Trabajo de Fin de Máster
“Efecto de la mutación Asp187Gly de Cdh1 sobre la la actividad de la E3 ubiquitina ligasa APC/C”
Leticia Sancha Ortega
Máster en Fisiopatología y Farmacología Celular y Molecular
Curso académico 2019 – 2020
RESUMEN ABSTRACT ABREVIATURAS INTRODUCCIÓN
1.1. Complejo Promotor de la Anafase/Ciclosoma (APC/C) 1
1.1. 1. Estructura y reconocimiento de sustratos 1
1.1. 2. Cofactores 2
1.1. 3. Regulación de APC/C-Cdh1 3
1.2. Funciones mitóticas del complejo APC/C 5
1.3. Funciones no mitóticas del complejo APC/C-Cdh1 en el sistema nervioso 5 1.3.1. Diferenciación neuronal y desarrollo del Sistema Nervioso Central 7
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
2.1. Hipótesis 10
2.2. Objetivos 10
MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Línea celular HEK293T 11
3.2. Transfecciones con plásmidos 11
3.3. Tratamientos celulares 12
3.4. Determinación de la expresión de proteínas mediante transferencia tipo western
blot 13
3.4.1. Obtención de proteínas totales 13
3.4.2. Fraccionamiento subcelular de proteínas 13
3.4.3. Cuantificación de la concentración de proteínas 14
3.4.4. Electroforesis de proteínas 15
3.4.5. Transferencia de proteínas 15
3.4.6. Inmunodetección de proteínas 16
3.5. Inmunoprecipitación de proteínas 17
3.5.1. Unión del anticuerpo a las Dynabeads 17
3.5.2. Crosslinking 18
3.5.3. Inmunoprecipitación 18
3.6. Inmunocitoquímica 19
Índice
3.7. Adquisición de imágenes: microscopios 20
3.8. Análisis estadístico 21
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1. La mutación Asp187Gly de Cdh1 determina la abundancia de la proteína Cdh1 y la actividad del complejo APC/C-Cdh1
4.2. La mutación Asp187Gly de Cdh1 condiciona la localización subcelular de Cdh1, favoreciendo su degradación
4.3. La mutación Asp187Gly de Cdh1 afecta a su capacidad de reconocimiento y unión a sus sustratos
22
25
29
CONCLUSIONES 32
BIBLIOGRAFÍA 33
APÉNDICES
1. Reactivos y soluciones I
2. Sistemas de inmunodetección en inmunofluorescencia II
3. Sistemas de inmunodetección en western blot III
El gen Fzr1 (Fizzy-related protein o proteína 1 relacionada con Fizzy) codifica la proteína Cdh1, que es un cofactor de la E3 ubiquitina ligasa Complejo Promotor de la Anafase/Ciclosoma (APC/C). APC/C-Cdh1 regula funciones de regulación de la mitosis [Watson et al., 2019] y no mitóticas [Almeida, 2012]. Además de la regulación del ciclo celular, APC/C-Cdh1 juega un papel clave en la supervivencia neuronal [Maestre et al., 2008] y la neurogénesis durante el desarrollo [Delgado-Esteban et al., 2013].
Recientemente, nuestro grupo ha identificado la mutación humana (p.Asp187Gly) del gen Fzr1 (c.560A > G) como una nueva causa de microcefalia prenatal, ya que provoca la pérdida de función de APC/C-Cdh1 [Rodríguez et al., 2019]. Sin embargo, los mecanismos responsables de dicha pérdida son desconocidos.
El objetivo del presente trabajo ha sido investigar los mecanismos moleculares responsables de la pérdida de actividad del complejo APC/C causada por la mutación Asp187Gly de Cdh1, centrándonos en el estudio de la estabilidad de Cdh1 y la interacción con sus sustratos. Con este fin, se empleó la línea celular procedente de riñón embrionario humano 293T (HEK293T) transfectada con un vector que expresa la proteína mutada.
Nuestros resultados mostraron que la expresión de la forma mutada de Cdh1 en las células HEK293T confirmaba la pérdida de actividad de APC/C, así como la inestabilidad de la proteína, respecto a las células que expresaban la condición wild-type. Además, nuestros resultados sugieren una mayor degradación de Cdh1 vía proteosoma, ya que la variante mutada se localizaba fundamentalmente en el núcleo, donde es susceptible de ser marcada para su degradación por las ligasas APC/C y Skp1 Cullin1 F-box (SCF). Sin embargo, la variante wild-type se localizaba tanto en el núcleo como en el citosol, donde su estabilidad es mayor. Finalmente, hemos observado cómo la mutación Asp187Gly de Cdh1, localizada en la primera repetición del dominio WD40 de la proteína y esencial para las interacciones proteína-proteína, afecta al reconocimiento y unión a sus sustratos.
En conclusión, nuestros resultados demuestran que la mutación Asp187Gly altera la estabilidad y la capacidad de reconocimiento de sustratos de la proteína Cdh1, afectando así a la actividad del complejo APC/C. Estos resultados proporcionan nuevas herramientas para descifrar la regulación de la actividad del complejo APC/C-Cdh1 y su participación en importantes procesos como el control del tamaño de la corteza cerebral.
Resumen
The Fizzy-related protein 1 (Fzr1) gene encodes the Cdh1 protein, a coactivator of the E3 ubiquitin ligase Anaphase Promoting Complex/Cyclosome (APC/C). APC/C-Cdh1 regulates mitotic [Watson et al., 2019] and non-mitotic functions [Almeida, 2012]. In addition to cell cycle regulation, APC/C-Cdh1 plays a key role in neuronal survival [Maestre et al., 2008] and neurogenesis during brain development [Delgado-Esteban et al., 2013]. Recently, we described that the loss of function of APC/C-Cdh1 caused by a novel human mutation (p.Asp187Gly) in the Fzr1 gene (c.560A > G) results in a new cause of prenatal microcephaly [Rodríguez et al., 2019].
The aim of the present project was to understand the molecular mechanisms involved in APC/C loss of activity due to the Cdh1 Asp187Gly mutation, focusing on the study of Cdh1 stability and the interaction with its targets. To this end, we used the human embryonic kidney 293T (HEK293T) cell line transfected with a cDNA-containing vector of the mutated gene.
Our results showed that the expression of Asp187Gly mutant form of Cdh1 in HEK293T cells confirmed the inactivation of APC/C and the decreased in Cdh1 protein levels, in comparison with Cdh1 wild type-expressing cells. Moreover, our results suggest an increased proteosomal degradation of the mutant variant, due to an accumulations of the Asp187Gly mutant in the nucleus, where it is targeted for degradation by APC/C and Skp1 Cullin1 F-box (SCF). However, wild-type Cdh1 was located in both the nucleus and the cytosol, whereas it is stabilized. Finally, we have observed that Cdh1 Asp187Gly mutation, located in the essential protein-protein interaction WD40 domain, affects Cdh1 ability to recognize and bind to its substrates.
In conclusion, we found that the Cdh1 Asp187Gly mutation impairs Cdh1 protein stability and substrate recognition, thus affecting APC/C activity. These results provide new tools to understand the regulation of APC/C-Cdh1 complex activity and its involvement in important processes such as the control of cerebral cortex size.
Abstract
A: Adenina.
ADN: Ácido desoxirribonucleico.
AgO: Agitación orbital constante.
APC/C: Anaphase Promoting Complex/Cyclosome.
ARN: Ácido ribonucleico.
ARNm: ARN mensajero.
Asp: Aspartato.
BCA: Ácido bicinconínico.
BSA: Albúmina sérica bovina.
Cdk: Quinasa dependiente de ciclina.
Cre: Cre recombinasa.
Cx: Corteza cerebral.
DAPI: 4′,6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride.
D-box: Destruction box.
DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium.
EDTA: Ácido etileno di-amino tetra-acético.
Fzr1: Fizzy-related protein 1.
G: Guanina.
GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.
GFP: Green fluorescent protein.
Gly: Glicina.
h: Horas.
H2Od: Agua destilada.
HA: Hemaglutinina.
HEK293T: Línea celular 293T de riñón embrionario humano.
HRP: Peroxidasa de rábano.
kDa: kiloDaltons.
min: Minutos.
nm: Nanómetros.
PBS: Tampón fosfato salino.
PDL: Poli-D-Lisina.
