Departameato de Química, Area de Biofisicoquímica

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UNIVERSIDAD AUT~NOMA

METROPOLITANA

IZTAPALAPA

PROYECTO

TERMINAL

DE

LA LIC.EN Q&CA

TITULO: PURIFICACI~N

Y CINÉTICA DE DESNATURALIZACI~N

DE

LA CARICAÍNA.

POR:

LETICIA

LÓPEZ

ARENAS

DICIEMBRE

DEL

96.

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El presente trabajo f i e desarrollado en la Universidad Autónoma Metropolitana- Unidad Mapalapa, División de

CBI,

Departameato de Química, Area de Biofisicoquímica (R-209), bajo la

dirección

de la Dra.

Sihia

S o b Mendiola.

r

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c

c L c L c LA INTRODUCCI~N

CROMATOGMF~ DE INTERCAMBIO IÓNICO.

La punñcación de las proteínas es de gran importancia ya que para realizar cualquier estudio sobre ellas, lo primero que hay que considerar es su pureza, con lo cual se asegura que los resultados obtenidos corresponden exchisivamente a la proteína estudiada.

La cromatograña líquida de alta resolución

(HPLC)

presenta una gran cantidad de ventajas con respecto a la cromatograña tradicional, por ejemplo, versatilidad, rapidez, reproducibilidad, estabilidad y senddidad.

Algunos de los componentes del equipo de HPLC son :

1.- Sistema de entrega del solvente.

2.- Válvuia de myección para la muestra.

3.- Detector.

4.- Registrador o computadora para exhiiir y almacenar los resultados.

La cromatograña de intercambio ióniw se basa en el equilibrio de los iones de soluto entre el solvente y los sitios fijos cargados de la fise estacionaria. En los intercambindores aniónicos, los grupos con carga positiva están unidos covalentemente a la fase estacionaria.

Los animes del soluto son atraídos hacia estos sitios. Los intercambiadorea catiónicos contienen sitios de carga negativa unidos covalentemente, los cuales retienen los cationes del soluto.

La resolución de la cromatograña de líquidos mejora al disminuir el tamaño de partícula de la fase estacionaria. El precio de utilizar partículas muy íinas es la resistencia al flujo. Por lo tanto es necesario emplear alta presión para fonar el paso del líquido a través de la columna. Normahnente se requieren presiones aproximadas de 7 a 40 MPa ( 70 a

400 atm ) para obtener gastos de 0.5 a 5 ml I min.

La cehdosa, dextrán e mtercambiadores relacionados son adecuados para el mtercambio iónico de macromolécuias, como las proteínas. El segundo (dextrán), con

enlaces cnizados de glicerina, se vende con el nombre de Sephadex Otros mtercambiadores iónicos macroporosos se basan en el polisacérido agarosa y en la poiiacrilamida. Los geles de m t e r c w o iónico se utdizan en el caso de moléculas grandes (proteínas y ácidos nucleicos),

las cuales no pueden penetrar en los poros de las reshas. A menudo, las molécuías grandes tienen cargas tan altas que si pudieran penetrar en las resnias, quedarían retenidas tan fuartemente que no podrían *se. En la cromatograña de mtercambio iónico se debe de tomar en cuenta tanto el punto isoeléctrico @I) como la carga neta de las proteínas a SeP-.

INTERCAME310 CATIÓNICO.

c

....

L c *._ c L c

....

c I c

valor del punto isoeléctrico de la proteína. El valor del pH debe estar alejado del punto isoeléctrico, ya que en este punto las fuerzas de repuisión son míuimas lo que hace que las proteínas tiendan a agregarse con su consecuente precipitación hal.

INTERCAMBIO ANIÓNICO.

Cuando la proteína a separar tiene carga negativa neta se trata de intercambio aniónico, por lo tanto la fase estacionaria debe tener carga positiva neta. El pH de la fase

móvil (regulador) será mayor que el valor del punto isoeléctrico de la proteína a separar.

CROMATOGRAFÍA DE FILTRACI~N EN GEL ( CFG

1.

La cromatograña de exclusión molenilar también se denomina comúnmente

cromatograña de filtración en gel o cromatograña de permeación en gel. Esta técnica [l], en

la cual las moléculas se separan por su tamaño, se utiliza ampliamente en bioquímica para

separar molédas grandes como proteínas y carbobidratos. La fase estacionaria contiene pequeños poros en los que pueden penetrar las moléculas de tamaño reducido, pero no a 4 las grandes. Por lo tanto, el volumen diqonible es mayor para las moléculas pequeñas que para las más grandes. En consecuencia, las molécuias de mayor tamaño se eluirán de la columna antes que las pequeñas, como se muestra en la

fisura

1. Desde otro punto de vista, puede considerarse que las moléculas grandes pasan todo el tiempo en la fase móvil, mientras que las de menor tamaño pasan sólo una kacción del tiempo en esa fase. Asá las moléculas pequeñas se transportan más lentamente.

