ESCUELA PROFESIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

ESCUELA PROFESIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Identificación molecular de bacterias con potencial capacidad promotora de crecimiento vegetal aisladas de la rizósfera de Capsicum annuum cv. Piquillo

TESIS PARA OPTAR

EL TÍTULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO AUTOR

Br. Asmat Ortega, Cristian Daniel ASESORA

Dra. Chaman Medina, Mercedes Elizabeth TRUJILLO-PERÚ

2020

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PRESENTACIÓN

Señores miembros del jurado:

En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el reglamento de Grados y Títulos de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo pongo a vuestra consideración y criterio el presente informe de tesis titulado: “Identificación molecular de bacterias con potencial capacidad promotora de crecimiento vegetal aisladas de la rizósfera de Capsicum annuum cv. Piquillo”, con el cual cumplo con uno de los requisitos indispensables para obtener el Título Profesional de Biólogo.

Trujillo, marzo de 2020

Br. Cristian Daniel Asmat Ortega

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JURADO DICTAMINADOR

Dra. Marlene René Rodríguez Espejo PRESIDENTE

Dr. Carlos Helí Quijano Jara SECRETARIO

Dra. Mercedes Elizabeth Chaman Medina VOCAL

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DE LA ASESORA

La que suscribe, docente asesora de la tesis titulada: “Identificación molecular de bacterias con potencial capacidad promotora de crecimiento vegetal aisladas de la rizósfera de Capsicum annuum cv. Piquillo” deja constancia que esta tesis ha sido desarrollada y revisada en conformidad a los objetivos planteados en el perfil académico acogiendo las observaciones y sugerencias alcanzadas.

Por lo tanto, autorizo al Br. Cristian Daniel Asmat Ortega a continuar con los trámites correspondientes.

Dra. Mercedes Elizabeth Chaman Medina ASESORA

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Dra. Marlene René Rodríguez Espejo PRESIDENTE

Dr. Carlos Helí Quijano Jara SECRETARIO

Dra. Mercedes Elizabeth Chaman Medina VOCAL

APROBACIÓN

Los profesores que suscriben, miembros del Jurado Dictaminador, declaran que el presente informe de tesis ha cumplido con los requisitos formales y fundamentales; siendo aprobado conmención honrosa, la cual amerita su publicación.

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DEDICATORIA

A mis padres.

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AGRADECIMIENTOS

A Dios, a Víctor y a Noemí.

A la Dra. Mercedes Chaman por su asesoría.

Al Ph. D. Eric Mialhe y a su equipo colaborador de INCABIOTEC S.A.C.

A la Dra. Valeria Maia y a su equipo colaborador del CPQBA-UNICAMP.

Al Blgo. Bryan Cruz Valderrama y a la Blga. Rosita Chang por su apoyo.

Al bibliotecario Carlos Ortiz Mallorca por la atención y apoyo.

A demás familiares, amigos y colegas que apoyaron esta investigación y por razones de espacio u omisión involuntaria, no fueron mencionados.

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«There is no knowledge that is not power»

—Ralph Waldo Emerson

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RESUMEN

La agricultura es una de las principales actividades económicas de la sociedad humana, sin embargo, la producción y rendimiento agrícola se ve disminuida por diversos tipos de estrés. Frente a este problema, se está utilizando microrganismos promotores de crecimiento vegetal como alternativa biotecnológica con impacto medioambiental mínimo. Se identificó aislados bacterianos de la rizósfera del cultivo de Capsicum annuum cv. Piquillo mediante análisis genómico dirigido al gen ADNr 16s. Dichas bacterias fueron aisladas mediante diluciones seriadas y cultivo en medio sólido en placas a partir de muestras de suelo rizosférico. Luego, se realizó la extracción de ADN genómico a partir de cultivos puros de los aislados, secuenciamiento y análisis bioinformático. Finalmente, se determinó aquellos aislados con potencial capacidad promotora de crecimiento vegetal en base a referencias bibliográficas correspondientes a cada género o especie identificada. Se determinó siete aislados a nivel de género: Ca2 y Ca5 corresponden a Staphylococcus sp.; mientras que, Ca3, Ca4, Ca8, Ca10 y Ca11 corresponden a Bacillus sp. Además, se identificó cinco aislados a nivel de especie: Ca1 corresponde a Streptomyces roseolilacinus, Ca6 a Staphylococcus arlettae, Ca7 a Staphylococcus xylosus, Ca9 a Bacillus firmus y Ca12 a Bacillus humi. Se concluye que de los doce aislados identificados, siete correspondientes al género Bacillus y uno a la especie Streptomyces roseolilacinus presentan potencial capacidad promotora de crecimiento vegetal.

