición de preservantes hacen del producto un medio que imposibilita el crecimiento microbiano (Salinas, 2002).

En los recuentos de CT y CF presentaron valores < 10 NMP/ml durante todo el periodo de estudio, tanto para las muestras mantenidas en refrigeración y las conservadas a temperatura ambiente.

Tabla 9. Recuento microbiológico de coliformes totales (CT), coliformes fecales (CF), aerobios mesófilos (RT), mohos y levaduras (M+L) en refresco de mortiño almacenado a

temperatura ambiente y en refrigeración.

Parámetro CT

(NMP/ml) CF (NMP/ml) RT (UFC/ml) M+L (UP/ml)

Refresco mortiño DÍA

Inicial 0 < 10 < 10 <10 <10

Refrigerado

7 < 10 < 10 <10 <10 15 < 10 < 10 <10 <10 30 < 10 < 10 6.7 x 102 _<10

45 < 10 < 10 <10 2.3 x 102

90 < 10 < 10 <10 <10

Temperatura ambiente

7 < 10 < 10 1.3 x 101 _<10

15 < 10 < 10 <10 <10 30 < 10 < 10 2.33 x 102 _<10

45 < 10 < 10 <10 <10

Valor referencial (NTE

INEN 2 304) < 3 < 3 1.0 x 10

3 _{5 x 10}1

38 las condiciones higiénicas de la materia prima (Pascual & Calderón, 2000), por lo que existe la posibilidad de que la contaminación provenga de diferentes fuentes que deben considerarse, por ejemplo, errores en el procesamiento por falta de experiencia del manipulador, limpieza deficiente de los utensilios utilizados, materia prima contaminada y contaminación ambiental, sin embargo los valores obtenidos en el recuento no superan a los valores referenciales de la norma INEN 2 304.

Por otro lado, no se presentó desarrollo de mohos y levaduras en las muestras almacenadas a temperatura ambiente. Únicamente la muestra refrigerada registró una población de 2.3 x 102 _{UP/ml en el día 45 superando los} parámetros establecidos en la normativa nacional, no obstante el recuento en el día 90 fue de (< 10 UP/ml) por lo que este resultado probablemente se debería a algún tipo de contaminación cruzada debido a malas prácticas durante el almacenamiento. Se han realizado numerosas investigaciones para comprobar la estabilidad microbiológica a diferente temperatura en bebidas cítricas con adición de fuentes de betalaínas (Moreno et al., 2007), licores de crema (Moya, 2013), bebidas fermentadas a base de suero (Londoño, Sepúlveda, Hernández, & Parra, 2008) y bebidas isotónicas de limón y maqui (Girones, Huertas, Moreno, Periago, & García, 2016) en donde se ha determinado que el almacenamiento en refrigeración es el más idóneo para reducir el crecimiento de microbiano.

39

4.3. CONCENTRACIÓN

DE

ANTOCIANINAS

EN

EL

REFRESCO DE MORTIÑO

El mortiño presenta un alto contenido de antocianinas totales (201 mg eq de cianidina-3-glicósido/100 g de fruta) (Gaviria et al., 2009); el extracto crudo de mortiño utilizado en la elaboración del refresco de mortiño presenta una concentración de 7.7 g eq de cianidin-3-glicósido/100 ml de extracto según indica Proaño (2015), esta diferencia se debe a que la mayor cantidad de antocianinas se encuentran en la cáscara de la fruta y ésta puede ser eliminada como desecho durante la preparación del extracto crudo (Tupuna, 2012). En la Tabla 10, se expresa la concentración de antocianinas del refresco de mortiño refrigerado y sin refrigerar. La temperatura de almacenamiento no produjo cambios en el contenido de antocianinas durante 45 días. Mientras que en el día 90 del refresco refrigerado se observó una reducción del 26.6 %; al igual que en el presente estudio, Hellström, Mattila, and Karjalainen (2013) reportaron la reducción del contenido de antocianinas durante el almacenamiento refrigerado (12 semanas / 4 ºC) de bebidas de frutos rojos.

40

Tabla 10. Efecto del tiempo de almacenamiento sobre contenido de antocianinas totales en el refresco de mortiño.

