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Estructura y Función de los ácidos nucleicos
Estructura y Función de los ácidos nucleicos
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Estructura de los acidos nucleicos
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Diferencias estructurales del ADN y el ARN
Porque 2´-dideoxi en el ADN ?
Dos grupos OH en el ARN lo hacen más suceptible a hidrólisis.
El ADN sin OH en 2´ es más estable a hidrólisis. H20
NH3 Porque Timina en el ADN y uracilo en el ARN?
La Citosina se deamina espontaneamente formando Uracilo
Las enzimas reparadoras reconocen estas "mutaciones" y reemplazan Us por Cs
Si no hubiera Timina (5-metil-U) como distinguir las U normales de las resultantes de deaminación?
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Estructura secundaria del ADN: Características Principales
Dos cadenas polinucleotídicas enrrolladas en una doble hélice dextrógira
Las hebras son antiparalelas Los esqueletos azucar-fosfato en el exterior de la doble hélice
Pares de base planares a través de puentes de hidrógeno, en el centro de la estructura
A T (2 H) GC (3H)
Pares de base separados 3.4 A. Una vuelta de hebra (3.4 nm) tiene aprox. 10 pares de base La posición de los esqueletos azucar-fosfato definen surco mayor y menor.
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Flujo de información en
Flujo de información en
la célula
la célula
Odio ser una
molécula de
ADN!!
Hay tanta
información
que debo
recordar!!
6Reglas de síntesis de moléculas informativas
Acidos
Acidosnucleicos y proteínasnucleicos y proteínas
Formados por un número Formados por un número limitado de
limitado de subunidadessubunidades Las unidades son Las unidades son agregadas agregadas secuencialmente
secuencialmenteformando formando cadenas lineales
cadenas lineales Cada cadena tiene un Cada cadena tiene un punto de inicio, avanza en punto de inicio, avanza en una única dirección y tiene una única dirección y tiene un punto de finalización un punto de finalización Los productos de la síntesis Los productos de la síntesis primaria son modificados primaria son modificados previamente a cumplir su previamente a cumplir su función
función
Señales en el ADN
Señales Donde comienza y termina un gen? Donde comienza y termina una proteína? Como leer estas señales?
Legibilidad
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Legibilidad de secuencias de ADN
Accesibilidad a la secuencia
(surcos mayor y menor)
Variación con
movimientos de pares de base Formas alternativas del ADN
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La estructura de los ácidos nucleicos no es rígida
Enlaces móviles
Enlace N-glicosídico Enlace Fosfo-di-éster
Movilidad de las bases
dependiendo de la secuencia varía el ángulo entre los pares de base
Ladeado Abertura
Giro Propulsor
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forma A
forma A condiciones de baja humedad híbridos ADN-ARN
ARN- ARN 11pb/vta bases inclinadas surco mayor profundo
surco menor angosto, mas expuesto
Formas alternativas del ADN
forma Z
forma Z
alternancia de purinas y pirimidinas (CGCGCG)
lev ógira 12 pb/vta
surco mayor muy profundo y cerrado surco menor muy expuesto
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Propiedades fisico-químicas de los ácidos nucleicos
Aumento de Temperatura
Regiones ricas en AT se disocian primero
Aumento de Temperatura
Disociación cooperativa de las hebras
Separación de hebras y formación de ovillos 1. Desnaturalización de los ácidos
nucleicos
Desnaturalización Parcial del ADN necesaria para procesos de copiado
Experimental Por temperatura
Se analiza mediante espectroscopía
Tm : un reflejo de la composición promedio de un ADN Depende del contenido de GC
Tm Temperatura de disociación
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Tm : un reflejo de la composición promedio de un ADN
Se analiza mediante espectroscopía Depende del contenido de GC Tm Temperatura de disociación
T a la que la mitad del ADN está disociado
Denaturalización de los ácidos nucleicos: Tm
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2. Renaturalización del ADN
Reacción Bimolecular
Encuentro de hebra complementaria Zipping de complementarias
depende del tiempo y de la concentración de reactantes
Aplicaciones
Complejidad del genoma
Búsqueda de secuencias específicas
Permite analizar complejidad de un genoma Secuencias repetidas reasocian rapidamente Secuencias únicas reasocian lentamente Cot1/2 50 100 0 % DN A re a soc ia d o log Cot rápido(repetidos) intermedio (repetido)
lento (copia única) Fracciones obtenidas: reasociación rápida reasociación intermedia reasociación lenta Cot1/2 Cot1/2
Reasociación de ADN: complejidad del genoma
Cot1/2= 1 / k2 k2 = constante de segundo orden Co= concentración de ADN t1/2= tiempo medio de reacción
Cot1/2 50 100 0 % D N A re a so c ia d o
I I I I I I I I I
log Cot rápido(repetidos) intermedio (repetido)lento (copia única) Fracciones obtenidas: reasociación rápida reasociación intermedia reasociación lenta Cot1/2 Cot1/2
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3. Hibridación de ácidos nucleicos
En solución
En soportes sólidos
Southern Blot ADN
Northern Blot ARN
Dot blot Micro-arrays
Búsqueda de secuencias específicas en mezclas complejas de ácidos nucleicos
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En soportes sólidos
Southern Blot ADN
Northern Blot ARN
Dot blot Micro-arrays
3. Hibridación de ácidos nucleicos
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Estructura terciaria de los ácidos nucleicos:
palíndromes, horquillas y cruciformes
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Acidos nucleicos monocatenarios:
Estructura secundaria y terciaria
Los ARN suelen adoptar distintas conformaciones, muchas de
ellas estables y mantenidas por regiones autocomplementarias
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Topología y función
• Superenrrollamiento necesario para la compactación del ADN y su función • In vivo la mayoría del ADN está superenrrollado negativamente
• Esto favorece la disociación local de las hebras, importantes durante la duplicación y transcripción
• Enzimas topoisomerasas regulan los niveles de superenrrollamiento celular • Es posible que se formen estructuras alternativas debido a desenrrollamientos
locales generados por superrollamiento
Estructuras complejas de ARN
Topología del ADN
Como hace el ADN para caber en los limitados volumenes intracelulares? Superenrrolamiento
Asociación con proteínas
El ADN relajado en forma B tiene 10 pb/vta.
