Métodos inmunoquímicos de diagnóstico de enfermedades

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(1)DE ENFERMEDADES DE DI,AGIUOSTICO UÉTOOOSINMUÍUOIQU|MICOS Luz MarinaManülla Ptograma Ep¡demiolog¡aVeget¡l. coRPolcA. CCIÓN r. TNTRODI E|diagnH¡coaoertadoytempranode|asenfemedadesdep|€ntasesunGomponentecruc¡al pueden s€r cor mladas efeclivamerfe, $ las medidasd'e *á sl ran"¡o. l-as en-ferme¿a¿es en esladostempranosde desafro o de te enfermedad. ffi;J;ñú;ñntadas ya que la enfermedadpudedeserollarse,sin que exiSa Confiaren 16 síntomasno es adecuado, una'mánile$adónde eslosy su expresiónpuedeseraltamentevariable' de las€ntsmedades,se puedenrelacionar de diagnostico Denfo de los métod6 convenc¡onates (virus), examen ;-b""rac6n de síntomas, prueOal col plar as ¡nd¡cadoras ñ"4ñÉetiológico, ageflte del moffológica de tas paft6 afec,tadas,cáraaerizac¡ón ,¡"roúrp¡otr6. eÍtre bcterianos, lá"-iná.¡¿n U" propEbadestÉoquímicasde tos aislamientos son-eplicadospera el Redenlementelos evancesde la biología moleculary la b¡otecnología,patog€n6 de qlantas' A pruebasÉpidc especifica! y, sens¡blesen la detecciónde ññ]¡g y técnic€s pare pruebas ¡nmunodiagnóstico ¿esanoli¿n¿ose bacteriasl esGialmefie virus v d ¿c¡oosnucleicos.Didias tecnologíasson aplicedasen los úftimos ilñ;ü;d";¡""áút d€ p", tlof{os, micoplasmasy nemáodos;se cof¡skteraentoncesque la comp¡ementac¡ón ;il y precis¡on generan más tecnolfuicos üJ fd*¡ot ónvenc¡r¡ñates *ñ lo" nu*os avanoes permiteneÍ mafiejoacert¿dode 16 Plagas. en las nuevas El otietivo del pfesef e escrito rad¡c€en dar a conocefalgunosmétodos.incluidos de estudio y las el objeto con pafa de acuefdo uso su genersf y expectativas iecnóosias, cordbiones de trabajo. DenÍodelosinmunoensayossetendránencuenta|osmáodosqueimp|icandetecciones y cuarÍitativas' por látex y-la inmunod¡fusión; -ii¡fa¡n"", c(xno en el caso Oe la aglutinac¡ón denominación.proviene (EUSA) cüya un¡do con enzime ñü '¡"SÉ;+"]" sobfe inmunoábsorbenie y una 'Firrymelinked inmunoaborbertessaf; ensayos-con inmunofluorescencia ;;i monodonales' tterrarñ¡e*a¿e d¡agnosticonoredosa,tal como la tecnologíade los antiqrerpos hibidac¡én ta|es Def¡tfo de| h detecc¡oflde b ffios nuc|eicos,se pfes€nlan-los métodosde polirntórfica (RFLPS) longitud de resricción áiió, oa-eki" rarcájes no radiedivos,fragmeritosdá (PCR). y reacciónen cadenade la potimerasa 2. REACCIOÍIANTIGENO. ANTICUERP1O y El süiema inmunitariofunc¡onade dos formasdifefef¡tes,med¡anlela inmunidadHUMoRAL la inmunitd CELUI-AR. por moléculasen disoluc¡ónen el a la pfoporc¡onada ta inmunlladHumoral,hace referÉnc¡a moi¿*tas responsablesde e51ainmunidad son las proteínas llamadasen su que "ró¡"¡¡|:-l-* i¡luu¡¡oGLoBULtMb 0g) cada.moléq¡la¡ndivjduales un arficuerpo,lérmino á'Ounto [á material. determinado qu€ con reaccionan t#bid ; puede referir a las inirlnoglobulines, por inmunidadCs$¡lar,eda dada células..

