UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRÉS FACULTAD DE AGRONOMÍA
CARRERA DE INGENIERÍA EN PRODUCCIÓN Y COMERCIALIZACIÓN AGROPECUARIA
TESIS DE GRADO
ESTABLECIMIENTO Y MULTIPLICACIÓN DE 10 VARIEDADES NATIVAS DE PAPA (Solanum spp) A PARTIR DE YEMAS
BROTADAS EN CONDICIONES IN VITRO
PRESENTADO POR:
LIDIA GUTIERREZ COPA
La Paz – Bolivia 2021
I
UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRÉS FACULTAD DE AGRONOMÍA
CARRERA DE INGENIERÍA EN PRODUCCIÓN Y COMERCIALIZACIÓN AGROPECUARIA
ESTABLECIMIENTO Y MULTIPLICACIÓN DE 10 VARIEDADES NATIVAS DE PAPA (Solanum spp.) A PARTIR DE YEMAS BROTADAS
EN CONDICIONES IN VITRO
Tesis de Grado Presentado como Requisito principal para optar el Título de: Ingeniero en Producción y Comercialización Agropecuaria.
LIDIA GUTIERREZ COPA TUTORES:
Ing. M.Sc. JOSÉ EDUARDO OVIEDO FARFÁN ………
Ing. DELIA QUISPE FLORES ………
TRIBUNAL REVISOR:
Ing. M.Sc. RUBÉN JACOBO TRIGO RIVEROS ………
Ing. M.Sc. LUCIO RENE TITO VILLCA ………
Ing. M.Sc. JUAN JOSÉ VICENTE ROJAS ………
APROBADO
Presidente tribunal examinador: ………
La Paz – Bolivia 2021
II
DEDICATORIA
El presente trabajo investigativo lo dedico principalmente a Dios, por ser el inspirador y darme fuerza para continuar en este proceso de obtener uno de los anhelos más deseados.
A mi mamá, Elsa Copa por su amor, trabajo y sacrificio brindado, dándome a cada instante una palabra de aliento para llegar a culminar uno de mis objetivos gracias a ti he logrado llegar hasta aquí.
Más a mis Abuelitos; Nicacio Copa (†) y Melchora Tarqui fueron y son las personas después de mi madre quienes me vieron crecer. Sus canas son sinónimo de sabiduría. Quienes me encaminaron por el buen sendero, gracias abuelito Nicacio.
A mis hermanitos, Wara y Ariel por su cariño y apoyo. A toda mi familia; Mamá Elena, por haberme cuidado, apoyado incondicionalmente cuando más lo necesite.
Mis tíos German, Raúl y Lázaro porque con sus oraciones, consejos y palabras de aliento hicieron de mí una mejor persona, a Dennis por su apoyo y amor brindado hoy an permitido llegar a cumplir uno de mis sueños, siempre los llevare en mi corazón.
DIOS LOS BENDIGA A TODOS…
III
AGRADECIMIENTO
A Dios por darme un día más de vida, por guiarme a lo largo de mi existencia, por ser el apoyo y fortaleza en aquellos momentos de dificultad y de debilidad.
Expreso mi profundo agradecimiento: A la Carrera de Ingeniería en Producción y Comercialización Agropecuaria, Facultad de Agronomía de la Universidad Mayor de San Andrés, por abrirme sus puertas de esta casa de estudio, a los docentes por las enseñanzas y formación profesional impartida.
A el proyecto IDH “CONSERVACIÓN DE LA BIODIVERSIDAD PARA LA PRODUCCIÓN DE SEMILLA PREBASICA DE VARIEDADES NATIVAS DE PAPA, EN COMUNIDADES DE LAS PROVINCIAS MURILLO Y OMASUYOS DEL DEPARTAMENTO DE LA PAZ” por confiar en mi persona y haberme brindado este aporte de investigación a el Ing. M.Sc. José Eduardo Oviedo Farfán coordinador del proyecto a elIng.M.Sc. Rubén Jacobo Trigo Riveros co-coordinador del proyecto.
Un especial agradecimiento a mis asesores el Ing. M.Sc. José Eduardo Oviedo y la Ing. Delia Quispe de quien he recibido su valiosa orientación teórica, práctica y metodológica, así como el asesoramiento, sugerencia, revisión y corrección en la realización y redacción del presente documento.
Al Tribunal de Revisores: Ing. M.Sc. Rubén Jacobo Trigo Riveros, Ing. M.Sc. Juan José Vicente Rojas y el Ing. M.Sc. Lucio Rene Tito Villca por las observaciones, correcciones y sugerencias realizadas muchísimas gracias.
A toda mi familia Copa, en especial a: mi señora madre Elsa Copa a mis hermanitos Wara y Ariel por su cooperación y apoyo incondicional que me han brindado.
A mis amigos de Carrera, al Ing. Silvestre por colaborarme durante la elaboración de la tesis, muchísimas gracias por los consejos.
MUCHÍSIMAS GRACIAS...
IV
TABLA DE CONTENIDOS
ÍNDICE GENERAL……….… IV ÍNDICE DE FIGURA……….…. IX ÍNDICE DE TABLAS………..…… XI ÍNDICE DE ANEXOS………...…. XIII RESUMEN ……….… XIV
ÍNDICE GENERAL
1. INTRODUCCIÓN ... 1
1.1. Justificación ... 2
2. OBJETIVO ... 3
2.1. Objetivo General ... 3
2.2 Objetivos Específicos ... 3
3. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ... 4
3.1 Generalidades del cultivo de la papa ... 4
3.1.1. Origen de la papa ... 4
3.1.2. Importancia de los tubérculos ... 4
3.2 Descripción Botánica ... 5
3.2.1. Fases fonológicas del cultivo de la papa ... 6
3.3. Variedades nativas de papa ... 7
3.3.1. Taxonomía ... 9
3.4. Aspectos generales sobre Biotecnología Vegetal ... 9
3.4.1. Cultivo in vitro ... 9
3.4.2. Cultivo de órganos ... 10
3.4.3. Cultivo de ápices y meristemo ... 11
3.5. Técnica Estéril en Cultivo de Tejidos Vegetales ... 11
3.5.1. Tipos de contaminantes en el cultivo in vitro ... 12
3.5.2. Bacterias ... 12
3.5.3. Hongos ... 12
3.5.4. Oxidación ... 13
3.5.5. Ritketsias y fitoplasmas ... 13
3.5.6. Virus y viroides ... 13
3.5.7. Artrópodos ... 14
V
3.5.8. Vitrificación ... 14
3.6. Fuentes de contaminación ... 14
3.6.1. Material vegetal ... 14
3.6.2. Aire ... 15
3.6.3. Trabajador u operario ... 15
3.6.4. Técnica estéril ... 16
3.6.6. Indexación ... 17
3.7. Cultivo de meristemos ... 18
3.8. Ambiente estéril ... 18
3.9. Buenas prácticas de laboratorio ... 19
3.10. Edad fisiológica ... 20
3.10.1. Explante ... 20
3.10.2. Localización del explante ... 21
3.10.3. Tamaño del explante ... 21
3.11. Sistema de medio de cultivo ... 21
3.11.1. Medio de cultivo sólido ... 21
3.11.2. Medios de cultivo ... 22
3.5. Componentes de un medio ... 22
3.11.3. Agua ... 22
3.11.4. Destilación ... 23
3.11.5. Minerales ... 23
3.11.6. Compuestos orgánicos ... 23
3.11.7. Carbohidratos o fuentes energéticas... 23
3.11.8. Sacarosa... 24
3.11.9 . Vitaminas ... 24
3.12. Reguladores de crecimiento ... 24
3.13. Mecanismo de soporte ... 27
3.13.1. Estructura de la carragenina... 27
3.13.2. Propiedades físico químicas ... 27
3.13.3. Propiedad de Solubilidad ... 27
3.14. Condiciones ambientales para el cultivo in vitro ... 28
