Transformación genética de Digitalis purpurea mediada por Agrobacterium tumefaciens y análisis de genes candidatos para la sobreprodución de cardenólidos

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(1)UNIVERSIDAD CENTRAL ´´ MARTHA ABREU ´´ DE LAS VILLAS INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA DE LAS PLANTAS. Tesis presentada en opción al grado académico de Master en Biotecnología Vegetal. Transformación genética de Digitalis purpurea mediada por Agrobacterium tumefaciens y análisis de genes candidatos para la sobreprodución de cardenólidos. Autor: Lic. Yovanny Izquierdo Núñez Tutor: Dr. Elio Jiménez González. Santa Clara 2010.

(2) Resumen RESUMEN Los cardenólidos son metabolitos secundarios, producidos por las plantas del género Digitalis, que se utilizan ampliamente en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca. El fracaso de los intentos por potenciar la producción de los mismos a partir de técnicas de cultivo in vitro, ha señalado a la transformación genética como una estrategia promisoria para la obtención de plantas altamente productoras. A pesar de contar con un sistema de regeneración de plantas, los intentos para transformar Digitalis purpurea han sido infructuosos. Es por ello que el objetivo de este trabajo fue desarrollar un sistema de transformación de esta especie mediado por Agrobacterium tumefaciens y analizar desde un enfoque comparativo la regulación de los genes candidatos para la transformación. Se transformaron discos de hojas de plantas cultivadas in vitro con las cepas de A. tumefaciens EHA101 y C58C1-pMP90, con el vector de transformación pTJK136 que contenía al gen nptII como marcador de selección y uidA como gen reportero. Ambas cepas desarrollaron altos niveles de expresión transitoria del gen uidA, aunque sin diferencias significativas entre ambas. Sin embargo, a partir de la transformación con la cepa C58C1-pMP90 la inducción de callos y la regeneración de plantas fueron significativamente mayores respecto a la cepa EHA101. No hubo diferencias significativas en cuanto a la expresión estable de uidA en las plantas regeneradas a partir de la transformación con ambas cepas. La presencia de los transgenes fue detectada en las líneas de plantas regeneradas y el número de copias insertadas osciló entre una y dos. Para el estudio de los genes candidatos se detectaron los motivos reguladores en los promotores de los genes P5βR y P5βR2, codificantes para la enzima clave de la biosíntesis de cardenólidos en D. purpurea, a partir de su ortólogo VEP1 en Arabidopsis thaliana y genes coexpresados con él. Como resultado, se predice que el gen P5βR está regulado principalmente por motivos de unión a factores de transcripción DOF, mientras que P5βR2 lo está por motivos de factores de respuesta a etileno. Estos resultados en combinación con los presentados por otros autores indican a P5βR2 como el mejor candidato a la transformación de D. purpurea para obtener plantas sobreproductoras de cardenólidos. En su conjunto los resultados de este trabajo contribuyen al conocimiento sobre la biosíntesis de cardenólidos y permitirán obtener plantas transformadas altamente productoras de estos metabolitos de tanta importancia económica y social.. 1.

(3) Índice ÍNDICE Sección .................................................................................................................... ......... Página 1. INTRODUCCIÓN.............................................................................................. ........................4 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA...................................................................................................8 2.1 Digitalis purpurea L. Origen y clasificación....................................................................8 2.2 Descripción botánica............................................................................................ .............8 2.3 Importancia farmacológica................................................................................ ...............9 2.4 Cardenólidos........................................................................................................ .............10 2.4.1 Estructura y propiedades farmacológicas......................................................10 2.4.2 Mecanismo de acción........................................................................................11 2.4.3 Metabolismo........................................................................................... ............12 2.4.4 Flexibilidad de la ruta........................................................................................15 2.5 Cultivo in vitro de Digitalis................................................................................. ..............17 2.6 Producción de cardenólidos in vitro...............................................................................18 2.7 Transformación genética. Agrobacterium......................................................................19 2.8 Factores que influyen en la eficiencia de la transformación con A. tumefaciens......21 2.9 Transformación genética en Digitalis.............................................................................22 2.10 Chequeo de plantas transformadas..............................................................................23 2.11 Selección de genes candidatos para transformación de D. purpurea......................25 2.12 Análisis comparativo de regulación de genes.............................................................27 3. MATERIALES Y MÉTODOS...................................................................................................29 3.1 Transformación genética de D. purpurea mediada por A. tumefaciens y análisis molecular de líneas regeneradas......................................................................................................30 3.1.1 Transformación genética de de D. purpurea mediada por A. tumefaciens............................................................................................................. ................30 3.1.2 Análisis moleculares de las líneas de plantas regeneradas..........................34. 2.

(4) Índice 3.2 Análisis comparativo de la regulación de los genes P5βR y P5βR2...........................39 3.2.1 Análisis de expresión del gen VEP1 de A. thaliana........................................39 3.2.2 Detección de motivos reguladores en P5βR y P5βR2....................................40 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN................................................................................................41 4.1 Transformación genética de D. purpurea mediada por A. tumefaciens y análisis molecular de líneas regeneradas......................................................................................................41 4.1.1 Transformación genética de de D. purpurea mediada por A. tumefaciens.................................................................................................................. .......................41 4.1.2 Análisis molecular de las líneas de plantas regeneradas..............................46 4.2 Análisis comparativo de la regulación de los genes P5βR y P5βR2...........................49 4.2.1 Expresión del gen VEP1 de A. thaliana............................................................50 4.2.2 Detección de motivos reguladores en P5βR y P5βR2....................................58 4.2.3 P5βR y P5βR2 como candidatos a transformación para el incremento de la síntesis de cardenólidos....................................................................................................................62 5. CONCLUSIONES..................................................................................................... ...............64 6. RECOMENDACIONES............................................................................................................65 7. ANEXOS.................................................................................................................... ..............66 8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................................69. 3.

(5) 1. Introducción 1. INTRODUCCIÓN. La transformación genética es una herramienta de especial interés para el mejoramiento genético, en particular de plantas productoras exclusivas de compuestos de interés farmacéutico tales como los glicósidos cardiotónicos o cardenólidos (Giddings et al., 2000). Estos metabolitos secundarios constituyen los medicamentos más extensamente tratados a nivel mundial en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca (Gavidia et al., 2007). Hasta la fecha, las plantas del género Digitalis son las únicas fuentes viables desde el punto de vista económico para la producción de cardenólidos a escala industrial, de ahí que haya existido siempre un gran interés en el desarrollo de estrategias para fomentar la producción de estos metabolitos (Hagimori et al., 1980; Sales et al., 2007). El cultivo in vitro ha sido extensamente explorado en este sentido, tratando sin éxito de lograr la producción de cardenólidos en biorreactores de suspensiones celulares (Hagimori et al., 1980). Más tarde fue descubierto que la biosíntesis de estos glicósidos se produce sólo en tejidos verdes diferenciados (Stuhlemmer y Kreis 1996), por lo que solo mediante la propagación de plantas en sistemas de inmersión temporal se obtienen niveles apreciables, aunque todavía menores que los obtenidos en condiciones de campo (Pérez-Alonso et al., 2009). La ingeniería metabólica permite la manipulación de rutas biosintéticas de interés para modificar los niveles de determinados metabolitos, ya sea por adición de precursores, modificación de condiciones de cultivo o transformación genética (Venepoorte et al., 1999). Respecto a la biosíntesis de cardenólidos, la adición de precursores como la progesterona al medio de cultivo produce un aumento significativo de la biosíntesis (Hagimori et al., 1982b), pero su alto costo hace esta estrategia inviable. Como consecuencia, la transformación genética con un gen involucrado en la biosíntesis de este precursor o su canalización hacia la ruta de biosíntesis de los cardenólidos aparece como una alternativa promisoria para obtener plantas con una productividad elevada. Como ventaja adicional, este enfoque permitiría, en combinación con las técnicas de cultivo in vitro, propagar masivamente plantas transformadas con una productividad más uniforme que la registrada en condiciones naturales. 4.

