C A P Í T U L O 2 . 3 . 2 .
E N F E R M E D A D D E L A S M A N C H A S B L A N C A S
1. D
EFINICIÓN DE LA ENFERMEDADA efectos de este capítulo, la enfermedad de las manchas blancas (EMB) es una infección por el virus del síndrome de las manchas blancas (WSSV).
2. I
NFORMACIÓN PARA EL DISEÑO DE PROGRAMAS DE VIGILANCIAa) Factores del agente
• Agente etiológico: el virus White spot syndrome virus 1, tal como lo definen Vlak et al. 2004 (66). • Estabilidad del agente: se inactiva en <120 minutos a 50°C y <1 minuto a 60°C (49); es viable
durante al menos 30 días a 30°C en agua marina bajo condiciones de laboratorio (46); y es viable en estanques durante al menos 3–4 días (5, 29, 43, 49).
• Ciclo de replicación: los estudios in-vitro con cultivos de células primarias y estudios in-vivo con
postlarvas muestran que el ciclo de replicación es de aproximadamente 20 horas a 25°C.
b) Factores del hospedador
• Especies hospedadoras susceptibles: todos los crustáceos decápodos (orden Decapoda)
procedentes de fuentes marinas, o de agua dulce o salobre (3, 13, 17, 23, 26, 27, 35, 40–42, 57, 58, 69).
• Fases susceptibles del hospedador: todas las etapas de la vida, desde los huevos a los
reproductores (37, 38, 63).
• Especies o subpoblaciones más susceptibles: la probabilidad de detección del virus es mayor
en cangrejos y langostinos. Las etapas de mayor susceptibildad son las últimas fases postlarvarias, las formas juveniles y los adultos. La probabilidad de detección puede aumentarse por exposición a condiciones estresantes (ej. ablación de los pedúnculos, desove y variación de la salinidad y la temperatura).
• Órganos y tejidos infectados: tejidos ectodérmicos y mesodérmicos, especialmente el epitelio
cuticular y los tejidos conjuntivos subcuticulares (38, 47, 68, 72).
• Infección persistente y portadores asintomáticos: son comunes las infecciones persistentes y se
han hallado infecciones de por vida (61). En infecciones persistentes las cargas víricas pueden ser extremadamente bajas y potencialmente indetectables por las pruebas de diagnóstico disponibles.
• Vectores: rotíferos (73), bivalvos, gusanos marinos (65) y crustáceos no decápodos, incluyendo Artemia salina y los copépodos; también los artrópodos acuáticos no crustáceos, como la ligia
oceánica (Isopoda) y las larvas de insectos Euphydradae. Todas estas especies pueden acumular concentraciones elevadas de WSSV viable, aunque no existen pruebas que el virus se replique (7, 34, 40, 73).
c) Patrón de la enfermedad
• Mecanismo de transmisión: vertical (trans-ovum), horizontal por consumo de tejido infectado
(ej. canibalismo, predación, etc.), y por agua contaminada. La infección puede ser transmitida por animales aparentemente sanos. Los animales muertos y moribundos pueden constituir una fuente de transmisión de la enfermedad (11, 37, 38).
• Prevalencia: muy variable, desde <1% en poblaciones silvestres infectadas hasta el 100% en
poblaciones cautivas (23, 40, 41, 54, 62).
• Distribución geográfica: a lo largo del este, sureste y sur de Asia, en Norteamérica, Sudamérica
y América Central. En estas regiones se sabe de zonas y compartimentos que están libres de EMB (1–3, 8, 17–19, 37, 44, 50, 67, 75).
• Mortalidad y morbilidad: todas las especies cultivadas de langostinos peneidos son muy
susceptibles a la infección, frecuentemente con elevada mortalidad. Los cangrejos marinos, cangrejos de río, langostinos de agua dulce, langosta (Palinurus elephas), bogavantes son susceptibles a la infección, pero la morbilidad y mortalidad esa causa son muy variables (2, 9, 22, 24, 27, 47, 50, 56, 59, 74). En algunos decápodos pueden ocurrir altos niveles de infección en ausencia de enfermedad clínica. Los brotes de la enfermedad pueden ser provocados por factores estresantes, como los cambios rápidos en la salinidad. La temperatura del agua tiene un efecto considerable en la aparición de la enfermedad, y temperaturas promedio inferiores a ~30°C causan brotes de EMB (20, 21, 28, 64).