3.14.1. Luz, temperatura y humedad ... 28
3.14.2. pH – Metro ... 28
3.15. Micropropagación ... 29
3.15.1. Fase 0 Selección de materiales vegetales... 30
3.15.2. Fase I Establecimiento ... 30
3.15.3. Fase II Multiplicación ... 30
VI
3.15.4. Fase III Enraizamiento ... 31
3.15.5. Ventajas de la micropropagación menciona las siguientes ventajas que presenta la micropropagación in vitro. ... 32
3.15.6. Factores limitantes de la micropropagación ... 32
4. MATERIALES Y MÉTODOS ... 34
4.1. Ubicación del área de estudio ... 34
4.2. Materiales ... 34
4.2.3. Ambientes de trabajo ... 36
4.3. Metodología ... 37
4.3.3. Establecimiento y Multiplicación en condiciones in vitro ... 39
4.3.4. Periodo 0. Selección y tratamiento del material vegetal ... 39
4.3.5. Periodo 1. Preparación de Solución Stock y Medio de Cultivo... 40
4.3.6. Periodo 2. Introducción a condiciones in vitro y evaluación ... 41
4.3.7. Fase I Establecimiento análisis descriptivo ... 43
4.4. Factores de estudio ... 43
4.4.1. Variables de respuesta para la fase de establecimiento in vitro ... 44
4.5. Fase II Multiplicación de vitroplantas ... 44
4.5.1. Diseño experimental para 10 variedades nativas de papa en medios de cultivo sólidos y con distintos niveles de reguladores de crecimiento... 45
4.5.2. Modelo lineal aditivo ... 46
4.5.3. Factores de estudio para la fase Multiplicación ... 47
5. RESULTADOS Y DISCUSIONES ... 49
5.1. Resultados de la fase de establecimiento Análisis... 49
5.2. Porcentaje de supervivencia en explantes ... 49
5.3. Segunda Etapa: Fase II Multiplicación en variedades nativas de papa in vitro 58 5.3.1. Selección de los explantes a utilizar ... 58
5.4. Altura de vitroplanta ... 59
5.5. Análisis de varianza para altura de vitroplanta (cm) ... 60
5.5.1. Altura en variedades nativas de papa en la multiplicación ... 61
5.6. Número de hojas ... 68
5.6.1. Análisis de varianza para el número de hojas ... 68
5.6.2. Número de hojas en variedades nativas de papa ... 69
VII
5.7. Número de brotes ... 76 5.7.1. Análisis de varianza para número de brotes ... 76 5.7.2. Número de brotes en variedades nativas de papa en la multiplicación .. 77 6. CONCLUSIONES ... 86 7. RECOMENDACIONES... 88 8. BIBLIOGRAFÍA ... 89 ANEXOS
VIII
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Área de la investigación ... 34
Figura 2. Flujograma del procedimiento de la micropropagación in vitro ... 38
Figura 3. Variedades nativas de papa usadas en el experimento ... 39
Figura 4. Limpieza y Preparación de medio de cultivo………...…...40
Figura 5. Desinfeccion de explantes en establecimiento………41
Figura 6. Establecimiento de explantes en la cámara de flujo laminar……..……..42
Figura 7. Selección de explantes para la multiplicación ………..…..…...44
Figura 8. Porcentaje de supervivencia en tres diferentes tiempos de inmersión en hipoclorito de sodio. ... 50
Figura 9. Porcentaje de supervivencia en 10 variedades de papa …………...….51
Figura 10. Porcentaje de contaminación por hongos, bacterias y oxidación en los tratamientos en la fase de establecimiento. ... 52
Figura 11. Porcentaje de contaminación por hongos, bacterias y oxidación en variedades nativas de papa en la fase de establecimiento. ... 53
Figura 12. Altura de explante (cm) por tratamientos en fase de establecimiento. 55 Figura 13. Altura de explante (cm) en variedades nativas de papa en la fase de establecimiento. ... 56
Figura 14. Número de hojas en los tratamientos en la fase de establecimiento. . 57
Figura 15. Número de hojas en variedades nativas de papa en la fase de establecimiento. ... 58
Figura 16. Comparación de medias para la altura de vitroplanta (cm) en variedades nativas de papa en multiplicación. Duncan (α = 0,05). ... 61
Figura 17. Comparación de medias para la altura de vitroplantas (cm) en medios de cultivo multiplicación. Duncan (α = 0,05). ... 62
IX
Figura 18. Comparación de medias para la altura de vitroplanta (cm) en niveles de reguladores de crecimiento en multiplicación duncan (α = 0,05). ... 63 Figura 19. Análisis para altura de planta (cm) interacción de medio de cultivo en variedades nativas de papa. ... 65 Figura 20. Análisis de variable de respuesta para altura (cm) de las vitroplantas, interacción de niveles de reguladores de crecimiento en las variedades nativas de papa... 66 Figura 21. Análisis de variable de respuesta para altura (cm) de las vitroplantas, interacción de los niveles de reguladores de crecimiento en medios de cultivo. ... 67 Figura 22. Comparación de medias para número de hojas en variedades nativas de papa en multiplicación. Duncan (α = 0,05). ... 69 Figura 23. Comparación de medias para número de hojas en medios de cultivo en multiplicación. Duncan (α = 0,05). ... 70 Figura 24. Comparación de medias para la altura de explante (cm) en niveles de reguladores de crecimiento en multiplicación. Duncan (α = 0,05). ... 71 Figura 25. Análisis de variable de respuesta para el número de hojas de las vitroplantas, interacción de las variedades nativas de papa en medios de cultivo ms1 y ms2. ... 73 Figura 26. Análisis de variable de respuesta para el número de hojas de las vitroplantas, interacción de las variedades nativas de papa en niveles de reguladores de crecimiento. ... 74 Figura 27. Análisis de variable de respuesta para el número de hojas de las vitroplantas, interacción de niveles de reguladores de crecimiento en medios de cultivo. ... 75 Figura 28. Comparación de medias para número de brotes en variedades nativas de papa en multiplicación. Duncan (α = 0,05). ... 78 Figura 29. Comparación de medias para número de brotes en medios de cultivo en multiplicación. Duncan (α = 0,05). ... 79 Figura 30. Comparación de medias para el número de brotes en niveles de reguladores de crecimiento en multiplicación. Duncan (α = 0,05). ... 80
X
Figura 31. Análisis de variable de respuesta para el número de brotes de las vitroplantas, interacción de las variedades nativas de papa en medio de cultivo.
