INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA SUPERIOR DE INGENIERÍA MECÁNICA Y ELÉCTRICA
SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
“SISTEMA PARA LA MEDICIÓN DE
FLUORESCENCIA INDUCIDA POR LÁSER
(LIF) RESUELTA EN EL TIEMPO”
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:
MAESTRO EN CIENCIAS EN INGENIERÍA ELECTRÓNICA CON
ESPECIALIDAD EN INSTRUMENTACIÓN
PRESENTA:
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
COORDINACIÓN GENERAL DE POSGRADO E INVESTIGACIÓNCARTA CESIÓN DE DERECHOS
En la Ciudad de México, Distrito Federal, el día 10 de Septiembre de 2004, el que suscribe Bautista Díaz Francisco Javier alumno del Programa de Ingeniería en Electrónica con número de registro B021429, adscrito a la Sección de Estudios de Posgrado e Investigación de la ESIME Unidad Zacatenco, manifiesta que es autor intelectual del presente Trabajo de Tesis bajo la dirección del Dr. José Manuel de la Rosa Vázquez y cede los derechos del trabajo intitulado: “Sistema para la
Medición de Fluorescencia Inducida por Láser (LIF) Resuelta en el Tiempo”, al Instituto Politécnico
Nacional para su difusión, con fines académicos y de investigación.
Los usuarios de la información no deben reproducir el contenido textual, graficas o datos del trabajo sin el permiso expreso del autor y/o director del trabajo. Este puede ser obtenido escribiendo a la siguiente dirección: [email protected].
Si el permiso se otorga, el usuario deberá dar el agradecimiento correspondiente y citar la fuente del mismo.
A mi señora madre Ana María Díaz Calderón que con su gran sacrificio sacó adelante a la familia, por sus grandes consejos que me hacen mejorar cada día mas, por su apoyo incondicional en los momentos mas difíciles y de toda la vida. Siempre eres y serás reconocida por mí.
Gracias por siempre Mamá
A la señora Patricia Gómez González, (mi esposa), ¡¡flaka ya llevamos un año!! y se me pasó volando… gracias por compartirlo todo conmigo, por la confianza en mí y apoyarme en todo. No pude haber escogido mejor persona. Esto es para ti.
Gracias flaka
A mis tíos; Samuel Díaz, Rafael Díaz, Antonio Díaz y a mi abuelo Salvador Díaz por sus consejos, apoyo de siempre y confianza en mi. Siempre serán parte de mi vida.
A todos los cuates de la licenciatura, quienes vivimos de todo un poco… de los mejores años de mi vida. La lista es demasiado larga, pero siempre recordaré a todos.
No lo puse en la tesis de licenciatura porque no hice, pero lo pongo aquí… Muchas Gracias
A los cuates de la maestría, especialmente a Víctor Hidalgo
(el Vic) quien siempre estuvo a
ahí compartiendo sus conocimientos y amistad. Richard y Chucho… gracias, échenle ganas, si se puede. Eric, Víctor, J. Manuel, Moisés, Danny y José Luis quienes hicieron mi estancia ahí mucho más tranquila y divertida. Arcadio Bruno, Alberto
Mendoza, Luis Aguilar, Ismael Hernández, Miguel Coronel, Roberto León y Roberto Sánchez. Mis amigos de siempre. Y a los cuates de la cuadra Ricardo, Marcos, Jorge, Omar, Alejandro y Jaime… cuantos años viviendo juntos.
Mil gracias a todos por los ánimos. A la señora Guadalupe Correa
quien desde niño me enseño un sin fin de cosas para crecer hacerme mas responsable además de exhortarme a superarme y quien siempre confió en mi.
Muy Especialmente al Dr. Walter Fonseca quien con sus palabras muchas veces me hizo reflexionar y quien confió en mí. Sus conocimientos y consejos siempre fueron de gran utilidad durante mi estancia.
Muchas gracias
Muy especialmente al Dr. José Manuel de la Rosa, mi asesor, quién fue una parte invaluable para el desarrollo de ésta tesis. Gracias por sus conocimientos, ánimos, confianza en mí y por permitirme conocerlo como la gran persona que es.
Muchas gracias, es usted una gran persona.
Al Dr. Roberto Linares, cuantas cosas aprendí de usted… gracias por todo y por dejarme “jugar” con su laboratorio cuando lo requerí.
Al Dr. Francisco Gallegos que a pesar de conocerlo poco demostró ser una gran persona.
Al Dr. Argeo Vázquez, gracias por su confianza en mi.
A los profesores
Dr. Alexander Mitchenko M. en C. Raúl Peña M. en C. Héctor Caltenco
Mis maestros durante la maestría, gracias, verdaderamente aprendí mucho de ustedes.
La técnica LIF (Fluorescencia Inducida por Láser) es utilizada ampliamente en la química analítica para la investigación de espectros de fluorescencia de moléculas simples, hasta la determinación, en la bioquímica, de tejidos cancerosos. LIF es una de las técnicas mas sensibles disponibles para propósitos analíticos, es relativamente fácil de implementar y no invasivo por lo cual puede tener importantes aplicaciones.
En este trabajo se presenta el desarrollo de un sistema LIF con resolución temporal controlado por una PC que es capaz de medir los espectros de fluorescencia inducida por un láser de nitrógeno (337.1nm de longitud de onda, 6nm de ancho espectral FWHM, 1.1 µJ de energía y 4ns de duración FWHM ) y los
tiempos de vida de la fluorescencia de los materiales bajo estudio.
Los espectros de fluorescencia que se pueden medir van de 337.1nm hasta 1110nm con una resolución mínima de 0.1nm y una exactitud mínima de 94%. Los tiempos de vida de la fluorescencia de los materiales deben ser mayores de 5ns para poder ser medidos por el sistema.
Abstract
LIF (Laser Induced Fluorescence) technique is widely used in analytic chemistry from investigating fluorescence spectra of single molecules to the determination of cancerous tissues in biochemists. LIF is highly sensitive for analytic porpoises, it is no invasive relatively easy to implement, so that it could be used in important applications.
This work shows a LIF system with temporal resolution that is controlled by a PC. The system measures the induced provoked by a nitrogen laser (337.1nm of wavelength, 6nm of spectral band FWHM, 1.1 µJ of energy and 4ns FWHM time) and
the fluorescence lifetime of the samples under test.
Fluorescence spectra from 337.1nm until 1110nm with a minimal resolution of 0.1nm presenting a minimal accuracy of 94% can be measured. The samples fluorescence lifetimes must be longer than 5ns in order to be correctly measured by the system.
Objetivo
El objetivo general de este trabajo de tesis es desarrollar un sistema que sirva para obtener espectros de fluorescencia y el tiempo de vida de dicha fluorescencia de los materiales al ser excitados por luz ultravioleta (337.1nm) pulsada (?tFWHM =
4ns)
Justificación
El empleo de la fluorescencia con luz en la identificación de materiales es parte del desplazamiento que esta sufriendo el uso de sistemas que operan con fuentes radiactivas (rayos x). Con este tipo de métodos ópticos en estudios de biofísica y
medicina se elimina el peligro y costo de manejar materiales radiactivos.
El instrumento desarrollado facilitará el estudio analítico de material con propiedades fluorescentes que permitirá un mejor entendimiento de su estructura. Con él podrán analizarse tanto muestras sólidas como líquidos y dado que la técnica de inducción de fluorescencia por láser es no invasiva, ésta resulta particularmente interesante en aplicaciones in vivo, en donde no se desea perturbar el material a estudiar (por ejemplo en el estudio de tejido humano). Así mismo al realizarse a excitación con pulsos de luz con duración del orden de 4ns y frecuencias de excitación que pueden variarse desde unos cuantos pulsos a centenas de estos por segundo es posible el estudio de la dinámica de diferentes procesos químicos.
Índice de figuras
Pág. Figura 1.1 Absorción y reemisión de luz de un átomo
Figura 1.2 Espectro de fluorescencia de una muestra de diesel 1 2
Figura 2.1 Sistema para la medición de fluorescencia inducida por láser (LIF) resuelta en el tiempo.