(6) 1. Introducción (Neczypor 1969). Esta estrategia ha sido empleada con éxito en la manipulación de otras rutas metabólicas secundarias en plantas, como los flavonoides (Ververidis et al., 2007) y alcaloides (Hughes y Shanks 2002). Para el desarrollo de una estrategia para el desarrollo de plantas genéticamente modificadas para la sobreproducción de compuestos de interés, son necesarios un sistema de regeneración de plantas, un protocolo de transformación y un gen (o varios genes) que potencie(n) la biosíntesis del metabolito en cuestión. Para Digitalis purpurea no existe hasta la fecha un sistema de transformación descrito. Sólo se han publicado trabajos de este tipo en la especie relacionada Digitalis minor por Sales et al., (2003), quienes utilizan A. tumefaciens en la transformación de discos de hojas de plantas cultivadas in vitro. Con anterioridad fue desarrollado un protocolo para la regeneración vía embriogénesis somática de D. purpurea, a partir de explantes foliares de plantas cultivadas in vitro (Occeguera 2006). Además se determinaron las concentraciones mínimas inhibitorias de varios agentes selectivos para cada fase del proceso (Occeguera 2006). Se hace necesario, por tanto, el desarrollo de un sistema de transformación en esta especie que permita la introducción de genes que potencien la biosíntesis de cardenólidos. Estas plantas transgénicas podrían ser empleadas con fines industriales, a través de la propagación masiva de biomasa en ambientes controlados o de su cultivo en condiciones de invernadero.. En cuanto a los genes candidatos para la transformación, varios autores apuntan a la Progesterona 5β-reductasa como la enzima clave de la ruta de biosíntesis de cardenólidos (Seitz y Gärtner 1994; Gavidia et al., 2007). Sin embargo, estudios recientes revelan la existencia de dos genes que codifican para esta actividad enzimática en D. purpurea: P5BR y P5BR2, con patrones de expresión diferentes (Pérez-Bermúdez et al., 2010). Por otra parte, otros trabajos señalan que VEP1 (del inglés: vein patterning 1), el gen ortólogo de ambos en Arabidopsis thaliana, está asociado con la morfogénesis de los tejidos foliares (Jun et al., 2002), lo cual sugiere que esta actividad enzimática. 5.

(7) 1. Introducción pudiera también estar asociada a otros procesos fisiológicos en Digitalis, en adición a su rol en la biosíntesis de cardenólidos. Por tanto, el estudio de la regulación de P5BR y P5BR2 es importante para poder decidir cuál de ellos es un mejor candidato para la transformación y bajo qué señales reguladoras. Sin embargo, la carencia de datos genómicos y de microarreglos en Digitalis es una limitante en este sentido. Es por eso que se requieren estudios comparativos a partir de especies modelo como A. thaliana para predecir cuáles son las vías de regulación de ambos genes en D. purpurea, mientras que el desarrollo de un sistema de transformación a través del cual se introduzca el transgén seleccionado permitirá la obtención de plantas transgénicas de D. purpurea con una productividad alta y uniforme de cardenólidos. De ahí que la hipótesis sobre la que se basa este trabajo es: “Es posible desarrollar un sistema de transformación de D. purpurea mediado por A. tumefaciens y predecir la regulación de los posibles genes candidatos a partir de análisis de genómica y transcriptómica comparativas, como etapas previas al desarrollo de plantas transgénicas sobreproductoras de cardenólidos”. El objetivo general de este trabajo es, por tanto: - Desarrollar un sistema de transformación de D. purpurea mediado por Agrobacterium tumefaciens y predecir la regulación de posibles genes candidatos para la transformación Este puede ser desglosado en los siguientes objetivos específicos: -. Desarrollar un sistema de transformación de D. purpurea mediado por Agrobacterium tumefaciens. -. Predecir la regulación de P5BR y P5BR2 a partir de análisis de genómica y transcriptómica comparativa. La novedad científica de este trabajo radica en que se desarrollará por primera vez un sistema de transformación de D. purpurea y se estudiarán las señales de regulación de los genes VEP1, de A. thaliana; y P5BR y P5BR2, de D. purpurea. Los resultados podrán ser aplicados al diseño de. 6.

(8) 1. Introducción estrategias de transformación de D. purpurea para la obtención de plantas con una productividad alta y uniforme de cardenólidos. El aporte práctico fundamental es que la producción in vitro y a gran escala de biomasa con un contenido de cardenólidos elevado y estable permitiría reducir los costos de producción de estos metabolitos ampliamente usados en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca.. 7.

(9) 2. Revisión Bibliográfica 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2.1 Digitalis purpurea L. Origen y clasificación La planta D. purpurea es nativa de Europa occidental, el mediterráneo y el noroeste de África; aunque se ha naturalizado en otras regiones subtropicales o templadas de Europa, Asia, África, América del Sur, Nueva Zelanda, Canadá y Estados Unidos (Hultén 1968). Debido a sus propiedades medicinales, se ha intentado introducir en Cuba junto a otras especies del género. En nuestro país su crecimiento en condiciones de campo se produce de manera rápida en otoño e invierno, sin embargo la llegada del verano por lo general ocasiona la muerte de la planta por la ocurrencia de altas temperaturas y abundantes lluvias (Roig 1974). La planta es conocida en español con nombres comunes como Dedalera, Digital o Calzones de zorra. Su ubicación taxonómica fue dada a conocer por Linnaeus y en la actualidad se acepta de la siguiente forma (según NCBI taxonomy, disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov): Reino: Viridiplantae Phylum: Strptophyta División: Magnoliophyta Subclase: Asterids Orden: Lamiales Familia: Plantaginaceae Tribu: Digitalideae Género: Digitalis. 2.2 Descripción botánica Esta planta es una hierba bienal o perenne, de hasta 2,5 m de altura. Las hojas son alternas, las basales reunidas en una roseta, pecioladas con limbo ovado-lanceolado y margen dentado, densamente pilosas sobre todo por el envés, que tiene una coloración grisácea. Presenta una inervación reticular (reticulódromas) muy saliente por el envés e inflorescencia en un largo racimo. 8.

(10) 2. Revisión Bibliográfica terminal. Las flores son pedunculadas y algo péndulas, muy vistosas. El cáliz pentámero, verde, corola de 40-55 mm de longitud, en forma de tubo ancho apenas lobulado en la porción distal, de color en el rango desde el púrpura hasta el blanco con manchas oscuras en su interior. Su androceo está formado por 4 estambres didínamos de longitud desigual, fusionados a la corola y cuyas anteras se disponen en la parte superior del tubo de la corola. El gineceo es bicarpelar, con ovario súpero que fructifica en una cápsula de dehiscencia valvar. Florece entre la primavera y el verano. El fruto es una cápsula que al madurar se abre desprendiendo numerosas semillas de 0,1 a 0,2 mm de diámetro (Renobales 2001). En el primer año de crecimiento produce únicamente las hojas basales, ovales, dentadas y de peciolo largo mientras que durante el segundo año se desarrolla un tallo largo y cubierto de hojas sésiles y rugosas.. 2.3 Importancia farmacológica D. purpurea ha sido empleada desde la antigüedad como planta medicinal en el tratamiento de enfermedades cardíacas de manera empírica. Sin embargo, no fue hasta 1785 que William Withering describió sus propiedades medicinales en el tratamiento de la hidropesía, enfermedad caracterizada por la acumulación excesiva de líquido en los tejidos y que en la medicina moderna se reconoce como una consecuencia de la insuficiencia cardíaca (Withering 1785). En este mismo trabajo también se describían por primera vez los efectos tóxicos derivados de dosis elevadas de preparaciones de la planta. No fue hasta 1799, sin embargo, que la acción farmacológica de D. purpurea fue relacionada con su efecto sobre el corazón (Ferriar 1799). Estudios posteriores demostraron que la digital contiene una serie de sustancias cardiotónicas muy activas de naturaleza esteroideo-glicosídica conocidas comúnmente como glicósidos cardiotónicos, o más formalmente cardenólidos. Además, la planta produce otros compuestos no glicosídicos como la digitoflavina, el ciclohexanol, taninos, ácidos málico y succínico, los cuales complementan la acción de aquellos (Melero et al., 2000). En la actualidad varios cardenólidos, principalmente la digoxina y sus derivados, son utilizados en la terapia cardíaca.. 9.