Palabras clave: Capsicum annuum, identificación molecular, capacidad promotora de crecimiento vegetal, rizobacterias

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ABSTRACT

Agriculture is one of the major economic activities of human society, however, agricultural production and yield is diminished by various types of stress. To face this problem, plant growth-promoting microorganisms are being used as a biotechnological alternative with minimal environmental impact. Bacterial isolates from the rhizosphere of Capsicum annuum cv. Piquillo were identified by genomic analysis targeted to the 16s rDNA gene. Bacteria were isolated from rhizospheric soil samples by serial dilutions and cultured in solid medium agar plates. Then, genomic DNA extraction from pure cultures of each isolate, sequencing and bioinformatic analysis were performed. Finally, isolates with potential plant growth-promoting capacity were determined based on bibliographic references corresponding to each identified genus or species.

Seven isolates were determined at a genus level: Ca2 and Ca5 match to Staphylococcus sp.; while, Ca3, Ca4, Ca8, Ca10 and Ca11 match to Bacillus sp.

Besides, five isolates were identified at a species level: Ca1 matches to Streptomyces roseolilacinus, Ca6 to Staphylococcus arlettae, Ca7 to Staphylococcus xylosus, Ca9 to Bacillus firmus and Ca12 to Bacillus humi. It is concluded that from the twelve identified isolates, seven that that match to the genus Bacillus and one of the species Streptomyces roseolilacinus have potential plant growth-promoting capacity.

Keywords: Capsicum annuum, molecular identification, plant growth- promoting capacity, rhizobacteria

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ABREVIATURAS

UNT: Universidad Nacional de Trujillo.

PGPR: Rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (Plant Growth- Promoting Rhizobacteria).

TSA: Agar triptona de soya (Tryptic soy agar).

Agar R2A: Agar 2A de Reasoner (Reasoner’s 2A agar).

UFC: Unidad formadora de colonias.

DNA: Ácido desoxirribonucleico.

DNAr: Ácido desoxirribonucleico ribosomal.

DMSO: Dimetilsulfóxido.

PCR: Reacción en cadena de la polimerasa.

CPQBA: Centro Pluridisciplinario de Investigaciones Biológicas, Químicas y Agrícolas

UNICAMP: Universidad Estatal de Campinas

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ÍNDICE

I. INTRODUCCIÓN………...1

II. MATERIAL Y MÉTODOS………..3

III. RESULTADOS……….6

IV. DISCUSIÓN………16

V. CONCLUSIONES……….20

VI. RECOMENDACIONES………21

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS………22

ANEXOS……….29

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ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS

Tabla 1. Descripción morfológica de colonias y celular de los aislados bacterianos

evaluados. ... 6

Tabla 2. Identificación molecular de los aislados bacterianos evaluados mediante análisis genómico dirigido al gen ADNr 16s. ... 14

Tabla 3. Aislados bacterianos identificados con potencial capacidad promotora de crecimiento por comparación con literatura científica. ... 15

Figura 1. Tinción de Gram de los aislados bacterianos.. ... 7

Figura 2. Análisis filogenético de secuencias parciales de ADNr 16s del aislado Ca1.. ... 8

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I. INTRODUCCIÓN

La agricultura es una de las principales actividades económicas de la sociedad humana. Sobre esta actividad recae la provisión de alimentos, vestimenta, y generación de materias primas utilizadas como fuente de energía; sin embargo, en la actualidad, los cultivos agrícolas son severamente afectados por diversos tipos de estrés ambiental, los cuales constituyen algunos de los factores limitantes para el rendimiento agrícola. Una de las principales causas de dicho problema es la incidencia de plagas y enfermedades, las cuales requieren el uso de gran cantidad de agroquímicos contaminantes para su control efectivo. Frente a este desafío, se está desarrollando tecnologías que involucran la promoción del crecimiento vegetal presentando riesgos mínimos de contaminación ambiental (1,2).

Una de estas tecnologías involucra la utilización de bacterias que habitan la rizósfera de diversos cultivos vegetales de interés agrícola. Dentro de dicho grupo de bacterias, las rizobacterias promotoras de crecimiento vegetal (en inglés, plant growth-promoting rhizobacteria “PGPR”) son aquellas capaces de estimular el crecimiento vegetal mediante la mejora de la absorción de agua y nutrientes, el control biológico directo de agentes patógenos, y la activación de mecanismos de defensa y de resistencia a estrés. Especies rizobacterianas principalmente de los géneros Bacillus, Pseudomonas y Rhizobium son idóneas para la promoción del crecimiento vegetal con un impacto mínimo en el medioambiente. A la fecha, se ha identificado diversas especies bacterianas con esta capacidad, las cuales se han consolidado mundialmente como productos agrícolas biológicos que han logrado reemplazar parcial o totalmente a los tradicionales productos agroquímicos contaminantes (1,3).