Figura 2.2 Diagrama eléctrico del láser de nitrógeno Figura 2.3 Forma de los pulsos emitidos por el láser Figura 2.4 Divisor de haz
Figura 2.5 Luz entrando al divisor Figura 2.6 Luz saliendo del divisor
Figura 2.7 Reflexiones dentro del divisor de haz
Figura 2.8 Lente biconvexa para enfocar el haz en la muestra Figura 2.9 Lentes esféricos BK7
Figura 2.10 Configuración para acoplamiento de luz a una fibra óptica Figura 2.11 Configuración para acoplamiento de dos fibras ópticas
Figura 2.12 Arreglo de los lentes para enfocar la mayor cantidad de fluorescencia posible en la fibra óptica
Figura 2.13 Cilindro donde se encuentran integrados el divisor de haz, la lente biconvexa y las esferas concentradoras de fluorescencia a la fibra óptica
Figura 2.14 (a) Goniómetro para medir patrones de radiación (reflexión) (b) configuración para determinar la radiación detrás del papel (transmisión).
Figura 2.15 (a) Patrón de radiación de luz UV en papel, (b) radiación de reflexión vista a un ángulo de 40o
Figura 2.16 Fibra óptica de cuarzo
Figura 2.17 Principio básico del monocromador
Figura 2.18 Gráfica de la tensión de salida del PMT en función de su tensión de alimentación
Figura 2.19 Ruido de fondo del PMT (800mV pico máximo) Figura 2.20 Respuesta espectral relativa del fotodetector MRD500 Figura 2.21 Circuito eléctrico del detector
Figura 2.22 Tensión de salida en función de la potencia de luz incidente Figura 2.23 Señal de ruido a la salida del fotodetector de referencia
6 7 8 9 9 11 13 14 15 15 16 16 17 18 19 20 20 22 23 24 25 26 28
Figura 3.1 Diagrama de flujo para la obtención de espectros de emisión de fluorescencia Figura 3.2 Interfase de usuario programado en LabView 6i
Figura 3.3 Mensaje de verificación de inicialización del monocromador
Figura 3.4 Espectros de emisión obtenidos con distintas resistencias de carga a la salida del PMT
Figura 3.5 Señal de tiempo de vida de fluorescencia (de un tejido de próstata a 550nm), obtenida mediante la discriminación del ruido provocado por el láser
Figura 3.6 Comportamiento exponencial típico de la fluorescencia y su tiempo de vida Figura 3.7 Arreglo experimental para la medición del tiempo de respuesta natural del
sistema
Figura 3.8 Tiempo de respuesta natural del sistema (2.4 ns)
Figura 3.9 Espectro de emisión de una lámpara de mercurio en un intervalo de 400 a 600nm
Figura 3.10 Límites máximo y mínimo del espectro generado en papel de color amarillo Figura 3.11 Límites máximo y mínimo del espectro generado en papel de color verde
Figura 4.2 Espectro de emisión de fluorescencia de NaCl:Eu Figura 4.3 Espectro de emisión de fluorescencia de NaCMn:Eu
Figura 4.4 Tiempo de vida de fluorescencia de KBr:Eu medido a 420nm Figura 4.5 Tiempo de vida de fluorescencia de NaCl:Eu medido a 429nm Figura 4.6 Tiempo de vida de fluorescencia de NaClMn:Eu medido a 420nm Figura 4.7 Arreglo para obtener los espectros de fluorescencia en papel
Figura 4.8 Espectro de emisión de fluorescencia de un papel color naranja (a) obtenido, (b) bibliografía
Figura 4.9 Espectro de emisión de fluorescencia de un papel color mostaza
Figura 4.10 Espectro de emisión de fluorescencia de un papel color amarillo (a) obtenido, (b) bibliografía
Figura 4.11 Espectro de emisión de fluorescencia de un papel color verde limón Figura 4.12 Espectro de emisión de fluorescencia de un papel color verde Figura 4.13 Espectro de emisión de fluorescencia de un papel color rosa
Figura 4.14 Espectro de emisión de fluorescencia de un papel color rosa mexicano Figura 4.15 Espectro de emisión de fluorescencia de un papel color morado
Figura 4.16 Espectro de emisión de fluorescencia de un papel blanco (a) obtenido, (b) bibliografía
Figura 4.17 Tiempo de vida de la fluorescencia de papel blanco medida a 450nm (9.6 ns), en azul el pulso láser
Figura 4.18 Arreglo para obtener los espectros de fluorescencia de anticongelantes Figura 4.19 Espectro de emisión de fluorescencia de anticongelante Bardahl® concentrado Figura 4.20 Espectro de emisión de fluorescencia de anticongelante IceFreeze® concentrado Figura 4.21 Espectro de emisión de fluorescencia de anticongelante WinOil® concentrado Figura 4.22 Espectros de emisión de fluorescencia de anticongelante Bardahl® a varias
concentraciones
Figura 4.23 Espectros de emisión de fluorescencia de anticongelante IceFreeze® a varias concentraciones
Figura 4.24 Espectros de emisión de fluorescencia de anticongelante WinOil® a varias concentraciones
Figura 4.25 Espectros de emisión de tejidos de próstata en distinto avance de daño físico
Pág. Tabla 2.1 Principales características del PMT R955
Tabla 2.2 Principales características del fotodetector MRD500
21 24
Tabla 3.1 Tabla comparativa de los valores teóricos y experimentales Tabla 3.2 Errores relativos para ? y su amplitud
Tabla 3.3 Errores relativos entre variaciones de amplitud para color amarillo Tabla 3.4 Errores relativos entre variaciones de amplitud para color verde
44 44 46 46
Tabla 4.1 Características básicas de los espectros de emisión de los haluros alcalinos Tabla 4.2 Comparación de los tiempos de vida de los haluros alcalinos
Tabla 4.3 Características básicas de los espectros de fluorescencia de papeles de colores Tabla 4.4 Tiempos de vida de fluorescencia para diferentes papeles de color medidos a
varias ?.
Tabla 4.5 Características básicas de los espectros de emisión de anticongelante Bardahl a diferentes concentraciones
Tabla 4.6 Características básicas de los espectros de emisión de anticongelante WinOil a diferentes concentraciones
Tabla 4.7 Características básicas de los espectros de emisión de anticongelante IceFreeze a diferentes concentraciones
50 52 57 58
63
63
Capítulo 1
I ntroducción
La espectroscopia es un término general para la ciencia que trata de las distintas interacciones de la radiación con la materia. La espectrometría y los métodos espectrométricos hacen referencia a la medida de la intensidad de la radiación y su distribución espectral mediante un detector fotoeléctrico.
[image:12.612.217.394.404.545.2]Los métodos espectrométricos más utilizados son los relacionados con la radiación electromagnética como la luz y el calor radiante o los rayos gamma y los rayos X, así como las radiaciones ultravioleta (UV), de microondas y radiofrecuencia.
Figura 1.1 Absorción y reemisión de luz de un átomo
El espectro electromagnético abarca un gran intervalo de longitudes de onda (o de frecuencias). La región visible del espectro percibido por el ojo humano es muy pequeña si se compara con otras regiones espectrales.
direcciones cuando las partículas vuelven a su estado inicial. Ver Fig.1.1, en donde se muestra la absorción y reemisión de luz.
Cuando la radiación electromagnética se absorbe, se produce una transferencia de energía al medio absorbente. Para describir este fenómeno hay que tratar a la radiación electromagnética no como un conjunto de ondas, sino como un flujo de partículas discretas denominadas cuantos o fotones.
La radiación emitida por una fuente previamente excitada se caracteriza por un espectro de emisión que generalmente es una representación gráfica de la potencia relativa de la radiación emitida en función de su longitud de onda o de su frecuencia, ver Fig. 1.2.
-0.02 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16
0 200 400 600 800
Lo ngitud de onda [nm]
Figura 1.2 Espectro de fluorescencia de una muestra de diesel
En general el tiempo de vida de un átomo o una molécula excitados por absorción de radiación es breve, ya que existen diversos procesos de relajación que les permiten regresar rápidamente al estado fundamental o base. La energía de excitación se transforma en energía cinética al colisionar con otras moléculas produciéndose un pequeño aumento de la temperatura del material. La fluorescencia y la fosforescencia son procesos de emisión de importancia analítica en los que los átomos o moléculas se excitan mediante la absorción de un haz de radiación electromagnética, la emisión radiante se produce cuando los electrones excitados regresan a su estado base.
En este trabajo se desarrolla un sistema para la detección de espectros generados por la interacción de luz UV con algunos materiales sólidos y líquidos, así como los tiempos de vida de fluorescencia de estos materiales.