Los

geles más utilizados en la exclusión molecular son de la clase de Sephadex El tamaño de poro de los geles es controlado por el grado de formación de enlaces cruzados en el proceso de fabricación. Cada gel se encuentra disponible en varios tamaños de partícula. A

menor tamaño de partícula, mayor resolución y menor gasto de la cohinma. La fiítración en gel se utiliza pxincipahmte para separar mezclas de molédas con distinto masa molecular. Se puede separar una mezcla de 3 rnoIédas, por ejemplo, una mezcla de papah, q u h o p a p a h y cardíaca, cuyas masas moleculares son 23 350, 24 O00 y 24 O00 Da respectivamente [2]. Tomando en cuenta las masas moleculares es posiile identiíicar en u11 cromatograma que pico corresponde a cada proteína, ya que primero se eluye a la de mayor

masa molecular que en este caso sería quimopapaína, después la caricaína y por último la papaína, como se puede observar en la figura 2.

La cromatograña de filtración en gel también se utiliza para determinar masas

molecuiares. Se realiza una gráfica de logaRtm0 de la masa molecular de proteínas ya

conocidas contra el coeíiciente de distriición ( Kd ) de cada proteína. El coeficiente de

distn’bución se detexmina por la relación :

Ve

-

Vv

Vm- Vv

Fig.

1.

. I .I 11 8 10 I7 1.1 111 l V .>1

Tiempo (&)

Donde : Ve = Volumen de elución de la partícula.

Vv = Volumen vado de la columua.

Vm = Volumen máximo de elución.

Comparando la Kd de la proteína desoonocida con la de una serie de patrones, es posible estimar la masa molecuiar de la proteína desconocida (gráñca 1 ).

ELECTROFORESIS.

A fin de puriñcar una proteha es esencial disponer de un método para detectar y

cuantificar dicha proteína en presencia de muchas proteínas más. Las proteínas pueden caracterizarse por electroforesis. Además de la cromatograña existe otro conjunto importante de métodos para la separación de proteínas basado en el desplazamiento de las proteínas cargadas en un campo eléctrico, proceso denominado eiectroferesis.

La electroforesis es muy útil como método anilítico.

Su

ventaja es que al tiempo que

se separan también se pueden visualuar, permitiendo al mvestigador hacer una estimación rápida sobre el número de proteínas en una mezcla o al grado de pureza de una preparación proteica determinada. La electroforesis también permite la determinación de propiedades c r u d e s de una proteína tales como su punto isoeléctxico y la masa molecuiar aproximada.

En la electroforesk, la íÜerza que mueve la m a c r d é c u l a es el potencial eléctrico E.

En el caso de proteínas se lleva a cabo normalmente en peles formados por el polímero entrecruzado poliacdamida. Un método electroforético comúnmente utilizado para la

estimación de la pureza y la masa molecular utiliza el detergente dodecil sulfato sódico

(SDS).

O

O- (CH +I C B

Dodecil Sulfato Sódico.

El SDS se une a la mayoría de proteínas en una cantidad aproximadamente proporcional a la masa molecular de la proteína alrededor de una molécula por cada dos residuos de amiuoácidos [l]. La electroforeais en presencia de

SDS

separa, las proteínas casi exciusivamente en función de la masa (masa molecular relativa) de foxma que los péptidos peqUeaos se despiazan más rápidamente. Después de la electroforesis las proteínas se

wnialuan añadiendo un colorante tal como el 4 ComaSge que se ñja a las proteínas pero no ai gel, la mtensidad de la coloración retenida es proporcional a la cantidad de proteína. Este tipo de gel proporciona un método para seguir el progreso en el aislamiento de la

proteha ya que el número de bandas proteicas ha de

dismmuir

a medida que transcurre la

. .

punscación.

a

_I

3

O

U -1 a

o 5.0-

5:

a

a

a ul

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O

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(L

(3

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a

4.6,

4.L

L.2

4.C

1

üráficai.

Gráfica del logaritmo d e la masa molecular contra

e l coeficiente d e distribución ( K d ) para

proteínas, obtenida por cromatografía d e

c

....

c

polo negativo. Otro método para veriñcar la pureza de la caricaína, es realizarle una

recromatograña en el

HPLC.

Con la electroforesis también podemos determinar la masa molecular de la caricaína, comparando las posiciones a las que se desplazan en el gel proteínas de masa molecular conocida con la posición de la caricaína (proteína de-ocida) (gráfica 2).