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Los avances en tecnologías de biología molecular han favorecido la identificación de PGPR nativas, específicas de determinados cultivos y ecosistemas, con potencial capacidad promotora de crecimiento vegetal (1,3,4). La identificación de estos microorganismos mediante análisis genómico dirigido al gen ADNr 16s se ha consolidado como una herramienta muy útil en la determinación rápida y precisa de especies una vez que se cuenta con las secuencias génicas de referencia en bases de datos (5). Dicho análisis ha sido utilizado de manera generalizada para establecer relaciones filogenéticas entre microorganismos procariotas. Este hecho ha tenido un impacto significativo en la elaboración de modelos evolutivos y taxonomía bacteriana; en efecto, las ediciones vigentes de tratados en sistemática bacteriana están necesariamente basadas en la información provista por el análisis de secuencias de ADNr 16s (6).

En estudios similares específicos de la rizósfera de C. anuumm se ha reportado bacterias de diversos taxones y principalmente aislados grampositivos, tal como Asaff et al., (2017) quienes reportaron bacterias de las clases Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteria, Bacilli y del filo Actinobacteria mediante análisis metagenómico dirigido al gen ADNr 16s, Datta et al. (2010) reportaron veinte bacterias grampositivas, asimismo, Veerapagu et al. (2018) reportaron dos PGPR gramnegativas y una grampositiva. En este contexto, la presente investigación se planteó como objetivo identificar aislados bacterianos con potencial capacidad promotora de crecimiento vegetal aislados a partir de muestras de suelo provenientes de la rizósfera de cultivos de Capsicum annum cv Piquillo mediante análisis genómico dirigido al gen ADNr 16s.

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II. MATERIAL Y MÉTODOS

2.1 Material biológico

Los aislados bacterianos fueron obtenidos a partir de muestras de suelo rizosférico procedentes de la provincia de Virú, región de La Libertad (08°24’18” S, 78°51’18” W, ver anexo 1) provistas por el Laboratorio de Fisiología Vegetal de la Escuela de Ciencias Biológicas de La Universidad Nacional de Trujillo (UNT).

2.2 Aislamiento de rizobacterias mediante técnicas microbiológicas tradicionales

El aislamiento de las rizobacterias fue llevado a cabo en el Laboratorio de Bacteriología de la Escuela de Microbiología y Parasitología de la UNT. Las muestras de suelo rizosférico fueron tamizadas, mezcladas y homogenizadas hasta obtener alícuotas de 10 g, cada una de las cuales fue añadida a un matraz que contenía 90 ml de solución salina fisiológica estéril, el cual fue agitado hasta que el contenido tenga una apariencia homogénea.

Posteriormente, se extrajo una alícuota de 1 ml (10^-1) que fue sucesivamente colocada en tubos de ensayo que contenían 9 ml de diluyente (10^-2) hasta obtener un factor de dilución de 10^-5. Luego se tomó alícuotas de 0.1 ml de cada tubo y se cultivó de manera independiente en placas Petri con medios de cultivo TSA (Tryptic Soy Agar) y R2A (Reasoner's 2A Agar) de pH 7.8, las cuales fueron incubadas a 30 ± 5 °C hasta observar la aparición de colonias de bacterias (aproximadamente cinco días); luego, se aisló colonias con diferente morfología hasta obtener cultivos puros corroborados mediante tinción de Gram. Se aisló doce cultivos puros, los cuales fueron rotulados como: Ca1, Ca2, Ca3, Ca4, Ca5, Ca6, Ca7, Ca8, Ca9, Ca10, Ca11 y Ca12. Éstos aislados

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fueron caracterizados morfológicamente mediante descripción de sus colonias y forma celular; finalmente, fueron conservados en un cepario (7).

2.3 Extracción de ADN genómico bacteriano y PCR dirigida al gen ADNr 16s Se extrajo ADN genómico a partir de cultivos puros de los aislados utilizando el protocolo establecido por Van Soolingen et al., (1991) (8); posteriormente, el producto de extracción fue visualizado en un fotodocumentador después de realizar la electroforesis en gel de agarosa al 1% teñido con SYBR Safe en DMSO (Invitrogen) utilizando ADN de fago Lambda como estándar (ver anexo 3). La amplificación y secuenciación del gen 16s de ADNr a partir de ADN extraído de cada aislado fueron llevadas a cabo utilizando los primers 10f (5'- GAGTTTGATTCAGGCCCTG-3') y 1100r (5'-GTTGTGAGGGTTGGGG-3') de acuerdo con el protocolo descrito por Belgini et al., (2014) (9). El programa de amplificación de PCR consistió en un ciclo de 95 °C durante 2 min, 30 ciclos de 94°C durante 1 min, de 55 °C durante 1 min y de 72 °C durante 3 min; por último, un ciclo de elongación final de elongación final de 72 °C durante 3 min.

Los resultados de amplificación también fueron corroborados en gel de agarosa al 1% teñido con SYBR Safe (ver anexo 4). Luego, los productos de PCR fueron purificados en minicolumnas utilizando el kit GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare), corroborados en gel de agarosa 1%

teñido con SYBR Safe (ver anexo 5) y posteriormente tratados para secuenciamiento de tipo Sanger en un secuenciador automatizado ABI 3500XL (Applied Biosystems) con los primers 10f y 1100r en las instalaciones del laboratorio de Microbiología de la División de Recursos Microbianos del Centro Pluridisciplinario de Investigaciones Biológicas, Químicas y Agrícolas (CPQBA) de la Universidad Estatal de Campinas (UNICAMP).