Figura 32. Análisis de variable de respuesta para el número de brotes de las vitroplantas, interacción de las variedades nativas de papa en niveles de reguladores de crecimiento. ... 84 Figura 33. Análisis de variable de respuesta para el número de brotes de las vitroplantas, interacción de niveles de reguladores de crecimiento en medio de cultivo ms1 y ms2. ... 85
XI
ÍNDICE DE TABLAS
. Material de gabinete ... 34
. Material biologico ... 35
. Materiales de trabajo y equipos ... 35
. Material de vidrio y metal ... 35
Tabla 5. Reactivos y medios de cultivos ... 36
Tabla 6. Indumentaria y material de asepsia ... 36
Tabla 7. Distribución de tratamientos en la fase de establecimiento. ... 43
Tabla 9. Distribución de tratamiento en la fase de multiplicación ... 47
Tabla 10. Porcentaje de supervivencia evaluada en el estudio de identificación de explantes en la fase de establecimiento ... 49
Tabla 12. Porcentaje de contaminación, hongos, bacterias y oxidación evaluados en el estudio de identificación de explantes fase de establecimiento. ... 51
Tabla 13. Promedio de altura de explante (cm) evaluadas en el estudio de identificación en fase de establecimiento. ... 54
Tabla 14. Número de hojas por explante evaluadas en el estudio de identificación en la fase de establecimiento. ... 57
Tabla 15. Supervivencia evaluada en el estudio de identificación de vitroplanta fase de multiplicación. ... 59
Tabla 16. Análisis de anva para la variable dependiente altura (cm) evaluados en el estudio de la fase de multiplicación. ... 60
Tabla 17. Análisis de efecto simples para la interacción medio de cultivo por variedades nativas de papa. ... 64
Tabla 18. Análisis de efecto simples para la interacción de niveles de reguladores de crecimiento por variedades nativas de papa. ... 65
XII
Tabla 19. Análisis de efecto simples para la interacción de niveles de reguladores de crecimiento por medio de cultivo ... 67 Tabla 20. Análisis de anva para el variable dependiente número de hojas evaluados en el estudio de la fase de multiplicación. ... 68 Tabla 21. Análisis de efecto simples para la interacción medio de cultivo por variedades nativas de papa. ... 72 Tabla 22. Análisis de efecto simples para la interacción niveles de reguladores de crecimiento por variedades nativas de papa. ... 73 Tabla 23. Análisis de efecto simples para la interacción niveles de reguladores de crecimiento por medio de cultivo ... 75 Tabla 24. Análisis de anva para el variable dependiente número de brotes evaluados en el estudio de la fase de multiplicación. ... 76 Tabla 24. Análisis de efecto simples para medio de cultivo en variedades nativas de papa... 81 Tabla 25. Análisis de efecto simples para la interacciona de niveles de reguladores de crecimiento en variedades nativas de papa. ... 83 Tabla 26. Análisis de efecto simples para la interacción de niveles de reguladores de crecimiento en medio de cultivo ... 84
XIII
ÍNDICE DE ANEXOS
. Materiales y equipos de laboratorio ... 1
Preparación de la soluciones stock………..2
Comparación de medias para altura de vitroplantas en variedades nativas de papa, medio de cultivo y reguladores de crecimiento. ... 3
Comparación de medias para número de hojas de vitroplantas en variedades nativas de papa, medio de cultivo y reguladores de crecimiento. ... 3
Comparación de medias para número de brotes de vitroplantas en variedades nativas de papa, medio de cultivo y reguladores de crecimiento. ... 4
Cuadro de interacciones para altura (cm)... 5
. Cuadro de interacciones para número de hojas. ... 5
. Cuadro de interacciones para número de brotes. ... 6
Anexo 9. Datos generales en la fase de multiplicación para las variables altura de planta (cm), numero de hojas y numero de brotes ... 8
Anexo 10. Equipos e instrumentos utilizados en laboratorio de cultivo de tejidos vegetales. ... 9
Anexo 11.Desarrollo de las vitroplantas de acuerdo a estado y variedad de papa listas para la fase de multiplicación. ... 11
Anexo 12. Toma de datos para los tres tratamientos en la fase de multiplicación en medio de cultivo 2. ... 12
Anexo 13. Toma de datos para los tres tratamientos en la fase de multiplicación en medio de cultivo 1 ... 13
Anexo 14. Procedimiento de la micropropagacion invitro en variedades nativas de papa... 14
XIV
RESUMEN
La biotecnología vegetal es una herramienta que nos ayuda a obtener mayor rendimiento del cultivo de papa. A través de técnicas de cultivo in vitro o cultivos de tejidos vegetales, que puede garantizar la seguridad y soberanía alimentaria, pues esta técnica de cultivo de tejidos vegetales, ofrece cultivar explantes pequeños de la planta en frascos de vidrio donde se obtiene plantas homogéneas, en mayor cantidad, libres de patógenos, en ambientes controlados bajo diferentes etapas obteniendo clones mejorados.
El objetivo de la Tesis fue optimizar los tiempos de desinfección en la fase de establecimiento, niveles de concentración de reguladores de crecimiento y medio de cultivo en la fase de multiplicación en 10 variedades nativas de papa (Solanum spp.) a partir de yemas brotadas en condiciones in vitro, Se evaluó las siguientes variables: Porcentaje de supervivencia, contaminación, altura de planta, número de hojas y número de brotes.
Para la fase de establecimiento, se evaluaron tres diferentes tiempos de inmersión de 10, 14 y 18 min en hipoclorito de sodio donde se cultivaron durante 21 días con tres evaluaciones en un medio de cultivo MS (Murashige y Skoog.; 1962), se observó que el tiempo óptimo de inmersión fue durante 10 min al 3% de hipoclorito de sodio y alcohol durante 1 min al 70% (v/v).
Para la fase de multiplicación, se evaluaron tres diferentes concentraciones de reguladores de crecimiento de Ácido giberélico (AG3) y Ácido indol-acético (AIA) durante 30 días con tres evaluaciones en un medio de cultivo b1 (MS1) y b2 (MS2), se estableció que las concentraciones adecuadas fueron para la variable altura de planta, resultó la c1 (AG3-0,5 mg/l y AIA 0,01 mg/l) y el medio de cultivo MS2, para la variable número de hojas, resultó la c3 (AG3 0,1 mg/l y AIA 0,03 mg/l) y el medio de cultivo MS2 y para la variable número de brotes resulto la c2 (AG3 0,3 mg/l y AIA 0,02 mg/l) y el medio de cultivo MS1.
XV
SUMMARY
Plant biotechnology is a tool that helps us obtain higher yields from potato crops.
Through in vitro culture techniques or plant tissue cultures, which can guarantee food security and sovereignty, since this plant tissue culture technique offers to grow small plant explants in glass jars where homogeneous plants are obtained, in greater quantity, free of pathogens, in controlled environments under different stages obtaining improved clones.
The objective of the Thesis was to optimize disinfection times in the establishment phase, concentration levels of growth regulators and culture medium in the multiplication phase in 10 native potato varieties (Solanum spp.) From sprouting buds in In vitro conditions, the following variables were evaluated: Percentage of survival, contamination, plant height, number of leaves and number of shoots.
For the establishment phase, three different immersion times of 10, 14 and 18 min in sodium hypochlorite were evaluated where they were cultured for 21 days with three evaluations in a MS culture medium (Murashige and Skoog.; 1962), it was observed that the optimal immersion time was for 10 min at 3% sodium hypochlorite and alcohol for 1 min at 70% (v/v).
For the multiplication phase, three different concentrations of growth regulators of Gibberellic Acid (AG3) and Indole-Acetic Acid (IAA) were evaluated for 30 days with three evaluations in a culture medium (MS1 and MS2), it was established that the Adequate concentrations were for the variable plant height, the C1 was AG3-0.5 mg/l and IAA 0.01 mg/l and the culture medium MS2, for the variable number of leaves, the C3 was AG3 0.1 mg/l and AIA 0.03 mg/l and the MS2 culture medium and for the variable number of shoots, the C2 of AG3 0.3 mg/l and AIA 0.02 mg/l and the MS1 culture medium result
1 1. INTRODUCCIÓN
Bolivia hace más de 8.000 años forma parte del genocentro andino de origen y domesticación del cultivo de papa. Hoy en día, en la región Andina aún existe una amplia diversidad de cultivares nativos concentrados en microcentros de biodiversidad, mantenidos por familias campesinas conservacionistas. “Algunos de estos microcentros están localizados en la zona de Colomi (Cochabamba), en Llallagua (Norte de Potosí) y en el Altiplano (Norte de La Paz) (TUMIRI, 2013).
La papa es el cuarto alimento básico en el mundo después del arroz, el trigo y el maíz.
La producción mundial de papa se incrementó desde 276.311.694 toneladas métricas (Tm) en el año 1989 a 321.974.152 Tm en el 2005, lo cual significó un crecimiento promedio anual del 0,96 %. La mejora de los rendimientos explica los aumentos de la producción mundial, dado que la superficie permaneció estable.
La papa no solo brinda una alternativa económica sino también una fuente sana de alimento, por su alto valor nutricional para la población boliviana. En Bolivia se utiliza solo el 3 % de semilla certificada de papa para la producción. Esto indica que la semilla de papa es muy importante para la producción e incremento del rendimiento. Una alternativa para producir semilla pre-básica de papa de alta calidad fitosanitaria es a través de las técnicas de propagación in vitro que facilita la producción masiva en un espacio reducido y corto tiempo. El siguiente trabajo tiene por objetivo evaluar los tiempos de inmersión en la fase establecimiento y concentraciones de reguladores de crecimiento en la fase de multiplicación (HURTADO, 2006).
Los resultados alcanzados en el desarrollo de las investigaciones biotecnológicas han demostrado que estas nuevas herramientas ofrecen oportunidades para elevar la producción agrícola y mejorar el nivel de vida del agricultor, obteniendo plantas garantizadas con alta calidad genética y especialmente libre de patógenos contaminantes (Espinoza, 2013).