1.1 La técnica LIF
en función de la longitud de onda. Los espectros de emisión varían ampliamente entre los materiales, éstos dependen de la estructura química del material fluorescente (fluoróporo) y del solvente en el cuál están disueltos (en el caso de líquidos).
Los espectros de emisión son líneas o intervalos bien definidos que permiten analizar cualitativa (en función de la longitud de onda emitida) y cuantitativamente (según el grado de intensidad) un elemento. En los espectrómetros, la detección se hace por métodos fotoeléctricos como son los tubos fotomultiplicadores que son más precisos y sensibles, aunque más caros que otros fotodetectores.
En general se define a la emisión de luz de cualquier sustancia como luminiscencia y depende del estado de excitación de sus electrones. La luminiscencia esta formalmente dividida en dos categorías, fluorescencia y fosforescencia, dependiendo de la naturaleza del estado excitado.
Cuando un electrón excitado tiene un spin opuesto a un segundo electrón que se encuentra en la órbita base, el regreso de éste electrón excitado ocurre rápidamente por medio de la emisión de un fotón. Las tasas de emisión de fluorescencia son típicamente 108 s-1, así los tiempos de vida de fluorescencia son
cercanos a los 10ns. El tiempo de vida (t) de un fluoróporo es el tiempo promedio
entre su excitación y el regreso a su estado base. Debido a los cortos tiempos de vida de la fluorescencia las mediciones de emisión resueltas en tiempo requieren de elementos ópticos y electrónicos sofisticados.
1.2 LIF Resuelta en tiempo
La fluorescencia resuelta en tiempo supera a la fluorescencia estacionaria ya que genera además del espectro de emisión fluorescente de la materia, el tiempo de vida de los estados fluorescentes.
En la fluorescencia resuelta en tiempo se utilizan fuentes de excitación pulsadas, con un ancho de los pulsos del orden de los nanosegundos o picosegundos, idealmente se pretende que la fuente de excitación sea del tipo de un impulso. La emisión de fluorescencia es un proceso aleatorio y pocas moléculas emitirán sus fotones en un tiempo exactamente igual a t. El tiempo de vida es un valor
promedio; para un decaimiento exponencial el 63% de las moléculas se han relajado antes de t=t y el 37% restante en t>t. El tiempo de vida de un fluoróporo
en la ausencia de procesos no radiativos es llamado tiempo de vida natural.
proceso de promediación en las mediciones estacionarias. Por ejemplo, la forma de caída de la fluorescencia de algunas moléculas es más compleja que una simple exponencial y contiene información acerca de éstas moléculas. También la forma de la caída podría revelar varios tiempos de decaimiento y así, la presencia de más de un elemento. El estado estacionario solo revelaría una intensidad promedio que dependería del promedio de ambos tiempos de caída [4].
Existen numerosas razones adicionales para medir la fluorescencia resuelta en tiempo. En la presencia de transferencia de energía, los decaimientos de la intensidad revelan como los aceptores están distribuidos en el espacio alrededor de los donadores. Mucha de la información molecular esta disponible solo en las mediciones de fluorescencia resuelta en tiempo [4].
Además del uso de la fluorescencia en la bioquímica y la biofísica, existe un gran interés de su uso en la química analítica. El uso de la fluorescencia por medios ópticos en diagnósticos clínicos es parte de un continuo alejamiento del uso de sistemas que utilizan materiales radiactivos, de esta forma se elimina el peligro y el costo de manejo de estos [4].
La fluorescencia es ampliamente utilizada para una gran variedad de propósitos biomédicos. Por ejemplo, se utiliza para detectar fragmentos de DNA [4].
Otra área de investigación activa ocurre en la química clínica, un ejemplo bien conocido es en el análisis de sangre para la detección de niveles de glucosa [4].
1.4 Problemática en la implementación de la técnica LIF resuelta en tiempo
El éxito en la aplicación de los métodos de la fluorescencia requiere considerable atención a los detalles experimentales y un buen entendimiento de la instrumentación. Existen numerosos agentes que puede distorsionar la información obtenida. La ganancia en los instrumentos usualmente puede incrementarse para obtener señales mas fieles, incluso si el objeto bajo estudio es no fluorescente, esas señales vistas a gran amplificación pueden no haber sido generadas por el fluoróporo de interés, tal ves uno puede observar interferencia de la fluorescencia de fondo debida a los solventes en que se encuentra disuelta la muestra.
son los elementos ópticos que se utilizan, en el caso de los lentes, éstos no deben de comportarse como filtros en ningún intervalo del espectro en el que se desea trabajar. Los fotodetectores también deben responder correctamente en ese intervalo y el contenedor de la muestra a estudiar idealmente debe aislarla completamente de cualquier fuente de luz distinta a la de excitación con el fin de no alterar los espectros de emisión fluorescente generados por el material que se esté analizando.
Otro aspecto no menos importante que se debe tomar en cuenta es la interfase de comunicación entre los instrumentos de medición y la PC, ya que en los cables se pueden inducir tensiones de ruido generadas por la rápida descarga eléctrica en el láser y provocar problemas en la transmisión de datos, incluso bloquear completamente la comunicación.
1.5 La técnica LIF resuelta en tiempo con luz ultravioleta
Existen diversas aplicaciones en donde se puede emplear la técnica LIF resuelta en tiempo con luz ultravioleta. Tiene una sensibilidad de hasta 1 p.p.m, y es capaz de detectar compuestos polinucleares aromáticos carciogénicos, vitaminas, minerales, pesticidas y colorantes entre otras muchas cosas [5].
Una de las aplicaciones mas importantes es en el análisis de productos alimenticios, farmacéuticos, muestras clínicas y productos naturales[6]. Su uso para especies inorgánicas es a menudo un complemento de la espectrofotometría como método de detección de cationes. En cuanto a sustancias orgánicas su utilidad es impresionante: adenina, aminoácidos, proteínas, guadinina, gases nerviosos, hidrocarburos, esteroides, enzimas son solo algunos ejemplos. Este tipo de métodos son de 10 a 100 veces mas sensibles que los métodos de absorción y tiene una gran selectividad. En bebidas refrescantes permite conocer la concentración de quinina, que en disolución presenta fluorescencia cuando se excita a 350nm.
Capítulo 2
Arreglo experimental
Los espectros de fluorescencia se obtienen midiendo la emisión de luz del objeto bajo estudio cuando se le excita con una fuente que emite una longitud de onda específica.
[image:17.612.131.483.374.660.2]
Un esquema del arreglo experimental para obtener los espectros de fluorescencia se presenta en la figura 2.1.
Como fuente de excitación se utilizó un láser de N2 cuyo haz es alineado hacia el
sistema divisor de haz por medio de dos espejos totalmente reflejantes, el divisor de haz se utilizó para reflejar una parte de esa luz hacia un fotodiodo de referencia que sirve para disparar al osciloscopio. La mayoría de la luz que no se refleja llega a un lente biconvexo que la enfoca hacia la muestra que se este analizando, la fluorescencia emitida por esta se enfoca, utilizando un par de lentes esféricos, a una fibra óptica que la lleva al monocromador para descomponerla en sus componentes y el PMT (Photo Multiplier Tube) pueda registrar las intensidades correspondientes a cada longitud de onda en el osciloscopio.
Éste último envía las formas de onda por medio de una interfaz GPIB a una PC que se encarga de registrarlas e ir extrayendo la información para generar el espectro de emisión.
El monocromador también se controla desde la PC por medio de un puerto serie (RS-232) y el software fue desarrollado en LabView 6 de National Instruments®.
2.1 Fuente de excitación
La fuente de excitación es un láser de nitrógeno, que emite pulsos de luz con una longitud de onda de 337.1nm (UV) y tienen una duración de 4ns (FWHM).
El diagrama eléctrico del láser de nitrógeno se muestra en la figura 2.2 [8]
Figura 2.2 Diagrama eléctrico del láser de nitrógeno
La energía (E) promedio de los pulsos de emisión es de 1.1µJ y se obtuvo con un medidor de energía Láser precision corp. "Energy Radiometer" RJ-7610. De
acuerdo a la energía de los pulsos y la duración de estos, la potencia promedio de los pulsos del láser esta dada por:
P =E/FWHM (Ec. 2.1)
La tasa de repetición de pulsos del láser para estas mediciones se estableció en 35 Hz aproximadamente, aunque puede variar dependiendo de su tensión de alimentación.