Abreviaturas
PEI: Polietilenimina.
PFA: Paraformaldehído.
PFKFB3: 6-fosfofructo-2-quinasa/fructosa-2,6-bisfosfatasa-3.
PM: Peso molecular.
PSA: Persulfato sódico de amonio.
SCF: Skp1 Cullin1 F-box.
SDS: Dodecil sulfato sódico.
SF: Suero fetal.
SN: Sistema nervioso.
SNC: Sistema nervioso central.
TA: Temperatura ambiente.
TBS: Tampón Tris salino.
TEMED: Tetra-metil etileno di-amina.
TPR: Tetratrico Peptide Repeat.
TTBS: Tampón Tris salino con Tween-20.
Introducción
1 1.1. Complejo Promotor de la Anafase/Ciclosoma (APC/C)
Anaphase Promoting Complex/Cyclosome o APC/C es un complejo multiproteico que posee propiedades reguladoras, catalíticas y de especificidad [Schreiber et al., 2011].
APC/C es una E3 Ubiquitina ligasa, miembro de la familia cullin RING-finger, responsable de marcar proteínas por ubiquitinación para su posterior degradación a través del proteosoma [Peters, 2006]. APC/C tiene como sustratos proteínas mitóticas, entre otras, por lo que controla procesos del ciclo celular responsables de la segregación de cromátidas durante la anafase, la finalización de la mitosis y el establecimiento y mantenimiento de la fase G1 [Chang and Barford, 2014; Eguren et al., 2011]. Este complejo está localizado en el núcleo de las células durante la interfase y difunde al citoplasma durante la división celular [Peters, 2006].
1.1.1. Estructura y reconocimiento de sustratos
El complejo APC/C está formado por 15 subunidades proteicas, organizadas en tres dominios según su funcionalidad: el complejo estructural, el dominio catalítico y el brazo Tetratrico Peptide Repeat (TPR) (Esquema 1) [Zhou et al., 2016]. Las subunidades Apc2 y Apc11 son las responsables de la actividad catalítica y permiten al complejo interaccionar con la enzima E2 Ubiquitina mediante sus dominios cullin y ring H2 finger [Alfieri et al., 2017]. Apc10 (Doc1) y Cdh1 contribuyen al reconocimiento de sustratos y su cercanía a las subunidades Apc2, Apc11 y a la E2 Ubiquitina, es importante para que se produzca la ubiquitinación [Almeida, 2012; da Fonseca et al., 2011].
Esquema 1. Esquema estructural de las diferentes subunidades que constituyen el complejo APC/C. Se representa el dominio catalítico compuesto por las subunidades Apc2, Apc10 y Apc11, el complejo estructural y el brazo TPR constituido por el resto de subunidades. También aparecen en el centro del esquema los cofactores de APC/C, Cdh1 y Cdc20. Modificado de [Eme et al., 2011].
2 El brazo TPR permite posicionar tanto la proteína E2, encargada de transportar las ubiquitinas, como el sustrato para promover la correcta ubiquitinación y está compuesto por cuatro subunidades que contienen repeticiones tetratricopeptídicas (Apc3 (Cdc27), Apc6 (Cdc16), Apc7 y Apc8 (Cdc23)) y varias proteínas accesorias (Apc9, Apc12, Apc13, Apc15 y Apc16). Las subunidades Apc1, Apc4 y Apc5 constituyen la base estructural del complejo, le proporcionan estabilidad, siendo subunidades de sujeción o ensamblaje (Esquema 1) [Yamano, 2019; Chang et al., 2014].
Los sustratos de APC/C presentan motivos de degradación específicos, que son reconocidos por el dominio WD40 de los cofactores de APC/C, Cdc20 y Cdh1 y confieren especificidad al complejo. Estos motivos son principalmente la D-box (destruction box) y la KEN-box, cuyas secuencias consenso son RxxLxxxxN/D/E y KENxxxN, respectivamente. El motivo D-box se suele encontrar en regiones no plegadas de los sustratos de APC/C, como es el caso de la ciclina B1 [Fuchsberger et al., 2017; Almeida, 2012]. Recientemente, nuestro grupo ha descrito la proteína ROCK2 como sustrato de APC/C-Cdh1 debido a que posee un dominio KEN-box en su secuencia [Bobo-Jiménez et al., 2017].
1.1.2. Cofactores
La actividad del complejo APC/C depende de su interacción con los cofactores o coactivadores Cdc20 y Cdh1, durante fases específicas del ciclo celular [Almeida, 2012].
El gen de la proteína 1 relacionada con Fizzy (Fzr1) codifica la proteína Cdh1 que regula funciones mitóticas [Watson et al., 2019] y no mitóticas [Kimata, 2019] marcando proteínas por ubiquitinación para su posterior degradación a través del proteosoma.
Ambos cofactores presentan secuencias características: el motivo IR, la secuencia C- box y el dominio WD40. El motivo IR (dipéptido isoleucina-arginina), localizado en el extremo carboxilo-terminal, media la unión de los cofactores con APC/C. La secuencia C-box, presente en el extremo amino-terminal, promueve la ubiquitinación. El dominio WD40 está situado en el extremo carboxilo-terminal, se compone de 7 repeticiones de 40 aminoácidos, es importante para las interacciones proteína-proteína y permite el reconocimiento específico de sustratos ya que interacciona con las secuencias consenso, D-box y KEN-box [Barford, 2020; Peters, 2006].
3 La unión de APC/C con sus cofactores está regulada principalmente por fosforilación, es importante en la progresión del ciclo celular y se produce por la regulación recíproca entre los dos cofactores [Almeida, 2012]. Cdc20 se transcribe y se traduce durante las fases S y G2, pero no puede interactuar con APC/C hasta que se fosforilan subunidades específicas del complejo al comienzo de la mitosis. Por el contrario, APC/C-Cdh1 se activa durante la anafase y la telofase y mantiene su actividad hasta la transición de G1 a la fase S. En la mitosis tardía, la activación de APC/C-Cdh1 controla la salida mitótica y la progresión de G1/G0, regulando así el inicio de la replicación del ácido desoxirribonucleico (ADN) (Esquema 2) [Watson et al., 2019; Sivakumar and Gorbsky, 2015].
1.1.3. Regulación de APC/C-Cdh1
La actividad de APC/C-Cdh1 está estrechamente regulada por el estado de fosforilación de Cdh1, por la unión de proteínas inhibidoras o activadoras y por la cantidad de proteína de Cdh1 (Esquema 3) [Nagai et al., 2018; Kramer et al., 2000].
Esquema 2. Activación del complejo APC/C por Cdc20 y Cdh1 durante el ciclo celular. En la profase, APC/C se une a Cdc20, dando lugar a la degradación de la ciclina A en la prometafase. Durante la metafase, se lleva a cabo la proteólisis de la ciclina B1. En la anafase y la telofase, APC/C-Cdh1 se activa degradando Cdc20 e inactivando posteriormente el complejo APC/C-Cdc20. Durante el resto de ciclo celular APC/C-Cdh1 sigue activo. Modificado de [Peters, 2006].
Esquema 3. Regulación de la actividad de APC/C-Cdh1. La actividad de APC/C-Cdh1 está muy regulada por la fosforilación de tipo reversible de Cdh1, las proteínas inhibidoras y la propia degradación de Cdh1. La fosforilación de Cdh1 impide su interacción con APC/C, mientras que su desfosforilación conduce a la activación de APC/C-Cdh1.
Cdh1 media su propia degradación al estimular la actividad de APC/C. Modificado de [Almeida, 2012].
4 La función de APC/C-Cdh1 está regulada por el ciclo celular y controlada por las tasas de síntesis y/o degradación de Cdh1 [Kramer et al., 2000]. Los niveles de expresión del ácido ribonucleico mensajero (ARNm) permanecen más o menos constantes a lo largo del ciclo celular. Sin embargo, se ha demostrado que los niveles de la proteína Cdh1 son bajos durante la fase G1 tardía y la fase S y aumentan a medida que las células entran en la mitosis [Nagai et al., 2018]. La degradación de la proteína Cdh1 se controla a través de múltiples vías. Este proceso está finamente regulado, ya que es importante para el control de la activación adecuada de APC/C-Cdh1. La inestabilidad proteica de Cdh1 se promueve al forzar su acumulación en el núcleo, donde es susceptible de ser marcado para la degradación por las E3 ubiquitina ligasas, APC/C y Skp1 Cullin1 F-box (SCF) [Nagai et al., 2018; Benmaamar and Pagano, 2005]. Cdh1 se regula negativamente al activar APC/C mediando su propia degradación durante G1 y G0 [Listovsky et al., 2004].