(11) 2. Revisión Bibliográfica Su importancia es tal que no han podido ser sustituidos hasta la fecha, al menos en el tratamiento a gran escala (Gavidia et al., 2007). 2.4 Cardenólidos 2.4.1 Estructura y propiedades farmacológicas Los cardenólidos son moléculas caracterizadas por un núcleo esteroideo (genina o aglicona) que cuenta con un grupo hidroxilo en la posición C14β y un anillo lactónico insaturado de cinco miembros en la posición C17β. Varias de las demás posiciones de la fracción genina pueden tener además sustituyentes como grupos hidroxilo, formilo o acetilo (Kreis et al., 1998; Herl et al., 2005). A la posición C3β se une una cadena de oligosacáridos típicamente de hasta cinco unidades dentro de las cuales es usual encontrar azúcares poco comunes (Melero et al., 2000) (Figura 1). En cuanto a sus patrones de glicosilación, los cardenólidos se clasifican en primarios, si el azúcar terminal es la glucosa, o secundarios en caso contrario. El núcleo esteroideo tiene además la característica peculiar de tener sus cuatro anillos fusionados en la secuencia cis-trans-cis desde el A hasta el D (Figura 2), lo cual les confiere su actividad farmacológica a estos compuestos (Melero et al., 2000).. Figura 1. Estructura química de los cardenólidos. Como ejemplo, la digoxina (I) está formada por un núcleo esteroideo (aglicona) y tres unidades de digitoxosa. Las variaciones en el patrón de glicosilación de la aglicona dan lugar a los núcleos esteroideos de la digitoxina (II) y la gitoxina (III). 10.

(12) 2. Revisión Bibliográfica. Figura 2. Estereoquímica cis-trans-cis de los cardenólidos (a) comparada con otras conformaciones del núcleo esteroideo (b).. Las relaciones estructura-actividad han sido ampliamente estudiadas en los cardenólidos. Al respecto se han determinado tres regiones importantes en el reconocimiento por el receptor: el núcleo esteroideo, a través de interacciones hidrofóbicas; el anillo lactónico de la posición C17β y los residuos de azúcares, estos últimos por interacciones electrostáticas y puentes de hidrógeno (Thomas et al., 1990). De los tres, el núcleo esteroideo con su característica. conformación parece ser el. determinante, ya que la unión de las otras dos regiones al receptor depende de la unión previa de la genina (Melero et al., 2000). La farmacocinética de los cardenólidos también depende en gran parte de su estructura. En cuanto al número de restos de azúcares enlazados, la potencia farmacológica varía en el orden monosacárido-aglicona > disacárido-aglicona > trisacárido-aglicona >> aglicona. En cuanto a la velocidad de absorción, esta es inversamente proporcional a la cantidad de restos de azúcares enlazados (Chiu y Watson 1985 ). 2.4.2 Mecanismo de acción En cuanto a su mecanismo de acción, los glicósidos cardiotónicos pueden ser definidos como inhibidores alostéricos de la bomba Na+-K+, que se unen de manera no covalente a la misma (Repke et al., 1989). La bomba Na+-K+ (E.C. 3.6.1.37) es una enzima transportadora presente en casi todos los. 11.

(13) 2. Revisión Bibliográfica tipos de célula del reino animal. Su función es movilizar iones sodio hacia en exterior celular a la vez que transporta iones potasio a la célula, a costa de la hidrólisis de ATP. La bomba mueve ambos iones en contra de su gradiente de concentración, de manera que es la encargada de mantener dicho gradiente que es, por una parte, responsable de la polarización de la membrana plasmática y por otra, utilizado como fuente de energía para el transporte de otros iones y moléculas necesarias para el funcionamiento celular (Skou 1965). De acuerdo con el mecanismo de acción de los glicósidos cardiotónicos (Thomas et al., 1990), estos inhiben la bomba Na+-K+ (alrededor del 30% con dosis terapéuticas) causando un incremento intracelular de Ca2+ en el músculo cardíaco y por consiguiente un aumento en la fuerza de la contracción. Las dosis elevadas de estos glicósidos provocan la paralización en cadena de numerosos procesos de transporte secundario de iones y nutrientes que dependen de la bomba Na+-K+, lo cual conduce a la muerte celular y es la base de la toxicidad de estos compuestos. Este hecho, unido a la ubicuidad de la bomba Na+-K+ en el reino animal justifica que se haya propuesto que la función natural de los cardenólidos sea como repelentes de herbívoros que traten de alimentarse de las hojas de plantas del género Digitalis (Malcolm y Zalucki 1996). 2.4.3 Metabolismo Debido al potencial farmacológico de los cardenólidos, se han hecho consistentes esfuerzos por dilucidar sus rutas de biosíntesis y posterior degradación. Sin embargo, las limitaciones técnicas derivadas de la escasez de datos genómicos de esta especie combinadas con la complejidad de la red metabólica en la que se encuentran inmersos los cardenólidos, ha provocado que el conocimiento de dichas vías metabólicas sea aún incompleto. La biosíntesis de los cardenólidos puede decirse que comienza a partir de la degradación oxidativa de la cadena lateral de los fitosteroles (colesterol, campesterol, sitosterol, estigmasterol) por la enzima colesterol monooxigenasa (EC 1.14.15.6) o enzima degradadora de cadenas laterales (SCCE, del inglés: side chain cleaving enzyme) (Figura 3). El producto de esta reacción es la. 12.

(14) 2. Revisión Bibliográfica. Figura 3. Biosíntesis de cardenólidos (color negro) y su relación con otras rutas metabólicas (color gris). Los nombres de las enzimas se destacan en letra cursiva. Tomado de Fisterbusch et al. (1999), con modificaciones.. pregnenolona, la cual es oxidada reversiblemente a pregn-5-eno-3,20-diona por la enzima Δ5-3βhidroxiesteroide deshidrogenasa (EC 1.1.1.145) (3βHSD, siglas en inglés). Este último compuesto se transforma rápidamente en su isómero pregn-4-eno-3,20-diona (progesterona). No queda claro si la actividad Δ5- Δ4 cetoesteroide isomerasa reside en la propia 3βHSD, en otra enzima asociada o si la. 13.

(15) 2. Revisión Bibliográfica reacción ocurre espontáneamente por vía no enzimática debido a la mayor estabilidad del producto Δ4 (Lindemann y Luckner 1997; Finsterbusch et al., 1999). La próxima reacción de la ruta es la reducción del doble enlace de la progesterona para dar 5βpregnano-3,20-diona, primer compuesto en el que aparece la conformación 5β característica de los cardenólidos y que por consiguiente se considera el primer paso comprometido absolutamente con la producción de estos compuestos (Gavidia et al., 2007). La reacción es catalizada por la progesterona5β-reductasa, actividad codificada por al menos dos genes en D. purpurea (Pérez-Bermúdez et al., 2010). A continuación, la 5β-pregnano-3,20-diona es reducida en su posición C3 a 5β-pregnano-3β-ol20-ona por la propia 3βHSD (Finsterbusch et al., 1999). La ruta continúa por derivados de pregnano a partir de las hidroxilaciones en C14 y C20 hasta la condensación en esta última posición con AcetilCoA y la formación del anillo lactónico (Kreis et al., 1998). La sucesión de enzimas en esta porción de la ruta, sin embargo, no se encuentra descrita. En general se asume que la adición de azúcares a la posición C3 se produce luego de la formación de la aglicona, aunque no existen evidencias definitivas acerca de la secuencia relativa de los eventos de glicosilación e hidroxilación. La glicosilación de los glicósidos secundarios a primarios es catalizada por la enzima citosólica y soluble UDP-glucosa:digitoxina 16'-O-glucosiltransferasa (DGT, EC 2.4.1.-) en Digitalis lanata (Kreis et al., 1986). Estos glicósidos primarios son considerados la forma fundamental de almacenamiento en la vacuola central (Hoelz et al., 1992). Otra enzima relacionada con la biosíntesis tardía de los cardenólidos es la también soluble y citosólica Acetil-CoA:digitoxina 15'O-acetil transferasa (DAT, EC 2.3.1.-) que cataliza la formación de los lanatósidos a partir de sus precursores no acetilados (Sutor et al., 1990). Este grupo de cardenólidos se denomina de esta forma por ser los más abundantes en D. lanata. El metabolismo de degradación y movilización de los cardenólidos también ha sido estudiado. Al respecto, se han descrito las cardenólido glucohidrolasas (CGH) I y II. CGH-I es una enzima de membrana, mientras que CGH II es soluble en el citosol (May y Kreis 1997; Hornberger et al., 2000). Ambas hidrolizan rápidamente los glicósidos primarios vacuolares una vez que la compartimentación. 14.

