INFLUENCE DU SUBSTRAT SUR LA PRODUCTION DE PECTINASES D' ASPERGILLUS

'm

UNIVERSIDAO

AUTONOMA

METROPOLI~A#A

c a s a s a a t a a l ~

-

-

_{UNIDAD IZTAPALAPA}

ORSTOM

UNIVERSITE DE TECHNOLOGIE DE COMPIEPNE

" C 3 S

J.

INFLUENCE DU SUBSTRAT SUR

LA PRODUCTION DE

PECTINASES

D'

ASPERGILLUS

niger

PAR

FERMENTATION EN MILIEU SOLIDE

PROJET

DE

FIN

D

ETUDES

REALICE A MEXICO, D.

F.

.

PAR ~ R N A U D

CASANOVA

REMERCIEMENTB

Se tient

a

exprimBr mes sincbres remerciements

a

Monsimur

-

Smbastianoc ROUSSOS et Moneieur Mariano Guttierei pour lmur

7

acceuil au emin

de

leure laboratoires de

1

a U.&.M.

I.

CI

J m rmmmrcim

vivmmmnt Mon8isur Ernesto Favela pour

se38

conseils

6clairCi et Lion aide pmrmansnte ainsi qum

toutm

1'6quipi

des liboritoirss

del

Fermentation e n milieu molida et

dm

1'ORSTOM pouur leur acceuxl at leur Prki:iRUSn collaboration.

PLAN

titrmr "Influmnce

du

mubstrit sur

la

production

d.

pectinasme d*

WrrijJb-nsr

par

fermentation mn milimu Bolide"

p i r

Arnryd CASANOVPi

ReWlME

SUmMARV

REEUMEN

INTRODUCTION

I.PRESENTfiTION DE L'ENTREPRISE

1.1. Presentation de 1'ORSTOM

f . 2 . . Pr6eentition de la

U.A.m

1.3. Accord de coop8ration U.6i.M.-ORSTOM

11. ANALVSE BIBLIOGRAPHIPUE

2.1. La "pectins"

2.1.1. Nonmnclature

2.1.2. Structure et composition

2 . 2 . Les enzymes pectinolytiques

2 . 2 . 1 .

Le6

polyyalacturonases

2 . 2 . 2 . Les lyases

2 . 2 . 3 . Les pectines est8rase6

2.3. Production de pectinases sur diffdrents milieux

2.4. Utilisation des pectinase6 dans

1' industrie aero-alimentaire

111. MATERIEL ET METHODES

3 . 1 . Production de pectinaces p a r

fermentation soli de

3.1.1. Le microorganisme

5.1.2. Preparation de 1' inoculum

3 . 1 . 3 . Les milieux de culture

3 . 1 . 4 . La Cermentation

3.1.5. Rlcuplrition das extraits enzymatiques

D 14

P

1s

P

17

P 17 P 17 P 17

P 19

P

17

I

b

3.2. fldthodes d’analyse des activitas 8nrymatiqu.m p

21

3.2.1. ACtlVlt6 de l’end0polygalacturonr.e P 21

3.2.2. ñctivit6 de l’exopolygalacturonasa P 21

3.2.3. FIctivitB de la polygalacturonase lyase p 22

I V . RESULTPTS ET DISCU661ON P 23

4.1. Elaboration des milieu* do Culture P 23

4.1.1. Fermentation sur baga668 de Canne

a

6ucrm p 23

4.1.2. Fermentation 6ur pulpe de c a f 6 P 23

4.2. Elaboration et critiques de6 methodes de dosage

4.2.1. FIctivI t6 endopol y yalacturonase

4.2.2. FIctlvit6 wxopolrealacturonníe

4.2.3. Activit6 polypalacturona~e lyase

4.3. La production d‘cnzymes

4.3.1. HypothBem

4.3.2. Etude quantitative des rósultats

4.3.3. analyse qualitative

4.3.4. SynthLse et

analyse

des rdsultats

CONCLUDION GENERFILE

REFERENCE6 BIBLIOGRFIPHIPUES

FINNEXES

P

24

P 2s P 26

P 27

P

33

P 33 P 33

P 38

P 43

P 4 5

P 48

,-

1

R E W E

Danm

1s cadre dm man proJmt dm fin d'6tuds

m n

vum

d'obtmnir 1s diplomm d' inglnimur

dm

l'Univmrmit6 dm Tmchnologim

d.

Compibgnm.

]'ai

travail16 &rant unm pdrioda da mix inoim

(Flvrimr 1989

-

Juillmt 1989) u.

m m i n

d'ura 4quipm

d.

rmchmrchm

franco-mmxicainm dan8

Ism

laboratoirms & Ir "Univwrmidrd

Piutonoma Wmtropolitrna'*

h

Mmxico. Lm sulmt trait6 6tait

l'influmncm du substrat sur l a production

d.

pmctinammm d'

~ # l l u m

dw

n'CH4 par fermmntation en milieu

solid.

(Fils).

X i

mximtm quatrm famillmm da pectinassmi lyammn,

mndopolygalacturonrsim, mxopolygalrcturonasms mt pmctinm

mmt6ramms. 8mulm l a p'roduction &a trois prmmilrmm a 6t6

anal

y m 6 m .

Danm un prmmimr tmmpm. dmm m6thodmn d'analymm dmm

activit6m pmctlnolytiqrum ont 6th 6laborCmm:

-L'activit6 wndopolygalacturonamm mat analym6m par

-L'activit6 mxopolyprlrcturonique set dótmrmin4m par

-L'activi t6 pmct

i

nrmm lyasm met mmmur6m par

vimcomin6trim.

colorim6trim.

spmctrophotom~trim aprbm dialymm dms mxtraiti mnzymatiqums.

Par

la

suits, trois FUE mur dmm milimux diff6rmnt.m

(bagamsm dm cannm h mucrm mt pmctinm industrimllm, bagamsm &

cannm h mucrm et dcich polyQalacturonique, pulps

de

caf6) ont

6t6 rdalis6mm. L m s cinbtiqums dm production mnrymatiqum ont 6t6

.

muivim..

Lis r6multatm montrmnt qum 1mm quantit6m d'mnrymmm

produitwm par FM8 varimnt d'un milimu

h

l'autrm mt qum l a

composition du complmxm pmctirwlytiqum est Lgalmmmnt trbm

diff6rmntm muivant 1s substrat utili.&.

Cmci

impliqum q u i 1s

caractbra inductmur du mubmtrrt mmt dirmctmmmnt dWmndrnt

dm la

i

For

ny proymct

of

mnd of studimw i n vmmn to obtain thm

mnginmr

d m g r m m

of thw '"Univmrwit6

dr

Tmchnologim

dm

Compibgm",

I havm norkmd during

six

monthmw IFmbruary 1989

-

July 1989)

i n

a franco-maxican rammarch w t a f f i n tho laboratorlaw of thm

"Univmrwidad Putonomr ilmtropolitana" i n

Mmxico

city. Thm

wubjmct trmatmd Was thm influsncm of thw mubmtratm o n thm

production of pmctinawms of

~

~

~

by solid stat.