[image:19.612.117.497.184.395.2]La forma de los pulsos emitidos por este láser se muestra en la figura 2.3
Figura 2.3 Forma de los pulsos emitidos por el láser
2.2 Sistema óptico
El sistema óptico es el encargado de adecuar la luz del láser para dividirla en: el haz que servirá como referencia para disparar al osciloscopio y el haz que será concentrado y enfocado en la muestra que se esté estudiando. También consta de un par de lentes esféricos que se encargan de concentrar la mayor cantidad de luz emitida por fluorescencia de la muestra y dirigirla a una fibra óptica.
2.2.1 Divisor de haz
Como divisor de haz se utiliza un vidrio portaobjetos, el cual tiene un índice de reflexión (nt) de 1.5 [9] y un espesor de 1.0mm. El láser incide en él con un ángulo
de 450, el arreglo básico se muestra en la figura 2.4
Pulso del láser de Nitrógeno (FWHM = 4ns)
-0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
[5 ns/div]
Figura 2.4 Divisor de haz
El análisis para obtener los ángulos ?i y ?t así como los coeficientes de transmisión
y reflexión se realizó en dos etapas, la primera parte se realizó cuando el haz que entra al portaobjetos y la segunda cuando el haz sale.
Etapa 1: Luz entrando al divisor de haz
[image:20.612.227.385.83.214.2]En este caso el haz de luz pasa del aire a un medio con índice de reflexión mayor
Figura 2.5 Luz entrando al divisor
?i = 45o
?r = 45o
ni = 1.0
nt = 1.5
de la ley de refracción (o ley de Snell)
t t i
isen nsen
n θ = θ (Ec. 2.2)
despejando el ángulo transmitido
0 1 =28.12
= −
t i i t
n sen n
sen θ
θ
El haz se puede descomponer inicialmente en el haz reflejado (r) y trasmitido (t) y cada uno de estos en sus componentes perpendicular (⊥) y paralela ( || ).
3 . 0 ) ( ) ( cos cos cos
cos =−
+ − − = + − = = ⊥ ⊥ t i t i t t i i t t i i oi or sen sen n n n n E E r θ θ θ θ θ θ θ θ 09 . 0 ) tan( ) tan( cos cos cos cos || + = − = + − = t i t i i t t i t i i t n n n n r θ θ θ θ θ θ θ θ 7 . 0 ) sin( cos sin 2 cos cos cos 2 = + = + = = ⊥ ⊥ t i i t t t i i i i oi ot n n n E E t θ θ θ θ θ θ θ 7 . 0 ) cos( ) sin( cos sin 2 cos cos cos 2 || = + = + − = t i t i i t i t t i i i n n n t θ θ θ θ θ θ θ θ θ
de aquí las reflectancias perpendicular y paralela son:
2 2 9.2 10− ⊥
⊥ =r = x
R
3 2
||
|| =r =8.5x10−
R
y las transmitancias:
9 . 0 cos
cos 2 =
= ⊥ ⊥ t n n T i i t t θ θ 99 . 0 cos cos 2 || || = = t n n T i i t t θ θ
En este caso se cumple que: 1 = + ⊥ ⊥ T R 1 || ||+T =
R
Con las ecuaciones anteriores se comprueba que los resultados de t⊥, t||, r⊥ y
||
r son correctos. Finalmente podemos decir que el porcentaje que se refleja esta dado por la siguiente ecuación:
% 90 9 . 0
1− = ≈
= R
T
De aquí se concluye que el 10% del haz incidente se refleja y el otro 90% se transmite al portaobjetos. Los cálculos anteriores pueden compararse con las gráficas mostradas en el apéndice A-1 (figura 4.47).
Etapa 2: Luz saliendo del divisor de haz
Figura 2.6 Luz saliendo del divisor
?i = 28.1o
?r = 28.1o
ni = 1.5
nt = 1.0
De la ley de refracción (o ley de Snell)
t t i
isen nsen
n θ = θ (Ec. 2.2)
despejando el ángulo transmitido
0
1 =45
= − t i i t n sen n sen θ θ
El haz se puede descomponer inicialmente en el haz reflejado (r) y trasmitido (t) y cada uno de estos en sus componentes perpendicular (⊥) y paralelo ( || ).
de las ecuaciones de Fresnel [9]:
3 . 1 ) sin( cos sin 2 = + = ⊥ t i i t t θ θ θ θ 4 . 1 ) cos( ) sin( cos sin 2 || = − + = t i t i i t t θ θ θ θ θ θ
de aquí las reflectancias perpendicular y paralela son:
2 2 9.2 10− ⊥
⊥ =r = x
R
3 2
||
|| =r =8.5x10−
R
y las transmitancias:
9 . 0 cos
cos 2 =
= ⊥ ⊥ t n n T i i t t θ θ 99 . 0 cos cos 2 || || = = t n n T i i t t θ θ
en este caso se cumple que: 1 = + ⊥ ⊥ T R 1 || ||+T =
R
Con las ecuaciones anteriores se comprueba que los resultados de t⊥, t||, r⊥ y
||
r son correctos.
Finalmente podemos decir que el porcentaje que se refleja esta dado por la siguiente ecuación: % 10 1 . 0 || = ≈ + =R⊥ R R
por lo cual, el porcentaje que no se refleja, entra al medio y esta dado por:
% 90 9 . 0
1− = ≈
= R
También se observa aquí que el porcentaje de luz que se refleja en la frontera es del 10% y el porcentaje de luz transmitida al aire es del 90%
De los dos casos anteriores se concluye que en el divisor de haz solo entra el 90% de la luz y de este 90% que entró, solo sale el 90%, es decir, saldría el 81% de la luz, por lo cual se podría pensar que se refleja el 19%, sin embargo, apoyándose de los cálculos anteriores y tomando en cuenta las reflexiones internas, podemos observar lo que sucede en la figura 2.7.
Figura 2.7 Reflexiones dentro del divisor de haz
De lo anterior se puede deducir lo siguiente:
% 2 . 18 10 1 . 8 % 10 0 2 ≈ + ≈
∑
= = − j i i iR (Ec. 2.3) ß porcentaje de luz reflejada
8 . 81 10 1 . 8 % 81 0 ) 1 2 ( ≈ + ≈
∑
= = + − j i i iT (Ec. 2.4) ß porcentaje de luz transmitida
de lo anterior: j = d / ∆l
l
∆ = 0.8017mm (resolviendo los triángulos rectángulos formados)
P ≈ 0.9 (100% - (R + T)) (Ec. 2.5)
2.2.2 Enfoque de la radiación sobre la muestra
En esta etapa del sistema se utiliza un lente biconvexo de un diámetro de 3.5cm. y una longitud focal de 15cm. que se colocó después del divisor de haz con el fin de concentrar la luz trasmitida hacia la muestra.
Una característica del láser de N2 es su alta divergencia conforme se aleja de su
origen, debido a esto es necesario volver a concentrar este haz en un área lo mas pequeña posible para obtener mayores intensidades de fluorescencia.
Las dimensiones del haz una vez enfocado en la muestra son de 1.7mm x 0.9mm;
Logrando con esto un área de 1.53 mm2.
En el diagrama de la figura 2.8 se muestran los detalles.
Figura 2.8 Lente biconvexa para enfocar el haz en la muestra
El ángulo de incidencia al lente es 0o por lo que la reflexión es del 4%, al entrar a
la lente, para un índice de refracción de 1.5 (Ver apéndice A-1 figura 4.49)
Como en este lente también existen reflexiones internas, se realizó un procedimiento similar al del divisor de haz con el fin de obtener los porcentajes de luz transmitida y reflejada obteniéndose lo siguiente:
Luz reflejada = 7.7% Luz transmitida = 92.3%
) 1 ( 4 − =
n nD EFL
2.2.3 Concentración de la fluorescencia
Una vez que el haz ha sido dirigido a la muestra, la fluorescencia se emitirá en todas direcciones, incluso a su alrededor, dependiendo de la naturaleza y las dimensiones de ésta. La porción de luz detectada estará determinada por la óptica de colección de la fluorescencia y los fotodetectores utilizados.
El propósito de esta etapa es captar la mayor parte de la fluorescencia provocada por el haz láser y dirigirla a un punto que puede ser directamente un fotodetector o una fibra óptica (como en este caso).