• Impacto económico y/o productivo de la enfermedad: se ha informado de pérdidas en la
producción y el comercio por un valor de casi 10.000 millones de dólares desde 1993.
d) Control y prevención
• Vacunación: no se han desarrollado métodos de vacunación efectiva • Quimioterapia: no existen informes científicamente confirmados.
• Inmunoestimulación: según varios informes, el betaglucano, la vitamina C, extractos de algas
marinas (fucoidán) y otros inmunoestimulantes pueden mejorar la resistencia a la EMB (4, 10, 15, 32, 51, 71).
• Producción de resistentes: no se ha informado de avances significativos. • Repoblación con especies resistentes: no aplicable en el caso de la EMB. • Agentes bloqueadores: sin información.
• Prácticas generales de producción: se ha utilizado con éxito una variedad de prácticas de
producción para enfrentarse a la EMB, ej. evitando la repoblación durante la estación fría, uso de material reproductivo libre del patógenos específicos o negativo a la prueba de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y utilización de agua y de sistemas de cultivo que reúnan condiciones de bioseguridad (14, 25, 48, 54, 70).
3. M
ÉTODOS DE DIAIGNÓSTICOa) Métodos de diagnóstico de campo
• Síntomas generales: presencia de manchas blancas bajo la cutícula y marcado cambio de color con predominio de langostinos decolorados, disminución del consumo alimenticio, aumento de la letargia, desplazamientos de los langostinos moribundos hacia la superficie y los bordes del agua de los tanques o estanques, con la consiguiente aparición de aves depredadoras.
b) Métodos clínicos
• Lesiones macroscópicas: véase la sección 3.a más arriba. • Examen microscópico
• Preparaciones montadas: demostración de núcleos hipertróficos en preparaciones de
aplastamientos de branquias y/o epitelio cuticular, con y sin tinción.
• Demostración, mediante microscopia de campo oscuro, de agregados de WSSV en
Nota importante: esta es la más simple de las técnicas microscópicas. Se recomienda su
uso a personas con escaso conocimiento del WSSV. Los agregados aparecen como pequeñas manchas brillantes de 0,5 µm de diámetro (45).
• Cortes fijados: demostración histológica de cuerpos de inclusión patognomónicos en los
tejidos diana.
• Hibridación in situ: uso de sondas de ADN específicas para WSSV con cortes de tejidos
para demostrar la presencia de ácidos nucleicos del WSSV en célula infectadas.
• Inmunohistoquímica: uso de anticuerpos específicos para WSSV con cortes de tejidos o
preparaciones montadas para demostrar la presencia de antígeno de WSSV en las células infectadas.
• Microscopía electrónica: demostración del virus en cortes de tejidos o en preparaciones de
virus semi-purificados (de, por ejemplo, hemolinfa).
c) Métodos de detección e identificación del agente • Métodos de detección directa
i) Métodos microscópicos
• Preparaciones montadas: véase la sección 3.b más arriba. • Cortes fijados: véase la sección 3.b más arriba.
ii) Aislamiento e identificación del agente • Técnicas moleculares:
a) Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
En la descripción del protocolo se sigue a Lo et al. (38, 39), y se recomienda dicho protocolo para todas las situaciones en las que se requiera un diagnóstico de WSSV. Un resultado positivo en el primer paso del presente protocolo estándar implica la existencia de una infección grave; Cuando el resultado positivo se obtiene sólo en el segundo paso de la amplificación, es indicativo de una infección latente o como portador. También se han descrito algunas pruebas, (30, 31, 33, 36, 52, 55, 60), pero no se recomienda su uso, salvo que previamente se contraten con el protocolo aquí descrito.