ENFOQUE ISOELÉCTRICO

o

ELECTROENFOQUE.

El &que isoeléctrico es un procedimiento utilizado para determinar el punto isoeléctxico

@I)

de una proteins. Se establece un g r a d h e de pH al dejar que una mezcla de ácidos y bases orghicos de baja masa molecular (anfolitos) se distribuya espontáneamente en un campo eléctrico generado a través del gel. Cuando se aplica una mezcla de proteínas, cada proteína se desplaza hasta que alcanza el pH que iguala su PI.

De

este modo las

proteínas con distintos puntos isoelécüicos se distn’buyai de manera diferente a través del

gel. La carga neta de una proteína es cero cuando el pH es igual a l punto isoeléctnco, de modo que ya no emigrará en un campo eléctxico (gráñca 3).

DICROÍSMO CIRCULAR.

En la fig.3 se proporciona la variación del índice de r&acción (curva de dtspersión)

y del coeficiente de absorción (curva de absorción) de un m a t e d ópticamente activo

medidos con luz polarizada en fonna circular izquierdo y derecha. La diferencia del índice de refracción para los dos componeates recibe el nombre de birrcfrhgencia circular y a

la

diferencia de absorción se le

da

el nombre de dicroísmo circular. Las curvas diferenciaies se

muestran en la parte inferior de la fig.3.

La curva de dispersión rotatoria y el espectro de dicroho circular se emplean en la determinación de la estnictura, configuración y conformación de moléculas ópticamente activas, tales como las de los esteroides. Otra región de mucho mterés es la de las proteinas y

de los polipéptidos sintéticos. Aquí puede obtenerse mformación acerca de los cambios conformacionales poco precisos en las moléculas.

Las bandas del dicroísmo circular de proteínas ocurren en dos regiones del e s p m o . El W lejano o la región entre 170

-

250 nm,

la cual

es dominada por contn’buciones de los enlaces peptídicog mientras que las bandas del d i c r o h o circular en la región del W cercano ( 250

-

300 nm ) son originadas por los aminoácidos aromáticos.

para monitorear transiciones estnicturales de proteinas. Las diferencias en Dicroho circular entre proteinas nativas y no

plegadas son usualmente muy grandes en ambas regiones del espectro.

Como un ejemplo el espectro de dicroísmo circular de la RNasa A en la región de péptidos y en la región de los aromáticos es mostrada en

la

fig.4 para la proteína nativa (

-

)

y la no plegada (----).

Gráfica

2.

~ -.

I

2 3 4 5

0 him)

Gráfica del logaritmo de la masa molecular

el desplazamiento d e , l a s proteínas,

por electroforecis.

Contra

Absorbancii

\

I

I I I I

2 4 6 8

O

Distancia (cm)

I

1

1

Gel

T

--w

2 " f

7 2 3 4 5 6 7

I 1

250 175

m

3:

X

inml

1

1 m Ix) m %O

.

M

A Iml

Y

OBJETlVOS.

1.

-

Disponer de un método adecuado para detectar y cuantihar una proteína en presencia de muchas proteínas más.

2.

-

purificar las proteínas para poder realizpr estudios posteriores de caracterización:

determiuación de masas m o l d e s , dicroísmo

circular,

estudios de desnaturalización térmica por dicrokmo

circular

y calorimetnp.

3.

-

Reaüzar eshidios de cinética de desnatudkoión por diuoísmo c i r d u , para mvestigar los valores de la entaipía y la entropía de activación y establecer una comparación con los

valores para otras proteínas.

L

L

r-

L

.-

DESARROLLO

EXP-NTAL.

Se utilizó quimopapaíw (sigma chemical) y un cromatógrafo de líquidos de alta

presión (HPLC)

V

h

9012/9050. Las muestras de quimopapaína y caricaína se aislaron

por mmatografia de mtercambio iónico, de la siguiente manera:

Se prepararon dos soluciones reguladoras (solución A y solución B). Tanto la solución A como la solución B fueron solnciones reguladoras de fosfetos 0.05 M, pH 7, NaN3 0.02 %. A la solución B a d d s se le adicionó NaCl 1M.

Para la preparación de la muestra se utiW quimopapaína. La concentración utiliuda fue de 10 mg/ml, esta concentración se estableció haciendo prwiamente pruebas a

concentraciones diferentes.