~

n

r

r

farmintation i88F).

Thmre arm four f a m i 1 ims of pmct

i

n a n w t

mndopoly~alacturonasew, mxopolygalacturonrsms, lyasms and

pmctin mstmrawmm. Only thm production of thm first thrmm nam

a M

1 ysmd.

Pt firmt, analytic mathods of pmctinolytic activitimw

nmrm

mlaturatmd:

-Endopolygalacturonic activity Was analysmd by vimcomimmtry

-Exopolygalacturonic activity naw dmtmrminmd by colorimmtry

-Pmctinawm

_lyawe

activity W a s mmeurmd by wpmctrophotommtry

aftmr diriywim of mnzymatic mxtracts.

Aftmr, thrmm

88F

on difmrmntm substrata8 ísUQ8r cana

bagrssm and industrial pmctin. sugar cana bagamma and

polygalacturonic acid.

coffmm

pulp)

warm

realised. Tho k i m t i c s

of mnzymatic productions Ware followed.

Thm rmmultw mhon that thm quantitime

of

mnzymmw producmd

by BBF vary from

on.

middlm to anothmr and that thm Compomition

of the pmctimlytic complmx

im also

vmry differant sccording to

thm wubstratm uwmd. i t implicatms that thm inducmr charactmr of

thm subetrata

is

directly dmpmndrnt of the pectin natura i t

5

Por fin

dm

o b t m m r m1 diploma

dm

ingmnimro

dm

ir

"Univmrmitb

d.

Tochnologim

d.

Conpibarn", Efmctum

mi

m8tancia

d.

fin

da

carrera Id. fmbrero

d.

1989 a julio

dm

1989) i n un

mquipo dm invmstiaacion franco-nmxicano mn

io8

laboratorio8

d8

la

'aUnivmr8idad flutonoma Plmtropolitans" mn Plmníco U.F. El

mubjmto dml trabajo fum l a influmncia d.1 8umtrato mobrm l a

produccion

dm

pmctinama8

d.

W n t i U r Por

fmrmmntacion mn rnmdio molido

(FPl8).

w

cuatro f ami 1

i

a

.

dm pmcti nam.81

mndopoligalacturona~a~, mxopoligalrcturonisam, lia8.8, pmctin

mmtmra8as. 8010 mm analizo

la

produccion

d. lam

trm8 primram.

pi1 inicio

dm

mstm trabajo.

m m

ml&bcroraron lo. nmtodom dm

-8. analizo l a actividad mndopoliaalacturonama por

-80 dmtmrnino l a actividad ~wxopolipalaeturotuma por

-8. nidio l a actividad lia8a por mpmctrofotommtria dmmpumm

analimim

dm

lam

actividad.. pmctinolitieami

vi8cownmtr ia.

colorinmtria.

dm

lm dia1i.i~

d.

lorn

mxtractom rnzinaticom.

Ommpumm, 8. rialtzaron trmm corrida.

dm

FMS 8obrm

difmrmntm8 nmdiom (baga00 dm cana de azucar y pmctina

indu8tria1,

bagamo

dm can&

d.

azucar y asido poligalacturonico.

pulpa

dm

cafmi.

8m mfmctuaron lam cirnticam

dm

produccion

mnzimatica.

LO. rmmultadom mummtran qum la8 [email protected] dm mnzirnam

producida8 por FH8 varidn dm un medio a otro y qum

la

compo8icion d.l complejo mnzimatico em

muy

difmrmntm con

4

INTRODUCTION

Lwm mnzymws pwctinolytiques (pectinase61 trouvwnt urn

tr¿a

large

application dan. l’industria agro-alimentaire. Lmur

principal. utilisation est l a clarification des jus dm fruits

contenant dms substances pwctiques en suspension í pomma.

raisin. mangua,.

. .

> .

Lwur emploie au niveau industriwl wntrainw

u n pain’ Iconomique wt l’obtwntion d’un produit fin1

dw

meilleure qualité. Bisn q u e ’ c@e wnzymes soient utilie6ee

m n

tr¿m petits quintité, l a &mande nw cosss

de

s’accroitre depuis

1976 au Meriqum wt dan6

le

monde (Survey 1978). En 1984, 1-

Mmxlque d importé 3.413 k g de pwctinases pour u n montant dw

137.223 ‘u.s.., en 1985, 1 1 importa 23.149 kp équivalsnt b

346.439 u.0.8. Ce secteur e n pleine croissance rwpésmntmrd mn

1991 une somms globrle de 1.7 millions de dollars. (sourcw:

Banquw National.

du

Commerce Extérieur de Moxico).

wchIma) :

11 wxistw dwux vo.ies de production de COS wnzymwm (voir

-

La culture en milieu liquide.

-

La firmentation e n milieu solide.

ñctuwllwmwnt, l a majorit6 dws procéd6s industriwls dw

production d’wnzymws pmctinolytiqums utilisent

la

culturw mn

milieu liquid.. Le Menique ne produit p a s de pectinaews. Le

marché national Bot conti.8lé par quatre grrndws wntrepriewi

importatrices. Chacune commercialisw S d propre marquw et sws

produitr provlmnnsnt de filiales implantées en dwhoro du

territoirw mwxicain:

-

ENMEX

s.a.,

fillale

de MILES Laboratories íU.S.ñ.i.

-

QUIMORGAN 8.ñ.. reprémwntdnt de GIST BROCADES

-

ROHM and HññB (R.F.ñ.1

-

PROBST

Fermentation Industries (FRANCE)

La prix dms enzymes varie

seion le

marché intwrnational et

La compdtition sst +Or+-., 1. march6 réduit. I1 sem’blw dons

diCCiciie da i m pénétrer. Cependant, le coüt dm cew produits

(pdyds e n devises1 oblige les diett..ibuteui-s et les utilisateurs

b chercher de nouvelles alternatives. De plus, une des

priorités que s’est fix6

le

nouveau gouvernement mexicain est

dm r6duirw wwm importations.

ñu OIpdrtwm@nt de Biotwchnologie de la U.A.M. I,u n

groupe de rwcherche

-

en collaboration d V B C 1’ORSTOM

-

développe une technologin employant la Fermantation

en M i

1 leu

Solide (FMS) pour l a production de biomaese et d’enrymws. Leur

but wst dw développnr uno nouvelle trchnologie pour l a

production dm pectinases dfin de la commercialimer au niveau

induwtriwl.

5

inoculation,

incubation &

ZS-40'C, 1-6 J O U I 6

6

LE

stage que j’ai effectué

au

sein des laboratoires d

.

la

U.A.M.

EntrE d a m le cadre de

CE

projet.

MOO

travail

a

6 t h

d’une part de mettre

au

point

dES

méthudas d’analy6E de6

activités p9ctinolytiques utilisables

a u ,

cnpartement Et de

compsrer

les

pTOfil6

d’activités des enzymes p e ~ t i m l y t i q u s s

obtenus

p a r

fermentation e n milieu solide

a

partir d’un

memE

microorganism.