Extracción de ADN
i) Se recogen 100-200 mg de tejido de gamba (pleópodo de juveniles vivos o gamba subadulta, postlarvas, 11 o más [PL11 o más], sin cabezas, o PL10 enteras, o se usan 100 µl de hemolinfa) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con 600 µl de solución de lisis (100 mM de NaCl, 10 mM de Tris/HCl, pH 8, 25 mM de EDTA [ácido etilendiaminotetracético], 0,5% SLS [N-lauril sarcosinato de sodio] o 2% de SDS [docecil sulfato sódico], y 0,5 mg/ml de proteinasa K agregado inmediatamente antes del uso).
ii) Se homogeneiza bien el tejido en el tubo, con una varilla descartable. iii) Después de la homogeneización, se incuba a 65°C durante 1 hora.
iv) Se añade 5 M de NaCl hasta una concentración final de 0,7 M. Luego se añadir lentamente 1/10 del volumen de bromuro de N-cetil -N,N,N-trimetilamonio (solución CTAB)/NaCl (10% de CTAB en 0,7 M de NaCl) y se mezcla bien.
NOTA: El método de extracción CTAB aquí descrito es el único que ha
resultado fiable. No se recomiendan los kits de extracción del mercado.
v) Se incuba a 65°C durante 10 minutos, y luego a temperatura ambiente, se añade un volumen igual de cloroformo/isoamil alcohol (24/1) y se mezcla cuidadosamente. Se centrifuga a 13.000 g durante 5 minutos y luego se
transferir la solución acuosa (la capa superior) a un tubo fresco de 1,5 ml y se añadir un volumen igual de fenol.
vi) Se mezcla suavemente y se centrifuga a 13.000 g durante 5 minutos. Se recoge la solución de la capa superior y se repite el proceso de extracción del fenol una o dos veces más.
vii) Se transfiere la capa superior final a un nuevo tubo, se mezcla suavemente con dos volúmenes de cloroformo/isoamil alcohol (24/1) y se centrifuga a 13.000 g
durante 5 minutos.
viii) Se transfiere la capa superior a un nuevo tubo y se precipita el ADN añadiendo dos volúmenes de etanol absoluto o al 95% y se deja a –20°C durante 30 minutos o –80° C durante 15 minutos.
ix) Se centrifuga a 13.000 g durante 30 minutos y se desecha el etanol. Se lava el precipitado de ADN con etanol al 70%, se seca y se resuspende en 100 µl de agua doblemente destilada y esterilizada a 65°C durante 15 minutos.
x) Se usa 1 µl de esa solución de ADN para una reacción por PCR.
NOTA: Los siguientes procedimientos de PCR anidada están bien establecidos y
proporcionan resultados de diagnóstico fiable bajo las condiciones especificadas. Sin embargo, debe asegurarse que las muestras de ADN se toman de los órganos recomendados, y de que la temperatura durante la PCR (particularmente para la hibridación, la temperatura recomendada es de 55°C) sea la correcta. A fin de prevenir posibles resultados positivos falsos, es importante seguir al pie de la letra los procedimientos especificados, sobre todo, cuando estos se utilizan para ensayar nuevos candidatos a hospedador, como Cherax quadricarinatus (12). Para el diagnóstico de infección por WSSV en un hospedador nuevo o en una zona que anteriormente ha estado libre de infección, se debe utilizar la secuenciación de ADN para confirmar los resultados positivos.
Primer paso de la reacción por PCR
i) Se coloca 1 µl de solución de ADN molde (que contenga entre 0,1–0,3 µg de ADN) en un tubo para PCR con 100 µl de la mezcla de reacción (10 mM de Tris/HCl, pH 8,8, 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl2, 0,1% de Tritón X-100, 200 µM de cada dNTP, 100 pmol de cada cebador, 2 unidades ADN polimerasa termoestable).
ii) Las secuencias de cebadores externos son 146F1, 5’-ACT-ACT-AAC-TTC-AGC-CTA-TCTAG-3’ y 146R1, 5’-TAA-TGC-GGG-TGT-AAT-GTT-CTT-ACG-A-3’.
iii) El perfil de la PCR es de un ciclo de 94°C durante 4 minutos, 55°C durante 1 minuto, y 72°C durante 2 minutos, seguido de 39 ciclos de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto, y 72°C durante 2 minutos y una extensión final de 5 minutos a 72°C. El amplicón específico para WSSV, de esta reacción es de 1.447 pares de bases. La sensibilidad es de aproximadamente 20.000 copias del plásmido utilizado como molde.