Existen distintos métodos para realizar este proceso dependiendo de la naturaleza del sistema de detección, por ejemplo, si se utiliza un solo detector o un arreglo de estos para cubrir un área mayor.
Para la realización del sistema de colección se utilizó un par de lentes esféricos (Edmund Industrial Optics L32-748) en una configuración para acoplar fibras ópticas. Estos lentes esféricos son unas excelentes herramientas para mejorar el acoplamiento de la señal entre fibras ópticas, emisores y detectores ópticos. El material de que están hechos es BK7 y el índice de refracción es 1.51, en este caso los lentes esféricos tienen un diámetro de 10mm.
Figura 2.9 Lentes esféricos BK7
A continuación se muestran dos configuraciones básicas para concentración de luz:
Configuración 1: Acoplamiento de luz a una fibra óptica
[image:26.612.210.409.586.668.2]En esta configuración la luz que viene dispersa se enfoca a un punto en el cuál debe estar el inicio de la fibra óptica que llevará la luz. La longitud focal efectiva (EFL) según el fabricante, esta dada por la ecuación mostrada en la figura 2.10
Figura 2.10 Configuración para acoplamiento de luz a una fibra óptica1
donde:
D: Diámetro del lente esférico EFL: Longitud Focal Efectiva P: Eje perpendicular n: Coeficiente de reflexión d: Diámetro del haz
Configuración 2: Acoplamiento entre dos fibras ópticas
Esta configuración se usa para acoplar dos fibras ópticas, se utilizan dos lentes idénticas y se ponen en contacto con ambas fibras según se muestra en la figura 2.11.
Figura 2.11 Configuración para acoplamiento de dos fibras ópticas1
Tomando en cuenta que el área de emisión de fluorescencia puede ser muy pequeña dependiendo del tipo de material que se esté estudiando se decidió utilizar la configuración 2. Por ejemplo, para el caso del papel el área de emisión de fluorescencia es aproximadamente igual al área del haz de luz láser concentrado (1.7mm x 0.9mm). Ver figura 2.12.
Figura 2.12 Arreglo de los lentes para enfocar la mayor cantidad de fluorescencia posible en la fibra óptica
Figura 2.13 Cilindro donde se encuentran integrados el divisor de haz, la lente biconvexa y las esferas concentradoras de fluorescencia a la fibra óptica (ver figura 2.1)
En el apéndice A-3 se muestran los planos de construcción del cilindro. Y en el apéndice A-4 se muestran los planos de construcción de las terminales del mismo.
2.2.4 Goniómetro
Con el uso de un goniómetro se pueden obtener los patrones de esparcimiento de luz UV debido a los materiales bajo estudio. Éste instrumento cuenta con dos graduaciones que permiten fijar los ángulos de observación de luz esparcida y de esta forma poder construir una gráfica mostrando la intensidad de luz en cada punto. Se pueden emplear filtros de diferente tipo no solo para generar patrones de radiación de luz UV sino para bloquearla y construir un patrón de radiación de, por ejemplo, fluorescencia.
El goniómetro en el estudio de papel ayuda a determinar la posición de las fibras con que el papel fue construido ya que al obtener una gráfica de frente al papel que esta dispersando la luz UV se observa que tiene una característica elíptica y el eje mayor mostrará la posición de las fibras en el papel.
(a) (b)
Figura 2.14 (a) Goniómetro para medir patrones de radiación (reflexión) (b) configuración para determinar la radiación detrás del papel (transmisión).
El goniómetro no es parte fundamental para la obtención espectros de fluorescencia sin embargo se podría utilizar en conjunto con el sistema para obtener espectros de fluorescencia a distintos ángulos. Este instrumento se opera manualmente; para obtener los patrones de radiación se hace incidir la luz del láser de manera perpendicular al papel (que siempre debe quedar fijo) y se realiza un barrido desde 0o a 180o tomando en el plano paralelo al eje óptico. También permite obtener gráficas de la forma del patrón de radiación en planos perpendiculares al eje óptico. Las figura 2.15 (a) y (b) muestran las gráficas correspondientes obtenidas para una muestra de papel blanco.
(a) (b)
Figura 2.15 (a) Patrón de radiación de luz UV en papel en el plano paralelo al eje óptico, (b) radiación de reflexión en el plano perpendicular al eje óptico vista a un ángulo de 40o respecto al eje óptico
2.3 Subsistema espectrométrico
Esta parte la componen la fibra óptica, el monocromador, el tubo Fotomultiplicador y el fotodiodo de referencia. El trabajo principal del subsistema espectrométrico es tomar la muestra de fluorescencia y obtener sus componentes espectrales en función de la longitud de onda. La fibra óptica se encarga de conducir la luz de fluorescencia inducida por el láser hacia el monocromador, mismo que la descompone en sus componentes, la intensidad de cada componente se convierte por el PMT a señal eléctrica y se observa en un osciloscopio.
2.3.1 Fibra óptica
Las fibras ópticas son filamentos de vidrio o plástico que son capaces de transmitir la luz en su interior.
La misión que tiene la fibra óptica en este subsistema es conducir la fluorescencia emitida por la muestra hacia el monocromador.
intervalo de análisis. Tiene una cubierta de plástico que provee una máxima eficiencia en la transmitancia debido a la razón núcleo-revestimiento que es 10:1. La funda es de PVC y esta terminada con puntas de acero inoxidable (figura 2.16). Su longitud total es de 36" (92.5cm) y tiene un diámetro de 0.250" (6.35mm).
Figura 2.16 Fibra óptica de cuarzo
2.3.2 Monocromador
Un monocromador se caracteriza por presentar en su salida un haz de radiación de gran pureza espectral y permitir analizar las longitudes de onda del haz (o radiación) incidente de forma continua en un amplio intervalo. Los componentes básicos de un monocromador son:
ü Una rendija de entrada que selecciona un haz de luz entrante. ü Un elemento dispersante.
ü Una o mas rejillas de dispersión. (el monocromador usado tiene tres que forman un prisma triangular).
ü Una rendija de salida que aísla la banda espectral deseada. El diagrama simple del monocromador se muestra en la figura 2.17
Figura 2.17. Principio básico del monocromador
permiten seleccionar la resolución del barrido y es posible controlarlo remotamente por medio del puerto serie de una PC (RS-232).
La resolución mínima es de 0.1nm y dependiendo de la rejilla seleccionada se pueden obtener intervalos de barrido de 100nm a 750nm, 100nm a 1500nm ó 100nm a 2400nm.
Debido a que la fluorescencia inducida por láser se encuentra dentro del espectro visible en su mayoría, se utiliza la rejilla 1, que es capaz de realizar un barrido desde 100nm a 750nm
2.3.3 Tubo fotomultiplicador
En la salida del monocromador se pueden tener niveles de luz extremadamente pequeños por lo que se usó un tubo fotomultiplicador modelo R955 de Hammamatsu® que proporciona niveles de tensión equivalentes a la cantidad de
luz en la salida del monocromador.
Algunas características principales del PMT utilizado se muestran en la tabla 2.1. ANCHO ESPECTRAL 160 A 900 NM
Tiempo de respuesta 2.2 ns
Sensibilidad 7.4x105 A/W a 400 nm Corriente de oscuridad 3 nA
Tensión de alimentación 1000V máx
Tabla 2.1 Principales características del PMT R955
Para revisar otras características se muestran las hojas del fabricante en el apéndice A-6
2.3.3.1 Punto de operación óptimo del PMT
Los PMT's se caracterizan por tener una curva de ganancia (punto de operación) que varía de acuerdo a la tensión de alimentación. Existe un punto llamado
meseta en donde la ganancia del PMT no depende de la tensión de alimentación.
La meseta nos indicará la región en donde es mas estable la operación del PMT. Trabajando en esta región se obtienen mediciones mas confiables.
Ya que la intensidad de entrada siempre permanece constante siempre a la misma longitud de onda (en este caso 632.8nm de un láser de He-Ne), la ganancia es directamente proporcional a la tensión de salida. Conociendo esto se procede a graficar la respuesta de la tensión de salida respecto a la tensión de alimentación del PMT obteniéndose la gráfica mostrada en la figura 2.18.
