Anticuerpos anti HLA
Métodos de Detección
TM. Manuel Jimenez S.
Laboratorio de Histocompatibilidad
Introducción
Las técnicas de Histocompatibilidad en el trasplante de órganos
sólidos ha ido evolucionando desde que la técnica de Crossmatch
fue descrita por primera vez por el Dr. Paul Terasaki. Sin embargo, el
objetivo final de estas técnicas se mantienen inalterables en el
tiempo:
“Entregar una estimación confiable del riesgo inmunológico de un
receptor para trasplante, en el contexto de sus potenciales
donantes”, como un complemento a la evaluación clínica.
Anticuerpos anti-HLA
• Los anticuerpos HLA específicos presentes en el
receptor al momento del trasplante o que se desarrollan
como producto de este, son serios factores de riesgo
que disminuyen la función del injerto y la sobrevida del
paciente.
• Hasta un tercio de los pacientes en lista de espera para
trasplante poseen anticuerpos preformados anti HLA.
Francia 25% Chile > 50% PRA
E. Unidos 32% (2007) 30%
J Am Neprhrol 21:1398-1406, 2010 (2008) 26.5%
(2009) 26.9% (2010) 29.7 %
Vías de sensibilización
Métodos de detección
Técnicas celulares Técnicas de fase sólida
Detección de anticuerpos linfocitotóxicos
PRA-CDC
•
El suero a estudiar se enfrenta a un panel celular. Corresponden
a linfocitos tipificados para antígenos HLA ABDR. Estos
linfocitos son conservados en nitrógeno líquido a -192ºC.
•
Este panel debe ser representativo de la distribución de
antígenos HLA de la población.
• El suero del receptor es mezclado
con los linfocitos del panel en
pocillos individuales.
•
Se añade complemento y un
colorante vital.
•
Si el suero posee anticuerpos
que se unen a la superficie
celular con suficiente densidad:
se activa el complemento.
•
Se produce la muerte celular que
es identificada mediante el
colorante vital.
Lectura de Placas de PRA-CDC
“1”Reacción “2”Reacción
“8”Reacción
“4”Reacción
“6”Reacción
0-10%Células muertas 11- 20%Células muertas 21- 50%Células muertas
81-100%Células muertas 51- 80%Células muertas
(Negativa) (Negativa) (Positiva)
Nº de células con reacción positiva x 100
% de PRA
Nº total de células del panel
DESVENTAJAS
-El % de PRA en un mismo paciente puede variar dependiendo del panel que se esté usando, lo cual no significa un cambio en la cantidad de anticuerpo.
-Paneles comerciales pueden no necesariamente representar la frecuencia HLA de la población. -Baja sensibilidad
-Falsos positivos resultantes de la participación de anticuerpos no HLA, autoanticuerpos (anticuerpos IgM)
- Falsos negativos en el caso de bajos títulos de anticuerpo (no se activa el complemento)
VENTAJAS
-Criticada por su baja sensibilidad, el PRA es una medida de la
sensibilización anti HLA.
-Es un indicador útil para estimar el riesgo de rechazo agudo y potencial rechazo hiperagudo.
-Es una buena técnica para detectar Ac IgG que fijan complemento
(IgG1-IgG3).
-Equipamiento “sencillo”
-Bajo costo en comparación con otras técnicas.
Detección de Anticuerpos anti-HLA por
métodos de fase sólida
• Estas metodologías de fase sólida utilizan únicamente
moléculas de HLA solubles o recombinantes.
-Las moléculas purificadas de HLA se encuentran adheridas a medios de fase sólida (plataformas ELISA) o a microesferas (Lúminex o Flow PRA).
-Estas unirán sólo anticuerpos anti HLA presentes en el suero del receptor.