Segundo paso de la reacción de la PCR (anidada): este segundo paso es
necesario para la detección del WSSV en gambas portadoras.
i) Se añade 10 µl del producto de la primera fase de la reacción de la PCR a 90 µl de la mezcla para PCR con la misma composición que se indicó más arriba, excepto que ahora contiene el segundo par de cebadores (internos): 146F2 (5’-GTA-ACT-GCC-CCT-TCC-ATC-TCC-A-3’) y 146R2 (5’-TAC-GGC-AGC-TGC-TGC-ACC-TTG-T-3’).
ii) Se usa el mismo protocolo de amplificación indicado anteriormente. El amplicón específico para WSSV de esta reacción es de 941 pares de bases. La sensibilidad global de los dos pasos es de aproximadamente 20 copias del plásmido de WSSV usado como molde.
iii) Para visualización, se someten a electroforesis 10 µl de los productos de reacción de la PCR en gel de agarosa al 1% que contenga bromuro de etidio a una concentración de 0,5 µg/ml.
iv) Se deben usar cebadores específicos para decápodos (143F 5’-TGC-CTT-ATC-AGCTNT-CGA-TTG-TAG-3’ y 145R 5’-TTC-AGN-TTT-GCA-ACC-ATA-CTT-CCC-3’ producen un amplicón de 848 pb; N representa a G, A, T, o C) en reacciones control para verificar la calidad del ADN extraído y la integridad de la reacción de la PCR. En la gamba peneida Penaeus aztecus, el producto de la PCR generado por este par de cebadores específicos para decápodos corresponde a la secuencia de nucleótidos 352–1200 de los rARN 18S (39). La secuencia de ARN 18S de los decápodos se conserva muy bien y origina un producto de PCR de tamaño similar en casi todos los decápodos. Se deberían incluir en cada prueba un control positivo (ADN molde de WSSV) y controles negativos (un no molde y un ADN molde de gamba).
b) Secuenciación de ADN de los productos de la PCR
Para confirmar sospechas de infección por WSSV en nuevos hospedadores, se debe secuenciar el fragmento de ADN amplificado por PCR de diagnóstico anidada en dos pasos. En lo relativo a los protocolos de clonación y secuenciación aquí descritos, seguimos las directrices de Claydon et al. (12).
Nota: A fin de ahorrar tiempo y dinero, es aceptable la secuenciación directa del
amplicón de la PCR. Si se obtiene un resultado positivo, se procede al paso (iv), indicado más abajo. Si se produce un resultado negativo, se debe procesar la muestra de nuevo según los procedimientos de clonación y secuenciación descritos a continuación.
i) Se separan los fragmentos de ADN seleccionados para el análisis adicional de los geles de agarosa y se purifican utilizando el sistema Wizard SV Gel y PCR
clean-up según las instrucciones del fabricante.
ii) Se ligan los amplicones al plásmido vector pGEM®-T (Promega) y se clona el constructo siguiendo las instrucciones del fabricante.
iii) La secuenciación de ADN se puede realizar utilizando cebadores universales M13 (Promega) y un kit de inicio rápido de secuenciación en ciclos Beckman Coulter CEQ dye terminator.
iv) Se comparan las secuencias obtenidas con las bases de datos disponibles utilizando la Herramienta de Búsqueda de Alineamiento Local Básico (Basic
Local Alignment Search Tool [BLAST]) para determinar la afiliación filogenética
aproximada.
c) Método de hibridación in situ (ISH)
El protocolo aquí descrito se basa en el diseñado por Nunan & Lightner (52), aunque Chang et al. (6) han descrito un protocolo alternativo.
i) Se fijan gambas moribundas con fijador AFA de Davidson’s durante 24– 48 horas.
ii) Se incluyen los tejidos en parafina y se realizan cortes de 5 µm de espesor. Se colocan los cortes en portas Superfrost Plus cargados positivamente.
iv) Se desparafinan, se rehidratan y se tratan durante 2–30 minutos (según el tipo de tejido) con 100 µg/ml de proteinasa K en tampón Tris/NaCl/EDTA (TNE) a 37°C.