(Aspergillus

niger

n e

CH4)

mais cur de6

substrate diff6rmnts.

LES enzymes

peCtinolytiquES peuvint EtrE

separéem

,

e n

quatre

s o u s - g r ~ ~ p m s : endopolygaldcturonasm,

E x O p O ~ y ~ a l a C t U r O n a ~ ~ ,

lyase

et DRCtirlB esterase compte tEnU de5

difféisnces

de

spéc1f1cité et

da

mode d’bction décrits au

chapitre

I.

D e nombreuses inethodes

de do:-iaqe

des activités

de

a

modifié E t Utili66 eont

les

suivantes:

ces

différentes

Enzyme6

Ont BtB deci-ites.

L e s

methodes que l‘on

e x O p O ~ y ~ a ~ a C t U r O n a s e :

<néthode colorimEtrique d6CritE par

endopolygalacturonasr:

mesure p a r

uiscosimétrie Blabolle

lyase:

methode spectrophotometrique (Fogarty e t Ward,

Miller

i19591.

par

D.

Dufoui- ( 1 9 8 7 ) .

1973).

adaptée

de

facon suffisamment

fonctionnelle

pour

et18

PECtinE 06teraSe:

aucune méthode de dosage

n * a

pu etre

Uti

1 iSbE.

L a

composition des pectines varie énuimement suivant

IEU~

origins.

La

longueur

des chatnes,

le

taux

ae

méthoxylation et

la p r é s ~ n c e de composés autros que l’acide yalacturonique eont

leis p r i n ~ i p a l s s

sources

de différencee (aspinall et ai.,

1958). Dane l a

mesure o u les

E n Z y m e G

pectinolytiques sont inductibiee

(Maldonado e t al.,

19891,

i l est ~ntérdsoant

d’utiliser divers

substirats pectiqires

i o r s

des fnrmentatiiní pour obtenir de5

~ r o f i l s d’activités

des diff+rentes

e n z y r n o s .

Ceux-ci pouvant

par i d

EuitE

etre

c n m p a ~ - é s

qualitatirement

-

enzyme

predominante

-

et quantitativrment

-

milieu

SUI

lequel

les

dCtiVitb6 60nt

1ES

PIUS &levbe6

-.

La

littérature ne relate

pas

d’dtudes

U P ce

type e n milieu

solide.

Par

contre, i*ef+et inductaur du sutistrat

a

été étudió

en

milieu

liquide.

Ces etudes véalis8es

d

partir de diverees

différencee

quantitatives

tr8e

faibles

sur les profils

d’activitóe

suivant la source PeCtiqUe utilisée, l’aepect

qualitatif

n’a

pas été soulevé.

@ouches

d’AspergillU6 niyer

(6avdl et

al..

19B.21

montrent des

L’intérRt de l’étude

proposee

est imnirdist

dans

la

mesure

d’fispergillus

n i g e r n’ CH4

l’utiiisation

de

différentes sources

pECtiqueS,’aboutit o u

non

a

l’obtention de profils d’activité

différents.

Si

la réponEe est positive,

on

pourra déterminer la

source PeCtiqUE la

p l u s

adaptée

a

telle

ou

telle application

pectinolytiques

p a r Asoeroi 1 ius

nioei‘

‘ir

CH4 en fermentation

O u

Elle

devrait

permettre

de

S a V O l I Si

dan6 le Cas

en miliwu calids.

Le c h a i x de la saurce pectlque pour une praductian

inductrimll. depend de nambreux parambtrss. L’Btude eff‘octuee a

permi6 de camparer le6 facteurs prapres I l a production

-

facteurc qualitatiCs et qu?ntitatifc Et facteur tamps (temps de

fwrmentatian nBt66Sair. paur obtenir 80%

de

la praduction

m i x i m r l a

dei p.ctinasaei

-

pour trois substrats diffdrantsi

pectin. 1 ndustr i a 1 1

e

d’ at‘ I g i ne C L tr ique, ac i de

I

F'RESENTFiT I O N

DE

I. PREBENTñTION

DE

L'ENTREPAISE

1.1. PRESENTPTION DE L'ORSTOV

L'institut

Frrngais de Rscherche ücientifiqui

pour

le

DIveloppement

en

Cooperation est

un

etabliesement public

A

caractere scientifique et technologique. I 1 est plapé sous

l a

double tutelle du minielbre charge

de

la recherche et du

ministare

c h a r p 6 de l a

cooperation et du developpement.

La

mission

de

cet institut eet. la recherche e n

cooperation pour

le

developpement des pays et de6 peuplee du

tiere monde.

Dans c e but.,

I'ORSTOM

effectue des recherches

contribuant au pi'ogres economique et

social

des

p a y s

de la

zone

intertropicale et 43sure

une

Stvuctura d'acceuil,

de

formation

e t

d'information

pour

tous les scientifiques franCais et

etrangers

souhaitant

participer

a

la

recherche pour

la

ddvsloppement

en

coopération.

ñu plan international,

1'ORSTOM p a s s e

de6

accords de

coopCration

scientifique

et

technolcgique soit

a v e c

des

giuvsrnements et

des institutions Btrangeres, soit svec des

organismes intcrnationaux.

Le travail e n équipe s'effectue eoit dane les centres

de

l'institut,

eoit d a m

le3

locaux

des institutions des

pays

d'acceuil.

La repartition Qéographique des implantations est

l a

suivante:

France:

siege,

3

centres et 4

antannss

DOV-TOM : b

centres

Afrique et Ocean indien: 18 centres

ñmdrique Latine:

1 1

missions

Ocean

Pacifique et üsie:

7

centres

Pu

total.

I'ORBTOM

possCde

50

implantations dan3

une

quarantsine de pays pour

u n

budget

d r 800

mil lions

de f r a n c s

et

un

effectif de

1500

personnas dont

800 chercheurs.

1.2. PRESENTATION DE

LA U.A.M.

La

IJ.ñ.M.

(Universidad Autonoma Vrt.ropolitana1 est

une

univarsite pluridisciplinaire.

Cette

univernité est composée de

trois unites implantées

d Mexico

(Yochimllco, ñzcapotralco,

Iztapalapa). La "Division de Ciencias Biologicas

Y

de

l a

Salud"

dont fait partie le "Departamento de üiotecnologia" est situ8

a

I

z

tapa

1

apa. Ce. dépar

tement de

hi oi e?c hnn 1 ,IC) i es

lui-meme

9

Microbiologia",

"Area

de

Productos

Naturalss"

i t

"InfraestVuCtura

para Desarol

lo: Plantas Pi loto".

L e i

"pldntam

piloto" (hall de fsrmentations) sont des infraEtruCtUrie pour

dddicacs

a

l'étude

des fermentations en milieu solide.