Punto de operación del PMT
750 V
650 V
0 10 20 30 40 50 60
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850
Tensión de alimentación [V]
Tensión de salida [V]
Figura 2.18 Gráfica de la tensión de salida del PMT en función de su tensión de alimentación
El barrido realizado va de 200V a 800V con incrementos de 10V. Se observaron dos puntos en donde la ganancia tiene variaciones debidas a la tensión de alimentación, por lo cual este detector cuenta con dos mesetas que, aunque pequeñas, permiten operar de una forma mas eficiente al PMT. De acuerdo a la gráfica, las tensiones de alimentación óptimas son 650V y 750V.
El PMT se operó con una tensión de alimentación de 750V con el fin de obtener una mayor ganancia y por lo tanto mayor amplitud en las señales detectadas.
2.3.3.2 Ruido de fondo del PMT
La salida del tubo PMT presenta una señal de ruido de fondo inducido en la línea provocada por la descarga eléctrica en el láser de nitrógeno utilizado. Las condiciones de medición fueron: luz totalmente bloqueada a la entrada del PMT, todo el equipo en operación normal, (PC, láser, fuentes de alimentación, monocromador)
de alimentación del PMT. Otro aspecto importante para disminuir el ruido de fondo es la reducción de la longitud de cables del PMT hacia el osciloscopio, inicialmente se tenían cables de 3m de longitud y se redujeron a 20cm para el PMT y 50cm para el fotodetector de referencia. Además se alejó el sistema óptico y el espectrométrico del láser con esto se acortó la separación entre los instrumentos de medición.
Así, el ruido inducido en el PMT es el que se muestra en la figura 2.19. Una característica de esta señal es su alta repetitividad en cada descarga del láser, lo cuál es de gran ayuda para obtener los tiempos de fluorescencia de los materiales a estudiar.
Ruido de fondo con el PMT
-0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
50 ns/div
[image:34.612.110.503.254.466.2]Tensión [V]
Figura 2.19 Ruido de fondo del PMT (800mV pico máximo)
2.3.4 Fotodiodo para muestreo de la radiación láser
Las características principales del fotodiodo utilizado se muestran en la tabla 2.2. ANCHO ESPECTRAL 300 A 1150 NM
Tiempo de respuesta 1 ns
Sensibilidad (S) 1.2 - 6.6 µA/mW/cm2 a 800 nm Corriente de oscuridad 14 nA
Área de detección 0.1225 cm2
Tabla 2.2 Principales características del fotodetector MRD500
La gráfica mostrada en la figura 2.20 muestra la curva de respuesta espectral relativa del fotodiodo. Esta curva es útil para conocer la respuesta real de éste en función de la longitud de onda de la luz incidente. Para este caso, la longitud de onda de la luz UV del láser de nitrógeno es 337.1nm y su tensión de salida será el 10% de la tensión obtenida si se excitara con luz de una longitud de onda de 800nm (respuesta máxima).
Figura 2.20 Respuesta espectral relativa del fotodetector MRD500
Para revisar otras características de este fotodiodo se muestran las hojas del fabricante en el apéndice A-7
2.3.4.1 Caracterización del circuito detector
En esta parte se pretende obtener las limitaciones de detección del fotodiodo de referencia. En la figura 2.21 se observa el circuito eléctrico utilizado. La salida tiene una impedancia de 50? .
Respuesta espectral relativa
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Longitud de onda (µm)
Re
Figura 2.21 Circuito eléctrico del detector
Los parámetros que se obtuvieron son: la sensibilidad real e intensidades mínimas de detección y con lo anterior, para contar con una ecuación que relacione la tensión a la salida del detector contra la potencia real incidente.
2.3.4.1.1 Sensibilidad real
La sensibilidad es una característica del fotodiodo que relaciona la corriente circulante en el diodo debida a la potencia de luz incidente en función del área de detección del fotodiodo. Sus unidades son [µA/mW/cm2].
Los valores de sensibilidad mínima y máxima de este dispositivo según el fabricante son S1=1.2 y S2=6.6 µA/mW/cm2 respectivamente. Con estos valores y
conociendo el área de detección del fotodiodo se puede comenzar el análisis para obtener el valor real de la sensibilidad.
tomando el valor de sensibilidad máximo.
S2 = 6.6 [0.1225 cm2] = 0.8085 (Ec. 2.6)
De las unidades se observa que esto corresponde a una relación de corriente I entre potencia, dada por:
mW A P
I 0.8085 /
2 µ = à mW A I P / 8085 . 0
2 = µ a 800nm
pero la respuesta a 337nm es el 10%, por lo tanto:
mW A I P / 08085 . 0 * 2 µ
= a 337nm (Ec. 2.7)
W V x V mW V V mW A V mW A I P o / 10 0425 . 4 / 0425 . 4 / 08085 . 0 50 / / 08085 . 0 3 0 0 *
2 = = −
Ω = = µ µ µ * 2
P = 247.4 Vo [W] (a 337nm) (Ec. 2.8)
realizando el mismo procedimiento con S1 = 1.2 se tiene la siguiente
ecuación: *
1
P = 1361 Vo [W] (a 337nm) (Ec. 2.9)
Con las ecuaciones 2.8 y 2.9 se puede trazar una gráfica que muestre los límites de los valores de sensibilidad.
Apoyándonos de los datos de la sección 2.1 ( P=275W, V0=614mV de la Ec.2.1 y
Fig.2.3) podemos trazar en la gráfica el punto que corresponde a la potencia del láser utilizado y la tensión que proporciona el fotodetector (Figura 2.22). Se observa que este punto se encuentra dentro de los límites de lo esperado. La pendiente de la recta trazada desde el origen al punto obtenido esta relacionada con la sensibilidad del fotodetector.
Figura 2.22 Tensión de salida en función de la potencia de luz incidente
La nueva recta corresponde entonces a la siguiente ecuación:
[image:37.612.129.490.380.611.2]Con esta ecuación se realizó el proceso inverso al desarrollado para obtener P1 y
P2 y así conocer la sensibilidad real del fotodiodo:
P = 447 Vo
mW A I mW A V nW V V W V x V P / 04465 . 0 / 04465 . 0 50 / / 2327 . 2 / 10 2327 . 2 0 0 3 0 µ µ µ = Ω = = = − mW A P
I =0.04465µ / a 337nm
P I
= 0.4465 µA/mW a 800nm
multiplicando por el área de detección del fotodiodo: S = 3.64
que es el valor de sensibilidad real del fotodiodo.
2.3.4.1.2 Potencia mínima de detección
El ruido de oscuridad produce una tensión de salida que limitará la lectura de señales muy pequeñas, la mínima potencia necesaria para rebasar este valor se deduce de lo siguiente:
IDARK = 14nA generan una tensión a la salida igual a V0 = 700nV que equivalen a
una potencia incidente de P = 312.9µW según la ecuación 2.10.
Para tener un valor real de la potencia que se podría detectar se debe tomar en cuenta el ruido debido a la descarga del láser. La señal de ruido a la salida del fotodiodo provocada por el láser es la que se muestra en la figura 2.21
En la señal de ruido mostrada en la figura 2.23 se observa, como en el caso del PMT, que la señal de ruido es repetitiva y tiene niveles de tensión pico máximos de 70mV, que, si se utiliza la ecuación 2.10 se podrá saber que potencia mínima necesaria para rebasar estos niveles de tensión de ruido y así tener un umbral mínimo de detección confiable.
Figura 2.23 Señal de ruido a la salida del fotodetector de referencia
En este caso particular, la señal de referencia vista por el fotodiodo es de aproximadamente 50W (18% desviados por el divisor de haz de los 275W totales del láser) y rebasa la potencia mínima de detección.
El plano de construcción para el cilindro que contiene este fotodetector se muestra en el apéndice A-8.
2.4 Registro de las señales de radiación láser y fluorescencia
Las señales eléctricas debidas a la radiación láser y la fluorescencia proporcionadas por los fotodetectores se registran en un osciloscopio digital Tektronix® 2440 con una tasa máxima de digitalización de 500 MS/S lo que proporciona un ancho de banda máximo de 200Mhz.
Algunos osciloscopios digitales permiten guardar las señales registradas en un disco y posteriormente observar estas imágenes en una PC, aunque esta es una gran ventaja, la grabación de señales en disco es lenta y si se deseara realizar alguna operación matemática con dos o mas señales mediante este proceso, resultaría una actividad demasiado lenta y tediosa.