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2.4 Análisis bioinformático de secuencias de ADNr 16s

El montaje de dos secuencias parciales de dicho gen (forward y reverse) en una sola secuencia consenso (contig), fue realizada en el programa BioEdit (10). Luego, dichas secuencias consenso fueron comparadas con las secuencias de organismos tipo de la base de datos EZBioCloud (https://www.ezbiocloud.net/) y RDP (Ribosomal Database Project, Wisconsin, USA https://rdp.cme.msu.edu/). Las secuencias fueron alineadas utilizando el programa CLUSTAL X (11) y su análisis filogenético fue realizado en el software MEGA 7 (12). Las distancias evolutivas fueron calculadas en base a las disimilitudes por pares de secuencias según el modelo de sustitución de ADN de Kimura (13) y la reconstrucción filogenética fue llevada a cabo en base al algoritmo Neighbor-Joining (NJ) (14) con valores bootstrap calculados a partir de 1000 réplicas.

2.5 Selección de bacterias con potencial capacidad promotora de crecimiento vegetal

Se determinó la potencial capacidad promotora de crecimiento vegetal de cada aislado bacteriano mediante comparación de sus características determinadas frente a la información actual disponible en la literatura científica (1,3,15–25).

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III. RESULTADOS

La tabla 1 muestra la descripción morfológica de las colonias y de células de los doce aislados bacterianos obtenidos de la rizósfera de Capsicum annuum cv Piquillo. Todos los aislados presentan morfología celular grampositiva, siete presentan morfología de bacilos, cinco, de cocos y una presenta morfología filamentosa (Fig. 1).

Tabla 1. Descripción morfológica de colonias y celular de los aislados bacterianos evaluados.

Aislado bacteriano Morfología de las colonias Morfología celular Ca1 Blancas, superficie lisa y borde circular regular Filamentosas

grampositivas Ca2 Blanquecinas, superficie lisa y borde circular

regular

Cocos grampositivos

Ca3 Blanquecinas, superficie rugosa y borde regular Bacilos grampositivos

Ca4 Blanquecinas, superficie papilada, borde lobado.

Bacilos grampositivos

Ca5 Blancas, superficie lisa y borde circular regular. Cocos grampositivos

Ca6 Traslúcidas brillantes, superficie lisa y borde regular.

Cocos grampositivos

Ca7 Blanquecinas, superficie lisa y borde regular circular.

Cocos grampositivos

Ca 8 Blanquecinas, superficie lisa y de borde irregular Bacilos grampositivos

Ca 9 De color crema, superficie lisa y de borde irregular

Ca10 Opacas, superficie lisa y de borde regular Bacilos grampositivos

Ca11 Traslúcidas, pequeñas, superficie lisa y de borde regular

Ca 12 Traslúcidas, superficie lisa y de borde regular Bacilos grampositivos

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Figura 1. Tinción de Gram de los aislados bacterianos. A. Ca1. B. Ca2. C. Ca3. D. Ca4. E. Ca5. F. Ca6. G. Ca7. H. Ca8. I. Ca9. J. Ca10. K.

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Las figuras 2-13 muestran los árboles filogenéticos basados en las secuencias de DNAr 16S de cada aislado (1000 réplicas, valores mostrados como porcentaje). Los códigos de las accesiones en el GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) son listados antes del nombre de cada especie.

Figura 2. Análisis filogenético de secuencias parciales de ADNr 16s del aislado Ca1.

Actinoalloteichus cyanogriseus fue utilizado como grupo externo.

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Figura 3. Análisis filogenético de secuencias parciales de ADNr 16s del aislado Ca2.

Macrococcus bovicus fue utilizado como grupo externo.

Salirhabdus euzebyi fue utilizado como grupo externo.

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Calditerricola satsumensis fue utilizado como grupo externo.

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Calditerricola satsumensis fue utilizado como grupo externo.

Salirhabdus euzebyi fue utilizado como grupo externo.

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Listeria monocytogenes fue utilizado como grupo externo.

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La tabla 2 muestra la identificación molecular de cada aislado bacteriano anteriormente caracterizado a nivel morfológico y denominado como Ca1- Ca12. En base al análisis filogenético, se determinó siete aislados a nivel de género: Ca2 y Ca5 corresponden a Staphylococcus sp.; mientras que, Ca3, Ca4, Ca8, Ca10 y Ca11 corresponden a Bacillus sp. Además, se identificó cinco aislados a nivel de especie: Ca1 corresponde a Streptomyces roseolilacinus, Ca6 a Staphylococcus arlettae, Ca7 a Staphylococcus xylosus, Ca9 a Bacillus firmus y Ca12 a Bacillus humi.