(2) [a inyecciónde c.Élquief slFtanciaextraíaal organ¡smode un animal,promuevela fqrnación de prgducela affidérpc y élr,üs inmunescapacesde unirsea dicha sustancia.La 5¡ganc¡a que de ANTIGENO. nombre con d o éluhs inmune6se le corioce ¿é ior",""¡én -l-" un" moiéculade dtt¡cuefpoes la de un¡rsecon dta afinidd a una regiónlimitadade n t*¡¿n ¿r "nt¡"¡erpos E" td uniónin¡grvier¡enfuezre de van der Wads, fuer¿asitnices e hidrofóbicG,s¡n - ;ib"-. que seioíne ningtn er ace cüraleflte entre el anticuerpoy el antigeno Éigt¡o ¿e un anl-fgenoal que se une un anticuefpodado es d determinrylte.La superficiede una pu€den unir lG Ídé.¡lla prdeha presenta írtEho6 d€deminant€s pos¡bles,a los que se qtE el misrm ddgrm{anle ¡fgrd flÍígenos üerpn estructurasrepetitiv6, de forma "rl¡o*rpo!. q;d.-lfu¡¡üdr6 veés Ede tipo de antígenose derpmina multivdente.Unhren eiemplode éo to cons¡tuyeuna partíortaviral (Figura1). que La rnlécula del afficuerpo está d¡vida en dos fegiones análogas:dominios de un¡ón,. para de inicio que d h señal consituyen y efec{ores, int"ádonan con el drtlgeno, domin¡os por ecá constituida del anlicrerpo molécula cada Tambien talcs cüno ¡¿ íagocitosis. ;¡""*, p€sad* á* t¡p.i ¿. cad€fraspolipeptld¡c* de distirfo tamaño:cadenasligera (9 y cadenas (Fig¡fa 2)' G); ei anr¡cue¡poes tivalenté y poseedc siths de rcconrcimiento 3. REACCIONESDE PRECIP]TACION al t6 reGiofies de prec¡pite¡ón ó pfecip¡tind, son 16 f€a€iones qtE mas ha1 contlibuido (b un la fomaión de es derivado la reacción nomOre de de h imiunoóuim¡ca. Ei ¿"=-fn pret¡p¡ta¿ove¡¡le, el o¡ai es formadocuaridocantiúdes dealadas de arÍlgeno y anti4erpo son q\ geles fu.¡n"¿." par o comblnacióntales reacc¡onesse puedenr@liz¿¡ rpd66 lfquidoso en de4Br. de m*rornolécdas y La precipitación6 un témino üilizdo pa¡-¿describir la insolubilizacíatn de cáulas o de al agruptn¡ento panicul* viraleq mientr* que la aglui¡naciónse ref¡ere particulasde tarndo dmilar El hnaño del antígenoreaccionanteinfluenciala inEracc¡óndel núrnerode moléculasrequeridas de arficuerpo,paraproduciruna agregaciónvisible' En la curva de prcci¡iüna puede notarseque en la medida.enque se agrega más dcaza un eela<ioóptimo,tras el cual se forma menosprec¡p¡tado'. tfgeno' se. En edas reaccionesse pr€x€ntandos esiadG el primeroes el reconocimientoinmuneespecifico' segundgat el cual seda la re66n q"e n-""áa ra t"nm"¡¿n'o.l -.pt"¡o "ntlgeno-ant¡cuerpoi-el hidrofótica e insolubleen cierlas fÉe de una torma¿t¿n e pr"Ap¡t*¡0", que cons¡steü ia y condicionesión¡c6 de PH. puedenser cuanlificadospor nefetornetrfa, Lc agregdG -por-r" que se forman medianteesta reacción, t nUü¡" presentadaen cadatubo, la cud es medidaa trar63 de la disp€rsiónde una ¿aA fuentelum¡nGa. .L INTUNODIFUSÓN SIMPLE:DIFUSIÓNSENCILLAO SIMPLE. l. i'. ESa técnica tamsn conoc¡dacomo el máodo de Oudin, requiere que un f€actanteextejno' u"ol*"nt" en una f.rge lfquida, m¡gfe denlro de un gel que contierÉ el otro readante. Esto ágnif¡ca que el r€actantedue se difunde debe edar presenteen un ex@so cons¡derableen cornperacióncon d feadante intEmo..