(16) 2. Revisión Bibliográfica celular es eliminada, aunque sus especificidades de substrato difieren. En particular, CGH II sólo acepta glicósidos no acetilados, de manera que no puede hidrolizar lanatósidos, que sí son procesados por CGH I. De manera general, ambas enzimas se relacionan con la movilización de cardenólidos desde la vacuola presumiblemente ante ataques de herbívoros (Hornberger et al., 2000). Además se ha descrito una lanatósido 15'-O-acetilasa, supuestamente vinculada a los mismos procesos de CGH-I y CGH-II (Sutor et al., 1990).. 2.4.4 Flexibilidad de la ruta Los esteroides son sustancias estructuralmente relacionadas con muchas y muy diversas funciones en la fisiología de las plantas. Estas pueden ser estructurales, hormonales, de defensa, etc. Como consecuencia de esto las rutas metabólicas que se involucran son a menudo complejas. En el caso de la biosíntesis de cardenólidos, la primera parte de la ruta hasta la formación de progesterona se ramifica hacia otras vías metabólicas en plantas (Mueller et al., 2003). De hecho, el suministro de colesterol o pregnenolona al medio de cultivo de D. purpurea no se traduce en un aumento de la producción de cardenólidos según resultados publicados por Hagimori et al., (1983) y atribuidos al hecho de que estos esteroles son precursores de otras rutas metabólicas. Sin embargo, Sales et al., (2007) han logrado obtener líneas transgénicas de Digitalis minor que sobreexpresan el dominio catalítico de la enzima hidroximetil glutaril CoA reductasa (HMGCoA reductasa) de Arabidopsis thaliana y presentan mayor contenido de cardenólidos que las plantas no transformadas. HMGCoA reductasa es una enzima clave en la ruta de síntesis de esteroles que desemboca en la síntesis del colesterol, por lo que en principio su sobreexpresión debe afectar a todos los esteroles derivados de este, incluidos los cardenólidos. Existe por tanto una aparente contradicción con los experimentos de suministro de colesterol de Hagimori y colaboradores (1983), que puede explicarse al considerar, por una parte, la diferente naturaleza de inducción metabólica que existe entre suministrar un metabolito y sobreexpresar un gen; y por otra, la aleatoriedad de los eventos de transformación genética que puede provocar activación o. 15.

(17) 2. Revisión Bibliográfica represión de otros genes de manera que el efecto observado pueda no sólo deberse al transgén en sí, sino además, al lugar donde se inserte. Una evidencia de esto último es el hecho de que de las líneas transgénicas obtenidas en el mencionado trabajo no todas mostraron un incremento en el contenido de cardenólidos. Más adelante en la ruta, la enzima 3βHSD es un buen ejemplo de plasticidad por cuanto cataliza varias reacciones tanto dentro de la biosíntesis de los cardenólidos como la de los pregnanos 5α-derivados (Finsterbusch et al., 1999). Sólo a nivel de la progesterona es que se observa una respuesta de síntesis de glicósidos ante la administración del substrato, lo cual soporta la hipótesis de que su reducción en 5β es la primera reacción específica de la ruta (Gärtner y Seitz 1993). No obstante, la progesterona se encuentra relacionada con otros procesos fisiológicos vegetales, aunque el conocimiento al respecto es limitado. Ylstra et al., (1995) demostraron que varias hormonas animales incluida la progesterona estimulaban la germinación y el crecimiento del tubo del polen en tabaco (Nicotiana tabacum). Además se ha demostrado que puede inducir floración o desarrollo generativo en trigo (Hordeum vulgare) (Janeczko y Filek 2002) y A. thaliana (Janeczko et al., 2003). La reducción de la progesterona para dar lugar a la 5α-pregnano-3,20-diona es el camino alternativo a la síntesis de los cardenólidos que puede seguir esta sustancia, para dar lugar a una ruta que desemboca en la síntesis de los brasinoesteroides (Clouse y Sasse 2003; Iino et al., 2007). Estos son fitohormonas a las que se les atribuyen una variedad de funciones como la elongación celular, división celular, diferenciación vascular y modulación de respuestas a estrés (Clouse y Sasse 2003). Por último, el hallazgo de que la actividad progesterona 5β-reductasa está codificada por al menos dos genes (P5βR y P5βR2) en D. purpurea, reafirma la complejidad del contexto de la ruta de los cardenólidos (Pérez-Bermúdez et al., 2010). De estos dos genes, P5βR2 parece estar relacionado directamente con la biosíntesis en respuesta a condiciones de estrés, mientras que P5βR mantiene una expresión basal que pudiera estar relacionado con otras funciones desconocidas (PérezBermúdez et al., 2010). Esto concuerda con el hecho de que su ortólogo en A. thaliana (VEP1, del. 16.

(18) 2. Revisión Bibliográfica inglés Vein Patterning 1) fue inicialmente involucrado en la diferenciación vascular (Jun et al., 2002), y sólo después se demostró su actividad enzimática (Herl et al., 2009) lo cual pone en tela de juicio el argumento de que la reducción 5β de la progesterona es una reacción absolutamente comprometida con la síntesis de glicósidos cardiotónicos. Todos estos elementos demuestran la relación de la biosíntesis de cardenólidos con otros procesos fisiológicos. Tal interconexión implica una fina regulación por parte de la planta, pero además entraña un reto en las proyecciones de ingeniería metabólica para incrementar la producción de estos fármacos en el género Digitalis.. 2.5 Cultivo in vitro de Digitalis Por su importancia en la industria farmacéutica las especies del género Digitalis han sido objeto de estudio en cuanto a sus potencialidades en el cultivo in vitro, casi siempre ligadas a la producción de cardenólidos. Para algunas de estas especies, se han descrito considerables fluctuaciones de productividad y composición de los componentes activos, así como variaciones morfológicas entre individuos. Estas variaciones son atribuidas al relativamente corto tiempo de cultivo de estas especies (a pesar de su extensivo uso a lo largo de la historia) así como la variación en el número de cromosomas y la formación espontánea de híbridos (Neczypor 1969). De manera que, en los inicios, la exploración del cultivo in vitro. en dicho género tuvo como finalidad la propagación de líneas de. elevada productividad y el desarrollo de métodos de producción de cardenólidos a escala industrial. En 1975 Corduan y Spix desarrollaron un protocolo de regeneración de plantas a partir de cultivo de anteras de D. purpurea. En este trabajo se establecían las condiciones para obtención de callos haploides así como la regeneración y conversión de plantas diploides y tetraploides (Corduan y Spix 1975). A principios de los 80, Hagimori y colaboradores realizaron una serie de trabajos en los que se desarrollaban diferentes etapas del cultivo in vitro de D. purpurea. (Hagimori et al., 1980). Este mismo grupo de investigadores logró desarrollar suspensiones celulares en condiciones de luz y oscuridad. 17.