2
El cultivo de tejidos vegetales es una importante técnica relativamente nueva. Pero no es ampliamente usada debido a su poca difusión e inversión que debe realizarse. Esta técnica debe tener mayor investigación e integrar progresivamente el trabajo del agricultor (Quispe D. N., 2009).
Por lo expuesto, el siguiente trabajo como propósito optimizar los tiempos de inmersión en hipoclorito de sodio en la fase de establecimiento. Concentraciones de reguladores de crecimiento de AG3 y AIA en medios de cultivos MS1 y MS2 durante la fase de multiplicación in vitro en variedades nativas de papa Luk´y, Qhoyllu, Ch´oqhepitu, Surimana, Allqa ajahuiri, Sapallu, Janq´u phiñu, Ch´iyara Imilla, Qhaty y Saq´ampaya negra.
1.1. Justificación
En el país son pocas las instituciones que trabajan con técnicas de cultivo de tejidos in vitro.
En la ciudad de Cochabamba se encuentra Sepa es una Empresa Mixta líder en la producción semilla de papa, cuya visión es asegurar el abastecimiento sostenible de semilla de papa de categorías altas en el ámbito nacional, contribuyendo a la seguridad y soberanía alimentaria del sector papero, trabajando en alianza con agricultores Semilleristas, con capacidad de atender eficientemente y competitivamente los requerimientos del mercado nacional e internacional tiene una producción promedio anual de 322.000 plántulas in vitro en laboratorio.
Entre las aplicaciones de la biotecnología vegetal los cultivos Andinos destacan el uso del cultivo in vitro de yemas y meristemos caulinares para la micropropagación, conservación y distribución de recursos genéticos de raíces y tubérculos (ANGEL MUJICA, 2002).
A partir del material in vitro se obtendrá semilla pre-básica de papa. Atendiendo así las demandas de los agricultores semilleros encargados de cultivar estas especies nativas y asegurando de esta manera la cadena de producción.
Es oportuno mantener un acceso ágil a los bancos de germoplasma para que el material vegetativo pueda ser producido por o con la comunidad agrícola apoyando la selección dirigida a problemas específicos del lugar, entre otros: respuesta a
3
condiciones de baja fertilidad, resistencia a enfermedades locales, resistencia a condiciones ambientales estresantes como calor, frío o falta de humedad, tolerancia a pestes del lugar, selección de líneas con elevado contenido de nutrientes tales como proteínas y evaluación por facilidad de cocción. Estos esfuerzos de largo plazo deben contar con investigadores comprometidos e integrados en un programa con objetivos comunes (Izquierdo, 1995).
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo General
- Optimizar los tiempos de desinfección en la fase de establecimiento, niveles de concentración de reguladores de crecimiento y medios de cultivo en la fase de multiplicación en 10 variedades nativas de papa (Solanum spp.) a partir de yemas brotadas en condiciones in vitro.
2.2 Objetivos Específicos
- Evaluar el tiempo óptimo de desinfección con Hipoclorito de Sodio, que estimule los explantes en la fase de Establecimiento.
- Evaluar los efectos de niveles de concentración de AG3 y AIA que estimulen las vitroplantas en la fase de Multiplicación.
- Determinar el efecto del medio de cultivo (MS1 Y MS2) durante la fase de multiplicación.
4 3. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
3.1 Generalidades del cultivo de la papa
Las papas nativas o indígenas (Solanum ssp.), son aquellas que han sido generados por los antiguos agricultores; son el resultado de la selección realizada por los productores desde los inicios de la agricultura. En las comunidades campesinas se siembran mezcladas en áreas de producción ubicados por encima de 3 200 msnm; el cual es una excelente manera de reducir la diseminación de plagas o enfermedades y una adecuada estrategia para asegurar la producción de alimentos en caso ocurriera accidentes ambientales como sequía, heladas, etc. Este tipo de aprovechamiento ha permitido la valorización y la conservación de las papas nativas por sus características muy peculiares de forma, color y sabor debido a su diversidad genética (GUTIERREZ, 2016)
3.1.1. Origen de la papa
En el altiplano entre Perú y Bolivia, alrededor del Lago Titicaca, se encuentra la mayor variabilidad genética de especies silvestres y variedades cultivadas de papa, la cual fue domesticada hace unos 10.000 aňos por la mujer cuando el hombre se dedicaba a la caza y a la pesca (GABRIEL, 2010)
La papa patata, de nombre científico Solanum tuberosum, pertenece a la familia solanáceae, tiene una antigüedad de 8000 años y fue domesticada por pobladores de Perú que vivían en la proximidades de lago Titicaca, el más alto del mundo, en la frontera con Bolivia, (Lizzeth, 1997)
3.1.2. Importancia de los tubérculos
Las papas son buena fuente de micro nutrientes, también contiene antioxidantes alimenticios que pueden contribuir a prevenir enfermedades. En Bolivia, la papa es importante por varias razones: a) por su diversidad genética; b) por su importancia como alimento; c) por su papel cultural; y d) por su papel en la generación de ingresos (Quispe D. G., 2016).
La región de los Andes es la cuna de la papa y se caracteriza por la presencia de una gran variedad de papas. En Bolivia se ha identificado unas 725 variedades. En toda el
5
área Andina se ha identificado unos 3000 cultivares con características propias estimado que el 75% corresponden al tipo “nativas comerciales”, el 11% al tipo
“holandés” y 14% al tipo “nativa” (Wiliam Garcia, 2003).
3.2 Descripción Botánica
Menciona que la papa es una dicotiledónea herbácea, tiene un hábito de crecimiento rastrero o erecto; los tubérculos son de tallos carnosos originándose del extremo del estolón con ojos y yemas, su follaje alcanza una altura aproximada de 0.60 a 1.50 m, las hojas son compuestas y pinnadas, el fruto es de tipo baya tiene forma redonda u ovalada de tamaño pequeño y carnoso que tiene semillas sexuales, posee un color verde amarillento o castaño rojizo (Huaman, 2018).
La papa es una planta herbácea, suculenta que presenta tubérculos (tallos subterráneos), que se desarrollan al final de los estolones que nacen del tallo principal;
los tallos aéreos son de sección angular y entre las axilas de las hojas y los tallos se forman ramificaciones secundarias con tres a seis tallos por planta.
Las hojas son alternas, de color verde claro, verde y verde oscuro, haz y envés poco pubescente; presentando las primeras hojas simples, posteriormente presenta hojas compuestas, imparipinadas con tres a cuatro pares de hojuelas laterales y una hojuela terminal (jeiner, 2017).
El fruto es una baya bilocular de 15-30 mm de diámetro, el color es verde amarillento y cada fruto contiene 200 semillas aproximadamente. El tubérculo de la papa es un tallo subterráneo ensanchado con diferentes colores de acuerdo a la variedad. La papa tiene ojos superficiales, semi profundas y profundas con una dormancia de 120 días aproximado las raíces presentan un desarrollo en verticilo en los nudos del tallo principal, su primer crecimiento es vertical dentro de la capa de suelo arable, posteriormente se presenta un crecimiento horizontal de 25 a 50 cm., la papa tiene un sistema radicular fibroso muy ramificado. La inflorescencia es cimosa, presentando flores hermafroditas, tetracíclicas, pentámeras, con cáliz gamosépalo lobulado, con corola rotácea pentalobulada de 7 color blanco a púrpura, con cinco estambres, cada
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estambre posee dos anteras de color amarillo pálido, amarillo fuerte o anaranjada, gineceo con ovario bilocular (Rivera, 2018).
Los tubérculos se hallan engrosados y están adaptados para almacenar los nutrientes.
Presenta hojas compuestas de 7 a 9 foliolos, de forma lanceolada. La flor es de color lila con rojo morado, las flores tienen de 3 a 4 cm de diámetro, con cinco pétalos. El fruto es una baya, con un diámetro de 1 y 3 cm. Presentan semillas pequeñas, aplanadas de forma arriñonada (Morante, 2012).