(3) La difusiónde una mezclacomdejade antígenosen un gel, dara kgar a múltipleslíneasde precipitacón,que trAslapsnparc¡almenteunascon oÚas.S¡ se usAun 8úicuerpo monoespecífico, sé s|releitentificar fác¡lmenteen diferentesmueÉtras,por la presencia d antígenocorrcspondiente espedñco,es tambiénposiue revelar en el gE. Con anl¡c{¡erpo inmunoprecip¡tado del o ausenc¡a gruposespecít¡cosantigénicosen proteínassimilaresde diferenleorigenbiolog¡co' Ele tecnica puede ser utitizada para evaluac¡óncualitat¡vede mezdas de anlígenos,pero su de ar ígEnosprote¡cosen liquidos p¡nc¡patna sido en el campode la determ¡nación a¡rlicación tiolog¡cc. DOBLE 5. ttoB¡-E tÍ{MulrloDlFuslÓilo lNMUNoDlFUslÓN Tecnicadescfita por Ouchtefony en 1958, es et método más empleadopara la identificacióny esudio de v¡rus,bac{eriasy hongosfitopeiógenos. En esiletécniceel anlígenoy el anthuerposé difundenen el gel y d unirse,formanlíneasde trec¡pitina que permanecenestac¡onerias,si las GonceÍtfac¡onesde antígeno y anticuefpo empleadascon€spondena su puntode equivalencie. Esle es un método muy aceÉado pues puede diferenciaf mezclasde antígenosy deteminaf, de identidadparc¡al def¡nidas,las reacc¡ones mediantelos patronesde las líneasde precipitac¡ón o no idenüdedeñtreantígenos. En virologíavegctel, eca técnicá fue introducidapor van Regenmofbl y Engelbfecñten 1962, pera la detem¡naciónÉftrfa de virus isométricos.Tamtién se ha emÉado con la gran mayoría üe vinrs y ha dado ápoyo a los pfogramasde control fiosanitario, e\raluacióny control de la en algunc paísesd€l mundo. de papa,tabacoy leguminosas cal¡dad& sem¡llas En la pafte de badefiotogíase ha empleadoen el diagnósico de espec¡esfitopatogenasy ha permitklo eslaHecer te pfes€ncia Cleseroüposen esp€c¡escomo: Pserrdomo¡tspñaseoritora, É'vviniacadovúa, E. c'ry*dani y Xanttnnnnas campstig er¡treotrs'. s"É. -r¡ utú. Fa o J. t¡. RADIAL 6- INMUIIODIFTNiIÓN. E. se real¡za Usualmenle Estemáodoesiá basadoen el princ¡piode la difusiónen dosdimensiof¡es. en cajasperi, con una @ncenlraciónde anticuerposque estát contenitosen el agar. El entígeno pozosquedifundenrad¡almere en el medio.Se foma eritoncesun halo es colocdo en pegueños de precipitac¡ónahededordel pozo, hasta que todo el antígmo es consumido,incrementándose másen diámÚo, se puedeenconlraruna es¡el hmañode esle.Cuandoel halono se ¡ncrementa de este, m€d¡dadJant¡tetivede la concentracióndel antígeno;cuantomayorsee la concentrac¡ón patmnes por de concentrac¡ón tres ejemplo ¡ncorporan mayorsofá el diámetrodel helo. Si se conocidadel antígeno, puede oüeners€ una cu a de cdibrac¡ón que pueda uülizars€ para determ¡nar la cantktadde anlígenoquese encuentraen muedras@noc¡das' La pfincipaláreade aplicaciónde ede métodoha sido el ed¡¡diode Yirusde plantas,lo cual he llecedoa un diagnósticoráptolo,mediarfe la disociaciónquímicade las prsteínasde las c.ipsides de estos. de dobleditusién.Ha sido ut¡lizadapara el Eda prueba¿5 más sensibleque la de procedim¡entos como la pape, para h titulación de anücuerpos diagnódho masivo en cultivos de importancia y de s|t especificilad. y en la evsluac¡ón ñtopatogenas bacterias contravirus. 30.