Un ADN superenrrollado tiene mas o menos pb/vta. (superenrrollamiento positivo o negativo)
•Torsión (Twist) •Superenrrollamiento
o Retorcimiento (Writhe) Topoisómeros
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Lk = Tw + Wr
Ligazón (Linking number) Torsión (Twist)Superenrrollamiento o Retorcimiento (Writhe) Al superenrrollar el ADN se genera tensión, que se expresa en un desenrrollamiento local del ADN (variando la torsion).
Al separar las hebras, se genera tensión que se resuelve enrrollando sobre si misma la molécula de ADN (variando el superenrrollamiento).
Torsión y superenrrollamiento
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Organización del material hereditario
• Necesidad de compactación Volumen limitado
Neutralización de cargas del ADN • Organización funcional del ADN
mecanismos de segregación en duplicación
accesibilidad de proteínas reguladoras de la expresión génica
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El genoma bacteriano incluye un cromosoma circular y moléculas pequeñas circulares (plásmidos) No existe núcleo definido
ADN en “región nucleoide”
Varios dominios de 40-80 Kb superenrrollados asociado a ARN y proteínas
El nucleoide bacteriano
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El genoma nuclear humano comprende 46 moléculas de ADN lineales
El largo sumado de este ADN es mas de 1.5 metros
El diámetro del núcleo es aprox. 10 nm 10,000 nm
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Cromatina
complejo compuesto por ADN y proteínas
Eucromatinazonas menos condensadas
Heterocromatinazonas más condensadas
Toda la cromatina se condensa previamente a la división celular
El nucleo interfásico
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Durante la división se visualizan cromosomas individuales Los cromosomas metafásicos son la forma más condensada de la cromatina
Los cromosomas son herramientas de segregación del material hereditario Cuáles son los pasos de compactación?
El ciclo celular
A partir de núcleos aislados se puede aislarse cromatina
Al microscopio electrónico se observan fibras de 30 nm y collar de cuentas de 10 nm
La cromatina: microscopía
Análisis bioquímico
Cantidades similares de ADN y proteínas Digestión de ADN con nucleasas
repetidos de 160-200pb Proteínas básicas – HISTONAS
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• Proteínas básicas pequeñas • Altamente conservadas
• Centro globular y colas ricas en Lys y Arg
• Sitios de acetilación de Lys en colas N terminales (+) • Sitios de fosforilación en Ser en colas de H1
Las histonas
Histone Fold H2A/H2B Dimer “handshake”
H1 H2B H2A H3 H4 hélice variable conservado 34
Las histonas H2A y H2B forman un dímero Dos H3 y dos H4 forman un tetrámero Dos dímeros H2A-H2B y un tetrámero H3-H4 forman un octámero con forma de disco aplanado
El octámero de histonas
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•Sobre el octámero se enrrolla el ADN
•Cada octámero organiza 145 pb en 1 ¾ vuelta •48 nm ADN en un disco de 6x11nm
•Sitios distantes en el ADN se aproximan (accesibilidad) •Otros sitios quedan cubiertos (en la cara interna)
El nucleosoma
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•Cargadas positivamente •Pasan entre las vueltas de ADN •Contactan con el ADN adayente y del octámero próximo
Las colas de las
histonas del core
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• No forma parte del octámero
•Organiza el ADN a la entrada y salida del octámero
La histona H1
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Hélice nucleosomal 6 nucleosomas por vuelta
El solenoide
•La modificación de histonas es VITAL en la expresión génica •La acetilación y desacetilación de histonas es cíclica
Cuentas 10 nm
• Colas cargadas + Se unen al ADN de nucleosomes adyacentes • Alto nivel de histona H1
NO es posible la transcripción
Fibra de 30 nm
• Colas acetiladas NO se unen al ADN • Bajo nivel de histona H1Existe transcripción génica
Correlación estructura función
+ 2M NaCl
histonas
Eliminación de histonas
(Tratamiento con detergentes leves o altas concentraciones salinas)
Matriz nuclear proteica y bucles de ADN unidos a la matriz
Matriz nuclear DNA loops
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Igual tratamiento en cromosomas metafásicos revela un esqueleto proteico del cromosoma (scaffold) del que salen bucles de ADN de 30 a 100 Kb
La matriz nuclear proteica es el scaffold durante la interfase
El andamiaje (scaffold)
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Existen regiones de ADN que se unen al scaffold
SARs (scaffold attachment regions) MARs (matrix attachment regions) SARs=MARs
Bucles de cromatina
Loops of 30 – 90 kb
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Bucles como dominios de cromatina
Cada bucle fijado al scaffold puede presentar una estructura diferente, mas o menos condensada.