Antocianinas

(mg de cianidina-3-glicósido /L) Tiempo de

almacenamiento (días)

Temperatura de Almacenamiento Ambiente Refrigeración

0 26.98±1.42a

7 24.95±1.97a _26.25±0.39a 15 25.93±3.15a _28.74±0.14a 30 26.60±0.85a _27.15±3.47a 45 24.89±1.68a _25.18±2.10a 90 --- 19,8±0.91b

Tukey =5.51307

Las letras distintas indican diferencia estadística significativa entre las muestras (p<0.05)

Resultados similares a los obtenidos en esta investigación se reportaron jugo y concentrado de agraz (Martínez, Rojas, Borda, Hastamorir, & Medina, 2011), donde se observó que la bebida mantuvo su estabilidad durante 4 semanas almacenadas a 4 y a 17 °C obteniendo menor la degradación a 4 °C. Al comparar el promedio del contenido total de antocianinas de la bebida en estudio 25.7 ± 1.61 mg/L con jugos de arándano 424.1 – 518 mg/L (Lee, Durst, & Wrolstad, 2002) y jugos de frutilla 55.7 mg/L (Torreggiani et al., 1999), se puede decir que el refresco formulado tan solo representa un 5.45 % del contenido de antocianinas presentes en el jugo de arándano y un 46.1 % de antocianinas en jugos de frutilla.

En general las investigaciones demuestran que el contenido de antocianinas se ve reducido durante el almacenamiento a temperaturas ≥ 5 °C (Brownmiller, Howard, & Prior, 2009; Howard, Mauromoustakos, &

Brownmiller, 2010; Laleh, Frydoonfar, Heidary, Jameel, & Zare, 2006). Se

debe destacar también que la estabilidad de las antocianinas presentes en el

refresco de mortiño aportarían con la retención del color del producto, tal como

41

4.4. ESTABILIDAD EN ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EN EL

REFRESCO DE MORTIÑO

De acuerdo a Gutiérrez et al (2007), la capacidad antioxidante total en los alimentos depende de la concentración de vitaminas C, E, carotenoides y otros compuestos como los flavonoides (flavonas, isoflavonas, flavononas, antocianinas y catequinas). El mortiño presenta un alto contenido de antocianinas y fenoles totales los cuales son responsables de su coloración y alta capacidad antioxidante (Gaviria et al., 2009; Prior et al., 1998). El almacenamiento a temperaturas de congelación (-18 a 0 °C) no afecta la capacidad antioxidante durante largos periodos de tiempo (Meza, 2012); sin embargo, a temperatura de refrigeración (5 °C) este contenido puede disminuir o aumentar dependiendo del tiempo de almacenamiento (Velázquez et al., 2014; Flores et al., 2011); en consecuencia el almacenamiento a temperaturas mayores a 25 °C durante extensos periodos de tiempo pueden producir la reducción de capacidad antioxidante (Brownmiller et al., 2009).

En la Tabla 11, se compara la capacidad antioxidante de la bebida de mortiño

almacenada a temperatura ambiente y en refrigeración. El refresco de mortiño

presentó cambios significativos en la capacidad antioxidante a lo largo del tiempo de almacenamiento.

42

Tabla 11. Efecto del tiempo de almacenamiento sobre la capacidad antioxidante del refresco de mortiño.

Capacidad antioxidante ABTS (mMol de trolox/500 ml de jugo) Tiempo de

almacenamiento (días)

Temperatura de Almacenamiento Ambiente Refrigeración

0 146.45±2.75ab

7 105.10±8.61cd _141.87±0.60ab 15 160.06±8.83a _124.47±9.26bc 30 105.96±10.65cd _105.30±5.86cd 45 132.13±26.05abc _124.41±6.35bc 90 --- 80.07d_±9.79

Tukey = 31.7849

Las letras distintas indican diferencia estadística significativa entre las muestras (p<0.05)

43

4.5. ESTABILIDAD

SENSORIAL

DEL

REFRESCO

DE

MORTIÑO

Como se indicó en la sección 3.2.4 en la prueba triangular participaron 12 jueces entrenados, cada día de muestreo se compararon los refrescos recién preparados con muestras almacenadas a temperatura ambiente y de refrigeración. En la Tabla 12, se puede observar los resultados del análisis sensorial. Mediante el test triangular (prueba de discriminación) se determinó que todas las muestras presentaron diferencia significativa con respecto a un refresco recién preparado. Las diferencias entre un refresco recién preparado y una muestra almacenada se pueden apreciar en el Anexo I. Debido a que el número de aciertos (TCAL) es superior al número calculado mediante Chi cuadrado (TTAB), es decir que se acepta la hipótesis nula (Hi) indicando que las muestras son diferentes.

44

Tabla 12. Efecto del tiempo de almacenamiento en la estabilidad sensorial del refresco de mortiño1

DÍA TTAB

TCAL

refresco refrigerado

TCAL

refresco Temp. ambiente

RESULTADO

7

2.34

7 8 Hi

15 12 12 Hi

30 8 9 Hi

45 10 12 Hi

90 11 --- Hi

1

T TAB: Valor “T tabulado” mediante chi2 T CAL: Valor “T calculado” # de aciertos

panelistas

Ho: las muestras son iguales

Hi: las muestras son diferentes