3.2.1. Fases fonológicas del cultivo de la papa
La papa, es una planta herbácea; de habito: erecto, semirrecto y postrado; su reproducción es sexual (semilla verdadera) y asexual (tubérculos). En el primer caso, es una planta anual, y como agámica, es considerada perenne potencial debido a su capacidad de reproducirse vegetativamente por medio de tubérculos, que la papa es una planta suculenta, herbácea y anual por su parte aérea y perenne por sus tubérculos (tallos subterráneos) que se desarrollan al final de los estolones que nacen del tallo principal. Posee un tallo principal y a veces varios tallos, según el número de yemas que hayan brotado del tubérculo. Los tallos son de sección angular, y en las axilas de las hojas con los tallos de forman ramificaciones secundarias. La papa trascurre por las siguientes fases fenológicas: brotación, emergencia, estolonización, floración, tuberización, madurez (Huaman, 2018)
Brotación: El tubérculo-semilla de la papa, antes de la siembra produce brotes que indica el estado fisiológico apropiado para la plantación; el estado fisiológico determina el rendimiento y el período vegetativo del cultivo de la papa (Huaman, 2018).
Emergencia: La emergencia es cuando la planta ha emergido del suelo, sucede a partir de los 30 a 40 días de la siembra del cultivo de la papa; la semilla asexual tiene un periodo de reposo o dormancia de 2 a 3 meses y la semilla sexual de 4 a 6 meses aproximadamente (Huaman, 2018).
Estolonización: La estolonización es cuando las yemas de la parte subterránea de los tallos inician su crecimiento horizontal, ocurre a partir de los 15 a 20 días de la emergencia del cultivo de la papa (Huaman, 2018).
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Floración: La floración es cuando la corola en la primera flor de la inflorescencia se abre totalmente, sucede a partir de los 20 a 25 días de emergencia; la última flor inicia su marchitamiento y secado esto ocurre a partir de los 55 a 85 días de la emergencia del cultivo de la papa (Huaman, 2018).
Tuberización: La tuberización es el agrandamiento o hinchamiento extremo de los estolones son tallos subterráneos en su extremo distal, ocurre a partir de los 35 a 40 días de la emergencia del cultivo de la papa. Madurez La madurez fisiológica sucede a partir de los 135 a 145 días después de la siembra (Huaman, 2018).
3.3. Variedades nativas de papa
La papa puede ser clasificada por niveles de ploidía, que es el número de juegos (x) de cromosomas presentes en la célula vegetativa (somática). Las células vegetativas normalmente contienen como mínimo dos juegos de cromosomas, que constan de 12 cromosomas, es decir; x=12. Las células somáticas de las especies cultivadas de papa pueden variar entre el nivel diploide y pentaploide. La expresión 2n simboliza el número total de juegos de cromosomas en las células vegetativas y en consecuencia el número total de cromosomas en cualquier nivel de ploidía.
Afirma que la papa cultivada está constituida por ocho especies:
Diploides (2n): S. ajanhuiri; S. goniocalyx; S. phureja y S. stenotomun.
Triploides (3n): S. chaucha y S. juzepczukii (AMARGA).
Tretraploides (4n): S. tuberosum; ssp tuberosum y ssp andigena.
Pentaploides (5n): S. curtilobum (AMARGA).
La caracterización de las variedades empleadas en el trabajo de investigación son las siguientes según las especies mencionadas (Arcos, 2002).
Qhoyllu: Especie: (Solanum tuberosum ssp. Andigena) Características Morfológicas:
el color de la flor es celeste la forma del tubérculo es elíptica aplanada, con ojos superficiales el color de la piel es amarillo con áreas de color morado el color de la pulpa morado con blanco (Ceballos et al, 2008)
Luk´y: Especie: (Solanum juzepezukii) Características Morfológicas: el color de la flor es blanco noradola forma del tubérculo es alargado y falcado como herraduras, con
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ojos superficiales el color de la piel es amarillo y color de la pulpa es amarillo claro (Ugarte & Iriarte, 2020).
Ch´oqhepitu: Especie: (Solanum cortilobum) Características Morfológicas: el color de la flor es morado la forma del tubérculo es oblongo-plana, con ojos medio profundos el color de la piel es blanco crema palido el color de la pulpa es crema con áreas morados (Ugarte & Iriarte, 2020).
Surimana: Especie: (Solanum stenotum) Características Morfológicas: el color de la flor es morado la forma del tubérculo es oblongo-alargado y fusiforme, con ojos profundos el color de la piel es amarillo con áreas de color negro el color de la pulpa es crema (Ugarte & Iriarte, 2020).
Allqa ajahuiri: Especie: (Solanum x ajahuiri) Características Morfológicas: el color de la flor es violeta claro la forma del tubérculo es eliptico, con ojos profundos el color de la piel es morado intenso con algunas manchas dispersad de color crema el color de la pulpa es crema (Ugarte & Iriarte, 2020).
Jank´u phinu: Especie: (Solanum tuberosum ssp. andigena) Características Morfológicas: el color de la flor es morado claro la forma del tubérculo es comprimida con profundidad de medios ojos, color de la piel es blanco crema el color de la pulpa es amarillo claro (Ceballos et al, 2008).
Sapallu: Especie: (Solanum goniocalyx) Características Morfológicas: el color de la flor es blanco claro la forma del tubérculo comprimida tuberisada, con ojos profundos el color de la piel es semi anaranjado el color de la pulpa es amarillo intenso (Ceballos et al, 2008).
Ch´iyara imilla: Especie: Solanum tuberosum ssp. andigena Características Morfológicas: el color de la flor es morado del tubérculo es redondeada, con ojos profundos el color de la piel es morado oscuro el color de la pulpa es blanco (Ceballos et al, 2008).
Qhaty: Especie: (Solanum tuberosum ssp. andigena) Características Morfológicas: el color de la flor es blanca del tubérculo es alargada, con ojos semi profundos el color de la piel es rodado pardo el color de la pulpa es blanca crema (Ugarte & Iriarte, 2020).
Saq´ampaya negra: Especie: (Solanum tuberosum ssp. andigena) Características Morfológicas: el color de la flor es lila la forma del tubérculo es redonda, con ojos
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profundos el color de la piel es moradas intenso el color de la pulpa es amarillo claro con morado (Ugarte & Iriarte, 2020).
3.3.1. Taxonomía
Clasifica taxonómicamente a la papa nativa de la siguiente manera:
División : Magnoliophyta Clase : Magnoliopsida Subclase : Asteridae Orden : Solanales Familia : Solanaceae Género : Solanum Especie : S. tuberosum 3.4. Aspectos generales sobre Biotecnología Vegetal
La Biotecnología, es el área de las ciencias biológicas y la tecnología que utiliza organismos vivos o algunas de sus partes constituyentes para el incremento de la producción de alimentos y otros productos que beneficien al hombre (IBTEN, 2006).
La “biotecnología es la aplicación de organismos vivientes para el desarrollo de nuevos productos” y la Biotecnología de Plantas o vegetal es la adición de rasgos selectos a plantas, para el desarrollo de nuevas variedades (Espinoza, 2013).
La biotecnología vegetal considerada como el área de la ciencia y la tecnología que utiliza organismos vivos o algunas partes constituyentes para generar organismos modificados o productos derivados con utilidad clínica, alimentaria o industrial (Espinoza, 2013).
3.4.1. Cultivo in vitro
Las biotecnologías, utilizan bacterias, hongos, células animales y vegetales de cultivo
“in vitro” cuyo metabolismo está orientado a la producción de substancias específicas (IBTEN, 2006).
El cultivo in vitro es considerado sinónimo de “Cultivo de tejidos” siendo una herramienta de la biotecnología que permite el uso de un conjunto de técnicas que establecen el cultivo en condiciones asépticas, usando como material de partida, órganos, tejidos, células, etc. Empleando medios nutritivos artificiales (Espinoza, 2013).
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El cultivo de tejidos vegetales es una herramienta para la investigación, multiplicación y mejoramiento de las plantas, en relación con otras áreas como la fisiología, bioquímica, morfogénesis, anatomía y otras, así como contribuciones prácticas en la multiplicación y mejoramiento de plantas (Murillo, 2014).