Tabla 2. Identificación molecular de los aislados bacterianos evaluados mediante análisis genómico dirigido al gen ADNr 16s.

Aislado bacteriano Identificación Molecular

Ca1 Streptomyces roseolilacinus

Ca2 Staphylococcus sp.

Ca3 Bacillus sp.

Ca4 Bacillus sp.

Ca5 Staphylococcus sp.

Ca6 Staphylococcus arlettae

Ca7 Staphylococcus xylosus

Ca 8 Bacillus sp.

Ca 9 Bacillus firmus

Ca10 Bacillus sp.

Ca11 Bacillus sp.

Ca12 Bacillus humi

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Tabla 3. Aislados bacterianos identificados con potencial capacidad promotora de crecimiento por comparación con literatura científica.

Potencial PGPR

Identificación Molecular

Referencias bibliográficas

Ca1

Streptomyces roseolilacinus

Dhananjaya Pratap & Harikesh Bahadu, 2016;

Choudhary & Varma, 2016; Francis et al., 2010; Qi et al., 2019; Shrivastava et al., 2015; Sousa &

Olivares, 2016; Vurukonda et al., 2018; Chewning et al., 2019; Nakashima et al., 2009

Ca3 Bacillus sp.

Dhananjaya Pratap & Harikesh Bahadu, 2016;

Choudhary & Varma, 2016; Shrivastava et al., 2015; Sansinenea, 2019; Tiwari et al., 2019;

Mendis et al., 2018; Yadav et al., 2011.

Ca4 Bacillus sp.

Ca 8 Bacillus sp.

Ca 9 Bacillus firmus Ca10 Bacillus sp.

Ca11 Bacillus sp.

Ca12 Bacillus humi

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IV. DISCUSIÓN

La descripción morfológica de los doce aislados bacterianos mostrada en la tabla 1 y en la figura 1 indicaría una eminente presencia de bacterias grampositivas en la rizósfera del cultivo de Capsicum annuum del cual provinieron las muestras. Dentro de la diversidad de especies de PGPR, se ha reportado ampliamente la presencia de bacterias gramnegativas como por ejemplo Psedomonas, Burkholderia, Serratia, Achromobacter, Azospirillum y Rhizobium debido a que son más fáciles de aislar y cultivar en laboratorio;

además, éstas han sido más estudiadas a nivel molecular debido a la importancia de algunas bacterias patógenas de los mismos géneros mencionados en ámbitos de salud pública y veterinaria (15,26). No obstante, en estudios similares a la presente investigación, se ha reportado diferentes cantidades tanto de aislados rizobacterianos gramnegativos como de grampositivos; por ejemplo, Khan et al. (2018) reportaron la presencia de once aislados rizobacterianos gramnegativos de un total de catorce en el cultivo de Brassica oleracea (27), Patel y Mehta (2014) reportaron quince aislados rizobacterianos grampositivos de un total de 25 en el cultivo de Solanum melongena (28), e Islam et al. (2016) reportaron un total de diez PGPR aisladas de Cucumis sativus, las cuales fueron todas grampositivas. Adicionalmente, la presencia de bacterias grampositivas se ha reportado en suelo de cultivos que crecen en condiciones áridas al igual que en las muestras de suelo de la presente investigación (18)

En estudios similares específicos de la rizósfera de C. anuumm, Datta et al.

(2010) reportaron a la totalidad de bacterias aisladas de la rizósfera como grampositivas, asimismo, Veerapagu et al. (2018) reportaron dos PGPR gramnegativas y una grampositiva. La elevada presencia de bacterias grampositivas en el suelo rizosférico tiene fundamento en el hecho de

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presentar una pared celular más gruesa que las gramnegativas, ello les permite resistir a condiciones físicas adversas; también se fundamenta en el hecho de que algunas presentan capacidades para formar endosporas, como por ejemplo aquellas pertenecientes al género Bacillus, lo cual les permite proliferar en ecosistemas afectados por diversos tipos de estrés biótico y abiótico (3,18,29). Finalmente, algunas PGPR grampositivas, como los del género Streptomyces, presentan capacidad de producir antibióticos, así, éstas proliferan desplazando a otras rizobacterias inhibiendo su crecimiento (1,15,18).

El análisis filogenético basado en secuencias de DNAr 16s mostrado en las figuras 2-13, provee una aproximación confiable para la identificación molecular de cada aislado rizobacteriano. La identificación molecular de especies bacterianas mediante análisis dirigido al DNAr 16s se ha establecido como una herramienta rápida y eficaz en estudios de taxonomía. El ADNr 16s es un polidesoxirribonucleótido de 1500 pb; si bien es una secuencia muy conservada en procariotas, ésta presenta regiones hipervariables denominadas V1-V9, las cuales permiten la diferenciación de algunas especies a nivel taxonómico. Cabe resaltar también que las ediciones actuales de tratados de sistemática bacteriana como el Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (https://www.springer.com/gp/book/9780387950433) basan su estructuración en base al análisis molecular de ADNr 16s (6).