El complejo SCF controla la actividad de APC/C-Cdh1 al promover la ubiquitinación y la posterior degradación de Cdh1, que ha sido previamente fosforilada por ciclina A y Plk1, lo que asegura la progresión adecuada del ciclo celular [Fukushima et al., 2013].
La localización subcelular de Cdh1 es clave en la regulación espacial de la actividad del complejo APC/C-Cdh1. Cdh1 se localiza en el núcleo durante la fase G1 del ciclo celular, pero se redistribuye al citosol entre la fase S y el final de la mitosis [Zhou et al., 2003]. Este proceso está regulado por la fosforilación de Cdh1, que induce su exportación nuclear y la acumulación citosólica, contribuyendo a la inactivación eficiente de APC/C‐
Cdh1 durante el ciclo celular [Maestre et al., 2008; Jaquenoud et al., 2002].
La fosforilación de Cdh1 por las quinasas dependientes de ciclina (Cdks) durante la fase S, la fase G2 y la mitosis, impide su unión con APC/C. Durante la salida de la mitosis se produce la inactivación de las Cdks y la posterior activación de las fosfatasas, permitiendo la desfosforilación de Cdh1, lo que conduce a la completa activación del complejo APC/C-Cdh1 en la mitosis tardía y durante la fase G1. A su vez, APC/C-Cdh1 marca por ubiquitinación a Cdc20, evitando la activación simultánea de APC/C con sus dos cofactores [Almeida, 2012].
Los principales inhibidores del complejo APC/C-Cdh1 son Emi1, RASSF1A y el complejo Rae1-Nup98, que bloquean su actividad durante la transición de la fase G1 a la fase S, permitiendo la acumulación de sus sustratos [Cappell et al., 2018; Cuende et al., 2018; Whitehurst et al., 2008].
5 1.2. Funciones mitóticas del complejo APC/C
El ciclo celular es un proceso esencial para el desarrollo, la diferenciación y la proliferación de las células eucariotas. APC/C se encarga del control del ciclo celular, promueve la transición de la metafase a la anafase y favorece la salida de mitosis. Las principales dianas de APC/C durante la mitosis son las ciclinas mitóticas (ciclinas A y B) y la securina, que es un inhibidor de la proteasa separasa. De esta manera, cuando el proteosoma degrada a la securina, se activa la separasa, que rompe la cohesina, proteína encargada de mantener unidas las cromátidas hermanas. La rotura de la cohesina inicia la segregación cromosómica durante la anafase [Watson et al., 2019].
El cofactor Cdh1 está implicado en el mantenimiento de una baja actividad por parte de las Cdks, lo que caracteriza a la fase G0/G1. El complejo APC/C-Cdh1 marca por ubiquitinación a las ciclinas mitóticas para su posterior degradación. La degradación de las ciclinas mitóticas es esencial para que se produzca el correcto movimiento del huso mitótico y de los cromosomas en la anafase, así como para que se lleven a cabo el desensamblaje del huso mitótico, la descondensación de la cromatina y el ensamblaje de la envuelta nuclear durante la telofase posterior [Li and Zhang, 2009]. Además, APC/C- Cdh1 también puede inactivar la actividad de Cdk al promover la degradación de reguladores positivos de la proliferación celular, como pueden ser Plk1, Aurora A o Cdc25A. El complejo APC/C-Cdh1 también es responsable de la degradación del componente SCF de Skp2, lo que conduce a la acumulación de sus sustratos p27 y p21, que bloquean cualquier actividad Cdk residual [Almeida, 2012].
1.3. Funciones no mitóticas del complejo APC/C-Cdh1 en el sistema nervioso El control espacio-temporal de la abundancia proteica por el sistema ubiquitina- proteasoma es clave para el correcto desarrollo del sistema nervioso (SN) y sus funciones [Huang and Bonni, 2016]. Trabajos previos de nuestro grupo han estudiado el papel de APC/C-Cdh1 en funciones esenciales del SN, como son la diferenciación neuronal [Cuende et al., 2008], la neurogénesis [Delgado-Esteban et al., 2013; Almeida, 2012], la supervivencia neuronal [Almeida et al., 2005], la formación sináptica y la plasticidad [Bobo-Jiménez et al., 2017; Almeida, 2012], el metabolismo energético y el estrés oxidativo [Bolaños et al., 2010; Herrero-Méndez et al., 2009], el establecimiento de la red neuronal y los procesos de aprendizaje y memoria [Bobo-Jiménez et al., 2017].
6 Estudios previos del laboratorio han confirmado que APC/C-Cdh1 desempeña una función clave en la supervivencia neuronal ya que el cofactor Cdh1 impide la muerte neuronal por apoptosis al mantener bajos los niveles de ciclina B1 [Almeida et al., 2005].
Posteriormente, nuestro grupo demostró que la hiperactivación de los receptores de glutamato provoca la fosforilación de Cdh1 mediada por Cdk5 y promueve su translocación del núcleo al citoplasma, lo que bloquea la actividad de APC/C. Además, la estimulación de los receptores de glutamato induce la acumulación de ciclina B1, provocando la entrada aberrante en el ciclo celular y la apoptosis neuronal (Esquema 4) [Maestre et al., 2008]. Se ha relacionado la acumulación de ciclina B1 en el cerebro de pacientes con enfermedad de Alzheimer y de accidentes cerebrovasculares con situaciones asociadas con una muerte neuronal de tipo excitotóxico [Almeida, 2012].
Además, APC/C-Cdh1 regula la formación y transmisión de la sinapsis al controlar la localización de receptores de glutamato y la cantidad de botones sinápticos en elementos presinápticos [Fu et al., 2011; van Roessel et al., 2004].Recientemente, nuestro grupo ha demostrado que la ausencia de Cdh1 en un modelo in vivo de ratón adulto afecta directamente al establecimiento y formación de la red dendrítica, provocando disrupción dendrítica, pérdida de sinapsis y espinas dendríticas en las neuronas piramidales de áreas de la corteza cerebral (Cx) e hipocampo [Bobo-Jiménez et al., 2017]. El complejo APC/C-Cdh1 es, por tanto, un importante regulador de la conectividad neuronal.
Las neuronas presentan una baja tasa glucolítica a pesar de su gran gasto energético y son incapaces de adaptarse a la disfunción energética mitocondrial asociada a estrés. Los astrocitos, en cambio, poseen una elevada tasa glucolítica y una gran capacidad de adaptación a cambios metabólicos [Fernández-Fernández et al., 2012; Rodríguez- Rodríguez et al., 2012]. Esta diferencia en actividad glucolítica se debe, en gran medida,
Esquema 4. APC/C-Cdh1 regula la apoptosis neuronal. La excitotoxicidad activa a Cdk5-p25, que fosforilan a Cdh1.
La inactivación de APC/C-Cdh1 provoca la estabilización de ciclina B1 y de PFKFB3. La estabilización de estas proteínas induce la entrada aberrante de las neuronas postmitóticas en el ciclo celular, lo que conlleva el estrés oxidativo y la muerte neuronal por apoptosis.
Modificado de [Almeida, 2012].
7 a la diferente expresión de la enzima 6-fosfofructo-2-quinasa/fructosa-2,6-bisfosfatasa-3 (PFKFB3), cuya expresión es muy abundante en astrocitos y prácticamente no se expresa en neuronas [Almeida et al., 2004]. PFKFB3 posee el motivo de reconocimiento KEN- box, por lo que es un sustrato del complejo APC/C-Cdh1 [Herrero-Méndez et al., 2009].
1.3.1. Diferenciación neuronal y desarrollo del Sistema Nervioso Central Nuestro laboratorio ha confirmado que la actividad del complejo APC/C-Cdh1 es clave para la diferenciación neuronal in vitro. APC/C-Cdh1 media la parada del ciclo celular a través de la degradación de activadores de las Cdks como las ciclinas y la estabilización de inhibidores de Cdks, entre otros, p27. Esta parada del ciclo celular induce la diferenciación neuronal [Cuende et al., 2008]. Además, el complejo APC/C- Cdh1 regula el crecimiento axonal y su disposición mediante la degradación de las proteínas nucleares Id2 y SnoN, reguladores de la proliferación celular entre otras funciones (Esquema 5) [Almeida, 2012; Stegmüller et al., 2008; Lasorella et al., 2006].