(4) 7. ]NMUNOELECTROFORESIS Esila técn¡caes una heframientaanalít¡c¿¡mportafe para sepaEr mezclas complejasde antígenc. Estadifercnciaciónse establecepartiendode dos criterios:la movilidadelectroforé{icá y la especif¡cHadantigénica. La mezcla de afi¡genos es pfimem separadaen sus componentesen los geles de agar. El anticuefpoes colocadoen un cenal paraleloa la ruta de la migraciónelectroforét¡cay así las líneasd€ prec¡Étación0nÍh¡nodfus6n), sondesanolladas. OenEDde sus aplicac¡onesse incluye la cerecterizeciónde los virus de plantas,diferenciación pera eritfe cepasde v¡rusy virionesy las disociecionesde sus unidadesploteicas;se ha empleado_ y én la deteminación de caraderizardetafladámentepatwarir:dadÉ de Xdúluflr,nas catnpesÍris, fas relec¡onesentre diferentes aislamientosde üdocfia na,densis, pfocedentesde d¡stirfos hosped€ros. PORLÁTEX E. AGLUTIITIAGIóN conoc¡dodesde princip¡os¿e s¡glo,es una de las reacciones Este fenómenode aglutinación, antígenoartiq¡erpo másempleadaen la prácticas€rologica' En esta técnice, el antioierpo es ebsortido o pegado a partículascomercíalesde poliestireno, luego de la ddem¡nac¡ón de ta cor¡cent¡ac¡ona utilizarse,sea de antisueroó inmunoglobulina pulincaCa.Al entrent€rlas pafticulasde láex sensitilizadasal antígenoespec¡fico,se prcducela 'reacc¡ón oe las esferasmegnincandode estafoma la reaccióninmune. El mecanismode agMinaciín no sob está influenc¡adopor la unión afitígencar¡ticuerpojtamt ién pres€ntes,diferencias influyenfadores comola treterogeneiladde las clasesde ¡nmunoglobulinas_ y dieléctrica del medio. la conslante intrírisecasen la afinidadde los ántklerpos involucrados Los ensayosde sglutinaciór¡son sencittosy sens¡blesy requ¡erenpocacantidedde feactivos. En fitopetologíaesta tfuiica, se ha utilizado pera el d¡agnólico de rulina de virus alefgadose ísométiicos;ásí como, pera el e€(udiode relacioneser¡tigénices.En bacferiologíase ha usado y P*uúmorcs sohtAcearum paradetedar bacteriastal6 como:chibúer michigarrensis TARCADOS 9. TECilICAS DE ANTICUERPiOS puedenser incrementades mediantela Le sefn¡bil¡dadde las reecc¡onesantígenGariticuerpo, y fluorescentes (ts Coloranles enz¡mas, se encuentfan: de las Cuales defflfo mafcadores, unión mater¡alesrediadivos. El uso de enz¡mas para marcar arÍicuerpos fue primero reportadaen 1966 y originalmente desenollapafa tocalizaraÍtígenos en pfeperacioneshislotógices.A nivel ódico y de microscopía eleclrÚnicase encontróque cuandolos fg8ctanteseCabanunktosa una fese sol¡da,los ens€yos eranapfopiadospera med¡cionescuar itetivasde anlígeflosy de anlicuerpos. inmunoenzimáücos Como rEultado s€ ottwo al métodoconocidocomo ELISA. Es{e método ha sido empleadosd¡sfactoriamentepara deteclaf difereritestipos de €nlígenos como: y¡n¡s, bederias, hongos, micoplasmas,ácidos nucleicos y pequeñas proteína o los snticuerposinducldospor ellas. 3l.