Pueden ser dominios funcionalmente independientes
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Visualización in vivo de niveles superiores de
compactación: cromosomas plumulados
A. Lampbrush chromosomes.
Cromosomas meióticos apareados parcialmente condensados y pausados durante la profase meiótica para sintetizar ARNs y proteinas a ser almacenadas para el desarrollo temprano del huevo.
45 cromátide radial loop chrosomosom e model 1µm 10 µm cromátide C rom o som a m it ót ic o
Los bucles de ADN fijados al scaffold se pliegan formando una superhélice
Dominios condensados
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Forma de máxima compactación de la cromatina Unidad estructural segregacional de la
información hereditaria
El cromosoma metafásico
Constricción secundaria Región organizadora nucleolar
Con genes ribosomales Centromero
Constricción primaria Sitio de unión de proteínas que forman cinetocoro Brazos
Porciones del cromosoma entre el centrómero y el telómero
Unidad funcional de la información hereditaria
Centrómero Constricción primaria Rico en secuencias repetidas Sitio de unión de proteínas que forman cinetocoro Función = segregación Telómeros Regiones terminales de los cromosomas Secuencias repetidas particulares Mecanismo de duplicación particular Función = Integridad cromosómica
Orígenes de replicación ARS (secuencias de replicación autónomas) Varios por cromosoma Función = replicación
El cromosoma
Citogenética: técnicas de estudio de los cromosomas
La CITOGENETICAanaliza la cantidad y
morfología de los cromosomas
Los cromosomas se pueden describir en base a la posición del centromero Bandeo cromosómico
Tratamiento desnaturalizante o enzimático del cromosoma y posterior tinción
Cada cromosoma revela un patrón específico de bandas claras y oscuras,
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Revelan diferencias estructurales en la cromatina que constituye cada banda Tratamiento desnaturalizante o enzimático y tinción
Bandas oscuras y claras (1-10 Mb)
•Bandeo G
•tratamiento con tripsina
Bandas claras zonas activas
replicación temprana Bandas oscuras zonas inactivas
replicación tardía
•Bandeo R
•patrón opuesto a Bandeo G
•Bandeo C
•heterocromatina constitutiva •pericentromérica
Técnicas de bandeo cromosómico
50 FISH
Hibridación in situ sobre cromosomas con sondas fluorescentes
Técnicas de localización cromosómicas
Cariotipo Espectral
Multiple FISH con sondas específicas de cada cromosoma marcadas con un fluorocromo diferente
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Tamaño compacto DNA longitud compactado
Núcleo (humano) 2 x 23 = 46 cromosomas 92 moléculas ADN 10 µm esfera 12,000 Mbp 4 m DNA 400,000 x Cromosma mitótico 2 cromátides, 1 µm espesor 2 moléculas ADN 10 µm forma X 2x 130 Mbp 2x 43 mm DNA 10,000 x Dominio de ADN Bucle de AND anclado 1 replicón ? 60 nm x 0.5 µm 60 kbp 20 µm DNA 35 x Fibra de cromatina approx. 6 nucleosomas por vuelta of 11 nm 30 nm diámetro 1200 bp 400 nm DNA 35 x nucleosoma disco 1 ¾ vueltas de ADN (146 bp) + ADN linker 6 x 11 nm 200 bp 66 nm DNA 6 - 11 x
Par de bases 0.33 x 1.1 nm 1 bp 0.33 nm DNA 1 x
Compactación debida a histonas
Compactación debida al scaffold / matriz nuclear
Niveles de
compactación
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Compactación
neutralización de cargas del ADN mecanismos de segregación
en duplicación
Represor transcripcional Dominios topológicos independientes ( Regulación independiente)
Problemas
Que sucede durante la duplicación y la transcripción?