Nuestro grupo ha demostrado que APC/C-Cdh1 también coordina la neurogénesis cortical in vivo y el tamaño de la Cx durante el desarrollo. La morfología del cerebro adulto depende del equilibrio entre la proliferación de los progenitores neurales y el inicio de la neurogénesis en el período embrionario. En las primeras etapas del desarrollo de la Cx, las células progenitoras se dividen simétricamente para mantener la población celular, mientras que, en estadios posteriores, los progenitores neurales comienzan a dividirse asimétricamente, dando lugar a neuronas diferenciadas [Hindley and Philpott, 2012]. Por tanto, la duración del ciclo celular es esencial para mantener el balance entre progenitores neurales y neuronas diferenciadas [Delgado-Esteban et al., 2013].
Esquema 5. APC/C-Cdh1 coordina la parada del ciclo celular y la diferenciación neuronal. APC/C-Cdh1 inhibe la proliferación celular mediante su interacción con otras proteínas específicas.
Modificado de [Almeida, 2012].
8 Empleando un modelo de ratón KO para Cdh1 específico de embrión (Sox2-Cre condicional), se ha descrito que la ausencia de Cdh1 acorta la duración de la fase G1 y prolonga la duración de la fase S del ciclo celular, provocando estrés replicativo que conduce a la muerte por apoptosis de las células progenitoras neurales dependiente de p53, el deterioro de la neurogénesis y la reducción del tamaño de la Cx en ratones [Delgado-Esteban et al., 2013; Eguren et al., 2013]. Por tanto, APC/C-Cdh1 es esencial en la diferenciación neuronal, en el control del tamaño cerebral, así como en el desarrollo de enfermedades congénitas del neurodesarrollo, como puede ser la microcefalia [Delgado-Esteban et al., 2013]. Recientemente, nuestro grupo ha confirmado el papel de Cdh1 en el control del tamaño cerebral en humanos, que detallamos más adelante [Rodríguez et al., 2019].
La microcefalia primaria es un trastorno congénito del neurodesarrollo que se caracteriza por la reducción del tamaño de la Cx y discapacidad intelectual no progresiva.
Generalmente se transmite por herencia autosómica recesiva, con una incidencia global de 1/10000 a 1/100000 nacimientos dependiendo de la etnia y de la tasa de consanguinidad [Duerinckx and Abramowicz, 2018]. El desarrollo cerebral adecuado requiere un equilibrio espacio-temporal entre las divisiones simétricas que mantienen el conjunto de células progenitoras neurales y las divisiones asimétricas que dan lugar a neuronas diferenciadas. Como se ha mencionado anteriormente, un buen control sobre el ciclo celular es imprescindible para un correcto desarrollo cerebral, por ello no es de extrañar que mutaciones en genes que codifican proteínas relacionadas con el ciclo celular causen microcefalia [Shaheen et al., 2019; Jayaraman et al., 2018].
Ahora nuestro laboratorio ha identificado y descrito una nueva mutación de novo, heterocigota y deletérea en el gen Fzr1 humano en un niño de 4 años, con padres españoles no consanguíneos como una nueva causa de microcefalia perinatal. Esta mutación se debe a un cambio en un único nucleótido (adenina por guanina) localizado en la posición 560 (c.560 A > G), lo que supone una sustitución en el aminoácido codificado en la proteína Cdh1 (aspartato a glicina) situado en la posición 187 (p.
Asp187Gly). Las características clínicas que presentaba este paciente son retraso psicomotor, microcefalia prenatal grave y epilepsia refractaria [Rodríguez et al., 2019].
El estudio de los leucocitos de la sangre del paciente indicó que la mutación Asp187Gly de Cdh1 no afecta la expresión del gen Fzr1 ni la estabilidad del ARNm. Sin embargo, el análisis de transferencia western blot mostró una disminución en la
9 abundancia de la proteína Cdh1 en las células del paciente en comparación con los parentales [Rodríguez et al., 2019]. Se precisan más estudios para esclarecer cómo esta mutación afecta a la estabilidad de la proteína.
Además, esta mutación altera la actividad del complejo APC/C, afectando la distribución de las diferentes fases del ciclo celular ya que acorta la duración de la fase G0/G1 y prolonga la duración de la fase S del ciclo celular. Esta prolongación de la fase S y el estrés replicativo asociado conduciría a la muerte por apoptosis de las células progenitoras neurales y al fenotipo de microcefalia [Rodríguez et al., 2019]. Se desconoce el mecanismo mediante el cual la proteína Cdh1 mutada altera la actividad de APC/C.
Teniendo en cuenta que la mutación Asp187Gly de Cdh1 está localizada en la primera repetición del dominio WD40, que es un dominio clásico de interacción proteína-proteína [Xu and Min, 2011], sería de gran interés estudiar cómo afecta esta mutación en la interacción de APC/C-Cdh1 con sus sustratos, objetivo principal del presente trabajo.
Hipótesis y Objetivos
10 2.1. Hipótesis
La actividad del complejo APC/C-Cdh1 es fundamental para importantes funciones del SN, tales como la diferenciación neuronal [Delgado-Esteban et al., 2013; Cuende et al., 2008], la supervivencia neuronal [Maestre et al., 2008; Almeida et al., 2005], los procesos de aprendizaje y memoria en la etapa adulta [Bobo-Jiménez et al., 2017] y el desarrollo de la corteza cerebral [Delgado-Esteban et al., 2013]. Además, recientemente nuestro grupo ha descrito la pérdida de función de APC/C-Cdh1 debida a la mutación p.Asp187Gly de Cdh1 como una nueva causa de microcefalia prenatal [Rodríguez et al., 2019].
Por todo lo mencionado con anterioridad, nos planteamos estudiar los mecanismos moleculares que determinan la pérdida de actividad del complejo APC/C causada por la mutación Asp187Gly del gen Fzr1 (c.560 A>G), mecanismos que podrían condicionar la estabilidad de la proteína Cdh1 y la capacidad de interacción entre APC/C y sus sustratos.
Con este estudio pretendemos entender mejor, no solo los mecanismos de interacción Cdh1-sustrato importantes para la actividad de APC/C, sino también la regulación de importantes procesos como el control de la corteza cerebral.
2.2. Objetivos
En relación con la hipótesis indicada, los objetivos propuestos para el desarrollo del presente trabajo son:
1. Confirmar el efecto de la mutación Asp187Gly de Cdh1 sobre la actividad del complejo APC/C-Cdh1.
2. Evaluar los mecanismos moleculares que condicionan la estabilidad de la proteína Cdh1 mutada.
3. Estudiar el efecto de la mutación Asp187Gly de Cdh1 sobre su capacidad de interacción con el complejo APC/C y con sus sustratos.
Materiales y Métodos
11 3.1. Línea celular HEK293T
Para caracterizar la mutación Asp187Gly de Cdh1 en el laboratorio, se utilizó la línea celular procedente de riñón embrionario humano 293T (HEK293T). Esta línea celular se cultivó en Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) suplementado con suero fetal (SF; Roche Diagnostics, Heidelberg, Alemania) a una concentración final del 10% (v/v) [Almeida et al., 2005]. Para el mantenimiento de las células, se subcultivaron a una proporción 1:3 cada 2 o 3 días. Para los experimentos de transfección e inmunocitoquímica, las células HEK293T se resembraron en placas previamente recubiertas con poli-D-Lisina (PDL; 15 µg/ml; Sigma-Aldrich) a una densidad de 75000 células/cm2 (Imagen 1).
3.2. Transfecciones con plásmidos
Para expresar la variante Asp187Gly en células HEK293T, estas se transfectaron con diferentes construcciones de plásmidos que fueron diseñados y producidos previamente en el laboratorio. El vector que contiene el ADNc de longitud completa de Cdh1 humano fusionado a hemaglutinina (HA-Cdh1) construido en base al plásmido pcDNA™ 3.1 (Invitrogen) [Bobo-Jiménez et al., 2017], fue sometido a mutagénesis dirigida en el residuo Asp187, de modo que se reemplazó por Gly para obtener la forma mutada (HA‐
Cdh1mut) de Cdh1 [Rodríguez et al., 2019]. Se empleó el plásmido vacío (pcDNA) como control de la transfección (Figura 1).