El osciloscopio utilizado no tiene la capacidad de registrar estas señales en un disco, sin embargo cuenta con una interfase de comunicación GPIB con el estándar IEEE 488 que le permitirá comunicarse con una PC para transferir todas las señales que se requieran en un tiempo corto.
Ruido de fondo a la salida de fotodetector de referencia
-0.01 -0.008 -0.006 -0.004 -0.002 0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
2.4.1 Interfase GPIB bajo la norma IEEE 488
Utilizando una interfase estándar, se pueden diseñar instrumentos que tengan un nivel básico de compatibilidad con otros instrumentos que cumplan con la norma. La norma IEEE 488 define tres aspectos de la interfase de un instrumento:
• Mecánica. El conector y el cable
• Eléctrica. Los niveles eléctricos para las señales lógicas y como las señales con enviadas y recibidas
• Funcional. Las tareas que la interfase de un instrumento puede realizar tales como, enviar datos o recibirlos.
El conector GPIB tiene 24 pines, 16 asignados a señales específicas y 8 para tierras. Los instrumentos pueden conectarse en una configuración serie, de estrella o una combinación de ambas. La forma lineal es donde el cable GPIB estará conectado de un instrumento al siguiente. En la configuración de estrella, todos los cables de los instrumentos están conectados a un punto en común. Para mantener las características eléctricas de potencia en el bus, un dispositivo debe estar conectado mediante un cable de 2 metros de longitud como máximo y al menos dos terceras partes de los instrumentos conectados al bus deben estar encendidos.
Las tensiones requeridas en todos los conectores del bus se basan en la tecnología TTL.
Un “1” lógico corresponde a tensiones > 2 volts y < 5.2 volts Un “0” lógico corresponde a tensiones > 0 volts y < 0.8 volts
Cada instrumento conectado al bus tiene una única dirección primaria. Se puede asignar una dirección primaria a cada instrumento en el intervalo de 0 a 31. Con esto se observa que un solo bus es capaz de controlar hasta 32 instrumentos.
2.4.2 Tarjeta GPIB
Para poder establecer la comunicación entre la PC y el osciloscopio por medio de la interfase GPIB es necesario contar con una tarjeta que nos permita realizar este proceso de control.
Se utilizó una tarjeta GPIB de National Instruments® AT-GPIB/TNT con el fin de
Algunas características de esta tarjeta son las siguientes:
• Transferencia máxima de datos de 1.5 MBytes/s, normalmente 1 MB/s
• Compatible con sistemas Windows 95/98/ME
• Control simultáneo de hasta 32 instrumentos
Capítulo 3
C
aracterísticas de Operación del
Sistema
En esta sección se describen algunos aspectos detallados del sistema, la forma en que se generan los espectros de emisión de fluorescencia y la obtención de comportamiento temporal de la fluorescencia con el cálculo de su tiempo de vida.
3.1 Envío de señales del osciloscopio a la PC
El osciloscopio es capaz de enviar la señal registrada a una PC en forma de gráfico o como una lista de datos que corresponden a las variaciones de amplitud con el tiempo de la señal.
Para este caso las señales son enviadas a la PC como un arreglo de datos numéricos que tiene una longitud de 1024 elementos. Esta es una gran ventaja porque de esta manera se pueden obtener los niveles de tensión correspondientes a cada instante de tiempo sin necesidad de adivinarlos en una gráfica. Otra
ventaja es la facilidad con que se pueden realizar operaciones matemáticas entre dos o mas señales.
El tiempo de transferencia de los datos del osciloscopio (de una sola señal) a la PC es de aproximadamente 10ms según lo siguiente:
Tasa de transferencia de datos: 1 Mb/seg = 1024 Kb/seg
Tamaño de los datos enviados: 10 bytes por punto (1 de inicio, 8 del dato, 1 de cola) Número de puntos enviados: 1024 para toda la forma de onda
Total de información enviada: 10240 bytes = 10Kb
3.2 Control del monocromador
El monocromador Spectra Pro 275 es controlado por medio de la PC haciendo uso de la interfaz serie RS-232. La PC se encarga únicamente de enviarle los comandos necesarios al monocromador para que el mecanismo interno de éste permita el paso de luz correspondiente a la longitud de onda deseada.
Un ejemplo para el envío de este comando es la siguiente: 337.1 GOTO
En este caso, el monocromador responde colocando sus espejos de tal manera que solo pase la luz UV generada por un láser de N2 (correspondiente a la longitud
de onda de 337.1nm)
El proceso general para obtener los espectros de emisión es realizar un barrido en un intervalo de longitudes de onda deseado por lo que únicamente es necesaria esta instrucción de posicionamiento.
3.3 Obtención de espectros de emisión de fluorescencia
[image:43.612.168.447.441.688.2]Algunas de las abreviaciones utilizadas en el diagrama de flujo se definen a continuación.
L_ONDA INICIAL: Es la longitud de onda inicial en donde el monocromador comenzará el barrido para obtener el espectro. Este valor lo define el usuario en el programa.
V/DIV: Coloca las escalas de tensión de los canales del osciloscopio, Este valor también lo define el usuario mediante los controles que aparecen en el programa. SEC/DIV: Aquí se define la escala de tiempo del osciloscopio. Se define en el programa de usuario
VMAX CH1?, VMAX CH2?: La PC le pide los valores de tensión pico al osciloscopio correspondientes a la señal presente en los canales 1 y 2 respectivamente.
PROMEDIO DE 256 SEÑALES: En el osciloscopio se realiza el promedio de 256 señales consecutivas con el fin de reducir el ruido aleatorio y enviar una sola señal que represente el promedio de éstas. Con esto se reduce también el tiempo de transmisión de información entre el osciloscopio y la PC. Los pulsos de un láser de N2, por generarse a través de una descarga eléctrica, varían su amplitud dentro de
un intervalo por lo que el proceso de promediación es necesario para obtener señales mas estables. Este proceso es el mas largo de todos (4 segundos si el láser opera a una frecuencia de 60Hz aproximadamente).
PEDIR FORMA DE ONDA: Aquí se realiza el proceso de adquisición de los datos numéricos de la forma de onda presente en cada canal.
GRABAR VMAX1, VMAX2, LONDA: Se guardan los valores correspondientes en una hoja de cálculo de Microsoft Excel para su posterior graficación.
L_ACT: Es la longitud de onda en que esta posicionado el monocromador.
INC L_ACT: Se incrementa la longitud de onda actual de acuerdo a los pasos incrementales definidos por el usuario en el programa para continuar el barrido. L_FIN: Longitud de onda final definida también en el programa de usuario.
En el archivo de Excel generado se guarda en la primer columna el valor de la longitud de onda, después el valor de la tensión pico del canal 1 (pulso de referencia), en la tercer columna se guarda el valor de tensión pico en el canal 2 (señal del PMT) y por último el tiempo de defasamiento entre los picos de las señales del canal 1 y 2 que, aunque en este caso no se utiliza, puede servir para obtener distancias entre los objetos que se estén midiendo.
3.3.1 Interfase de usuario
Con el software desarrollado en LabView de National Instruments® se pueden
seleccionar las condiciones de operación del sistema para la obtención de los espectros de emisión.
[image:45.612.85.530.250.568.2]En la figura 3.2 se muestra esta interfase editada y posteriormente se da una pequeña descripción de la función de los controles e indicadores marcados por un número.
Figura 3.2 Interfase de usuario programado en LabView 6i
Los nombres de los controles de la figura 3.2 son los siguientes: 1. Barra de selección de escala de tiempo
8. Longitud de onda final del barrido
9. Puerto serial donde se encuentra conectado el monocromador
10. Nombre del archivo en donde se guardarán los datos para graficar el espectro 11. Palanca de selección para la función que se desea realizar
13. Ejecución del proceso
Y los indicadores son los siguientes:
4. Pantalla para desplegado de las señales en el tiempo 5. Barra de progreso en el barrido
12. Pantalla de espectro
3.3.2 Operación de la interfase de usuario
Se deben seguir tres pasos para poner en marcha el programa de generación de espectros.
3.3.2.1 Inicialización de comunicación entre el monocromador y la PC
Para ejecutar el programa, el monocromador debe inicializarse solamente la primera vez, después de esto, no es necesario repetir el proceso a menos que la PC o el monocromador se apaguen.
Para realizar esta operación, la palanca de selección (11) debe colocarse en la primera posición (Iniciar Monocromador) y presionar la flecha que corra el proceso (13).