v) Se post-fijan los cortes enfriándolos en 0,4% formaldehído previamente enfriado durante 5 minutos a 4°C y se lavan en 2 × citrato salino estándar (SSC; 1 × SSC = 150 mM de NaCl, 15 mM de citrato trisódico, pH 7,0) a temperatura ambiente.
vi) Se prehibridan los portas con solución de prehibridación (50% de formamida, 0,2% de Ficoll 400, 0,2% de polivinilpirrolidona, 0.2% de seroalbúmina bovina, 5 × SSC, 1 mM de EDTA, 50 mM de Tris/HCl, pH 8) durante 30 minutos a 42°C.
vii) Se continúa la hibridación con el amplicón PCR específico de WSSV de 1447 pares de bases (véase “Primer paso de la reacción por la PCR” más arriba) que se ha marcado con digoxigenina (DIG; Roche). Se recomienda marcar la sonda mediante la incorporación de DIG-dNTP en el ciclo de duplicación por PCR. Se debe determinar la concentración óptima probando y ajustando hasta obtener una señal específica alta sobre un fondo bajo.
viii) Para la hibridación, se hierve la sonda durante 10 minutos y se coloca inmediatamente en hielo. Se diluye la sonda a 30–50 ng/ml en solución de prehibridación y se aplican 500 µl a cada porta.
ix) Se coloca el porta sobre una placa caliente a 85–95°C durante 6–10 minutos (asegurándose de que no llegue a hervir), enfriando los portas sobre hielo durante 5 minutos y luego se transfieren a una cámara húmeda durante 16– 20 horas a 42°C.
x) Después de la hibridación, se lavan los portas dos veces durante 15 minutos, cada vez con 2 × SSC a temperatura ambiente, dos veces durante 5 minutos con 1 × SSC a 37°C, y dos veces durante 5 minutos con 0,5 × SSC a 37°C. xi) Para la detección de la hibridación, se lavan los portaobjetos con tampón que
contenga ácido maleico (100 mM de ácido maleico, 150 mM de NaCl, pH 7,5) durante 5 minutos a temperatura ambiente.
xii) Se bloquean los portas con solución bloqueadora (2% de suero normal de cabra y 0,3% de Tritón X-100 en tampón con ácido maleico) durante 30 minutos a 37°C.
xiii) Se añade 250 µl de solución con anticuerpos anti-DIG conjugados con fosfatasa alcalina (FA) (1 µl/ml del fragmento anti-DIG/AP-Fab en tampón con ácido maleico que contenga 1% de suero normal de cabra y 0,3% de Tritón X-100) a cada portaobjetos, y se incuba a 37°C durante 30 minutos.
xiv) Se lavan los portaobjetos dos veces con tampón con ácido maleico durante 10 minutos por lavado, y se vuelven a lavar una vez más con tampón para detección (100 mM de Tris/HCl, 100 mM de NaCl, pH 9,5) a temperatura ambiente.
xv) Se añade a cada porta 500 µl de solución de desarrollo de color (que se prepara inmediatamente antes de usar añadiendo a 9 ml de tampón de detección 45 µl de solución salina NBT [75 mg/ml en dimetilformamida al 70%], 35 µl de 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato, solución de sal [X-fosfato] de toluidina [50 mg/ml en dimetilformamida] y 1 ml de PVA 10%) y se incuba en cámara húmeda durante 1–3 horas.
xvi) Se detiene la reacción lavando los portaobjetos en tampón TE (10 mM de Tri-HCl, 1 mM de EDTA, pH 8,0) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se lavan los portas sumergiéndolos diez veces en agua destilada, se tiñen para contraste en 0,5% de marrón Bismarck Y durante 30–90 segundos y luego se
aclaran con agua. Se montan los portas con un medio de montaje acuoso para observación inmediata o se deshidratan los portas y se montan con medio de montaje Permount para su conservación durante un largo período.
xvii) Se cubren los portaobjetos con cubreobjetos y se examinan con microscopio de campo claro. La hibridación positiva aparece como un precipitado de color entre azul oscuro y negro sobre el fondo entre amarillo y marrón de la tinción de contraste.