Considerando en conjunto el análisis filogenético llevado a cabo en la presente investigación y la descripción morfológica correspondiente a cada aislado rizobacteriano, se ha logrado identificar a siete aislados a nivel de género: Ca2 y Ca5 corresponden a Staphylococcus sp.; Ca3, Ca4, Ca8, Ca10 y Ca11 corresponden a Bacillus sp.; además, se identificó cinco aislados a nivel de

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arlettae, Ca7 a Staphylococcus xylosus, Ca9 a Bacillus firmus y Ca12 a Bacillus humi (Ver Tabla 2). La presencia de aislados correspondientes a Bacillus, Staphylococcus y Streptomyces estaría en concordancia con lo descrito por Asaff et al., (2017) quienes reportaron mayor abundancia de bacterias pertenecientes a la clase Bacilli (a la cual corresponde Bacillus y Staphylococcus) y al filo Actinobacteria (al cual corresponde Streptomyces) en la rizósfera de C. anuumm mediante análisis metagenómico dirigido al gen ADNr 16s (30); asimismo, está en concordancia con la presencia de especies de Bacillus y Streptomyces descrita ampliamente en suelos rizosféricos (18,31–33). Sin embargo, según nuestro conocimiento, hasta la fecha no se ha reportado la presencia de especies de Staphylococcus en suelo rizosférico del cultivo de C. anuum.

En particular, los estudios que reportan rizobacterias del género Staphylococcus son aún escasos, Lopez et al., (2019) reportaron Staphylococcus asociado a la rizósfera de manglares de las especies Avicennia germinans, Laguncularia racemosa y Rhizophora mangle (34), también Leiva et. al, (2013) reportaron a la PGPR Staphylococcus vitulinus como solubilizadora de fosfatos asociada a la rizósfera de Theobroma cacao (35). No conocemos acerca de reportes de PGPR de las especies S. arlettae y S. xylosus;

sin embargo, la primera ha sido reportada como rizobacteria de plantaciones de “cardamomo” con capacidad para degradar residuos del insecticida fipronil (36), y la segunda ha sido reportada en la rizósfera de Solanum tuberosum (37).

Las PGPR del género Bacillus son las más extensamente estudiadas por su capacidad promotora de crecimiento. Los mecanismos por los cuales promueven el crecimiento vegetal incluyen la producción de fitohormonas, solubilización de fosfatos, producción de sideróforos, producción de toxinas

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plaguicidas, antibiosis e inducción de resistencia sistémica (22,23). La especie B. firmus ha sido descrita como como promotor de crecimiento vegetal actuando como agente biocontrolador de nemátodos (24). Asimismo, la especie B. humi ha sido reportada como promotor de crecimiento vegetal con capacidad de degradar materia orgánica en suelos moderadamente ácidos (25).

Las especies del género Streptomyces han sido aisladas de suelos y estudiadas por su capacidad para producir compuestos, nematicidas, antifúngicos y antibacterianos de amplio espectro, por lo tanto, son alternativas ecológicas para el control de plagas y enfermedades así como la promoción del crecimiento vegetal al favorecer la asimilación de nutrientes mediante la regulación de la producción de fitohormonas (15–20). La especie S.

roseolilacinus ha sido descrita como promotora de crecimiento vegetal al ser capaz de producir un compuesto nematicida e inhibidor de la enzima tirosinasa, una enzima clave en la síntesis de melanina en microorganismos, animales y plantas. La melanina es un compuesto que confiere protección a microorganismos frente a compuestos vegetales (21), es por ello que la utilización de inhibidores de la tirosinasa tiene una importante aplicación en agricultura mediante el control de fitopatógenos (16,21).

Todo lo mencionado anteriormente sugiere que los siete aislados identificados correspondientes al género Bacillus y el correspondiente a la especie S. roseolilacinus presentan potencial capacidad promotora de crecimiento vegetal.

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V. CONCLUSIONES

Del total de doce aislados bacterianos identificados de la rizósfera de Capsicum anuum L. cv Piquillo, siete aislados del género Bacillus, que incluyen a B. firmus y B. humi, y uno correspondiente a Streptomyces roseolilacinus presentan potencial capacidad promotora de crecimiento vegetal.

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VI. RECOMENDACIONES

Se sugiere evaluar la capacidad promotora de crecimiento vegetal de los aislados bacterianos identificados en plantas a nivel de laboratorio e invernadero.

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VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Singapore: Springer Singapore; 2016. Available from:

http://link.springer.com/10.1007/978-981-10-0388-2

2. Aroca R. Plant Responses to Drought Stress [Internet]. Aroca R, editor.

Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg; 2012. 466 p. Available from: http://link.springer.com/10.1007/978-3-642-32653-0

3. Dhananjaya Pratap S, Harikesh Bahadur S. Microbial Inoculants in Sustainable Agricultural Productivity [Internet]. Singh DP, Singh HB, Prabha R, editors. Vol. 2. New Delhi: Springer India; 2016. 319 p.