(19) 2. Revisión Bibliográfica (Hagimori et al., 1982a). Otros trabajos dan cuenta de la restauración del potencial regenerativo de cultivos prolongados de brotes de D. purpurea por acción del ácido giberélico (Chaturvedi y Jain 1994). Para otras especies del género también han sido desarrollados protocolos de regeneración in vitro. Pérez-Bermúdez et al. (1984) estudiaron la morfogénesis a partir de explantes foliares de Digitalis obscura. Un estudio similar desarrollado por Cacho et al. (1991) estableció el potencial morfogenético in vitro de explantes de hojas, hipocótilos y raíces de Digitalis thapsi. En D. lanata han sido establecidos protocolos tanto de organogénesis como de embriogénesis somática (Tewes et al., 1982; Diettrich et al., 1986), mientras que en D. minor se han establecido protocolos de regeneración vía organogénesis a partir tanto de tratamiento con reguladores del crecimiento como de la infección de explantes foliares con Agrobacterium tumefaciens (Sales et al., 2002). En D. purpurea, sin embargo, además de los trabajos de morfogénesis mencionados, solo se ha descrito un protocolo completo de regeneración por embriogénesis somática (Occeguera 2006). En este mismo trabajo se determinaron las concentraciones mínimas inhibitorias de los agentes selectivos higromicina B y geneticina en la fase de inducción de callos.. 2.6 Producción de cardenólidos in vitro El cultivo in vitro comenzó a desarrollarse en especies de Digitalis desde hace varias décadas, por el entusiasmo que representaba la posibilidad de utilizar sus facilidades de automatización para la producción de cardenólidos. Sin embargo, dentro de los métodos de producción de biomasa, los intentos de producción mediante cultivos celulares en biorreactores fracasaron visiblemente (Hagimori et al., 1980; Hagimori et al., 1982a). El estudio de las condiciones necesarias para incrementar la producción de cardenólidos se convirtió, por tanto, en una prioridad. Varios trabajos desde finales de la década del 70 ya daban cuenta de la baja productividad de las células indiferenciadas (Hirotani y Furuya 1977; Garve et al., 1980; Hagimori et al., 1980). Estos resultados, conjuntamente con el hecho de que las partes verdes de la planta sean las de mayor producción de cardenólidos (Stuhlemmer y Kreis 1996), condujeron al estudio del efecto de la luz, la. 18.

(20) 2. Revisión Bibliográfica presencia de cloroplastos y la diferenciación celular en la productividad de D. purpurea (Hagimori et al., 1982b). Estos investigadores encontraron que la organogénesis era el factor primario que determinaba la síntesis de estos metabolitos, mientras que la luz estimula la biosíntesis una vez que los tejidos productores ya están formados. Estudios posteriores en D. lanata corroboraron estas observaciones al demostrar la síntesis de novo de cardenólidos en brotes cultivados en la oscuridad, la cual se incrementaba considerablemente al trasponer los brotes a la luz (Eisenbeiß et al., 1999). Como consecuencia de todo esto, la producción de biomasa de D. purpurea a partir de sistemas de inmersión temporal ha surgido como la estrategia más viable que combine las bondades del cultivo in vitro y los requerimientos de diferenciación celular necesarios para obtener niveles razonablemente altos de cardenólidos (Pérez-Alonso et al., 2009). También ha sido estudiada la influencia de los nutrientes del medio de cultivo sobre la productividad de suspensiones celulares de D. purpurea llevando a optimizar los niveles de sales y vitaminas (Hagimori et al., 1982a), calcio, magnesio y varios microelementos (Hagimori et al., 1983). Otros factores relacionados con la producción de cardenólidos en Digitalis son el genotipo (Gavidia et al., 1996; Nebauer et al., 1999), la concentración de CO2, el estrés hídrico (Stuhlfauth et al., 1987) y la estación del año (Roca-Pérez et al., 2004). Además, se ha encontrado una correlación positiva con la biomasa (Kosinski 1996) y la respuesta defensiva ante herbívoros (Malcolm y Zalucki 1996).. 2.7 Transformación genética. Agrobacterium La transformación genética es la metodología mediante la cual se inserta ADN foráneo de manera estable dentro de un genoma hospedero, y resulta una técnica de mejoramiento con amplias potencialidades de uso en ingeniería metabólica. Esto radica en el hecho de que seleccionando adecuadamente genes reguladores de alguna ruta en particular se puede lograr aumentar la producción de metabolitos de interés a partir de la sobreexpresión o silenciamiento de aquellos (Gelvin. 19.

(21) 2. Revisión Bibliográfica 2003b). En el caso de los cardenólidos, su estatus de producto final de una ruta los hace un blanco atractivo para la transformación. Existen varias metodologías de transformación de plantas. Las más utilizadas han sido la biobalística y sobre todo la mediada por bacterias del género Agrobacterium. Estas últimas son componentes ubicuos de la microbiota del suelo, siendo la mayoría bacterias saprofíticas cuyo hábitat es la materia orgánica en descomposición (Escobar y Dandekar 2003). Sin embargo, algunas de estas especies causan enfermedades neoplásicas en plantas. Por ejemplo, Agrobacterium rhizogenes, causante de la formación de raíces adventicias; Agrobacterium rubi (enfermedad de la agalla de la caña), A. tumefaciens (enfermedad de la agalla de la corona) y Agrobacterium vitis (agalla de la corona de la uva) (Chilton et al., 1977). Estas enfermedades han sido descritas como una forma de “colonización genética”, debido a que se caracterizan por la transferencia y expresión de un conjunto de genes hacia las células de la planta que causan un crecimiento celular incontrolado y la producción por estas células de sustancias nutritivas para la bacteria. Estas sustancias, conocidas como opinas, son aminoácidos de bajo peso molecular y derivados fosfatados de azúcares (Schell et al., 1979). Aunque ha sido principalmente utilizado en ingeniería de plantas (Gelvin 2003b), Agrobacterium puede transformar virtualmente cualquier tipo celular, desde otros procariontes (Kelly y Kado 2002), pasando por levaduras y hongos (Piers et al., 1996; De Groot et al., 1998), hasta incluso células humanas (Kunik et al., 2001). Las características de las enfermedades causadas por especies de Agrobacterium son resultado de la transferencia de un segmento de ADN (ADN-T) del plasmidio inductor de tumores (Ti) hacia la célula hospedera, su integración en el genoma y la expresión de los genes que contiene. El plasmidio Ti contiene dos componentes necesarios para la transformación: los genes vir y la región ADN-T (Gelvin 2003a). Los genes vir codifican la mayor parte de las proteínas necesarias para el procesamiento, transporte y entrada al núcleo del ADN-T (Tzfira y Citovsky 2000). La región ADN-T contiene dos clases de genes: oncogenes y genes del metabolismo de opinas. Los oncogenes codifican proteínas. 20.

(22) 2. Revisión Bibliográfica para la síntesis de. reguladores del crecimiento como auxinas y citocininas, así como para la. modificación del efecto de estas substancias en la célula (Gaudin et al., 1994; Zhu et al., 2000). Los genes del metabolismo de opinas codifican funciones de síntesis, captación y catabolismo de estos compuestos. Existen más de 20 clases de opinas descritas, de manera que cada cepa de Agrobacterium induce la producción y luego metaboliza un conjunto específico de estas. Estos conjuntos varían entre especies y solo unas pocas opinas son encontradas en varios a la vez (Escobar y Dandekar 2003). La región ADN-T, sin embargo, no contiene ninguna secuencia señal ni codifica ninguna función de transporte o integración. De hecho, solo los bordes de este fragmento, que contienen repeticiones directas de 25 pares de bases, son necesarios como substrato de la integración, lo cual permite la substitución de los genes del ADN-T por genes de interés sin afectar el proceso de transformación (Scheiffele et al., 1995). Precisamente aquí radica la clave del uso tan extendido de Agrobacterium en ingeniería genética.. 2.8 Factores que influyen en la eficiencia de la transformación con A. tumefaciens Existe una serie de factores que influyen en la eficiencia de la transformación de tejidos vegetales por A. tumefaciens. Uno de los más importantes es la virulencia de la cepa bacteriana utilizada (Grant et al., 2003). De manera general existen cepas con virulencia baja, moderada o alta (Maheswaran et al., 1992). Varios autores refieren las ventajas de cepas altamente virulentas en cuanto a la eficiencia de la transformación (Lulsdorf et al., 1991; Nadolska-Orczyk y Orczyk 2000), sin embargo otros trabajos demuestran la ventaja del uso de cepas menos virulentas cuando la planta desarrolla naturalmente una respuesta necrótica a Agrobacterium (Wroblewski et al., 2005). Otro factor estudiado y muy relacionado con la virulencia de la cepa es la adición de acetosiringona al medio de cocultivo. Esta sustancia de naturaleza fenólica induce la expresión de los genes vir (Rogowsky et al., 1987) por lo que en muchos casos aumenta la eficiencia de la transformación por Agrobacterium.. 21.

