La duplicació del DNA
i la biosíntesi de les proteïnes
●
●
●
●
La duplicació del DNA. Investigacions
i propietats.
Mecanismes de la duplicació.
La transcripció del DNA.
Introducció
●
L’ADN durant la vida de la cèl·lula té
dues funcions:
–
–
Transmetre la informació que conté a la descendència.
(Replicació o duplicació)
Expressar la informació que conté en forma de proteïnes.
(Transcripció i traducció)
La duplicació o replicació del DNA
Procés mitjançant el qual a partir d'una
molècula de DNA de doble hèlix se'n
sintetitzen dues de idèntiques.
La molècula “progenitora” serveix de
“motlle” per a la síntesi de la seva
còpia.
Hipòtesis sobre la duplicació del DNA
●
●
●
Hipòtesi conservadora.
Hipòtesi semiconservadora
(Watson i Crick)
●
Molècula DNA
progenitora
Hipòtesi replicació conservadora
●
Molècules DNA
filles
Molècula amb els dos filaments parentals. La molècula parental es conserva.
Hipòtesi replicació semiconservadora
Cadascuna de les molècules filles conté un
filament parental i un filament de nova sítesi.
●
Molècula DNA
progenitora
●
Molècules DNA
●
Molècula DNA
progenitora
Hipòtesi replicació dispersiva
●
Molècules de DNA
després d'un cicle de
replicació
DNA parental
Molècules filles després d'un cicle de replicació
Molècules filles després de dos cicle de replicació
Hipòtesi
Experiments que van portar a coneixer
el mecanisme de replicació del DNA
● ● ● ●
1957 Meselson i Stahl
1956 Kornerg
●
Experiment que demostra la hipòtesi correcta
sobre la duplicació del DNA:
1957 Meselson i
Stahl
.
●
Cultiven bacteris d'
Escherichia coli
en un medi amb N
15(isòtop del nitrogen N
14amb un neutró més i per tant de
major pes). Els bacteris incorporen el
nitrogen pesat N
15en
el seu DNA.
●
Després passen aquests bacteris a un medi amb N
14,
(isòtop comú del nitrogen i més lleuger). Qualsevol DNA nou
que sintetitzin els bacteris a partir d'ara serà més lleuger
que el parental.
●
Cada 20 minuts, extreuen bacteris del medi que
conté N
14
, i procedeixen a la separació del DNA per
Meselson i Sthal van utilitzar la centrifugació en gradient de densitat per distingir entre el DNA pesat carregat amb N15 del DNA lleuger carregat amb N14.
Meselson i Stahl arriben a la conclusió que la replicació del DNA
Clica damunt
l'esquema per
veure una
1956, Kornberg
:
–
–
Comença l’estudi sobre els
mecanismes pels quals es
produeix la duplicació del DNA.
Aïlla l'enzim
DNA-polimerasa
de
l’
Escherichia coli
.
●
Aquest enzim és capaç de
sintetitzar DNA
in vitro.
DNA patró
DNA encebador
Com pot la DNA-polimerasa sintetitzar DNA?
●
●
●
La DNA polimerasa és incapaç de sintetitzar una cadena de
DNA
de novo
.
L'enzim l'únic que pot fer és afegir nucleòtids a l'extrem 3'
La DNA-polimerasa necessita:
●
Desoxiribonucleòtids 5'-trifosfat lliures en el medi
(dATP, dGTP, dCTP i dTTP)
●
●
Un DNA encebador (”primer”).
DNA polimerasa
DNApatró DNAencebador Nucleòtids lliures
Extrem 5' Extrem 3' Extrem 5' Extrem 3' DNA polimerasa Extrem 3' Desoxiribosa Fosfat Extrem 3' Desoxinucleòtid trifosfat
Extrem 5' Extrem 5'
Com que la DNA-polimerasa
només pot unir els nucleòtids al carboni 3’
lliure del
“primer” la nova cadena sintetitzada només pot créixer en sentit 5’
→
3’, essent la cadena
patró el filament 3’
→
5’.