LES

sujets traitbs sont les suivants:

le

d8veloppement

industriel des DrOjEt6. Une de

CES

UlliteS

68

-PrBtraitement de substrate amylacés.

-Production de protéines unicellulaires par Cermantation

-Production de métabolites 6eCOndolrB6

E n

milieu solide

-Conservation lactique

de

mateiiouh

eniy l a c k .

-Production d'sxhausteurs de goUt

a

pa!-tir d'extraits de

-Dimensionnement

des piocedés:

fermentation solide et

-Contrale informatique de procedes biologiques

-Modélisation mathematique du pl'oces6

de

production de

en milieu solide.

ienrymss,

antibiotiques..

.

) .

levure.

production massive

d'

inoculum.

biomasse par fermentation

solide.

C'est

au

6Ein de CEtte unite que

j'ai

r6alisO mon projet

de fin d'étude.

1.3. ACCORD DE COOPERARTION

ORSTOM-UñM

Dspuis 1981, I'ORCTOM et le Oépaitement de Biotechnologie

de

l a UñM

collaborent

d

un iirogramme de vecnerche. En effet, un

accord de coopération

a

Bté signé 6nti.e

ce6

deux organismes

dans le cadre de l'accord gBn8val de Cuoperation ORSTOM-CONñCYT

aU MexiqUE.

Le6

étudee concernent lee domaines

suivants:

-

Fermentation solide: caractérisation das supports it

-

Reproduction de bactéries lactiques.

-

Microbiologie Et f e ~ m e n t a t i o n s

anaérobies.

-

Valorisation

des

productions

agricoles

par

étude des transferts de

rhaebe.

Cmrmsntation

en

milieu sulide.

Le

financement de c e programme

conjoint est assure

E"

partie par

la

UñM

pour

son

peréonnel

et l e s

infrastructures,

par

I'ORSTOM pour

se6

CbevCheurs et

pa,'

des contrats de

richarche

avoc

des

Orgar8iSmES n a t i o n a u x

et internationaux

iCONñCYT,

IF%,

OEA, CEE).

L '

infrastructure

disponible

porir

i'equipe

de

fsrmentations solides comprend

7

laboi-ato!

,'es

de microbiologie

et d'anslyees et

un

hall-pilota de

f e l l ~ l e n T . ~ C ~ C i i l .

La UüM

souhaite intensifier

sa

coopáration bcimntifique

10

en6eignonsnt-recherche de niveau international danr Is domaine

da6

fsimsntations agro-alimentairis. Le6 ,-Csul tata de ce groups

pourront par la suite Otrs transf4r4s m u secteur produstif

a

I

, , .

,.*---*

A N A L Y S E

i.

1 1

11. ONOLYSE

BIBLIOGROPHIQUE

2.1.

Lñ

“PECTINE”

.

2.1.1. Nomenclature

L.

nommnclature concernant les substances pectiques est

trBs confuse.

U n

comité de saciét&américaines

a

defini

ces

substances comme suit

(KEVtsesz

et. al..

1944; Fogarty et

Kelly):

Substances pectiques:

ie terme designe

les

complexes

crrbohydratbe col loidaur. pvésents dans

les

iou

prepares

a

partir

de) plantes et contenant une irrge proportion d’acide

galacturoniqum.

Les

groupements

caiboxyles

de

l’acide

poiygaiacturonique

peuveiit.

etre p a r t i e l i e ~ ~ n t

est4rifiés

p a r

des groupements

m e t h y l s ou

neutralisés

p a r des

bases.

Protopectines:

C‘e6t

le nom donne a u x

substances

pectiquef

insolubles pr6sente6

danc

les plantes et

d

partir

desquelles les substances pectiques sant extroites.

FIcides pectinlques:

C’e6t le terme utilisé

pour

designer

les

acides

polygalacturoniques

colloil;lu.

contenant

une

proportion

non

nbgliQeabie de Fonctions estl~,iii

m e t h y l .

Pectines:

Ce

sont

les acideb: Pectiniques solubles

possddrnt

une

quantité de fonctlons esther methyl et

un

doer8

de neutralisation variables.

11s

peuvent

p a r

ailleurs former

des

gels avec les

suc-es et

les

a c i d e c sous

certaines

conditions.

acides pectiques:

C’est. le

nom donne aux

substances

composées d’acides polygalacturoniques colloidaux et libros de

groupements esther methyl.

2.1.2. Structure et composition

Les

polysaccharides

pectiques

~ c l n t des

acides

hOtBvo-polygrlacturonlques

(Foparty et Ke!ly).

Oiitre l’acide

U-galacturonique,

les

sucree suivants ont été

isoles et

ceractérie&3

a

partir de polysaccharides pectiqves: L-rhamnose,

L-arabinose,

U-galactose,

U-xylose

et

L-Fucose

iñ3pinall

et:

Canas-Rodriguez,

19568

Aspinall

et

Fanehawe, 1961).

La

composition du

polysaccharide varie

énnrnément

suivant

son

Table

1 s Poi-de Moléculaire de

~ U E ~ ~ U E S

polysaccharides

pest

i

qUES

üourcm

Poids Moléculaire

R8fé*EnCE

pamplemOUiES

23000-71000

Porwal et Chakravarti,

1970

pOmmE,pEChE

25000-35000

Luh et PhaFf, 1951

Orange

40000-50000

Luh E t Phaff, 1951

pomme,

c i t r o n 200000-360000

Newbold

et

Joslyn, 1952

2 . 2 .

LES ENZYMES PECTINOLYTIPUES (PECTINñSES)

Cee

enzymes sont eynthétisees par les végdtaux

m a i s

aussi

par certain,

microorganismes.

LES

enzymes

de dépolymérisation

eont

caractbrisees selon trois crithres

( F o g a r t y

et Kelly)

:

-

Suivant qu’ellee syissent par transelimination

ou

-

Suivant

le Sunstrat !pectins, acide pectique o u

-

Si

la degradation s’efiectue

au

hiisard dan6 la chaine

hydro

lyse.

oligo-D-galacturonate).

o u epécifiquement

a

pat-ti,- de l’srtr8mité non rwductrice.

Kertsesz Et aii.(1944)

diStingUEnt deux grandes ClaSSES

da ces

enzymes:

-

LEE

enzymes

saponifiantec

qui

catalysent

la

d~mlthoxylation

dEs pectines lpectinestérases).

-

L E S enzymes

dépolymérisantes qui i.oiipent les liaisons

alpha 1-4 glycosidiques 50it

p a r i-ydi 0 1 y ~ t .

~ p o l y g a l a c t u i o n a ~ e s )

soit

p a *

tranee!iminatinn

i l y a s r s ~ .

Ces

deux

classes

d‘enzymes

comprennent un nombre

important d’enzymes diffQrentee par leur specificite et/ou

leur

mode d*action. On peut cepandant distinguer trois s o u s - c l a ~ s E 6

d’enzymes de dépolymbrieation (Yeitsesz,

1344;

Deue!

e t

Stutz,

1958;

Fogarty

et

Yelly).