(23) 2. Revisión Bibliográfica También influyen el rango de hospederos de la cepa de Agrobacterium (Torregrosa et al., 2002), las condiciones de oscuridad durante el cocultivo (Cervera et al., 1998), la densidad óptica del cultivo de A. tumefaciens utilizado (Archilletti et al., 1995), el explante inicial y el genotipo de la planta (Li et al., 1992). En los trabajos previos de transformación de Digitalis minor (Sales et al., 2003) desarrollaron un sistema de transformación en el que utilizaban la cepa EHA105 (Hood et al., 1993) de alta virulencia, con la adición de acetosiringona al medio de cocultivo. Sin embargo, en un trabajo posterior en el que utilizaron dicho sistema para la introducción de un gen metabólicamente relevante estos mismos investigadores utilizaron la cepa ambiental de virulencia moderada C58 (Sales et al., 2007). En este trabajo se compara la eficiencia de transformación con las cepas EHA101 (Hood et al., 1986) y C58C1-pMP90 (Koncz y Schell 1986). Ambas cepas tienen el mismo fondo genético cromosomal correspondiente a la cepa ambiental C58, por lo que la diferencia de virulencia entre ambas está determinada por el plasmidio auxiliar que contiene los genes vir en cada una (Lee y Gelvin 2008).. 2.9 Transformación genética en Digitalis Las plantas del género Digitalis son bien conocidas por la producción de glicósidos cardiotónicos de gran demanda farmacéutica, por lo que muchos trabajos se han enfocado en las diferentes vías de aumentar la productividad de las plantas. A medida que se ha ampliado el conocimiento de las rutas de biosíntesis de cardenólidos, también ha ido aumentando el interés por incluir la transformación genética dentro de las alternativas de mejoramiento en este género. Sin embargo hasta el momento existen solo unos pocos antecedentes de transformación en Digitalis. Los trabajos más sostenidos de transformación en este género han sido realizados en la especie D. minor. En un primer intento, Sales et al. (2002) describieron la regeneración eficiente de la planta a partir de explantes de hojas infectadas con la cepa 82.139 de A. tumefaciens. Durante el proceso de infección, el transgén reportero codificante para la subunidad A de la glucuronidasa (gusA). 22.

(24) 2. Revisión Bibliográfica fue detectado en los tumores inducidos por la bacteria. Sin embargo, ni los brotes y raíces regenerados, ni las plantas obtenidas resultaron transformadas. Posteriormente este mismo grupo de investigadores publicó un sistema de transformación mediado por A. tumefaciens en esta misma planta, pero esta vez utilizando las cepas EHA105 y AGL1 que contenían el transgén reportero gusA y genes marcadores de selección. En esta ocasión, una vez más los explantes de partida utilizados fueron discos de hojas de plantas cultivadas in vitro empleando acetosiringona como estimulante de la virulencia de Agrobacterium en las fase de cocultivo (Sales et al., 2003). Dicho sistema de transformación fue utilizado para obtener plantas de D. minor que sobreexpresaban el dominio catalítico de HMGCoA reductasa de A. thaliana (Sales et al., 2007). Algunas de las líneas obtenidas presentaron un mayor contenido de cardenólidos (hasta un 40%) tanto in vitro como en condiciones de invernadero. Sin embargo, los efectos pleiotrópicos de esta enzima sobre el metabolismo esteroideo ponen en duda su aplicabilidad en la transformación de otras especies del género. En cuanto a D. purpurea, ya en 1990 Saito y colaboradores lograron la transferencia de un vector T al genoma de esta especie a través de la transformación de discos de hojas de la planta con la bacteria A. rhizogenes. Esta bacteria es capaz de inducir la rizogénesis por lo que estos investigadores lograron la generación y el cultivo de raíces transgénicas, sin embargo no lograron la regeneración de plantas completas a partir de estas (Saito et al., 1990). Este es el único antecedente de transformación genética de D. purpurea, por lo que no existe hasta el momento ningún trabajo que describa un protocolo de transformación completo en esta especie.. 2.10 Chequeo de plantas transformadas Mediante la transgénesis de plantas es posible obtener individuos transformados que expresen un fenotipo diferente, con características deseables en cuanto a productividad, resistencia a patógenos, a la desecación, etc. Dentro de las estrategias de obtención de plantas transformadas, la infección con A. tumefaciens que contenga un transgén en su ADN-T ha sido una de las más utilizadas. 23.

(25) 2. Revisión Bibliográfica por la capacidad de estas bacterias de transformar un amplio rango de tipos celulares y especies vegetales. El desarrollo de un protocolo de transformación por Agrobacterium requiere invariablemente un método de selección de las plantas regeneradas (Birch 2003). Es por tanto muy común la utilización de marcadores de selección en los vectores de transformación, que confieran resistencia a herbicidas, antibióticos, u otras condiciones de toxicidad o estrés para la planta (Gelvin 2003b). Otra forma de selección fenotípica es la utilización de genes reporteros, esto es, que bajo determinada condición o ensayo sencillo pueda determinarse su presencia por expresión de alguna característica fenotípica o actividad enzimática (Gelvin 2003b). Dentro de los más utilizados se encuentran los genes gusA, lucFF, gfp y grp. El gen gusA codifica una glucuronidasa que al actuar sobre el sustrato 5-bromo-4chloro-3-indolil-β-D-glucurónido forma un producto azul fácilmente visible (Jefferson et al., 1987). El ensayo puede ser realizado de manera muy sencilla por exposición del tejido vegetal supuestamente transformado a una solución del sustrato en condiciones óptimas de reacción. El gen lucFF codifica la luciferasa, una enzima aislada a partir de la luciérnaga (Photinus pyralis) que oxida a su substrato, la luciferina, liberando energía en forma de luz. Los genes gfp y grp codifican para las proteínas fluorescentes verde y roja, respectivamente. Estas dos proteínas fluorescen espontáneamente, por lo que al igual que la luciferina en presencia de su substrato pueden ser detectadas al observar un corte del tejido vegetal en condiciones de oscuridad (Hakkila et al., 2002). En Digitalis se han descrito protocolos de transformación que utilizan gusA como gen reportero, y varios genes de resistencia a antibióticos como marcadores de selección (Sales et al., 2003; Sales et al., 2007). En los últimos años, sin embargo, la utilización de estos marcadores ha generado interrogantes sobre si estos genes pudieran ser transferidos hacia otras plantas u organismos en general, con las consecuencias ecológicas, bioéticas y sobre la salud humana que este hecho pudiera tener. Es por eso que se han desarrollado métodos de trasformación mediante los cuales se elimina el marcador de selección por acción de enzimas recombinasas o transposasas contenidas en los vectores de transformación, o por. 24.