-Para detectar estos anticuerpos unidos al antígeno purificado, se utiliza un conjugado enzimático (ELISA) o un conjugado de anticuerpos anti IgG marcados con un fluorocromo. (microesferas)
Lúminex
Tecnología XMAP
Red laser reads the bead, i.e. the target
Detección de Anticuerpos anti HLA
Lúminex
•
Screening:
Determina cualitativamente Clase I y/o II entregando resultados:
Positivo o Negativo para ac. Anti HLA clase I Positivo o Negativo para ac. Anti HLA clase II • Especificidad ID
Especificidad Clase I
50 haplotipos de diferentes individuos
Especificidad Clase II
30 haplotipos de diferentes individuos
• Especificidad con Antígenos Individuales Single Clase I
93 antígenos purificados de líneas celulares
Single Clase II
Luminex Single / PRA virtual
Ejemplos
• R1
vPRA
: 5%
Anti: A25, A34, A43, A66, B37, DR103
• R2
vPRA:
62%
Anti: A2, DR4
• R3
vPRA:
0%
Anticuerpos anti HLA en
Anticuerpos anti HLA en Luminex
Luminex
Ventajas
Ventajas
Discrimina entre anticuerpos anti HLA
clase I y II
Detecta Anticuerpos fijadores y no fijadores
de complemento
Permite análisis complejos perfiles de anticuerpos en
pacientes hipersensibilizados
Otorga la posibilidad de definir mismatch aceptable y no
aceptables
“Crossmatch Virtual”
En 1969 un artículo publicado por Patel y Terasaki, demostraron inequívocamente que el factor de mayor riesgo en el rechazo hiperagudo en el trasplante de órganos sólidos, fue la presencia de DSA en el suero del receptor.
Esto se convirtió en el mayor descubrimiento para los Laboratorios de HLA, estableciendo el Crossmatch citotóxico en LT como un requisito técnico antes de trasplantar. Resultados positivos se establecieron como una contraindicación a trasplantar.
La técnica original poseía una estimación de falsos positivos de un 20%, demostrando que no era los suficientemente especifica ni sensible para detectar los anticuerpos relevantes.
Desarrollando a través del tiempo ensayos que fueran solucionando estas limitantes.
Crossmatch por citotoxicidad dependiente
de complemento (CDC)
-El Crossmatch corresponde a una reacción entre el suero de receptor y los linfocitos del donante en presencia de complemento y colorante vital.
-Al igual que en Screening citotóxico, el resultado es considerado positivo si una considerable población celular muere con la activación del complemento.
Interpretación Resultados de XM CDC
Linfocitos T Linfocitos T (AHG) (AHG) Linfocitos Linfocitos B B Anticuerpos presentes Anticuerpos presentesNegativo Negativo No se detectan ac. contra antígenos HLA del donante.
Positivo Positivo Ac. Anti HLA clase I Ac. Anti HLA clase I y II
Ac. No-HLA
Negativo Positivo Ac. Anti HLA clase II Ac. Anti HLA clase I débil.
Ac. No-HLA
Positivo Negativo Probablemente Ac. No-HLA
Crossmatch por Citometría de Flujo
-Fue descrito por primera vez en 1983.-Detecta anticuerpos independiente de si fijan o no complemento.
-A la incubación de células y suero se le añade un conjugado de ac anti IgG humana y fluorocromo, el cual se unirá solo a los ac unidos a la superficie celular.
-Anticuerpos dirigidos contra proteínas especificas de linfocitos T Y B marcados con distintos fluorocromos pueden ser añadidos permitiendo definir célula blanco.
Valores de referencia positividad Alo Crossmatch
Citometría de Flujo- ISP. Mediana +2DS
Sangre, Ganglio, Bazo
RMF
MESF
LT CD3 +
> 1.0
> 1876
LB CD19 +
> 2.0
> 4595
Ventajas de FCXM
• Sensibilidad, 5-10x sobre XM-CDC/AHG
• Se analiza mayor número de linfocitos con mayor
pureza.
• Puede cuantificarse la concentración de los
anticuerpos que producen positividad (
ratio-MESF
)
• Detecta anticuerpos fijadores, y no fijadores de
complemento
• Detecta bajos niveles de anticuerpos
Interpretación de
los resultados
Interferencias en FCXM
Drogas Inmunosupresoras Resultado Falso Positivo/Negativo
Modificación FCXM
Tymoglobulina LT Beads M-280
Rituximab LB Aumento Concentración Pronasa
IgIV LT/LB Aumento Lavados post incubación
Anticuerpos NO HLA Resultado Falso Positivo
Modificación FCXM
Autoanticuerpos (IgG) LT/LB Auto XM
DSA: Relevancia Clínica
-92 XM
-52 sueros
Correlación de resultados en la
detección de anticuerpos anti HLA entre
el Crossmatch por Citometría de Flujo y
Lúminex.
Laboratorio de Histocompatibilidad Departamento Biomédico