I

2.2.1. Les polygalacruronases

Lee polygalacturonases hydroiysant les liaisons alpha 1-4

de

l a

chaine

pectique

(figure

I ) .

Pour

les

endOpolygalacturOnase5,

1

’hydrolyse enzyinrtique

S E

produit

aU

hasard

a

l’intérieur des chalnes.

Le5

exopoly3aiacturonases,

au

13

FIGURE 1:

MODE D’ñCTION

DES PECTINñSES

PE

1

4

Xs>-+.

1

14

Las

rndthodes de do6age de l'activité

de

c e r onzyrnmr s e

basent moit cur I'apparition de sucres rbductaurs (G.L. Miller.

1959)

soit

sur

la baisee de viecosité d'une solution contenant

de la pectin6

(D.

Dufour,

1967).

2 . 2 . 2 .

Les

1yP66S

.

L'attaque

du

.

subfitrat

par

un

mécanisme de béta

Llimination par

16s'

lyases provoque la formation d'une double

liaison

C4-C5 cur

le monom&re

de l'extremité

non

i6ductrics

nouvellement formee

de

l a

chafne polygaiicturonique (figure

1).

LE

dosage de leur activite est effectué par la

mesure

de

la variation de la densité optique

A

235 nm

induite par la

formation de la double liaison (Fogarty et Word,

19741

.

2 . 2 . 3 .

La pectinestérase

La poctineetérase catalyse l'hydrolyne

des groupemsnts

mrtherméthyl iqums de 1 'aci de pecti nique entrai

nant

1 'apparition

de fonctions carboxyliques

SUI l a

pectine

(Oeuel et Stutz,

1956). (figure 1).

Les méthodes de dosage

do

!'aCtivitii

: ! e s

pectinestérares

reposant soit

SUI^

u n

titrage

doe c a r b o r y ; e c l i b é r a s a

partir du

eubitrat pactique (Kertsasz

et

Lavin, 1?54), 6oit

sur

u n dosage

du methanol

appai-u par chromatoyraphie e n phase gazeuce (Wood

e t Siddiqui, 1971)

ou

par distillation et estimation par

oxydation du formaldéhyde (Holden, 1945)

.

2 , 3 .

PRODUCTION

DE PECTINRSES

SUR DIFFERENT8 MILIEUX.

Oanr

la litterature, i l n'est

pas fait rbférence

A

l'effet

inducteur compare

de

diffbrents substrate e n

FMS. P a r

contre, pour

la culture e n milieu liquide, difiérente articlee

sont coneacrés

b

ce sujet.

Maldonado

et

al.

!1989: ont montree

que si une Faiblm

proportion de 1'endoPG est consti tutive

c h e i

SP, Cette

enzyme

06t inductible.

De

plus, l'emploie de pectine

a

1.%,

d'acide

polygalacturonique

a

1.5%

ou

d'acide

galacturonique

b

1.5% comme inducteur a b w t i t

a

la production

de la

m&me

quantité d'enzymes.

kQoaiura-rilp%L

Par

contre,

Caval

e t

a i . (19821,

qui cirtt LIgalement utiliee

un

~aaficnillUA-nig-er

SP.

ant observe que l'addition

de

pectine

a .

1%

ou

de Pulp6 de Hennequen

a

2%

permstait d'obtenir

le

m@me

proiil d'activitb enrymatique

(meme

induction1 mais que

I'addition

d'acide

galacturonique

b

1%

n'avait

pas d'effet

i nductmur

,

15

.st

!hgalemEnt &tudid.

Dana le cas

Cabezas de Herrera e t

al.

( 1 9 8 0 )

ont

du milieu

de Smith

(2%

d pectine) est plus efficient pour

la

production

de pectinase5 qu’un milieu CoPtendnt

20%

d’extraits

de haricots.

2 . 4 .

UTILISüTION

DES

PECTINES

DüN8 L’

INDUSTRIE

aGRO-üLIMENTülRE

Pour l’industrie agro-alimentaire. lors

de

la fabrication

de jus de fruits

ou de

legumes

,

la dbgradation de la pectine,

constitvant de la paroi cellulaire,

p o s e L I ~ ,

pt-obleme important.

D a m

certain3 cas,

i l

est

nécessaire

d’eiim?iner completement

les

pectines pour ubtbnir

des IUS

limpii?<-!s

(raisin,

pomme

...

I .

Oans

le

Cas des jus d’agrumes,

on

peut maintenir des particules

insolubles

en

suspension e t obtenir un

jus

trouble stabilis4.

Pour Certains produits (compotes, nectars,.

.

. ) ,

l ’ i n t e g r i t h de

l a

cellule est

conservée mais

los pectines

de l a

paroi doivent

etre dégrad&~a.

Bien qui les fruits possedent

u n

prit.entiel enzymatique

pectinolytique,

C E

dernier est tiop faibie pour garantir

une

quslité

e t

une productivite optimum

SUI

les chaines de

transformation.

I 1

faut

donc faire subir

u n

traitement

préalable au pioduit brut. pour obtenir un produit,

final de

bonne qualitá.

Dans

le

cas du

jus

de

pi.iine,

les

voies

de l a

production sont le traitement. par désintéyration, par diffusion

ou

la vole enzymatique.

L a

pectine

Confri‘e

a

l a

suspension

brute des propri4te coloidaies et une viscosité *levee poeant

de.

prblbmes de filtration.

Les

poctinases ant et& utilis4es

p o u r

la premiere +ais

aux

Etats-Unis

e t e n

Allemagne

en 1930

!Vsiasco.

1 9 6 8 ) .

Leur

empicic

entraPne

une

modification

d u

systeme bioiogique

equivalent

B

l’élirninatlor, des p o l y s d ~ ~ h a r i d e s

et

a

l‘addition

d’acide galacturcnlque o u

de

polymelec solubles dans le jus.

LE

ju6 perd

sa

caractéristique de suspension colloidale et est

enrichi

c a r on ne

peut pa6 Bliminer

lea composes formés

(Velascoi

19681. Flu

niveau

dL8 P I O C E E E , les

répercussians de

l’addition de pectinase5 SOnt ies cuivantes:

-

üugmentation des rendements (jussi~i‘i

10 7 . ) .

-

Clarification de6

j u s .

-

Elimination du probleme de filtration (la VitESSE de

-

ürdlioration de

l a

qualité

! ~ i o v e u r .

bouquet et

-

.Extraction plus ropide

des

piyineiiC6 par rupture des

filtration est augmentde de

200 % I .

stabilité du produit final).

Cel

lUlES.

-

Dans le

cas des produit6 Fermantrs comme le

“in,

i l

+aut

ojouter

B

cela la diminution du temps de Fermentation

e t l’augmentation du t.itre alco01ique final dans la

mesure

.

16

les levures, ce qui

n ’ e s t p a s

I C

c a s

de lb pectins.