Imagen 1. Línea celular HEK293T en cultivo. Microfotografía de células cotransfectadas con proteína fluorescente verde (GFP) para comprobar la eficiencia de la transfección. Barra de escala: 50 µm.
12 La transfección se realizó con el polímero catiónico polietilenimina (PEI, Sigma- Aldrich) y con el plásmido de interés, siguiendo las instrucciones del fabricante [Boussif et al., 1995]. En primer lugar, PEI se diluyó con el medio OptiMEM (Gibco) y, paralelamente, se prepararon diluciones tanto del plásmido control como del plásmido de expresión. Ambas soluciones se mezclaron en proporción 1:1 y se incubaron durante 10 minutos (min) a temperatura ambiente (TA), facilitando la formación de los liposomas que contendrán en su interior el ADN plasmídico. Posteriormente, el complejo plásmido - PEI se añadió gota a gota al cultivo y se incubaron en medio OptiMEM durante 1 hora (h) a 37ºC. Tras lavar con tampón fosfato salino (PBS) (ver apartado Apéndices), las células se incubaron en DMEM suplementado con SF al 10% (v/v). La expresión se comprobó mediante transferencia tipo western blot.
3.3. Tratamientos celulares
La línea celular HEK293T se trató con MG132 (Millipore), un potente inhibidor reversible del proteosoma. Para ello, se añadió directamente sobre el cultivo una solución de MG132 a una concentración final de 20 µM y se dejó actuar durante 2 h, antes de la recogida del extracto proteico [Bobo-Jiménez et al., 2017].
Figura 1. Plásmidos empleados en las transfecciones celulares. Esquema de la construcción de los plásmidos empleados en los experimentos de sobreexpresión. La secuencia del tag HA se encuentra fusionada a la secuencia del gen Fzr1. La variante mutada porta una Guanina en lugar de una Adenina en la posición 560 de su secuencia codificante. El plásmido vacío carece de toda la secuencia HA- Fzr1.
13 3.4. Determinación de la expresión de proteínas mediante transferencia tipo
western blot
3.4.1. Obtención de proteínas totales
La técnica de western blot permite determinar los niveles de expresión de proteínas específicas. Para obtener el extracto proteico total, las células se lavaron con PBS pH 7,4 a 4°C y se lisaron con tampón de lisis con NP-40 al 1% al que previamente se habían añadido inhibidores de fosfatasas y proteasas (ver apartado Apéndices). Posteriormente, las muestras se mantuvieron en hielo durante 10 min, se agitaron en un orbital vertical a 4ºC durante 20 min y se centrifugaron a 13000 x g durante 10 min a 4ºC. Así, los restos celulares se decantaron, los sobrenadantes con las proteínas celulares se recogieron en Eppendorf® y se congelaron a -80ºC hasta que se emplearon para la determinación de la concentración de proteínas [Rodríguez et al., 2019].
En el caso de la inmunoprecipitación de proteínas en condiciones desnaturalizantes, tras lavar las células con PBS pH 7,4 a 4°C, se incubaron con paraformaldehído (PFA) 1,25% en PBS pH 7,4 durante 10 min a TA. Seguidamente, se incubaron con glicina 1,25 M en PBS pH 7,4 durante 5 min y con glicina 0,1 M en PBS pH 7,4 durante 5 min a TA.
A continuación, se lavaron (2 x 5 min) con PBS pH 7,4 y se recogieron con tampón de crosslinking al que previamente se habían añadido inhibidores de fosfatasas y proteasas (ver apartado Apéndices). Las muestras se mantuvieron en hielo durante 10 min, se agitaron en un orbital vertical a 4ºC durante 20 min y se centrifugaron a 13000 x g durante 10 min a 4ºC. Finalmente, los sobrenadantes con las proteínas celulares se recogieron en Eppendorf® y se congelaron a -80ºC [Bobo-Jiménez et al., 2017].
3.4.2. Fraccionamiento subcelular de proteínas
El aislamiento de las fracciones nuclear y citosólica se llevó a cabo siguiendo el protocolo de fraccionamiento subcelular diferencial utilizado previamente en nuestro laboratorio (Esquema 6) [de Tudela et al., 2015]. Este método se basa en el uso de una solución de lisis débil (tampón de citosoles, ver apartado Apéndices) que fragmenta las membranas celulares dejando los núcleos intactos. A continuación, los lisados se tratan con una solución de lisis fuerte (tampón de núcleos, ver apartado Apéndices) que permite la rotura de los núcleos celulares y la obtención de dichas proteínas.
14 Para ello, se utilizaron células sembradas en placas de 60 cm2. Tras lavar las placas con PBS suplementado con MgCl2 1 mM, las células se desprendieron mediante raspado en tampón de citosoles. Posteriormente, la muestra se resuspendió con micropipeta y se mantuvo en hielo al menos 30 min, tiempo tras el cual se comprobó el aislamiento de los núcleos intactos y la rotura de las membranas plasmáticas con un microscopio de contraste de fases. A continuación, la mezcla se centrifugó a 800 x g durante 10 min a 4°C para separar el contenido citosólico (sobrenadante) del nuclear (precipitado o pellet).
La fracción citosólica se traspasó a un tubo eppendorf nuevo, donde se hirvió durante 5 min y el extracto de proteínas citosólicas se congeló a -80°C.
De la misma manera, la fracción nuclear resultante se resuspendió en tampón de núcleos con ayuda de una micropipeta y se mantuvo durante 1 h en hielo. Finalmente, la suspensión se hirvió durante 5 min y se sonicó durante 10 min con el objetivo de disgregar la envuelta nuclear. La fracción nuclear se congeló a -80°C junto con la fracción citosólica hasta su utilización [de Tudela et al., 2015].
3.4.3. Cuantificación de la concentración de proteínas
La concentración de los extractos proteicos se determinó mediante el método colorimétrico basado en el ácido bicinconínico (BCA) (Pierce™ BCA Protein Assay Reagent; Thermo Fisher Scientific). Este sistema colorimétrico se basa en la reducción del Cu2+ (azul) a Cu+ por parte de las proteínas de la muestra. La cantidad de Cu2+
reducido es proporcional a la cantidad de proteína presente en la solución. De esta manera el catión Cu+ generado es capaz de reaccionar con el BCA dando lugar a un producto de color púrpura que absorbe luz a una longitud de onda de 562 nm. Todas las medidas se
Esquema 6. Protocolo de fraccionamiento subcelular. El esquema muestra las diferentes fases del método de fraccionamiento para la obtención del extracto citoplásmatico y nuclear aislados.
15 realizaron por triplicado y las absorbancias se midieron espectrofotométricamente en un lector de placas (MIB#5250030, Thermo Scientific™ Varioskan™ Flash Multimode Reader, Thermo Fisher Scientific) utilizando albúmina sérica bovina (BSA) como estándar para calcular la recta patrón [Smith et al., 1985].
3.4.4. Electroforesis de proteínas
Las muestras a analizar se prepararon suspendiendo los extractos proteicos (25 – 40 µg) en tampón de carga (ver apartado Apéndices), se hirvieron durante 5 min a 100ºC y se centrifugaron a 13000 x g a 4ºC durante 10 min. A continuación, las proteínas se separaron mediante electroforesis (Esquema 7) en geles de poliacrilamida (ver apartado Apéndices) en presencia del detergente dodecil sulfato sódico (SDS – PAGE) utilizando un sistema de electroforesis vertical (Mini Protean 3, BioRad Laboratories, S.A.;
Hércules, California, EEUU) y un tampón no comercial de electroforesis (ver apartado Apéndices). Para identificar los pesos moleculares (PM) de las proteínas en estudio se empleó un marcador de PM (Page RulerTM Plus Protein Ladder, Thermo Fisher Scientific Inc; EEUU) que se cargó en el gel junto a las muestras. Una vez finalizada la electroforesis, los geles se sometieron a electrotransferencia e inmunodetección mediante la técnica de western blot [MacPhee, 2010; Moore, 2009].