(26) 2. Revisión Bibliográfica la técnica de co-transformación, de manera que se escindan estos genes marcadores ante la activación por algún estímulo (Scutt et al., 2002). Los métodos de selección fenotípica son muy útiles ya que constituyen un primer y rápido tamizaje de las plantas regeneradas. Sin embargo, es necesario además verificar la inserción de la construcción transgénica en el genoma hospedero. La técnica más utilizada para esto es la amplificación de los transgenes basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, siglas en inglés) sobre ADN de la planta transformada (Gachet et al., 1998). Otras técnicas, que además permiten saber el número de copias insertadas, son la hibridación por Southern Blot y el PCR cuantitativo (Anand et al., 2003). El conocimiento del número de copias de un transgén es importante por cuanto puede influir directamente en los niveles de expresión, además de que está relacionado con el nivel de alteración del resto del genoma (Bejar et al., 2002). Generalmente es deseable la inserción de una sola copia del transgén para minimizar ambos efectos. Tanto el PCR como Southern blot han sido utilizados para comprobar la transformación de D. minor (Sales et al., 2003; Sales et al., 2007). También es importante conocer el lugar exacto donde los transgenes se insertan. Especialmente si se quiere estudiar desde el punto de vista básico qué secuencia fue interrumpida por la inserción o si se quiere validar una línea transgénica con fines comerciales. La técnica de PCR invertido permite determinar el sitio de inserción a partir de la amplificación de las secuencias flanqueantes del inserto y su posterior secuenciación (Hoshi et al., 2004).. 2.11 Selección de genes candidatos para transformación de D. purpurea La selección de genes candidatos para la transformación genética no es una tarea fácil. El análisis de la siempre creciente cantidad de datos biológicos generados en la actualidad ha revelado una relación compleja entre los diferentes loci y los caracteres fenotípicos, de manera que varios loci pueden tener diferentes grados de influencia en cada carácter (Mcmullen et al., 1998). Esta realidad ha impulsado el desarrollo de enfoques que abarcan diferentes fuentes de datos para resolver el problema, como la búsqueda de genes candidatos para la caracterización de loci con influencia. 25.

(27) 2. Revisión Bibliográfica fenotípica cuantitativa (QTL, del inglés quantitative trait loci) (Pflieger et al., 2001). Este tipo de enfoques, sin embargo, requieren de un volumen de datos genómicos y/o fenotípicos con los que no se cuenta por el momento para la especie D. purpurea en relación con su producción de cardenólidos. La selección del candidato óptimo para obtener plantas transformadas altamente productivas debe basarse, por lo tanto, en el conocimiento existente sobre los pocos genes conocidos que influyen en las rutas de biosíntesis y degradación de estos metabolitos. Ya ha sido referido que la mayoría de los autores coinciden en señalar a la actividad Progesterona 5-β-reductasa como el paso clave de la ruta de biosíntesis, por lo que en principio un gen codificante para esta enzima sería el candidato más promisorio a sobreexpresar en D. purpurea para aumentar su productividad. Sin embargo, la existencia de al menos dos isoformas de este gen con funciones presuntamente diferentes genera dudas sobre los efectos que su sobreexpresión podría traer. La función del ortólogo de esta pareja de genes en A. thaliana fue descrita hace años como “influencia en el patrón de venación” debido al fenotipo anormal mostrado por una línea mutante de este gen (locus At4g24220), denominado entonces VEP1 (del inglés Vein patterning 1) (Jun et al., 2002). Posteriormente, Herl et al. (2009) demostraron que VEP1 en efecto codifica una proteína con actividad progesterona 5-β reductasa. Es posible, por lo tanto, que alguno de los dos ortólogos de Digitalis (P5βR y P5βR2) tenga también influencia en la morfogénesis u otro proceso fisiológico, y su sobreexpresión pueda traer consigo alguna alteración fisiológica no deseable. Esta hipótesis es además soportada por el hecho de que estos dos genes tienen patrones de expresión diferentes: P5βR aparece como constitutivo ante diversas condiciones de estrés mientras que P5βR2 presenta una expresión basal mínima y es altamente inducido por etileno y H2O2 (Pérez-Bermúdez et al., 2010). Curiosamente, el patrón de expresión de VEP1 en Arabidopsis se aproxima a la superposición de los patrones de expresión de estos dos genes en D. purpurea en las mismas condiciones (Gavidia y colaboradores, resultados no publicados) lo cual sugiere una subfuncionalización de esta actividad enzimática durante la evolución. Además, la expresión de P5βR2 está directamente correlacionada. 26.

(28) 2. Revisión Bibliográfica con los niveles de cardenólidos, a diferencia de P5βR. En consecuencia, estos autores proponen que P5βR2 es el responsable de la producción de glicósidos mientras que P5βR pudiera tener otras funciones fisiológicas. Dada la escasez de datos genómicos y de expresión en D. purpurea, los estudios comparativos a partir de datos de otras especies modelo como A. thaliana para el análisis de los promotores de estos dos genes (secuenciados por Gavidia y colaboradores, resultados no publicados) aparecen como una alternativa viable para estudiar las diferencias funcionales entre estos. Lo anterior proveería de información adicional para decidir si alguno de ellos sería un buen candidato para transformar D. purpurea.. 2.12 Análisis comparativo de regulación de genes Los avances tecnológicos aplicados a las ciencias biológicas han permitido la acumulación creciente de grandes volúmenes de datos de todo tipo: secuencia,. expresión, estructura. tridimensional, etc. Como consecuencia, la Bioinformática surge como la disciplina que se ocupa del procesamiento de esta información y la extracción de conclusiones biológicas. Casi inmediatamente se desarrollaron los enfoques comparativos cuyo principal objetivo es aplicar los datos existentes en especies modelo a la predicción de características de otras menos estudiadas (Davey et al., 2009). La genómica y la transcriptómica comparativas son dos de las metodologías más empleadas en la predicción de funciones de genes por su utilidad para el estudio de la regulación de los mismos (Schulze y Downward 2001). A través de la comparación de promotores de varios genes pueden descubrirse motivos de regulación, que no son más que pequeñas secuencias de ADN a las que se unen los factores de transcripción que controlan la expresión génica. Debido a su importancia, estos motivos están altamente conservados entre distintas especies, por lo que pueden ser determinados por comparación de las secuencias de los promotores de genes ortólogos, o de genes diferentes dentro de la misma especie que estén regulados por los mismos factores de transcripción (Conlon et al., 2003). Existen. 27.

(29) 2. Revisión Bibliográfica bases de datos públicas y privadas de motivos reguladores en diferentes especies vegetales, principalmente A. thaliana (Steffens et al., 2004) y Oryza sativa (Morris et al., 2008). Estas bases de datos permiten determinar a qué factor de transcripción corresponde cada motivo, lo cual permite asignarle una implicación funcional a este último. Otro enfoque para estudiar la regulación génica es determinando cuáles genes se coexpresan ante diferentes condiciones experimentales, utilizando datos de microarreglos. Los microarreglos constituyen una tecnología que permite la medición de los niveles de ARNm de decenas de miles de genes (que pueden ser todos los de la especie) a la vez (Schulze y Downward 2001). Esto permite establecer patrones de expresión a través de diferentes condiciones experimentales para cada gen, que pueden ser comparados y agrupados (Ihmels et al., 2004). Existen varias bases de datos públicas de experimentos de microarreglos, así como diferentes herramientas disponibles para su procesamiento (Edgar et al., 2002; Parkinson et al., 2007). Sin embargo, cada uno de estos tipos de datos tiene sus propias fuentes de error, lo cual se acentúa en el caso de enfoques comparativos debido a la diferencia entre especies. Varios autores sugieren por tanto la combinación del análisis de motivos reguladores con los análisis de expresión de genes. Al ser tecnologías y aproximaciones biológicamente diferentes con distintas fuentes de error, las conclusiones a que se arribe a partir del análisis combinado son más fiables que las de los enfoques individuales (Holtorf et al., 2002; Lemmens et al., 2009). Teniendo en cuenta todo lo anterior, una manera de abordar el problema de la regulación diferencial de P5βR y P5βR2 puede ser el estudio de datos de microarreglos de A. thaliana para determinar los genes coexpresados con VEP1 y comparar los promotores de estos genes con los de P5βR y P5βR2 con el fin de buscar motivos reguladores en cada uno de estos. La determinación de los factores de transcripción asociados a estos motivos permitiría predecir características funcionales de cada gen que complementen los estudios experimentales realizados por otros autores.. 28.