Finalenent,

l’util isat.iun

de

pectinase6 dan5 l’industi-ie

agro-alimontiire

ss

traduit

p a r

u n

gain

,economiquC important

MATER

I

EL

ET

.

17

,311.

MATERIEL ET METHOOES

3 . 1 .

PRODUCTION

DE

PECTINAGES PAR FERMENTATION

SOL IDE

3.1.1.

L e microorganisme.

Le

microor anisme utilisé

pour

la production

de

pectinases

investigaciones Biomedicas”

de l a UN”I

(Hi~itron

et al

1 9 7 1 ) .

est

1.

asnerni

P

us

niqer

n’

CH4

iealfi

pa!’

1”’Instituto de

Cette nouche est

un

champignon filamenteux. a**-obi strict.

3.1.2.

Preparation de l’inoculum.

Des

erlenmeyers de

250

nl

c:ontenant

110

n1

du

milieu

PDA

iPomme

de teri’e

-

Dextrose

.-

+%gal‘) c o n i

inoculés avsc

1

ml

d‘une suspension de

PPUICS. f i p i P 5

incubation

a

30 ‘C

durant

72

hrs, is0

spores Sont recupérées pai-

51mple 3yitation

en

surface

a

l’aide d’un

bñrreav

aimante e t

a p r e s

addition d’une solution

de Tween

SO

a

0.1%

dan6 l’eau distillée.

3 . 1 . 3 .

Wilieu de culture.

-

composition

Oeux types

de

supports salidss ont 4 t 6 employ861

lo

Bagasse

Table 2: C0mpositio.n de chaque milieu ( e n Q pour SO00

d.

matibra humid.):

sur support (bagasse) pulp=

*

.f.c

MBPI MBAPG MPC

scs

115.500 1 15. SCO

o.

O00

PECTINE 7.500

o .

000

o.

O00

Ac. POLYGñLACTURONIQUE 0.000 7.500

o.

O00

SACCHAROSE 15.700 15.700

o.

O00

UREE 1.500 1.500 10.500

SULFATE D'ñMMONIUM 5.300 5. :o0 z0.000

SULFATE DE FER O. 145 _i2.145 0.000

PHOSPHATE DE POTASSIUM 3 . 2 5 0 3 . 3 0 12.250

SULFATE DE MAGNESIUM O

,

1 O'?

ci.

100 0.000

EAU DISTILLEE 35O.OOii 350.300 250.000

PC

o.

O00 0.000 207.000

I SPORES 300*exp7 300*erp7 300*exp7

L

HUMIDITE INITIALE 70 70 50

MBPl

= Milisu SagAP6E Pectine Industrielle.

MBñPG

-

Milieu üaga6se Acide PolyGñlacturonique.

MPC 5 Milieu PUlpe 68 Café.

-

Préparation.

La preparation doc milieux ~ ' e f f + ? : ~ ~ t e de la maniare

suivante:

i ) Milieux synthdtiquss sur support 1iiBPI et MBñPGl.

.-

Le support

La bagasse seche est steriiisee 20 _mri

a

171 'C.

-

La solution saline ( e n deux parties).

une

solution composee de 25Og d ' s a u , de pectins ( o u

d'acide polygalacturoniqutl et de tous les se!6 figuiant sur la

table 2 excepte l'urée e t . !e sulfate i l t ser est p v é p a r 8 e . La

bagasse et cettr 5 a l o t i o n corit nielaiigés ' ~ m i i i r u 1 ) .

une smconde solution contenant 509 d'eau, l'urée et 1s

sulfate de fer est préparée.

-

Inoculation.

Le6 spores 6Ont recupdr&es dens iin 'VOlUme X d'eau

additionnée de Twuen 80 et inocuires d d n s l a so!ution contenant

l.urée st 10 suiCate de 4 3 , ' . O n a j n v ~ e i l n r , i5iO-X)g d'eau

19

-

Le

subetrat

a

fermenter.

la

fraction contenant

lar

spores et

le

milieu

1

eont

alors n&langla pour obtenir le miliuu final.

i i ) Milieu nature1

A'

baso de pulpa

de cafe,.

-

Le

subetrat

(support

ot eourca

dm

La

pulps de Cafe met utilis6e telle qumlle.

On na

lui

carbone).

fait pas eubir de st6rilisation.

-

La solution mineral-.

Une

solution ConetituBe de

200p

d'eau distillee e t de

la

globalit6 des

ssls

srt preparee et stériliséo.

-

Inoculation

Les S P O ~ ~ E

sont r6cuperbas e t inoculées comme indiqur

en i). On

djoutii alorí

( 3 0 - X ) g

d'eau distill&?.

-

Le

substrat

b

fermenter.

La

solution précedente est mblangie

a

la pulpi de

cafe

m n

et6rile.

3.1.4.

La fermentation.

-

Conditions gBnérales.

Lus

fermenteurs utilisbs eont des colonnes d'un diambtre

40.1 I 3.65

cme.

On

travaille avec

40 g de

matiilre humid.

par

colonnm.

Le

debit d'air

entrant initial est

d%

l'ordre de

4l/h/colonne.

Les colonnos eont plapBes dans

un

bain-maria

a

35

'C.

de fapon

B

assurer une tempeirature constante lors de la

fermentation. 'Dix colonnes de fermentation eont p l a ~ e e s

a u

bain-marie pour chaque fermentation.

L a

cinetique de production

enzymdtique est r6alis&s

SUI

une pdriode

de

72

heures

aves

des

intsrvalles da pr6lbviment variables et

en

double exemplairee.

b) Conditions particulibree.

MBPI

MBPiPG

MPC

Densit6 apparente

0.39 0.39 0 . 9

(9

ICrnS)

pH initid1

4.34 4.94 5.50

(unitis pHi

3 . 1 . 5 .

Récupération des extraits enzymatiques.

L a

totalitr du produit fermenté de la colonne Bet puse.

20

-dLtsrmination du poids de

matibrs s k h e

-pieseer

dirtillee.

Le

materiel est alar-e homogenCis4 puis

pressi

( 1

bar).

L’sxtrait rscueilli est filtre pour eliminar 1

6

.

spores

et

les

pdrticulss

eolidee pouvant affecter

las meeurss

. .

ultérieuree.

L’extrait

est stabiiisd par

l’adjonction de

benzoate de sodium

0.1%

puis placé au f r o i d

(Schema 2 ) .

i

21

!

I

i

$.Z.’METHODES D’ANPILVSE DE8 RCTIVITES ENZYMRTIQUES

3.2.1.

Dosags

de l’activité

de

l’endopolvgalacturona..

L a

m6thode

mmploybe repos8

mur

le principr

da

la

vi6comim6trim

(D. DUFOUR,

1987).