3.4.5. Transferencia de proteínas
Las proteínas previamente separadas en geles SDS-PAGE se transfirieron electroforéticamente del gel a membranas de nitrocelulosa (Amersham™ Protram™;
Sigma-Aldrich) utilizando un tampón de transferencia no comercial (ver apartado Apéndices) [Burnette, 1981]. La transferencia se realizó a un amperaje constante de 400 mA durante 3 h en hielo. Para comprobar que la transferencia se había llevado a cabo
Esquema 7. Etapas del proceso abreviado de electroforesis de proteínas en geles de acrilamida.
Modificado de [https://www.creative-diagnostics.com/].
16 correctamente, las membranas de nitrocelulosa se tiñeron con una solución de rojo Ponceau [Moore, 2009] (Esquema 8).
3.4.6. Inmunodetección de proteínas
Analizamos los niveles de expresión de las siguientes proteínas: Apc3 (97 kDa), Cdh1 (55 kDa), Ciclina B1 (55 kDa) y HA (55 kDa). La proteína GAPDH (37 kDa, Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) se utilizó como control de carga porque no varía en las condiciones estudiadas, en la fracción nuclear se empleó la lámina B (70 kDa) como control de carga (ver apartado Apéndices).
Una vez realizada la tinción con rojo Ponceau, las membranas se cortaron en función de las proteínas a estudiar, empleando el marcador de PM como guía. Posteriormente, se eliminó el exceso de rojo Ponceau mediante lavados (3 x 5 min) con tampón Tris salino con Tween-20 (TTBS) pH 7,5 (ver apartado Apéndices). Con el objetivo de evitar la formación de uniones inespecíficas de los anticuerpos, las membranas se bloquearon incubando con leche al 5% (p/v) en TTBS pH 7,5 durante 1 h en el NavigatorTM a TA, y seguidamente se lavaron (3 x 5 min) con TTBS pH 7,5. A continuación, las membranas se incubaron con la solución que contenía el anticuerpo primario frente a la proteína de estudio durante toda la noche a 4ºC y en el NavigatorTM. Dicha solución contiene TTBS con leche al 2,5% (p/v) y con el anticuerpo primario específico (ver apartado Apéndices).
Al día siguiente, las membranas se lavaron (3 x 5 min) con TTBS pH 7,5 para retirar el exceso de anticuerpo primario. Posteriormente, se incubaron con los correspondientes anticuerpos secundarios durante 1 h a TA en el NavigatorTM en una solución específica que está compuesta por TTBS pH 7,5 suplementado con leche al 2% y el anticuerpo secundario específico (ver apartado Apéndices) [Jensen, 2012].
Esquema 8. Esquema representativo de la transferencia a membranas de nitrocelulosa. Modificado de [https://www.creative-diagnostics.com/].
17 Una vez realizada la incubación, las membranas se lavaron con TTBS pH 7,5 (3 x 5 min) y con tampón Tris salino (TBS) (1 x 5 min) ya que el Tween-20 puede interferir con algunos reactivos de revelado utilizados. Finalmente, las membranas se revelaron utilizando distintos reactivos de quimioluminiscencia en función de la intensidad de la señal para detectar la proteína de interés y siguiendo las instrucciones del fabricante:
Western Blotting Luminol Reagent (Santa Cruz Biotechnology), Super Signal West Dura (Thermo Fisher Scientific), Super Signal West Fento (Thermo Fisher Scientific) y PierceTM ECL Plus Western Blotting Substrate (Thermo Fisher Scientific). Por último, la señal de las membranas se expuso a películas de autorradiografía Super HR-U X-Ray Film (Fujifilm Medical) y estas se introdujeron en la máquina de revelado para visualizar los resultados (Esquema 9).
3.5. Inmunoprecipitación de proteínas
La inmunoprecipitación es una técnica en la que se aísla una proteína de una solución empleando un anticuerpo que se une específicamente a ella. De esta manera, podemos determinar las interacciones proteína-proteína [Lee, 2007].
3.5.1. Unión del anticuerpo a las Dynabeads
Para la técnica de inmunoprecipitación se emplearon DynabeadsTM protein A (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific), que son gránulos de poliestireno magnéticos unidos por enlace covalente a proteína A recombinante (Esquema 10). En primer lugar, se utilizaron 10 µl de Dynabeads por cada muestra de inmunoprecipitación y se resuspendieron con PBS pH 8 en un volumen 4 veces superior al volumen de las Dynabeads, empleando el DynaMag, que es una superficie imantada que permite la retención del material unido a las Dynabeads. Posteriormente, se realizaron 3 lavados con PBS pH 8 también en un volumen 4 veces mayor y se incubaron con el anticuerpo especifico de la proteína a inmunoprecipitar (en nuestro caso 0,6 µg de anti-HA por cada muestra) en PBS pH 8 durante toda la noche a 4ºC en agitación orbital constante (AgO).
Esquema 9. Imagen esquemática del proceso de inmunodetección por quimioluminiscencia abreviado.
Modificado de [https://www.creative-diagnostics.com/].
18 3.5.2. Crosslinking
El crosslinking permite la unión de forma covalente del anticuerpo a las Dynabeads (Esquema 10). En primer lugar, se lavaron 3 veces con PBS pH 8 con un volumen 4 veces superior al de las Dynabeads y se realizaron 2 lavados con tampón de conjugación (ver apartado Apéndices). A continuación, las Dynabeads se resuspendieron en una solución de BS3 5 mM preparado en tampón de conjugación durante 30 min a TA y AgO.
Posteriormente, la reacción de crosslinking se detuvo incubando las Dynabeads con Tris 1 M pH 7,5 a TA y AgO durante 15 min. Seguidamente, se realizaron 3 lavados con tampón de almacenamiento (ver apartado Apéndices) y se resuspendieron en el mismo volumen que el volumen inicial de las Dynabeads para conservarlas a 4ºC hasta su uso.
3.5.3. Inmunoprecipitación
Los extractos proteicos (100 µg) obtenidos en tampón de crosslinking (ver apartado 3.4.1. de Materiales y Métodos) se incubaron con 10 µl de Dynabeads unidas al anticuerpo frente a la proteína de interés durante toda la noche, a 4ºC y AgO.
Posteriormente, se recogieron los sobrenadantes como control de carga o INPUT y los inmunoprecipitados se lavaron 3 veces con PBS pH 8 en un volumen igual al de las muestras con las Dynabeads. A continuación, las muestras se resuspendieron en 30 µl de tampón de carga y se calentaron a 70ºC durante 10 min para eluir la proteína unida al anticuerpo (Esquema 10).
Esquema 10. Pasos del proceso de inmunoprecipitación de proteínas mediante proteína A unida a Dynabeads. Modificado de [https://www.thermofisher.com/].
19 Finalmente, se aislaron las partículas magnéticas del inmunoprecipitado con ayuda del DynaMag, quedando las muestras en el tampón de carga para ser utilizadas en la detección de proteínas mediante análisis de transferencia de tipo western blot (ver apartado 3.4.6. de Materiales y Métodos). Por último, las Dynabeads se lavaron 3 veces con tampón de almacenamiento (10 µl/muestra) y se guardaron a 4ºC en un volumen de tampón igual al inicial, para poder reutilizarse.
3.6. Inmunocitoquímica
Para la realización de técnicas de inmunocitoquímica, es importante que las células conserven sus características morfológicas y moleculares lo más parecidas posibles a las presentes cuando estaban vivas. Para ello, primero es necesario fijar las céulas, proceso que evita su autolisis, las protege del ataque de microorganismos (hongos y bacterias), insolubiliza los constituyentes celulares y evita distorsiones y retracciones [Martoja et al., 1970]. Esta técnica permite detectar antígenos específicos utilizando anticuerpos dirigidos contra moléculas específicas, mayoritariamente proteínas y glicoproteínas. Esto permite caracterizar diferentes procesos celulares mediante la unión específica de anticuerpos a diversos biomarcadores moleculares.
Para los ensayos de inmunocitoquímica, las células se sembraron sobre cubreobjetos de cristal previamente esterilizados al fuego. En primer lugar, se lavaron (2 x 2 min) con PBS a TA y AgO. Posteriormente, se retiró el PBS y las células se fijaron con paraformaldehído (PFA) al 4% (v/v) en PBS a TA durante 30 min. A continuación, se realizaron lavados (3 x 5 min) con PBS para retirar el exceso de fijador y se incubaron con glicina 0,1 M en PBS durante 20 min a TA y AgO suave. Después, las células se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,25% (v/v) en PBS a TA y AgO suave durante 5 min [Rodríguez et al., 2019].