El desarrollo de las diferentes vías del cultivo de tejidos se basa en la capacidad de las células vegetales para regenerar una planta completa idéntica a la original. Esto permite obtener numerosos cambios fisiológicos, genéticos y morfológicos mediante el empleo de reguladores de crecimiento, como auxina, citoquinina, giberelinas y poliaminas, los cuales originan una serie de reacciones en las células vegetales que alteran procesos metabólicos y posibilitan obtener resultados de interés en el área de la biotecnología vegetal (Murillo, 2014).
Los métodos de propagación vegetativa en función del tejido que se ponga en el cultivo se pueden clasificar en:
Cultivo de plantas intactas: siembra de una semilla in vitro, obteniéndose primero una plántula y finalmente una planta.
Cultivo de embriones: cultivo de embriones aislados después de retirar el resto de los tejidos de la semilla.
Cultivo de células: aisladas de un tejido, un callo o un tejido en suspensión, obtenidas con la ayuda de enzimas o mecánicamente.
Cultivo de callo: cultivo de tejido des diferenciado in vitro formándose órganos adventicios o embriones somáticos.
3.4.2. Cultivo de órganos
Este método fue uno de los primeros en poner en práctica, consiste en emplear explantes provenientes de raíces, tallos, hojas, embriones, anteras, meristemos y otros. Entre los mencionados el cultivo de anteras, de embriones y de meristemos son muy importantes porque tienen una utilización frecuente en la propagación y mejoramiento genético (Caillante, 2017).
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Como su nombre indica, el objetivo es la producción del mayor número posible de propágalos a partir del brote establecidos. Para esto se induce la proliferación de brote los cuales son separados en condiciones estériles y cultivadas nuevamente en medio fresco para inducir nuevos brotes, operación que se repite hasta lograr la cantidad de plantas deseadas (Alcazar, 2018).
3.4.3. Cultivo de ápices y meristemo
El cultivo aséptico de ápices y meristemos da la formación de una plántula y posteriormente la inducción de brotes axilares. Este procedimiento constituye la base de la mayoría de los métodos de propagación de in vitro por vía organogénesis propagación in vitro (Acarapi, 2014).
La técnica de cultivo de meristemos es empleada para la obtención de plantas libres de patógenos y se fundamenta en el hecho de que la distribución de microorganismos como los virus, bacterias, micro plasmas y otros en los tejidos de la planta infectada no es uniforme y su concentración tiende a disminuir progresivamente hacia el ápice del tallo, por tanto las posibilidades de que las células del meristemo se encuentren mayor número de partículas o estén libres estas son mayores que en los tejidos más diferenciados de la planta (Espinoza, 2013).
3.5. Técnica Estéril en Cultivo de Tejidos Vegetales
La asepsia es una condición necesaria para el éxito del establecimiento y desarrollo de los cultivos vegetales en condiciones in vitro.
Las condiciones del ambiente en el que se encuentran los cultivos, como son los altos niveles de humedad relativa dentro del recipiente, fácil disponibilidad de nutrientes en el medio, ausencia de agentes de agentes antológicos y falta de aireación, favorecen el crecimiento rápido de cualquier inocula microbiano: por esta razón, la presencia de una mínima cantidad de agentes contaminantes puede terminar causando la pérdida parcial o total del tejido vegetal cultivado (Suàrez E. P., 2020).
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3.5.1. Tipos de contaminantes en el cultivo in vitro
Las plantas en su condición de crecimiento natural tienen asociadas un fauna y flora microbiana con la cual interactúan sin verse afectado su desarrollo; por el contrario.
Algunos microbios, dentro de los que se encuentran ciertas bacterias, actúan como agentes endófitos benéficos asociados al sistema vascular de la planta. Sin embargo, en condiciones de cultivo in vitro, estos microbios se convierten en contaminantes o agentes facilitadores de contaminación para los explantes (Suàrez E. P., 2020).
Dentro de los organismos contaminantes más comúnmente asociados con los cultivos in vitro se encuentran las bacterias, los hongos, los virus, rickettsias y fitoplasmas y algunos artrópodos (Cassells, 1991).
3.5.2. Bacterias
Son las más comunes entre los microbios contaminantes de tejidos vegetales en condiciones in vitro. Algunos de los géneros de bacterias vitropatógenas con mayor incidencia son Acinbacter, Agrobacterium, Bacillus, Corynebacterium, Erwinia, Enterobacter, Lactobacillus, Pseudomonas, Staphyllococcus y Xantomona (Agrios, 2005).
Los síntomas más comunes de la contaminación bacterial en los tejidos vegetales son la muerte completa del explante, crecimiento desuniforme, necrosis localizadas, bajas tasas de multiplicación en brotes axilares y baja capacidad de enraizamiento.
Generalmente, la contaminación con bacteria puede identificarse por la presencia de manchas de aspecto acuoso y coloración variada en el tejido vegetal, turbidez en medios líquidos y por la presencia de colonias que crecen en forma circular sobre medios semisólidos (Suàrez E. P., 2020).
3.5.3. Hongos
Los hongos son microorganismos que generalmente actúan como contaminantes externos de los explantes, aunque algunos se encuentran asociados con el sistema vascular (Suàrez E. P., 2020).
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Los géneros más comunes de hongos que actúan como contaminantes de cultivos in vitro son Aspergillus, Candida, Cladosporium, Penicillium y Saccharomyces, este último conocido como levaduras. Sus contaminaciones se caracterizan por el crecimiento micelial que rápidamente cubre el explante resultando en la muerte rápida de los tejidos, aunque la presencia de levaduras puede confundirse con contaminaciones de tipo bacterial (Carlite et al, 2021).
3.5.4. Oxidación
Causada por la liberación de fenoles al medio de cultivo, que reaccionan con el oxígeno del frasco, produciendo una coloración rojiza, amarillenta o café.
Indica, que los compuestos fenólicos actúan como inhibidores del crecimiento emitidos por el propio explante, capaces de causar el envejecimiento y muerte del mismo. Se han documentado incluso diferencias en los grados de oxidación entre los cultivares de una misma especie (Poma, 2014).
3.5.5. Ritketsias y fitoplasmas
Las Ritketsias y fitoplasmas son tipos particulares de bacterias que pueden causar enfermedades en organismos vegetales. Las rickettsias se caracterizan por ser inmóviles, mientras que los fitoplasmas carecen dela pared celular. Ambos pueden actuar como patógenos externos o sistémicos, y son generalmente inoculados en la planta por insectos vectores (Agrios, 2005).
Los síntomas de contaminación por Ritketsias y fitoplasmas en tejidos vegetales in vitro son amarillamiento de las hojas, reducción del tamaño de los órganos y flacidez de los tejidos.
3.5.6. Virus y viroides
Los virus son nucleoproteínas Fitopatógenas, mientras que los viroides son pequeñas cadenas de ARN sin proteínas asociadas que pueden causar enfermedades en las plantas. Ambos se desplazan dentro de las plantas a través de los conductos vasculares y necesitan de una célula hospedera para llevar a cabo sus funciones básicas (Suares J. y Jaraba J., 2004).
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Las contaminaciones ocasionadas por estos microorganismos no son eliminadas con la desinfección superficial de los explates, y los síntomas más comunes de estas son hojas amarillentas, presencia de mosaicos en la lámina foliar, crecimiento lento y baja capacidad de enraizamiento (Suàrez E. P., 2020).
3.5.7. Artrópodos
Varios arácnidos, como los ácaros y trips, e insectos, como las hormigas, pueden llegar a convertirse en problemas para el mantenimiento de las condiciones de asepsia en los cultivos de tejidos in vitro (Mattherws, 1981).
Los ácaros son transportados por el viento y fácilmente introducidos en el laboratorio a través de los sistemas de aire acondicionado, mientras que la presencia de comida y desechos orgánicos en el laboratorio favorece la presencia de hormigas. Tanto los ácaros como las hormigas actúan como transportadores de esporas de hongos hacia el interior de los cultivos in vitro (Mattherws, 1981).
3.5.8. Vitrificación
Fenómeno llamado también hiperhidricidad que consiste en el aumento del potencial hídrico de las células que causa el enverdecimiento de los tejidos y los torna quebradizos. En algunos casos se hace referencia a esta como una enfermedad fisiológica (Poma, 2014).