d) Método de Bioensayo:
Si se dispone de langostinos SPF, el siguiente método de bioensayo basado en Nunan et al. (53) y Durand et al. (16) es adecuado para el diagnóstico de WSSV. i) Para el ensayo, se separan los pleópodos de los langostinos sospechosos de
infección por WSSV y se homogeneizan en tampón TN (0,02 M de Tris/HCl, 0,4 M de NaCl, pH 7,4).
ii) Después de centrifugar a 1.000 g durante 10 minutos, se diluye 1/10 del líquido sobrenadante con 2% de NaCl y se filtra (con filtro de 0,2 µm).
iii) Se inyecta 0,2 ml del inóculo en el aspecto dorso-lateral del cuarto segmento abdominal del langostino indicador (ej. SPF Litopenaeus vannamei en su estadio juvenil), entre las placas tergales y dentro del músculo del tercer segmento abdominal.
iv) Se examina el langostino moribundo para ver si hay síntomas claros o utilizando los métodos descritos anteriormente.
Si a los
3–5 días después de la inoculación aún no hay langostinos moribundos y todas las pruebas son negativas, entonces se puede concluir con seguridad que el bioensayo es negativo.4. V
ALORACIÓN DE LAS PRUEBAS SEGÚN SU FINALIDADEn el cuadro 1 se ofrece una lista con los métodos de vigilancia, detección y diagnóstico de la EMB disponibles en la actualidad. Las denominaciones utilizadas en el cuadro indican: A = es el método recomendado por razones de disponibilidad, utilidad, así como por su especificidad y sensibilidad diagnóstica; B = es un método estándar con buena especificidad y sensibilidad diagnóstica; C = es un método aplicable en algunas situaciones, pero su costo, precisión y otros factores limitan seriamente su aplicación; D = es un método no recomendable en la actualidad. Estas denominaciones son un tanto subjetivas puesto que implicad cuestiones de fiabilidad, sensibilidad, especificidad y utilidad.
Cuadro 1. Métodos de vigilancia, detección y diagnóstico de la WSV
Vigilancia Método
Larvas PLs Juveniles Adultos Presuntivo Confirmativo
Síntomas generales D D C C C D Bioensayo D D D D C B MCC directa D D C C C C Histopatología D C C C A A MET D D D D D A Pruebas basadas en anticuerpos D D C C A B
Sondas de ADN in situ D D C C A A
PCR D B A A A A
Secuencia D D D D D A
PLs = postlarvas; MCC = microscopía de campo claro; MET = microscopía electrónica de transmisión; PCR = reacción en cadena de la polimerasa.
5. C
RITERIOS DE DIAGNÓSTICO CONFIRMATIVOa) Definición de un caso sospechoso
Para langostinos juveniles y adultas: síntomas generales (véase la sección 3.a más arriba). Para langostinos en cualquier fase de vida (desde larvas hasta adultos): mortalidad. Para langostinos y cangrejos de mar en cualquier fase de de vida (desde larvas hasta adultos): núcleos hipertróficos en las preparaciones con aplastamientos de agalla y/o epitelio cuticular; agregados inusuales en hemolinfa observables por microscopía de campo oscuro; cuerpos de inclusión en los cortes de los tejidos diana.
b) Definición de un caso confirmado
Los casos sospechosos se deben comprobar en primer lugar mediante PCR. Si en un país/zona/compartimento que previamente ha estado libre de WSSV los resultados de la PCR son positivos, éstos deberán confirmarse mediante secuenciación.
6. M
ÉTODOS DE DIAGNÓSTICO/
DETECCIÓN PARA DECLARAR LA AUSENCIA DE INFECCIÓNLa doble PCR y la secuenciación son los métodos prescritos para la declaración de la ausencia de infección. Se requieren resultados negativos de la doble PCR. Cuando no se puede confirmar un resultado positivo de la doble PCR mediante secuenciación, eso también se considera como resultado negativo.
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* * *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la enfermedad de las manchas blancas (véase el
cuadro al final de este Manual de animales acuáticos o consúltese la lista actualizada en la página Web de la OIE : www.oie.int).