Seguidamente, se incubaron en la solución de bloqueo (Triton X-100 al 0,1% v/v y suero de cabra al 10% v/v en PBS) a TA y AgO suave durante 1 h. A continuación, las células se incubaron con la solución que contenía el anticuerpo primario durante toda la noche a 4ºC en AgO suave (Esquema 11). Esta solución estaba compuesta por: PBS, suero de cabra al 5% y el anticuerpo primario (ver apartado Apéndices) en la dilución adecuada. Los anticuerpos primarios se unen específicamente a nuestra proteína de interés, mientras que, el resto de componentes, favorecen la reacción específica antígeno- anticuerpo.
20 Al día siguiente, se lavaron (3 x 5 min) con PBS a TA y AgO y se incubaron durante 1 h a TA, en AgO suave y en oscuridad, con la solución con el anticuerpo secundario conjugado con diferentes cianinas (Cy2 o Cy3) a una dilución 1:250 (ver apartado Apéndices) en suero de cabra al 5% en PBS. Seguidamente, las células se lavaron (3 x 5 min) con PBS para retirar el exceso de anticuerpo secundario que no se había unido específicamente. A continuación, se tiñeron los núcleos con 4′,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride (DAPI) diluido 1:7000 en PBS durante 10 min a TA, AgO suave y oscuridad. Posteriormente, los cubreobjetos se lavaron (3 x 5 min) de nuevo con PBS y con agua destilada (dH2O) (1 x 5 min). Finalmente, los cubreobjetos se montaron sobre portaobjetos utilizando el kit Slow Fade Antifade® (Molecular Probes) para prolongar la fluorescencia [Vecino et al., 2018].
3.7. Adquisición de imágenes: microscopios
La visualización y adquisición de fotografías seleccionadas para el desarrollo del presente trabajo se llevó a cabo en los siguientes equipos:
Microscopio confocal spinnig disk (Roper Scientific, Florida USA) con cámara Olymus IX81 (Olympus, Tokyo, Japón). Con láser de Ar con 4 líneas de excitación (458, 476, 488 y 514 nm) y 2 láseres de He/Ne (543 y 633 nm). Con objetivos: 10X/0.30 PH1 Plan Fluotar, 40X/0.75 PH2 Plan Fluotar, 63X/1.4 Oil Plan Apo CS, y 100X/1.4 Oil Plan Apo CS.
Esquema 11. Imagen esquemática del proceso de inmunocitoquímica.
21 Microscopio invertido Nikon Eclipse® Ti (Nikon Instruments; Tokio, Japón) equipado con epifluorescencia y campo claro, conectado a una cámara digital Hamamatsu ORCA- E.R. Camera Controller. Con objetivos: Plan 4X/0,10 ∞/- WD 30; Plan Fluor 10X/0,30 Ph1 DLL ∞/0,17 y Plan 40X/0,65 ∞/0,17 WD 0,56. Bloques de filtros para fluorescencia QH de SEMROCK: GFPQH: excitación: 455/485, dicroico: 495, emisión:
500/545; DAPI: excitación: 340/3800, dicroico: 400, emisión: 435/485 y TXRED:
excitación: 540/580, dicroico: 595, emisión: 600/660.
Las imágenes se procesaron y cuantificaron con el software Image J2 (http://developer.imagej.net/about).
3.8. Análisis estadístico
Los resultados obtenidos se analizaron empleando el programa estadístico SPSS Statistics® 23.0 Release 23.0.0 (SPSS Inc.; Chicago, Illinois, EEUU).
Los valores se expresaron como medias ± error estándar de la media (S.E.M.) de un número de determinaciones expresadas en las leyendas de las figuras. La significatividad entre dos grupos se determinó mediante el test de la t-Student para datos paramétricos.
En todos los casos, se consideró estadísticamente significativo un valor de p<0,05.
Resultados y Discusión
22 4.1. La mutación Asp187Gly de Cdh1 determina la abundancia de la proteína Cdh1
y la actividad del complejo APC-C/Cdh1
Recientemente, nuestro grupo ha identificado la mutación c.560 A > G del gen Fzr1 como una nueva causa de microcefalia prenatal por su alteración de la función del complejo APC-C/Cdh1 [Rodríguez et al., 2019], pero se desconocen los mecanismos moleculares que llevan a dicha alteración. Para llevar a cabo el presente estudio, se empleó la línea celular procedente de riñón embrionario humano 293T (HEK293T) transfectada con diferentes construcciones de plásmidos que portaban la mutación Asp187Gly, tal y como se ha descrito en el apartado de Materiales y Métodos. Este modelo, sencillo y reproducible, nos permite estudiar de manera precisa, a nivel molecular, los efectos de la mutación sobre la actividad de APC/C-Cdh1.
En primer lugar, para confirmar el efecto de esta mutación sobre los niveles de Cdh1, realizamos transferencias de tipo western blot. Como se muestra en la figura 2, la abundancia de la proteína Cdh1 disminuye en las células que expresan la variante mutada (HA-Cdh1mut) en comparación con las células HA-Cdh1, que expresan la variante wild type de la proteína, corroborando los resultados previos de nuestro laboratorio que demuestran la mayor inestabilidad de la proteína mutada [Rodríguez et al., 2019].
Figura 2. Las células que expresan HA-Cdh1mut presentan niveles reducidos de la proteína Cdh1.
A, B y C. Imágenes de transferencias de tipo western blot de los niveles de Cdh1 (55 kDa) y GAPDH (37 kDa), empleada en el estudio como control de carga, ya que su expresión no varía en nuestras condiciones experimentales. D. Cuantificación de la cantidad relativa de la proteína Cdh1 frente al control de carga GAPDH. Los datos se muestran como medias ± S.E.M de 3 cultivos independientes. *p
< 0.05 vs HA-Cdh1 (Prueba t de Student).
23 El análisis estadístico de los resultados obtenidos confirmó que la reducción en la cantidad de la proteína Cdh1 entre las células HA-Cdh1mut y HA-Cdh1 era significativa (Figura 2D).
A continuación, nos propusimos verificar esta observación analizando los niveles del tag hemaglutinina (HA), ya que, en la construcción plasmídica utilizada, la secuencia de este tag se encuentra fusionada con la del gen Fzr1. Esto nos permite diferenciar el Cdh1 endógeno (expresado por las células HEK293T en condiciones normales) del expresado exógenamente por la transfección. Tal y como se observa en la figura 3, como esperábamos, los niveles de expresión de HA disminuyen en la condición mutante (HA- Cdh1mut) de manera muy similar a la bajada que observamos en Cdh1.
Una forma indirecta de estudiar la actividad del complejo APC-C/Cdh1 es analizar la abundancia de sus proteínas diana, como es la ciclina B1. Esta proteína presenta el motivo consenso de degradación D-box en su secuencia que puede ser reconocido por el dominio WD40 del cofactor Cdh1. Así, APC/C-Cdh1 reconoce la proteína a través del motivo D- box y la marca por ubiquitinación para su posterior degradación vía proteosoma [Almeida, 2012].
Figura 3. Los niveles de Cdh1 y HA disminuyen en las células HA-Cdh1mut con respecto a las células HA-Cdh1. A. Visualización de la abundancia de Cdh1 (55 kDa) y GAPDH (37 kDa). B. Imagen de los niveles de HA (55 kDa) y GAPDH (37 kDa). C. Cuantificación de la cantidad relativa de Cdh1 y HA frente al control de carga GAPDH. Los datos muestran los resultados de un único cultivo.
24 Por todo lo mencionado con anterioridad, decidimos corroborar el efecto de la mutación sobre la actividad del complejo APC/C. Para cumplir este objetivo, realizamos transferencias de tipo western blot con objeto de estudiar la expresión proteica de ciclina B1 como conocido sustrato de Cdh1. Como se muestra en la figura 4, los niveles de expresión de ciclina B1 aumentan en las células que expresan la proteína mutada (HA- Cdh1mut), por lo que no se está marcando para su posterior degradación.