3.6. Fuentes de contaminación
Las fuentes de contaminación son aquellas que sirven como vehículo para que los agentes contaminantes llegue al cultivo in vitro, siendo las más frecuentes el material vegetal, el aire y operario.
3.6.1. Material vegetal
Muchos microbios e insectos se encuentran en la superficie de las planatas sin afectar su crecimiento y desarrollo, e incluso en algunos casos favoreciendo el desempeño vegetal. Sin embargo, una vez en contacto con las condiciones in vitro se convierten en vitropatógenos (Suàrez E. P., 2020).
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La mayoría de los microorganismos se localizan en pequeñas cavidades de la corteza de los tallos y órganos donde se hace más difícil la penetración de las soluciones desinfectantes y consecuentemente su eliminación. Adicionalmente, algunas plantas tienen microbios asociados a su sistema vascular, que hacen aún más complicado el proceso de desinfestación (Suàrez E. P., 2020).
3.6.2. Aire
El aire en condiciones normales mantiene suspendidas partículas de polvo, esporas de hongos, bacterias, ácaros y otros agentes que son contaminantes potenciales. Esto significa que, para evitar la presencia de estos factores al interior de los cultivos, es necesario contar con un mecanismo que proporcione una buena calidad del aire para disminuir los riesgos por contaminación.
3.6.3. Trabajador u operario
Al igual que las superficies vegetales. La piel humana tiene una flora asociada que interactua con las células de la apidermis y que pueden llegar a contaminar los cultivos in vitro. Adicionalmente, el proceso de renovación de la piel hace que del cuerpo humano se desprendan células muertas que pueden llevar consigo agentes externos, los cuales al entrar en contacto con el cultivo in vitro desarrollan contaminaciones (Suàrez E. P., 2020).
La indebida realización de las manipulaciones es una segunda forma mediante la cual el operario puede actuar como una fuente de contaminación. Dentro de las fallas más comunes se encuentran la utilización de utensilios contaminados, vociferación durante la realización de subcultivos, indebida colocación de herramientas y tejidos dentro del área de trabajo, calentamineto insuficiente de las pinzas y bisturíes para el manejo de las muestras y el subcultivo de tejidos contaminados (Suàrez E. P., 2020).
16 3.6.4. Técnica estéril
La técnica estéril consiste en la aplicación de una serie de medidas que buscan reducir la presencia de todos los factores capaces de causar contaminaciones en los cultivos en condiciones in vitro (Klein y Kyte, 2003).
Cada fuente de contaminación tiene un componente de la técnica estéril que se aplica de forma específica para evitar su posible incidencia en el proceso. La aplicación general de la técnica estéril involucra el uso de agentes químicos, procedimientos de manejo y calibración de equipos utilizados en el cultivo de tejidos vegetales (Klein y Kyte, 2003).
3.6.5. Desinfección superficial
Este componente de la técnica estéril esta específicamente dirigido a eliminar la indecencia de agentes contaminantes presentes en la superficie de los tejidos o explantes (Suàrez E. P., 2020).
La disminución de contaminantes externos se inicia previo a el aislamiento de los explantes, mediante tratamientos que se aplican a la planta madre. Este manejo constituye el estado 0 dentro del proceso de micropropagación y está conformado por estrategias como el mantenimiento de las plantas madres en locales cerrados, aplicación de controles fitosanitarios periodos, uso de antibióticos y cosecha de explantes preferiblemente en época seca (Suàrez E. P., 2020).
Inicialmente, los propágalos seleccionados deben ser enjuagados con abundante agua para remover las partículas de polvo y otros elementos antes de proceder a desinfectados superficialmente. La solución desinfectante se prepara con productos químicos de baja toxicidad para la planta, pero efectivos en la eliminación de microbios.
Los desinfectantes más ampliamente utilizados son los iones de hipoclorito de sodio o hipoclorito de calcio, y el etanol. Los primeros deben su acción desinfectante (sobre todo bactericida) a su capacidad oxidante por el contenido de cloruro presente en sus moléculas (Suàrez E. P., 2020).
El hipoclorito de sodio tiene una presentación líquida y es sensible a la luz, se utiliza en concentraciones que van desde 0.5 a 5% (vol:vol) con tiempos de exposición
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comprendidos entre 5 y 30 minutos dependiendo del tejido a desinfectar; mientras que, el hipoclorito de calcio es un polvo mojable que una vez disuelto en agua debe ser filtrado y usado inmediatamente. Este se utiliza en concentraciones entre 9 a 10 % con tiempos de exposición 5 a 30 minutos, sin embargo, su menor eficiencia y manejo más complicado hacen que sea menos utilizado que el hipoclorito de sodio (Abila M., 2004)
El etanol es el más usado en los alcoholes, aunque su uso individual como desinfectante no proporciona los mejores resultados. La inmersión rápida de los explantes en etanol, previo a la desinfestacion superficial, ayuda a remover resinas, tricomas y cutícula, contribuyendo a mejorar los efectos de la solución desinfectante a base de los iones de hipoclorito. Los alcoholes son también de gran utilidad papa limpiar las superficies de trabajo y herramientas ayudando con esto a disminuir la presencia de microbios y posibles contaminantes (Singa et al., 1987)
3.6.6. Indexación
La indexación consiiste en realizar pruebas a las plantas madres con el fin de diagnosticar la presencia o ausencia de contaminantes sistémicos asociados con sus tejidos, permitiendo con esto reducir las probabilidades de introducir material vegetal infectado en los cultivos in vitro (Klopmeyer M., 1996).
La indexación puede aplicarse por diferentes métodos que van a depender del tipo de planta y del microorganismo que se desea detectar. Una de las formas más efectivas consiste en tomar porciones de órganos de la planta a indexar y establecerlos en medios de cultivo cuya formulación es especefica para favorecer el crecimiento de determinados microbios. Los resultados de esta prueba generalmente son rápidos y fácilmente detectables para el caso de infecciones con hongos y bacterias (Ogleve, 1993).
El uso de e plantas indicadoras es un método utilizado para diagnosticar la presencia de algunas enfermedades de origen viral o viroidal. Esta consiste en injertar porciones de la planta a indexar en el tallo de una planta sensible sintomáticamente a la infección.
Cuando la planta indicadora muestra los síntomas típicos de la infección, el resultado
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es concluyente, sin embargo, la ausencia de síntomas no es definitivo para descartar la contaminación debido a que existe la posibilidad que se trate de una infección asintomática (Schnell et al., 2001).
3.7. Cultivo de meristemos
Aunque la eliminación de contaminantes sistémicos presentes en tejidos vegetales es prácticamente imposible mediante la aplicación de técnicas convencionales de desinfestación, existen algunas estrategias que permiten en algunos casos obtener explantes libres de contaminantes a partir de plantas infectadas, o en su defecto evitar que un agente contaminante presente en un explante se salga de control y cause la muerte del explante (Suàrez E. P., 2020).
Los virus y viroides se desplazan dentro de la planta preferencialmente a través de los haces vasculares, lo que posibilitaría la obtención de material libre de contaminación en zonas con ausencia de estos conductos. Con base en esta premisa, el aislamiento y cultivo de porciones de las capas más externas de los meristemos apicales ha sido una estrategia de gran utilidad para obtener y multiplicar material sano a partir de plantas contaminadas con agentes infecciosos sistémicos (Klopmeyer ., 1996)
La asociación de tratamientos térmicos con el aislamiento y cultivo de zonas meristemáticas (Termoterapia), ha permitido en algunos casos incrementar la efectividad en la eliminación de contaminantes sistemáticos; sin embargo, a pesar de los éxitos demostrados en muchas plantas, el cultivo de zonas meristemáticas y la termoterapia no son igualmente efectivos para toda clase de virus o viroides, al igual que varían en efectividad de acuerdo con el tipo de planta (Horts., 1993).
3.8. Ambiente estéril
La disminución del número de agentes contaminantes presentes en el área de trabajo se garantiza con el uso de cámaras de flujo laminar.