Available from: http://link.springer.com/10.1007/978-81-322-2644-4 4. Bishnoi U. PGPR Interaction. In: Advances in Botanical Research

[Internet]. Elsevier Ltd; 2015. p. 81–113. Available from:

http://dx.doi.org/10.1016/bs.abr.2015.09.006

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Int J Syst Bacteriol [Internet]. 1992 Jan 1;42(1):166–70. Available from:

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bin/wdbcgi.exe/doyma/mrevista.fulltext?pident=13059055

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7. Valencia Zapata H. Manual de prácticas de microbiología del suelo.

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ANEXOS

Anexo 1. Mapa de la zona de procedencia de las muestras de suelo rizosférico de Virú, La Libertad (S 08°24’18”, W 78°51’18”) provistas por el Laboratorio de Fisiología Vegetal de la Universidad Nacional de Trujillo. El mapa fue realizado en el Software QGIS versión 3.10.2. DC Desierto costero, Urb Zona urbana, Agri Zona agrícola, EM Estación de Muestreo. Imagen tomada de Asmat, C. y Mialhe, E.; 2020 (38)

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Anexo 2. Parámetros fisicoquímicos de las muestras de suelo provistas por el Laboratorio de Fisiología Vegetal de la Universidad Nacional de Trujillo para el aislamiento de aislados bacterianos. Imagen tomada de Cruz Valderrama, B. y Chaman Medina, M; 2019 (29).

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(44)

Anexo 3. Electroforesis en gel de agarosa 1% teñido con SYBR Safe de cada muestra de ADN genómico de los aislados. El ADN del fago λ (50 ng) fue utilizado como estándar. 1. Ca1. 2. Ca2. 3. Ca3. 4. Ca4. 5. Ca5. 6. Ca6. 7. Ca7. 8. Ca8. 9. Ca9. 10.

Ca10. 11. Ca11. 12. Ca12. C-. Control negativo.

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(45)

Anexo 4. Electroforesis en gel de agarosa 1% teñido con SYBR Safe del producto de amplificación por PCR del gen de ADNr 16s de cada aislado. Cada producto amplificado provino de muestras de ADN genómico puras o diluidas en determinadas proporciones (v/v). M. Marcador de peso molecular de 1Kb (250- 10000 bp GeneRuler Thermo Scientific™). 1. Producto amplificado de ADN de Ca1 diluido en 1:30. 2. Ca2 diluido 1:5. 3. Ca2 diluido en 1:10. 4. Ca2 diluido en 1:20. 5.

Ca3 diluido en 1:25. 6. Ca4. 7. Ca4 diluido en 1:5. 8. Ca5. 9. Ca5 diluido en 1:5. 10.

Ca6 diluido en 1:10. 11. Ca7 diluido en 1:10. 12. Ca8 diluido en 1:30. 13. Ca9. 14.

Ca10 diluido en 1:5. 15. Ca10 diluido en 1:10. 16. Ca11 diluido en 1:10. 17. Ca11 diluido en 1:50. 18. Ca12 diluido 1:5. 19. Ca12 diluido 1:10. 20. Ca1. 21. Ca2. 22. Ca3.

23. Ca6. 24. Ca10. 25. Ca8. 26. Ca9. 27. Ca7. 28. Ca8. 29. Ca9 diluido en 1:10. 30.

Ca11. 31. Ca11 diluido en 1:5. 32. Ca12. C-. Control negativo de PCR. CE. Control negativo de extracción de ADN.

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Anexo 5. Electroforesis en gel de agarosa 1% teñido con SYBR Safe de la purificación de productos amplificados previa a secuenciamiento de tipo Sanger. Cada producto purificado provino de muestras amplificadas del gen de ADNr 16s puras o diluidas en determinadas proporciones (v/v). λ. ADN del fago lambda utilizado como estándar (50 ng). M. Marcador de peso molecular de 1Kb (250-10000 bp GeneRuler Thermo Scientific™). 1. Ca1. 2. Ca1 diluido 1:5. 3. Ca2. 4. Ca2 diluido en 1:5. 5. Ca3.

6. Ca3 diluido en 1:5. 7. Ca3 diluido en 1:10. 8. Ca4. 9. Ca4 diluido en 1:5. 10. Ca4 diluido en 1:10. 11. Ca5. 12. Ca5 diluido en 1:5. 13. Ca5 diluido en 1:10. 14. Ca6. 15.

Ca6 diluido en 1:5. 16. Ca7. 17. Ca7 diluido en 1:10. 18. Ca7 diluido 1:30. 19. Ca8. 20.