Cadena nova Cadena motlle Cadena nova Cadena motlle
Experiment de Cairns (1963)
Objectiu:
observar la duplicació del DNA in vivo
●
Cairns deixa creixer, durant dues generacions, bacteris
de
Escherichia coli
en un medi amb nucleòtids
(
timina tritiada, TH
3
), els quals
β capaces d'impressionar una
emeten
placa
radiactius
partícules
fotogràfica.
●
Quan els bacteris es divideixen incorporen la timina
Formes observades en les fotografies després d'un cicle de replicació:
●
Cada 3 minuts es realitza una autoradiografia del DNA
bacterià fins obtenir la seqüencia completa, primer d'una
replicació del DNA, que dura aproximadament uns 30
minuts, i després d'una segona replicació.
● Les imatges inicials tenien forma de V;; les posteriors, de mitja lluna, i les finals semblaven cercles aixafats.
– Les formes en V Cairns les va anomenar forquetes de replicació, formades pels dos nous filaments de
DNA tritiat sintetitzats sobre la doble cadena antiga que s'havia escindit en dos per poder servir de motlle.
–
–
Les formes de mitja lluna les va anomenar bombolles de replicació.
• Les autoradiografies obtingudes després de la 1a generació
presenten imatges de punts formant un cercle.
Propietats de la replicació
●
●
És semiconservadora
: les dues cadenes de DNA
inicials se separen i cadascuna serveix de motlle per a la
síntesi, segons la complementarietat de bases, d'una
nova cadena antiparal·lela.
Comença en uns llocs concrets anomenats
orígens de
replicació
:
–
–
En bacteris
,
hi ha
un únic origen
de replicació
: es diu
que la replicació és monofocal.
En eucariotes
,
hi ha
molts orígens
de replicació
: és
diu que la replicació és multifocal.
●
És bidireccional
: és a dir, a partir de l'origen de
Dilema 1:
Si la DNA-polimerasa necessita un “primer”
o “DNA encebador”, de quina manera es
sintetitza aquest “primer”?
Dilema 2:
Els fragments d'Okazaki
1968 Okazaki.
Descobreix uns fragments
(anomenats
fragments
d'Okazaki
) constituïts per uns 50
nucleòtids de RNA i entre 1000 i
2000 nucleòtids de DNA que van
donar solució als dilemes
plantejats.
RNA
DNA
●
Els fragments d'Okazaki són sintetitzats per una
RNA-polimerasa
(també anomenada primasa),
que no necessita encebador, i per una
DNA-
polimerasa
, en direcció 5’→3’ sobre diferents
regions d'una cadena patró 3’→5’.
(cadena líder)
(Cadena retardada)
Fragment d'Okazaki
DNA patró
Fragment d'Okazaki
DNA patró Inici síntesi RNA Síntesi RNA «primer»
La síntesi de DNA es produeix en les dues cadenes simultàniament, però en
direccions oposades.
La replicació del DNA en una forqueta de replicació comença quan
●
Solució al dilema 1.
“
Primer” o encebador de RNA:
és sintetitzat
per la RNA-polimerasa (primasa) la qual no
necessita cap encebador per poder sintetitzar
fragments de RNA. Després el RNA serà
eliminat i substituït per DNA.
●
Solució al dilema 2.
●
Nou dilema:
Si el DNA d’una cèl·lula no té fragments de
RNA en la seva estructura, què passa amb el
RNA dels fragments d'Okazaki?
Enllaç
animació forquetes de replicació
Activitat exonucleasa 5’→3’ de la DNA polimerasa.
La DNA polimerasa elimina el «primer» en direcció 5’→3’ i omple el buit deixat amb
nucleòtids nous complementaris mitjançant la seva activitat polimerasa 5’→3’
Activitat de la DNA lligasa.
A T C G A A C C G T T G C A C C G T T G C A C
U
A
G
C
T
T
G
G
C
A
A
C
G
T
G
Síntesis continua de la cadena 5’→ 3’
A T C G A A C C G T T G C A C C G T T G C
T
Síntesis discontinua de la cadena 3’ → 5’
A
A
C
G
T
G
C
C
A
A
A
G
C
T
U
T
G
G
C
Síntesis discontinua. La cadena complementaria no se va a replicar en sentido 3 ' 5 ' sino que se replica