Encender el monocromador y esperar unos segundos. El programa responderá presentando una pequeña ventana pidiendo que se verifique la leyenda
“COMPUTER CONTROL” en el display del monocromador, si este mensaje aparece, el
[image:46.612.232.381.569.669.2]monocromador ha iniciado su comunicación correctamente con la PC, si no es así, se debe repetir el proceso o verificar la conexión al puerto serie, ver figura 3.3.
3.3.2.2 Posicionamiento del monocromador al inicio del intervalo de barrido
Una vez iniciada la comunicación entre el monocromador y la PC éste se debe posicionar al inicio del rango en el cual se desea hacer el barrido. Para realizar esto la palanca de selección (11) debe recorrerse hasta la función llamada “Posición Inicial” y presionar la flecha que corra el proceso (13). El monocromador, ya inicializado, deberá responder recorriéndose a la posición que el usuario haya definido en el control 6 de la figura 3.2.
3.3.2.3 Ejecución del barrido
Antes de ejecutar el barrido se debe escribir el nombre de un archivo, en formato Excel®, en donde se guardarán los puntos del espectro obtenido.
Ahora solo resta cambiar la palanca de función a la segunda posición (Barrido) y presionar la flecha de ejecución del proceso (13). A continuación comenzará el proceso de barrido mostrándose en la barra de progreso (5) el avance parcial de éste.
Conforme avanza el proceso, en la pantalla de espectro (12) se irá mostrando parcialmente el espectro obtenido.
El proceso puede interrumpirse en cualquier momento, si así se desea presionando el botón de stop situado a un costado de la flecha de ejecución de proceso, ver figura 3.2.
3.3.3 Graficación del espectro en Microsoft Excel®
Una vez almacenados los valores numéricos de las tensiones pico en función de la longitud de onda, es conveniente tener una representación gráfica de éste. Se generó una macro (ver Apéndice A-9) en lenguaje Visual Basic para realizar este proceso automáticamente con solo presionar las teclas <SHIFT><CTRL>A. Una vez abierto el archivo almacenado si se presiona esta secuencia aparecerá automáticamente una gráfica mostrando el espectro de emisión de fluorescencia igual al mostrado parcialmente en la pantalla de espectro.
3.3.4 Desacoplamiento de impedancia del PMT para los espectros de fluorescencia
duración, se realizaron algunas pruebas desacoplando el PMT con el fin de aumentar la tensión de salida de éste.
Basándose en un divisor de tensión formado por dos resistores. Vo = VT RL / (R + RL)
Si R fuese la resistencia interna del PMT y RL el resistor de carga, a valores
mayores de RL el valor de la tensión de salida Vo aumenta, de esta manera se
obtienen espectros de emisión de mayor intensidad.
En las figura 3.4 se muestran los espectros obtenidos de un haluro alcalino (NaCl:Eu)
(a)
(b)
Esp e c t r o d e F l u o r e sc e n c i a d e N a C l : Eu ( c a r g a d e 5 0 O h m s)
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4
0 100 200 300 400 500 600 700 800
Longit u d d e o n d a [ n m ]
Espe c t r o d e F l u o r e sc e n c i a d e N a C l : E u ( C a r g a 1 k O h m )
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
0 100 200 300 400 500 600 700 800
Espe c t r o d e F l u o r e sc e n c i a d e N a C l : E u ( c a r g a 1 0 k O h m s)
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0 100 200 300 400 500 600 700 800
Longit u d d e o n d a [ n m ]
Esp e c t r o d e F l u o r e sc e n c i a d e l N a C l : Eu ( si n c a r g a )
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
0 100 200 300 400 500 600 700 800
Longit u d d e o n d a [ nm]
Figura 3.4 Espectros de emisión obtenidos con distintas resistencias de carga a la salida del PMT
En los cuatro casos la amplitud máxima corresponde a una longitud de onda de 445nm y se observa mayor distorsión en los espectros obtenidos con cargas a la salida del PMT de 50O y 1 KO.
Los mejores espectros se obtienen con carga de 10KO y sin carga2 (con el sistema desacoplado), decidiendo a partir de aquí, que todos los espectros de emisión se obtengan bajo estas condiciones.
2
Se habla del término “sin carga” como si se despreciara la impedancia de entrada del osciloscopio, sin
(c)
3.4 Método para medición del tiempo de vida de la fluorescencia
Para la medición de tiempo de vida de la fluorescencia se emplea el mismo arreglo físico descrito en la sección 2.3 (capítulo anterior, figura 2.13).
Debido a los problemas de ruido presentados en el PMT, el sistema tendría una gran restricción para la medición de tiempos de vida ya que en algunas ocasiones las tensiones en el PMT debidas a la fluorescencia de los materiales estudiados no son lo suficientemente grandes como para rebasar a las tensiones provocadas por el ruido.
La solución propuesta para este problema fue realizada en tres pasos:
1.- Tomar el promedio de este ruido (256 señales) bloqueando totalmente la entrada de luz del PMT. Ver figura 3.5a
2.- Permitir la entrada de fluorescencia al PMT de la muestra bajo estudio y registrar nuevamente la señal promedio (256 señales). Ver figura 3.5b
3.- Restar la señal de ruido tomada en el punto 1 a la señal de fluorescencia. Ver figura 3.5c
[image:50.612.95.518.402.676.2]En la figura 3.5 se muestra una señal de tiempo de vida de la fluorescencia obtenida mediante este procedimiento.
Se podría pensar que al sacar el promedio de muchas señales provenientes del mismo evento el tiempo de vida obtenido sería erróneo, ya que al tener diferentes amplitudes el tiempo de caída varía virtualmente. Sin embargo esto no es así. El tiempo de vida en su forma más básica presenta un comportamiento exponencial dado por la siguiente expresión:
τ / 0 ) ( t e A t
A = −
donde: t es el tiempo de vida
A0 es la amplitud máxima de la señal donde t=0
t es el tiempo transcurrido cuando t = t
A(t) = A0e-1
que es la amplitud de la señal cuando el tiempo transcurrido es igual al tiempo de vida.
Los pulsos del láser de N2 son de amplitud variable, pero de ancho constante
(FWHM), por esta razón la amplitud de señal de fluorescencia varía también de pulso a pulso emitido. El proceso de promediado permitirá llegar a un límite de la amplitud registrada sin afectar la caída exponencial además de obtener un espectro de emisión continuo en caso de requerirlo.
A(t) = (A0e-t/t+ A1e-t/t + A2e-t/t+ … + A254e-t/t+ A255e-t/t) / 256
A0, A1 …son las amplitudes máximas de la señal de fluorescencia en cada pulso
Como se trata del mismo evento (mismo material a estudiar) el tiempo de vida (t)
obviamente es el mismo, entonces:
A(t) = 0 1 2 254 255 /τ 256 A A ... A A A t e− + + + +
A(t) = t/τ e A −
A(t) = Ae−1
En la figura 3.6 se muestra el promedio de 256 señales obtenidas consecutivamente así como el tiempo de vida. (no se ponen las escalas reales por tratarse de un ejemplo)
Figura 3.6 Comportamiento exponencial típico de la fluorescencia y su tiempo de vida
3.4.1 Limitación en la medición del tiempo de vida debido a la respuesta natural del sistema
El sistema por si solo presenta un tiempo de caída que limita las mediciones de tiempo de vida de fluorescencia, por ejemplo, si el sistema tuviera un tiempo de caída de 50ns únicamente sería posible realizar mediciones de tiempos de vida de fluorescencia mayores a este valor. El tiempo de caída no solo depende de la velocidad del detector óptico que se esté utilizando, también depende de la naturaleza de los pulsos de excitación y del tiempo de respuesta del osciloscopio. Para conocer éste tiempo de caída natural del sistema se utilizó el arreglo mostrado en la figura 3.7, éste arreglo inyecta la señal del láser a la fibra óptica y en el osciloscopio se registra lo que en realidad es el pulso del láser de N2 pero
que ha pasado por la propia fibra óptica y el monocromador antes de llegar al PMT.
Figura 3.7 Arreglo experimental para la medición del tiempo de respuesta natural del sistema
En la figura 3.8 se observa que el tiempo de respuesta natural es de 2.4ns, por lo cual el sistema estará limitado a realizar mediciones de tiempo de vida mínimos de 2.4ns.