(5) I. .-*. E2 "'--""'-. la adición del suslrato La pres€nc¡ede la reacción antigencar icuerpo *. Y9111 m€d¡arüe que pemiten la coloreedos' de hidrol¡zados formaciri,n de lá enzims y la cons{uiente proporcional a la es erEima de que ¡a retención "i*.m* Dado *áirjá¿" i¡*"i'Oe'f-oi rcsuna¿ós. por cuenlitativa ta posible evalueción realizar es inmoviti¡add, ant¡cuerpo üni¡¿"¿ ó ántbefir o c¡lo¡imelría. es: Para la utilizeciónde eSe métodose debefltenef en cuer a algunosasped6 ¡mportar real¡zala absorción L¿ fas¿ sótirlaque gBnerdm€t|teson micmplacasd€ polieslif€no,donde se o buffer de cobertura. alcalina preéencia solución de una CA amorerpo en p*"" O"i im¡fir*l Otrc imunoabofbente electrodátic6. llre2as las pepd irirportarfe ñ-;il ;,¡6¿;" juesen utilizdo, son las membfenasde nilrocelulosa' producen en animales' Le c¿lHad del ant¡$em es una variable muy importánte' F46 se que dependede ¡nmunización, *n","f,n"rn" án"rc ióvenes, Se debe adoSai un esquernede ¡sieros' que ar a los se dará áa álrtígenoy ¿e ta utitización i"" ááá"tU¡""" paratomarel suefo Debetenefsesi€mpfeen cl|€ffia la dinámicede la rcspuestainmdnehumofal, G' ¡nmunoglobu¡¡nas p¡oducdón las de én li m*t"nro o" inayor Lasinmunog|obr¡tinGdebensefsomel¡dasepfl'Gesosdeseleraciónypufifcac¡ónñediafit€ de derritd, uttrafilbació o cromdogrefíade iritercambioiónico'Luegode fiad¡;t;;ürdienes b4as' erfos pro""O¡mi"tn* se deüenalmacenara tempenaturas 9.1. TGcnologh de bs áGidosnucle¡cos para él d¡agnoslico en la Las lécnicasde hib.ilizafii{'l de los ácirtos nuclebos son henam¡eras bien estaHecijasde los a la seq¡enc¡a inherente gfado, h especiñcirfad de tiolmía molecülar.Dependenen alto bs nuiterSritos.como f6ulrado de di11a especmc¡d€d,se están ;,ü;';;;;;;iil*6¡¡ 5üi*nd; ñ t dpódrosde d¡4nód¡co' induvendola deteccíónde pattígenos' Las pruebasde los áckrosnudeícos offecen una Yer¡tajesobrelos nÉtodos sefolfoicos, puedenhacerceparaun s€t coflpleto de genescon un patógenodado'. ya que,. un s¡dema de derecciónde patógenosde plantasa gran escela, puede sef rcaliz¡do rnilEando pruebestien€n un CO¡¡¡ Oona¿oo 9¡q pnreúa, dn un ensayo denom¡nadoDot-Blot. ESas puede grado de especiñcidád Es1e nucleótitos. de inrlivirrualé difercndas oaiá O"rca¡r de de deteminar nazas ""ti"*r d¡f"¿nciar efffe virus sevefoso atenuadc; y con et fin ;;;áriü; hongos,nemátodc, bacteriasy mycodssmas9.2. Ens.yo dotóbt Un reder e desaroüoen hibridaciónes el ensayodot-bto{y represeñtaun potenc¡alc¡nE¡derable para el estudioy dkwósli:o de patogenosde dantas. una dafüa, hof€o o insedo En términc gentrstcs, el ác5o nucleico üardo, procecer¡te._de y enlazadomediante nitfocelulosa, cornúnmente sólila, matrz une vedor,' es col-oca¿osotxt celor. Los sn¡os t¡H€s l[radc sobre esla malrl¿ son bloqueádoscon un D¡lA no homólogo, praóOeme¿e esp.*a de-salmónó DM de ümo de temetay unafueíte d€ ptot€ína,usualmente u¡ ¡¡¿q pruetra' i¡ctre Oescremaó en polvo o BSA. Despr¡ésde e61o,la hibfidización69n por autofEdiograf¡a: detedtr|o es marcadocon fósforo3:¡'(P),es Sevadaa Ga'bo.El c,NAmafcdo pasos si¡uieítes son Los es úilizada. mrcada .o6ifóanca, si una enzima ü-ói-" ":"*0" 32.