E n

coupant

les

liaisons

alia

1-4

de

la

pmctinm

(substrat), l’endopolygalacturonaee

va

entrainer

une diminution

de

l a

longueur des chaines de la pectine occasionant unm baisss

de la ViSCO6it6 de la solution 6Ubstrdt. Le protocols exact

d’analyse WSt

10

suivdnt:

Proc6db:

Solution initiale de pectine GRINSTEED

MS

a

2%

dans

un tampon acide citrique (0.042Ni-PQ4 10.115N),(pH:5.9)

:

18

ml, preincuber

a

45

‘C

Addition de

1.

nil

de solution enzymatique (dilu6e

ou

non)

Lecture dm

l a

bais’e

de Viscosite (viscosimbtre

BROOKFIELD, USA)

a

4 5

‘C

Utilisation d’un blanc sans enzyme

( 1 6 mi

pectins

+

1

ml HZD)

L’activitb est exprimbe

en

unitóe de dépectinisation

( U . D . ) .

1

U.0.-

quantitb d’mnzyme nbcbssrire pour

qum

la

viscomit6 d.une

solution de pectine diminui de

50%

e n 10

mn drnm

les

conditions Mcrites.

3.2.2.

Dosage

de i’activite

de

l’exupolv0alacturonasm.

La

m6thode d’analyse daw sucres rdducteurs utilis6e

6 m t

unm m4thodm colorim6trique (Miller,

1959). Ei

Lbulition, l’acidm

3,s

dinitrosalycilique (DNS) eet rbduit e n pr6sence de sucres

r6ducteurs ut Cetre

iorme

rbduite

a une

absorbance spLciCiqus

A 5 7 5 nm.

Proc6déi

La

preparation du DNB est ddcrite

en

annwxe

Introeuire

1

ml de solution

de

pwctine GRINSTEED

MS

a

0.9%

dans du tampon acotate

(0.2M)

pH:4.5 dan=

u‘

tube

a

eSSdi.

üjouter

O.? mi

d’eau distblléw.

Prbincuber 5 mn

a

45

‘C.

Additioner

0.3

m l

de solution enzymatiqus (1).

Incuber

30

mn

A

45

“ C ( 2 ) .

Porter

B

Obulition

5

mn.

Rafroi dir

Ajuster

b

20

ml

av0c

de l’eau distillbe.

Lire

a

575

nm.

-_I-

-_-.

.---

.

22

Pour ChdqUm

eeeai

mnrymatique,

pr6parer u n mesai

sans la phims d’insubat’ion

(2) mn

invsrsarit l’ordrm

dss

phaess

( 1 )

mt

(31.

Gamme

Btalon:

de

0.1’

h 2 mg d”acids galicturonique

ISIGMü) dan.

S

ml d’eau dietillée. ajouter 3 nil

de D.N.E.,

porter

&

ébulition

5

mn,

ajustmr

A

20

in1

avec de l’mau

distill6m.

L i r a

h 575

run.

3.2.3.

Dosage

de

l’activitd

de la polygalacturonase

L’analyse

de

cette

activité

se

fait

par

SpectrophotomBtrie.

En d i e t ,

l a

double liaison

C4-CS form6e

par r6action enzymatiqum

h

une absorbance spbcifique

I 2 3 9

nm.

lyase.

Lm

protocolo

m i s

au point est le suivant:

Dialyser les extraits enzymatiques

48

hsures.

Préparer une Solution

de

pectine grinsteed

b 1% danr

u n

~

Introduire 2ml

de cette solution substrat d a m u n tub.

tampon acid6 citrique

i0.019N) -PO4

iO.162N1, pH:7.0.

a

mssai.

üjoutsr 0.5 m i de solution enzymatique diluÉe

ou non.

lncuber 30 inn

30 ‘C.

ürrbter

l a

réaction

en

ajoutant 0.5

m i

d’acide

Préparer u n blanc ou la phase

de

reaction enzymatique

Lire &

235 nm

l’essai contre le t h o i n .

L’activit6

enzymatique

est exprimée

en

y.mol/mn/ml

sulfurique

1 . 9 N.

est occultée.

RESULTATS

ET

.

2 3

. I V . RESULTFiTü ET DIüCUSSION

4.1. ELr?BORr?TION DES MILIEUX DE CULTURE

Le choix dmm supports solideo

a

Cté effectu6 euivant d a u x

eritbree:

O’une part, 1d bdgaese de canne A sucre et l a pulpe da caf6

sont des dechets agroindustriels tropicaux abondanto en

particuliero pour lec entrsprises agricolos mexicainae et il

paratt intórmeeant de les \aloriser. D’autre part, COS

eubotrate ont CtC largement UtiliSBS dans les laboratoiree de

fmrmmntation mn milieu solide de l a

U.ñ.M.

L’obJectif de cette étude est de déterminer l’sffet

inducteur du substrat pecrique SUI la production de pectinases

D ~ T FisDerailli*- niaer N CH4. P a r aiiieuirs, un trai emmnt

thermique de la pectine a pour effet de dépolymériser cette

dsrniara. I1 est donc apparu nécéscaire de ne pas faire subir

de traitemant thermique

a

l a fraction contenant l a sourcm da

pectine et donc ne pas

l a

stérilieer par autoclavm. I1 wet

óvident qu’alors des probl8mes de contamination bactórienne

pauvent surgir.

4.1.1. Fermentationr

sur

bagasse de canne A sucre

tics).

Pour l a fermentation sur support, la bagasse da canne

a

sucre smrt de support. Oans ce cas, 11 +aut ajouter l’inducteur

(pectinm) dans la fraction salino. L a bag2se.e de canne d sucri

a été stérilisCe afin d’éliminer l a micro+lore naturelle. O?

n’a pre constató de contamination importants dano leo

conditionm d k r i t e e au chapitrs pr8códent.

4.1.2. Fermentations sur pulpe

de

café.

Ici, l a pulpe de cafB sert de source de pectine mt de

support solide. La pulpe de café sbche CorltiKnt 6.5% de pectins

~(Brsgeani et Ellas, 1976). Ce support est fortement contamin6

maim

on ne peut pas éliminor cmtte contamination par une

EtCrilimation par autoclave moue peine de denaturer l a pectirn.

I1 a fallu louer sur

les

parambtree de la fermentation pour

emp8cher l e développement des Contaminants.J’ai choisi comme

factaur d’lnhibition de l a croissance bacterienne l‘humidité

initiale dm l a fermentation. Plue l e taun d’humiditd est

faible, plum les risque6 de contamination bactériennm

Dane’

ce

but, j ’ a i

rCalisó

‘des

expdriences avec diffórentm

tiun d’hunidit6 initiale. Le temps de fermentation a óté f i x 6

6S heuree. Las facteurs de contréle du déveiuppement bactórien ótaient lee suivants:

. dimi nuant.

-..-

, _.u-&

r

24

L’obsmrvrtion mlcroscopiqum permettant dm d6tmrmlnmr

la

p r d m m k m & bict6rImm.

La mmmurm

du

pH dmm mxtraits enrymrtlqums. Lm

&vmloppmnmnt bast6rlmn d pour effmt d’augmmntmr

emnelblmmmnt

im

pH d’une eolution. Or, les mxtraits

mnrymatlques de6 CUltUrES r6rllsée au laboratoirm mur

pulp.

da

cafb etérilas6m ont un pH de l’ordre

dm

5.S

-

6.0.