El análisis estadístico de los resultados obtenidos verificó que el incremento en la abundancia de la proteína ciclina B1, entre las células que expresan la condición mutante y las células que expresan la variante wild type de la proteína, era significativo (Figura 4D).
Nuestros resultados ponen de manifiesto que la mutación provoca la acumulación de la diana ciclina B1, lo que evidencia una pérdida de actividad de APC/C-Cdh1 en las células HA-Cdh1mut, con respecto a las células HA-Cdh1, probablemente como consecuencia de los menores niveles de Cdh1.
Figura 4. La proteína ciclina B1 se acumula en las células que expresan la variante mutada (HA- Cdh1mut). A, B y C. Visualización de transferencias de tipo western blot de los niveles de ciclina B1 (55 kDa) y GAPDH (37 kDa), utilizada en el trabajo como control de carga. D. Cuantificación de la cantidad relativa de ciclina B1 frente a GAPDH. Los datos se muestran como medias ± S.E.M de 3 cultivos independientes. *p < 0.05 vs HA-Cdh1 (Prueba t de Student).
25 El hecho de que los niveles de expresión de Cdh1 y HA disminuyan en la forma mutante nos lleva a confirmar que la mutación c.560 A > G del gen Fzr1 condiciona la abundancia de la proteína Cdh1. De acuerdo con resultados previos, esta mutación no afecta la expresión del gen Fzr1 ni la estabilidad del ARNm, ya que los niveles de expresión del ARNm se mantienen estables [Rodríguez et al., 2019]. Sin embargo, el análisis de transferencia de tipo western blot (Figura 2 y Figura 3) muestra una reducción en la abundancia de la proteína Cdh1 en las células que expresan la variante mutada (HA- Cdh1mut), lo que sugiere que la mutación Asp187Gly de Cdh1 podría estar afectando a la estabilidad de la proteína.
4.2. La mutación Asp187Gly de Cdh1 condiciona la localización subcelular de Cdh1, favoreciendo su degradación
La actividad del complejo APC/C-Cdh1 está regulada por la abundancia de Cdh1, por lo que el ciclo de síntesis y degradación de Cdh1 está estrechamente regulado en la célula [Kramer et al., 2000]. Cdh1 es marcado para degradación vía proteosoma por el propio complejo APC/C [Listovsky et al., 2004] y por otras E3 ubiquitinas ligasas como SCF [Benmaamar and Pagano, 2005].
A fin de estudiar si la mutación Asp187Gly influye en la estabilidad proteica de Cdh1, la línea celular HEK293T se trató con MG132 con el objetivo de inhibir el proteosoma, tal y como se ha descrito en el apartado de Materiales y Métodos. Como se observa en la figura 5, el tratamiento con el inhibidor favorece la acumulación de HA y Cdh1 en el caso de las células que expresan la condición mutada (HA-Cdh1mut) hasta niveles similares a los de la versión nativa de la proteína. La abundancia de ciclina B1 aumenta en las células que expresan la condición mutada (HA-Cdh1mut) y en las células HA-Cdh1 tratadas con MG132 en comparación con las células sin tratamiento. Por lo tanto, el complejo APC/C-Cdh1 marca a ciclina B1 por ubiquitinación para su posterior degradación, pero la proteína ciclina B1 no se degrada al estar bloqueado el proteosoma.
La equiparación de los niveles de HA en ambas condiciones tras el tratamiento con MG132 es un reflejo directo de lo que ocurre con la proteína expresada exógenamente, sin embargo, será necesario aumentar el número de repeticiones de este experimento en el futuro. Con ello en mente, podemos sugerir que la mutación Asp187Gly promueve la degradación del cofactor Cdh1.
26 Además de los niveles de Cdh1, su regulación espacial es imprescindible para la correcta actividad del complejo APC-C [Almeida, 2012]. Así, la fosforilación de la proteína Cdh1 induce su exportación nuclear y su acumulación en el citosol, lo que contribuye a la inactivación de APC/C‐Cdh1 [Maestre et al., 2008; Jaquenoud et al., 2002]. Además, se promueve la inestabilidad proteica de Cdh1 al forzar su acumulación en el núcleo, donde es susceptible de ser marcado para la degradación por las E3 ubiquitinas ligasas anteriormente mencionadas [Nagai et al., 2018; Listovsky et al., 2004].
Figura 5. La mutación Asp187Gly afecta a la estabilidad de la proteína Cdh1. A. Imagen de transferencia de tipo western blot de la abundancia de las proteínas ciclina B1 (55 kDa), HA (55 kDa), Cdh1 (55 kDa) y GAPDH (37 kDa) en las células HA-Cdh1mut y HA-Cdh1 tratadas con MG132 (20 µM durante 2 horas) en comparación con las células sin tratamiento. B. Cuantificación de la cantidad relativa de Cdh1 frente a GAPDH. C. Cuantificación de la cantidad relativa de HA frente a GAPDH. D.
Cuantificación de la cantidad relativa de ciclina B1 frente a GAPDH. Los datos muestras los resultados de un único experimento.
27 Trabajos previos apuntan a un diferente patrón de distribución subcelular del cofactor Cdh1 portador de la mutación Asp187Gly [Rodríguez et al., 2019]. Para corroborar esta afirmación, realizamos la detección de la proteína in situ mediante inmunocitoquímica y, además, estudiamos la abundancia de la proteína en extractos citosólicos y nucleares mediante transferencia de tipo western blot.
Para las inmunocitoquímicas, tal y como se menciona en el apartado de Materiales y Métodos, realizamos marcaje frente a HA que nos permitió visualizar la distribución subcelular de Cdh1, frente a tubulina (marcador citoplasmático) y utilizamos 4′,6- Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI) como marcador nuclear. A continuación, se adquirieron imágenes con el microscopio spinning disk.
Figura 6. La mutación Asp187Gly de Cdh1 condiciona la localización subcelular de la proteína Cdh1. A. Imágenes representativas de microscopía confocal de células HEK293T que expresan HA- Cdh1 y HA-Cdh1mut, tras tinción con el marcador citoplasmático tubulina (rojo), HA (verde) y el marcador nuclear DAPI (azul). B. Cuantificación de la distribución de Cdh1 en los compartimentos subcelulares expresados como cociente de la intensidad media de fluorescencia de HA en núcleo dividido por la intensidad media de fluorescencia de HA en citoplasma. Barra de escala: 25 µm. Los datos se muestran como medias ± S.E.M de 2 cultivos independientes. *p < 0.05 vs HA-Cdh1 (Prueba t de Student).
28 Valores mayores de 1 en el ratio nuclear/citosólico de Cdh1 indican una localización predominantemente nuclear de la proteína, como ocurre en la condición mutante (HA- Cdh1mut), tal y como se muestra en la figura 6. Valores menores de 1 corresponden con una distribución más citoplasmática, como se observa en las células que expresan la variante wild type de la proteína (HA-Cdh1), dónde la proteína Cdh1 está presente tanto en el citosol como en el núcleo.
El análisis estadístico de los resultados obtenidos determinó que la localización subcelular de la proteína Cdh1 era significativamente diferente entre las células HA- Cdh1mut y HA-Cdh1 (Figura 6B), de manera que la forma mutada se acumula en el núcleo.
Por otro lado, analizamos la distribución de Cdh1 en los diferentes compartimentos celulares tras un protocolo de fraccionamiento subcelular mediante centrifugación diferencial, como viene detallado en el apartado de Materiales y Métodos. Tal y como se observa en la figura 7, el ratio núcleo/citosol es mayor en el caso de la forma mutante (HA-Cdh1mut), es decir, confirmamos que la proteína se acumula preferentemente en el núcleo de las células.
Estos resultados demuestran que la mutación Asp187Gly de Cdh1 determina una diferente localización subcelular del cofactor Cdh1. Una mayor distribución nuclear de la proteína HA-Cdh1mut es compatible con una mayor exposición al proceso de ubiquitinación por las E3 ubiquitinas ligasas, APC/C [Listovsky et al., 2004] y SCF [Nagai et al., 2018; Fukushima et al., 2013; Benmaamar and Pagano, 2005], lo cual supondría una mayor degradación de la proteína vía proteosoma, como hemos observado en nuestros experimentos preliminares (Figura 5). Por lo tanto, la diferente localización subcelular podría estar determinando los niveles de expresión más bajos de la proteína Cdh1 en la variante mutada.