(6) dmilíes a lG del ELISA,sin eÍtbflgo, la basedel enlacees difef€flte,ya que m¡entrasel ELISA e5¡ábasadoen u rección antfgenoánticuerpo,la hibridizac¡ónedá b€sadasobrela dineaclh de band6 complementariGde ácidc nudeicos. de sÉorericiasde nudet$idos(bGÉs Se <leberecorda que hibidizaf significacomplemenlariedad pa¡-¿ en ctFnta: temperatura,cÚceítración deüe tener se condic¡on6 estc ¡iusta¡ nitfúenadas). pares de bas€s' y de la cantidad de fofinami& oe áes. corrcentsactirl 9.3. Fragment6 de r€stricciónde long¡ü¡dpolimóÉice Estatécn¡caúil¡za enEimasde redricción parefEgmentar el DÑA, el cual ea ento|,lcessÉperado en gEles& agaosa med¡antela técnicade el€drofores¡s' Cda enzimade rcsficc¡ón reconoceuna sedrenc¡aespetÍfica de nucle¿ttidGy oorta el Dl''lAen un sitio dderminado, siernpre que la secuencia apsfezca. El fr4rnento Di'lA € sepa¡-ado *¿i"ttt" g.lo d. etec.trofor;Csy'lc paÍones de bandeamientoson visiblesmedianteüncióncon ¡'omurc d; €*¡cfioo pr artonadío$af¡a. Cuandoel D¡¿\ m¡tocordrial(rnt Dl'lA), el ¡¡¡al tiene un (b diferentes 69€cies' es renoo de 10 a z(xi per€s @ kilobaÉesen lorgitu4 proced€nte de rcslricción puederi ser y fr4mentos de núme@ el tarnaño Ot"r.nUá entre lo€ siti6 de "n delecc¡mes insertos o pueden de resultaf, "ná-nr¡"do, Esic difefefici6 oge"t*. son @nocidoscomo Estricción de fr4mentos en lc onierva¿as r"rfi""lO.t. tás diferenciG RFLPS. que puedenser EstaspruebG ayuddt a identificarfeg¡onesdel genoffE o del DNA mit@rdrial' r¡sadaien e¡rkndto de pn¡ebasde rzas especificas' 9.4. tÉToDos DE HlBRlDlzAclÓNDE Los ÁclDos NUcLElcos ta hibridizaciónde 106ác¡dc nuctefcoedependeen alto gradode la especificidadinheref e a las o" l* patesoe nuaeot¡ac. Es una heramieritaedadecida en la biologíamolecular. *"iffi"" para propósitoe de Como resultado de esta especificidd la técnica eda s¡endo aplicada diagnóstico,induyendola ddección de patÓgenos.. IJ.

(7) Anügeho. DI D6term¡nante ant¡ génico. Detsfminañtes. Ant¡genos. F¡$¡l L f4 itiogpoa. t. rlrsr a ddc¡mhs|l6 riflpbo müpL¡ da m aiig€íd 3)t¡|¡iÍ da ur a b¡¡po e |¡la Fütir con m dCúr$¡l. h¡co, L¡a r¡a rba dC ar&¡¡F aL FJrd{ ¡ra 6.upado3, ¡do d ccarflalo m F¡da ccaü¡¡f cjlclcldo. L¡a anüd¡JF rl¡h¡¡lÉ aon nÉ da bmr -rlbl moacJb q¡c F.tda'l ú¡ra a n¡chc¡¡ datürarsüaa & (n Ítlgdro, 3tnú FLnchfrgrla cFaa ae¡!0rd6. b' AE||¡ lnc¡r¡o un¡ F¡b¡h ¡il¡úo, ÉFc[Í¡rúa ha vilr¡, Farotrl k|ll|Jcú ri un¡ ürlc¿ FnbIc |fr¡{thbr dlirrffcr aa F¡ñ da Ítlq¡Fa cap¿ da hYttf gúrdar arq¡iba c rGf¡in¡ cú a¡|..' i¡o Ó ¡rlit¡drdt.. Siüosde un¡ón del antlgono. *rt,o" I I *TI'o".{ -H"N \ fl ¿ " 1 / *" unión .¡r,r,rG Nrhtl/ ,ó \JJ. Floura 2, RerEar{aclóri. aaqudÍl¡|br. da uD¡ trE|h¡b. rh. cllrpo. L¡ 4¡cijo dal srllgrro r Foüra ú b¡ do¡ a¡!ú!a ruD..lorE d. b Y q¡a f¡rn¡ h mo*cüL, do¡rr b cadan¡a ¡gfa y p€!d. d¡h ü hl¡rD c¡r{do. L¡ p.¡t5o hrbrt ¡t b Y cqúrE ¡. '¡rlbsÍ.íia F. rtotrúb da b eaddrb rqfb.Hor¡. hrda p...de!. S. ¡Étár lo. a.!ür¡¡ l{ l!írb lr+€ ) y C lÍ¡H C¡dena ¡¡gero (COO) C. h¡ (Édmü llgrE y A¡üló db|'¡ltlD (S-9 D6ú¡, üñür ts¡ dbth¡r cadí6 düt ¡L. Dom¡nigs Efecto1€5. p€saoa. 34.

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