La mesure de l’activité d i l’endopolygaiacturonamm

caract6ristlque de l’activit6 d’ CISPPvalllus

.

LOB résultats obtenus eont coneignés suv

la

tablo 3:

-

Tablm 3:culturi sur Pulpm dm cafó avec dlfférmntmm

humiditdm lnltialmm (rdsultrte a p r h 65 h de culture),

hum1 di t6 ObS. uecope PH act. endopg

(u.

d. )

Initiale

70% présence de 6.95

Eacllem

60% prósencm dm . 4.72

Ercllec

b.

7

9.7

50%

pas

de 5.62 26. i

contaminants

On volt qum l’absence de la phase de st6rilisatlon

mntrrlnm

Ir

contamination des cultures presentant un- humidite

inltlale dm 60 et 70%. Par contrc, les trois ParamOtres

utilieée montrent que pour une humidite inltiale de 50%.

ime

contaminants ne ee développent p a s suffisament pour empechmr

l’mrprossfon dm ₁

_’

dctlvi té pecti _no1 yt lque d’

f i m E p l u u i a

.

C’mat donc un te1 milieu que nous avons utlllm6 Pour l’6tu&

cirdtiqum dm Ir production enzymatlque.

4.2. ELCIBORCITION ET CRITIQUE DES KETHODES DE DDCRGE.

Las mdthodas utilisées pour

la

meaure des actlvit6s

enzymatiquee ont 6t.6 6llabor6es mt/ou amélior8es, dans un

premier temp-, en utlllsant un

complexe

snzymatique

pectinolytlqus commercial sous forme de poudre (CLCIREX: ENMEX,

Mmxique,). Cette premiere étape P permis de mettre du point des

protocolss d e . mesure des dlfférentee actív! tes psctinolytiquea

de eolutl?ns enzymatiques pures. P a r

l a

suite, ila fallu

aíiner ces méthodmo mn tenant compte dms contraintes

mpbclfiqume

liées

I l a presence des multiples conposante des

mntralts

dm

fermmntation. En effet, des problbmee

d’interfdrmncms et d’inhibltions ont dil etre res01us pour

25

4 . 2 . 1 .

ñctivité wndopoly~~lacturoniqu~

ddtwrmin6i

,par

~ I s c ~ m i m ó t r i ~ .

Quantification

do

I’ictivitL

I

On

a utilim6

un

vI.co.imbtro

BROOKFIELD iU.6.ñ.i. On

0pBr0

do

la fapon

muivantm

I

I - La

lecture de la vi6~051t6 du temoin

sdni

emsai

inzymrtiqu.

nous

donne

la VisCoSité initials d’unm rolution dw

pectimw tslls qu’wlls

a

Bt6 prlparéo.

2-

Ensuite,

on cheiche

la dilution

de

i’extrait enzymatigue

donnant une visco~itB Bgale

a

50 X d.

lo vissosit8

du

t h o i n

apr&

10

mn (intsrvalle

ñ A 12 m n i

-

pout’

I’enzyme CLñREXi 3

mg/ml

-.

La

reaction est linhlre tent

QUB

le 6ubStrat “’est

pas limitant.

A 50 X de l a

vi6~06itB

initiale,

on 8.

trOUVa

k

.

.

1

limite

d.

la

ronii .d

lineaiité

(voir

Figure

2 ) .

FIGURE

2,

CINETIQUE DE

La

R E ~ C T I ~ N

6(

U

I

s

5(

C

O

s

_I

T 4 t

E

3(

c

8

&

I

”

8

A

8.

8

4

6

a

26

3-

L’activitb

e’exprims

nunbriqusmsnt

s n

unitb

di

dcipectinisation .<U.D.).l

U.D. =

quintit8 d’enrymsr nbsbeeairm

pour que la viisoiité d’uns solution de pectins diminue ds

S ü X

e n

10 mn

dan.

lee conditions d.critms

dans

10

chapitre

prbcbdsnt.

a C i

ENDO

=

0 1

lO/T

DI

dilution

dm

l’mx’trait

T:

temps

auquel

U-Uin/Z,

enzymatique

TIiü,

12)

.Diecuesioni Cette method- est intéressante dan.

l a mmmurs

ou

ells

mat reproductible.

.

Cepandant,

le viscosimbtre ns

pauvant ,pa9 nous donmer

l a viscosite durant les deux prsmibrss

minutsm

ds la reaction et

les

points d’interesstion des droitss

de régression avmc l’axe des

Y

étant fort differente de la

vissositb

initials de la solution ieous-evaluation),

i l emrait

n8ceesairs

da connattre

la

cinétique de debut de reaction

pour

mieux

gLrer

les rbsultats obtenus.

Neanmoins,

cetts

méthode noun donne des éléments de comparaison facilsment

srploitablss.

4.2.2.

Activite. exopolygalacturoniqus

déterminbm par

colorimbtrie

Quantification

de l’activité:

La lecturs dss d4viatione

Optiques rsiatives

a

Ir

g a m m s étalon nous permet par

rbgrsssion

d’avoir

une relation

linéairo entre

la D.O.

et

la quantite de

sucres réductsurs presents

d a m

le milieLi. Par

l a

suitm.

l a

D.O.

des solutions A tester peut etre rappurtée

2.

una quantitd

de sucres reducteurs présents dans

le milieu. Cependant,

i l

existe deux

categories de Sucres rOducteurs dans les esraie

issue ds fmrmsntation

e n

milieu solidsi

-

lec groupsmsnts

1iMr.e

l‘ors

de la réaction enzymatique et

-

les produits de

ddgradation du saccharose etlou

1’ accumulation de monombres

par

dbgradation

enzymatique

de

la pectine

lore

de

la

fsrmentation.

I 1 convient donc de quantifier ces deux typms di

sucres

rdducteurs

pour

ne

pas

surévaluer

l’activite

sxopolygalacturoniqum.

Pour ce faire,

nous

analyeons dan.

un

premiar temps un ersai pour

lequel

la phamm

d’incubition

snzymatiqus

a 4 t 4 volontairement ommise. Cela nous psrmst ds

dbtsrminer

la quantité de sucres rbductiurs présents dans

l’essai

itempe

? & T O ) .

Par la suite, u n

essai

enzymatique issu

du

mame

extrait est

analysé

(incubation

3 0

m n A 45.C). La

deviatio’n optique lue est due dan6 ce cas

~ U Y

sucres réducteurs

libres et

L

l’eupression

de

i’activite enzymatique. Une simple

sourtraction

nous

permet

alors de quantifier

I’activite

‘snzypatiqut.

d’acids galacturonique e n una minute.

1

Unite

Enzymatique

=

liberation d’une micromole

OCT EXD

-

O

*

1000

*

1

umnl/min/ml d’extrait