(30) 3. Materiales y métodos 3. MATERIALES Y MÉTODOS La presente investigación se llevó a cabo en los laboratorios de Ingeniería metabólica, Biología Molecular y Bioinformática del Instituto de Biotecnología de las Plantas (IBP) en el período comprendido desde enero de 2008 hasta enero de 2009. Procedimientos generales del cultivo in vitro Los instrumentos utilizados para la manipulación aséptica del material vegetal fueron esterilizados en estufa a una temperatura de 180°C durante dos horas antes de cada sesión de trabajo. Dichos instrumentos se mantuvieron en condiciones de asepsia mediante la inmersión en soluciones de NaOCl al 1% (m/v) siguiendo la metodología propuesta por (Agramonte et al., 1993). Todas las operaciones de disección y transferencias de los explantes se realizaron en cabinas de flujo laminar horizontal. Los medios de cultivo se esterilizaron en autoclave vertical a 121°C y 1,2 Kg/cm2 de presión durante 20 min. Medios de cultivo Se empleó como medio de cultivo basal la siguiente formulación: sales minerales del medio de cultivo propuesto por Murashige y Skoog (1962) (MS) con 4,0 mg/L de hidrocloruro de tiamina, 100 mg/L de mioinositol, 30 g/L de sacarosa y 3,0 g/L de Gelrite® (Merck y Co., Inc.) como agente gelificante. El pH fue ajustado a 5,7 antes de la esterilización, con KOH 0,5 N o HCl 0,5 N antes de la esterilización. Material vegetal En este trabajo se utilizó como material inicial semillas de Digitalis purpurea L. var Rotter Berggold (Farmasaat GmbH, Alemania). Las plantas fueron germinadas y cultivadas in vitro en medio de cultivo semisólido siguiendo la metodología descrita por (Pérez-Alonso et al., 2009). Inducción de callos y regeneración de plantas La formación de callos fue inducida a partir de segmentos de hojas de 1,0 cm2 de área, obtenidos a partir de las plantas cultivadas in vitro después del cuarto subcultivo, y colocados en el medio de cultivo semisólido sobre la superficie adaxial. Los callos obtenidos fueron cultivados en. 29.

(31) 3. Materiales y métodos medio de cultivo basal con 4,5 µM de ácido 2,4 diclorofenoxiacético (2,4 D) (Occeguera 2006). Los cultivos fueron mantenidos en condiciones de oscuridad a una temperatura de 28 ± 2 °C durante 30 días. Los callos obtenidos fueron divididos y subcultivados dos veces en el mismo medio de cultivo de inducción (en lo adelante medio de cultivo de proliferación de callos, MPC). Cuatro fragmentos de callos de aproximadamente 0,7 g de masa fresca cada uno fueron transferidos a medio de cultivo basal con 0,5 µM de ácido indolacético (AIA) y 4,4 µM de 6bencilaminopurina (6-BAP) para la regeneración de plantas. Los cultivos fueron incubados en cámara de crecimiento con luz solar y temperatura controlada de 27 ±2 °C (Occeguera 2006). Después de 30 días los de brotes fueron transferidos a frascos con 70 mL de medio de cultivo semisólido de multiplicación de brotes (Pérez-Alonso et al., 2009).. 3.1 Transformación genética de D. purpurea mediada por A. tumefaciens y análisis molecular de líneas regeneradas. 3.1.1 Transformación genética de de D. purpurea mediada por A. tumefaciens Cepas bacterianas y plasmidios empleados Se utilizaron dos cepas de A. tumefaciens para probar su capacidad de transformación: EHA 101 y C58C1RfR, esta última con el plasmidio auxiliar pMP90 (Koncz y Schell 1986). En ambas cepas se introdujo el plasmidio pTJK136 como vector de transformación (Figura 4). El ADN-T de pTJK136 contiene el gen de la neomicina fosfotransferasa II (nptII) (EC 2.7.1.95) bajo el control del promotor de la nopalina sintetasa (nos) y el terminador y las señales de poliadenilación de la octopina sintetasa. Este gen confiere resistencia a los antibióticos kanamicina, neomicina y geneticina al inactivarlos por fosforilación (Flavell 1992). Además, la construcción contiene el gen de la β-glucuronidasa de Escherichia coli (uidA) (Jefferson et al., 1987) con el intrón st-ls1 de la papa (Solanum tuberosum), lo cual permite que este gen se exprese sólo en células vegetales. uidA se encuentra bajo el control del. 30.

(32) 3. Materiales y métodos. Figura 4 Vector de transformación pTJK136. nptII: gen de la neomicina fosfatidil-transferasa (marcador de selección); Pnos: promotor de la nopalina sintetasa; 3’OCS: terminador y señales de poliadenilación del gen de la octopina sintetasa. Gus: gen reportero uidA que codifica la β-glucuronidasa de E. coli; P35S: promotor del virus del mosaico de la coliflor; 3’nos: terminador y señales de poliadenilación de la nopalina sintetasa; gusint: intrón st-ls1(Solanum tuberosum). LB y RB: bordes izquierdo y derecho, respectivamente, del ADN-T.. promotor del virus del mosaico de la coliflor (CaMV-35S) y el terminador y las señales de poliadenilación del gen nos. Transformación de A. tumefaciens Las cepas de A. tumefaciens EHA 101 y C58C1-pMP90 fueron transformadas con el vector de transformación pTJK136. La transformación se realizó a partir de células competentes preparadas según la metodología de (Hofgen y Willmitzer 1988). A 500 μl de cultivo de células competentes se añadieron 100 μl de agua y 10 μl del plasmidio (1 μg). Luego de homogenizar con cuidado se sometió la mezcla a la siguiente secuencia de choques térmicos: 5 min en hielo, 5 min en N2 (l) y 5 min a 37 °C. Este procedimiento se realizó por duplicado. El cultivo se dejó enfriar por 10 min en hielo, se le añadió 1 mL de medio de cultivo LuriaBertani (LB, 10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de NaCl) y se incubó a 28 °C por. 31.

(33) 3. Materiales y métodos 4 h. Posteriormente, de 100 a 600 μl del cultivo se inocularon en placas con medio de cultivo semisólido LB con los antibióticos adecuados. Se incubaron a 28 °C toda la noche y se seleccionaron colonias aisladas al azar para chequear la transformación mediante el aislamiento de ADN plasmídico y la digestión con enzimas de restricción. Infección y Cocultivo Antes de la transformación, se aisló una colonia de cada cepa de A. tumefaciens crecida en medio de cultivo semisólido LB con 100 mg/L de espectinomicina y 300 g/L de estreptomicina y se inoculó cada una en 3 mL de medio de cultivo LB líquido con los mismos antibióticos (precultivo). Los precultivos se incubaron por 24 a 48 h a 28 °C y luego se inocularon por separado en 50 mL de medio de cultivo líquido YEP (10 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de bactopeptona, 5 g/L de NaCl, pH 7,0) con el mismo suplemento de antibióticos y se mantuvieron toda la noche en zaranda orbital (Retomed) a 150 rpm. Después de 20 a 24 h, las células fueron colectadas por centrifugación a 3000 g a 4 °C por 10 min y el precipitado fue resuspendido en medio de cultivo de infección (sales MS al 100%, 2% (m/v) de sacarosa, 1,98g/L de D(+)-glucosa, 3,9 g/L de ácido 2-[N-morfolino]etano sulfónico (MES), 200 µM de acetosiringona, pH 5,5) de tal modo que la densidad óptica (DO) final a 600 nm fue de 0,7. Los segmentos de hojas fueron sumergidos en la suspensión de Agrobacterium por 15 min y posteriormente se secaron por contacto con papel de filtro (Waltman®). A continuación fueron transferidos a placas de Petri con medio de cocultivo (MPC con 200 µM de acetosiringona). Todas las placas fueron selladas con Parafilm y colocadas en la oscuridad por 5 días a 21 °C. Selección y regeneración de plantas Los explantes co-cultivados fueron lavados en MPC líquido con 500 mg/L de cefotaxima y 200 mg/L de timentina y luego secados por contacto con papel de filtro. Posteriormente fueron transferidos a MPC semisólido con 50 mg/L de geneticina G148 como agente selectivo y 200 mg/L de timentina para eliminar las células de Agrobacterium remanentes en la superficie (Occeguera 2006). El cultivo se mantuvo por dos meses con subcultivos cada 14 días. Los callos formados fueron transferidos individualmente al medio de cultivo de regeneración descrito en Inducción de callos y regeneración de. 32.