Ca8 diluido 1:10. 21. Ca9. 22. Ca9 diluido en 1:5. 23. Ca9 diluido en 1:10. 24. Ca9 diluido en 1:30. 25. Ca10. 26. Ca10 diluido en 1:5. 27. Ca10 diluido en 1:10. 28. Ca10 diluido en 1:30. 29. Ca10 diluido en 1:50. 30. Ca11. 31. Ca11 diluido en 1:5. 32. Ca11 diluido en 1:10. 33. Ca11 diluido en 1:30. 34. Ca12. 35. Ca12 diluido en 1:5. 36. Ca12 diluido en 1:10. 37. Ca12 diluido en 1:30. C-. Control negativo.

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Anexo 6. Tamaño de secuencia de ADNr 16s de cada aislado bacteriano evaluado y porcentaje de similitud con la accesión de GenBank más emparentada.

Aislado bacteriano

Tamaño de secuencia

ADNr 16s

% de similitud con accesión más emparentada

Código de accesión de GenBank más emparentada

Ca1 627 pb 100 AB184167

Ca2 833 pb 99.76 AY953148

Ca3 893 pb 99.89 ASJC01000029

Ca4 665 pb 100 CP002905

Ca5 667 pb 99.85 AY953148

Ca6 906 pb 100 AB009933.1

Ca7 730 pb 99.73 MRZO01000018

Ca 8 831 pb 100 AJ276351.1

Ca 9 800 pb 95.89 D16268.1

Ca10 657 pb 96.26 D16268.1

Ca11 986 pb 100 JJMH01000057

Ca 12 985 pb 97.15 AJ726210.1

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Anexo R.R N°384-2018/UNT

RECTORADO

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO DECLARACIÓN JURADA

Los autores suscritos en el presente documento DECLARAMOS BAJO JURAMENTO que somos los responsables legales de la calidad y originalidad del contenido del Proyecto de Investigación Científica, así como, del Informe de Investigación Científica Realizado.

Título: Identificación molecular de bacterias con potencial capacidad promotora de crecimiento vegetal aisladas de la rizósfera de Capsicum annuum cv. Piquillo

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA PROYECTO DE TRABAJO DE INVESTIGACIÓN ( ) (PREGRADO)

PROYECTO DE TESIS DE PREGRADO ( ) PROYECTO DE TESIS DE MAESTRÍA ( ) PROYECTO DE TESIS DE DOCTORADO ( )

INFOME FINAL DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA TRABAJO DE INVESTIGACIÓN (PREGRADO) ( ) TESIS DE PREGRADO ( X ) TESIS DE MAESTRÍA ( ) TESIS DE DOCTORADO ( )

Equipo investigador integrado por:

N° APELLIDOS Y NOMBRES FACULTAD DEP.

ACADÉMICO

CATEGORÍA DOCENTE ASESOR

CÓDIGO DOCENTE ASESOR NÚMERO DE MATRÍCULA ESTUDIANTE

AUTOR COAUTOR ASESOR

1 Asmat Ortega, Cristian Daniel

Ciencias Biológicas

- 1030400111 Autor 2 Chaman Medina,

Mercedes Elizabeth

Principal 2684 Asesora

Trujillo, 19 de setiembre de 2020

………

FIRMA

………

FIRMA

DNI 71433953

DNI 17912678

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Anexo R.R N°384-2018/UNT

RECTORADO

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

CARTA DE AUTORIZACIÓN DE PUBLICACIÓN DE TRABAJO DE INVESTIGACIÓN EN REPOSITORIO DIGITAL RENATI-SUNEDU

Trujillo, 19 de setiembre de 2020

Los autores suscritos del INFORME FINAL DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA

TITULADO: Identificación molecular de bacterias con potencial capacidad promotora de crecimiento vegetal aisladas de la rizósfera de Capsicum annuum cv. Piquillo

AUTORIZAMOS SU PUBLICACIÓN EN EL REPOSITORIO DIGITAL INSTITUCIONAL, REPOSITORIO RENATI-SUNEDU, ALICIA-CONCYTEC, CON EL SIGUIENTE TIPO DE ACCESSO:

A. Acceso abierto ( X ) B. Accesso restringido ( ) C. No autorizo su publicación ( )

Si eligió la opción restringido o NO autoriza su publicación sírvase a justificar _____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

ESTUDIANTE DE PREGRADO: TRABAJO DE INVESTIGACIÓN ( ) TESIS ( X ) ESTUDIANTE DE POSTGRADO: TESIS DE MAESTRÍA ( ) TESIS DE DOCTORADO ( ) DOCENTE: INFORME DE INVESTIGACIÓN ( ) OTROS ( ) Equipo investigador integrado por:

N° APELLIDOS Y NOMBRES FACULTAD DEP.

ACADÉMICO

CATEGORÍA DOCENTE ASESOR

CÓDIGO DOCENTE ASESOR NÚMERO DE MATRÍCULA ESTUDIANTE

AUTOR COAUTOR ASESOR

1 Asmat Ortega, Cristian Daniel

- 1030400111 Autor 2 Chaman Medina,

Mercedes Elizabeth

Principal 2684 Asesora

………

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DNI 71433953

DNI 17912678