La cámara de flujo laminar es un equipo dotado con una turbina que toma aire de exterior, lo impulsa a través de un filtro de alta eficiencia, para posteriormente expulsarlo hacia el interior de la cámara, donde el equipo lleva a cabo las
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manipulaciones. El filtro, a través de cual circula el aire, retiene partículas que normalmente se encuentran en suspensión, y que se convierten en contaminantes potenciales al entrar en contacto con los cultivos (Suàrez E. P., 2020).
Algunas cámaras de flujo laminar seencuentran euipadas con lámparas de luz ultravioleta que, al ser encendidas por un tiempo determinado, eliminan todos los microorganismos que se encuentran en la superficie de las mismas (Suàrez E. P., 2020).
3.9. Buenas prácticas de laboratorio
El uso inadecuado de herramientas y materiales, así como la falta de claridad en los protocolos de manejo son, después del material vegetal, las causas más frecuentes de la contaminación de los cultivos in vitro (Suàrez E. P., 2020).
Para evitar la entrada de agentes contaminantes al interior de la zona de trabajo, los recipientes, medios de cultivo, herramientas, papeles, y demás materiales que se usen al interior de la cámara de flujo laminar, deben haber sido esterelizados y asperjados con etanol al 70% antes de colocarlos en el interior de la cámara (Suàrez E. P., 2020).
Los operarios deben implementar medidas rutinarias de prevención de las contaminaciones como lavarse las manos antes de iniciar un procedimiento, vestir batas limpias, en lo posible evitar levantarse de la cámara antes de terminar el trabajo iniciado, no hablar dentro de la cámara y no sacar las herramientas, tejidos o medios descubiertos fuera de área de la cámara (Suàrez E. P., 2020).
Es preciso, durante el desarrollo de los trabajos, evitar colocarlas herramientas directamente sobre la superficie de cámara. Y cualquier tejido que entre en contacto con esta superficie debe ser descartado inmediatamente (Suàrez E. P., 2020).
Para la limpieza de los recipientes y herramientas utilizados, y una vez han sido esterilizados en el autoclave, el procedimiento estándar consiste en desechar el medio de cultivo y el material vegetal, lavar profusamente con detergente o jabón bactericida, enjuagar dos veces con agua potable y una tercera vez con agua destilada, permitir escurrir y secar al aire. Y finalmente almacenar en un sitio cerrado. Para reducir las
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posibilidades de proliferación de microrganismos, se recomienda esterilizar por separado recipientes y utensilios que hayan sido utilizados en cultivos donde se sospeche hay presencia de microbios sistémicos (Suàrez E. P., 2020).
3.10. Edad fisiológica
Este es un aspecto de gran influencia, se puede decir que cuando más joven e indiferenciado se encuentre el explante a cultivar, mejor será su respuesta in vitro. Es por ello que los meristemos apicales y axilares son ampliamente usados en numerosas especies (Granado, 2015).
3.10.1. Explante
El concepto de explante se refiere a cualquier parte vegetal que ha sido separada de la planta, que puede ser un tejido (fragmentos de hojas, tallos, raíces completas, etc.), estructuras como las anteras y los ovarios, o bien células individuales (como en el caso de los protoplastos). Con excepción de los óvulos y el polen, los explantes están constituidos por tejidos y/o células somáticas (Gomez & Lopez, 2019).
La selección de un adecuado explante inicial determina mejores resultados en la regeneración o formación de las plantas in vitro. La sección de tejido utilizada varia en dependencia de las características morfológicas de las diferentes especies, como regla general, se toman las yemas del tallo principal y de los brotes axilares de las plantas.
(Murillo, R., 2014). Existen especies donde pueden utilizarse diferentes partes vegetativas como material inicial, en papa (Solanum tuberosum sp.) se utilizan las yemas brotadas de los tubérculos o las yemas apicales y axilares de plantas completas. Sin embargo, los mejores resultados se obtienen al tomar las yemas de tubérculos brotados, por facilitarse su desinfección y manejo, con el 56,6 por ciento de regeneración de meristemos de 0.1 a 0.4 mm (Roca.M., 1993).
Los explantes en crecimiento que tienen su zona de tejido cubierto son más fáciles de desinfectar que los explantes de plantas adultas o plantas perennes. El tamaño del explante es otro factor que influye en la desinfección y regeneración de plantas, si el explante es más pequeño es menor el riesgo de contaminación y más difícil la regeneración mientras que con el aumento del tamaño del explante hay más 16
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contaminación y el crecimiento y la regeneración de plantas es más rápida (Roca.M., 1993)
3.10.2. Localización del explante
Frecuentemente se utilizan meristemos apicales y axilares con buenos resultados en la obtención de plantas libres de virus. Sin embargo, es aconsejable el uso de yemas terminales ya que tienen un mayor crecimiento potencial que las yemas laterales. En general, los meristemos más jóvenes se desarrollan mejor que los viejos y producen mayores cantidades de plantas libres de virus que las yemas laterales, probablemente porque tienen un crecimiento más activo que las axilares. No obstante, también es posible la obtención de plantas sanas a partir de yemas axilares (Lopez, 2010).
3.10.3. Tamaño del explante
El cultivo de meristemos tiene una serie de requerimientos nutricionales para cumplir sus funciones de auto perpetuación y de generar células para formar tejidos definidos.
Por lo tanto, al ser retirado de la planta debe ser sembrado en un medio de cultivo apropiado, así rápidamente desarrolla en una planta completa (Gomez & Lopez, 2019).
3.11. Sistema de medio de cultivo
(Roca.M., 1993) Plantean dos sistemas de medios de cultivo:
- Medios de cultivo líquidos.
- Medios de cultivos semisólidos
(Teresa, 2004) Da a conocer que, de acuerdo al estado físico, los medios de cultivo Pueden ser de los siguientes tipos:
- Medios de cultivo líquidos.
- Medios sólidos: llevan a un agente solidificante (comúnmente agar)
- Medios de cultivos semisólidos: agar a una concentración del 0.7 % (w/v) 3.11.1. Medio de cultivo sólido
(Hurtado Y Merino, 1994)Hurtado y Merino (1994), lo describen como el medio de cultivo que posee un material de soporte, como el agar, que es el material más utilizado, pues provee al medio de un gel húmedo que sirve como soporte al explante,
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pero fisiológicamente no es inerte, puesto que es una fuente de cantidades variables de sustancias inhibidoras o estimulantes de crecimiento.
(Brenes, 2001), expresa que el mérito de los medios semi sólidos es su gran
Simplicidad en cuanto al manejo, además un gran número de especies cultivadas pueden acomodarse en él.
3.11.2. Medios de cultivo
Los medios de cultivo son una combinación de diferentes componentes, los cuales varían proporcionalmente de acuerdo con las características del tejido a desarrollar (callo, proporciones de hojas, células, proporciones de tallos, etc.) y el proceso morfogenético que se desea seguir (cultivo de meristemos, organogénesis, embriogénesis somática, etc.) (Gam borg O., 1981).
Hasta la presente se ha asumido que las necesidades nutricionales de los tejidos son comparables a los de la planta completa. Por lo que el medio de cultivo debe contener todas las sustancias requerida por una planta intacta. Variado las proporciones de los componentes con el tiempo de explante y la vía morfogenética que se dese seguir para el desarrollo de los tejidos (Murashige skoog, 1962).
Un medio de cultivo según (Ramirez., 1989) es un conjunto de todos los elementos orgánicos e inorgánicos capaces de suministrar a un cultivo todo lo que el necesita para desarrollarse en condiciones in vitro.
3.5. Componentes de un medio
Según la (FAO, 1990)los medios de cultivo, utilizados para el manejo de meristemos y micropropagación de papa, contienen principalmente: sales de (Murashige skoog, 1962), vitaminas, reguladores de crecimiento, sacarosa, agar (Agente gelificante).
3.11.3. Agua
El agua constituye más del 95% de cualquier medio de cultivo y es el solvente de todos los solutos que componen en el medio (Suàrez E. P., 2020).
Teniendo en cuenta que el agua potable corriente contiene elementos varios como disueltos orgánicos e inorgánicos, partículas sólidas de diversa naturales y