Con el fin de impedir la autólisis de la proteína durante la puriñcación y los experimentos se procedió a bloquear

su

sitio activo de la siguiente manera: la quimopapaína

se diaolvió en la solución A, se le adicionó mercaptoetanol O.lM, después de 1 h se le adicionó iodoacetamida O. lM, dejándola reaccionar durante 30 min, por Último se íiltró la muestra. Es importante hacer notar que la muesira se mantuvo todo el tiempo en hielo para evitar la hidrólisis de la proteína.

Para obtener una buena resolución se partió de las condiciones de elución reportadas con anterioridad [2], una vez probadas y establecidas las nuevas condiciones se procedió a

purificar la muestra inicial a un ñujo de 0.5 d m i n .

Una

vez aisladas las proteínas (quimopapaíua y caricaína), se procedió a investigar su

grado de pureza, para lo cual se realizaron rccromatografias. Por otro, lado se utilizó la electroforesis también para mvestigar el grado de pureza de las proteínas

La electroforesis se llevó a cabo en un aparato pharmacia

-

phastsystem LKB, en un gel homogéneo 12.5 de poliarrilarnida. La concentraoión de las muestras analizadas fue de 1

mg/mi y se colocaron 8 p1 de las muestras en cada una de las ranuras de la placa, se aplicó un voltaje de 12 V/cm al gel, durante apro>nmrdament e 1 h a 15 "C. El tratamiento posterior para el gel CongStiÓ en aplicarle una solución de teaido que es una mezcla de O. 1 % de phast gel blue R, 30 % de metanol y 10 % de ácido acético, posteriormente se le hace pasar una solución de desteñido que es una mewla de 30 % de metanol y 10 % de ácido acético, por

r"

4

Último se le hace pasar una solución preswadora la

cual

es una mezcla de giicerol 10% y 10 % de ácido acético en agua.

Para eliminar la sal de las proteínas

aiskdas

se utüiza una columna PD

-

10, la cual Contiene Sephadex G

-

25 M para obteaer una rápida

desalinización,

las b s i o n e s de

di& columua son: volumen de la capa 9.1 mi, altura de la capa 5 cm. El método consiste en

eliminar primero el exceso de líquido conteaido en la c o h , para lo

cual

se le agrega 2.5

ml de regulador, postdomente se le agregan 2.5 ml de la muestra y por Último 2.5

ml

de regulador para h a m salir la muestra de la columna ya 8m NaCL

Lo Último que se realizó h e la lioñlización de las proteínas pudicadas. El procedimiento cons&a esencialmente de dos fases: congelación y desecación. 1) la muestra se

congela con nhógeno líquido, en el mismo recipiente donde teadrá lugar la desecación.2) el material congelado se somete a alto vacío por d o de una bomba de vacío de alta

potencia, mientras el condensador se mantiene durante la operación a temperaturas muy bajas& estas condiciones el líquido pasa daectamente de la fase sólida a la fase de vapor, y

este último se condensa inmediatamente en el condensador, obtdéndose de nuestras muestras un sólido poroso.

Para se@ la &ética de desnaturalización de la caricaína se utilizó un espectropolnitmetro JASCO 5-500 A con celda de 1

mm

de trayectoria Óptica, con chaqueta de circuiación de agua conectada a un baño de agua HAAKE NK-22. La temperatura se

registró directamente en la celda Óptica con un termómetro d@al COLEPARMER

Se efectuaron estudios &&os a difereates temperaturas y valores de pH. Se colocaron en la celda óptica 2

ml

de un reguhdor de glicina O.05M a distintos valores de pH, entre 2.0 y 3.9, y se p d ó que a l c m una temperatura estable. Después se myectaron 0.2

ml

de una solución de quimopapaína, cuya concentración fue de 0.13 a

0.15

Wml,

en el mismo regulador y se o b m ó la variación de la seaal de d i c r o h o

circular a 220 nm. Este proceso se utilizó para temperatinris entre 32 y 80 grados centígrados.

8402-20.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

La quitnopapaha parcialmente puriñcada esta compuesta por quimopapha y caricaíaa, de las d e s el punto isoeléctrico es 10.1

-

10.6 y 11 respectivammte [l]. La

proteína a separar tiene carga positiva neta , por lo tanto se empleó una columna para intercambio catiónico. El pH de la

fase

móvil debe ser menor que 10.1 y 11. Se podrían tomar valores de 2 a 9

,

pero es convmieate que el valor del pH este alejado del PI, y por otra parte no es conveniente que el valor del pH sea muy bajo, ya que la proteína puede retenerse demasiado en la coiunma o desnatmihrse antes de empezar el experimento. Tomando en cuenta lo anterior se eligió un pH de 7.

Se iailizó

como

fase móvil un sistema binario: un reguiador de fosaitos de pH 7, que

*... c I c L r- L e L c L f- L F- L

"

L c L F L r-

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P

L".

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L

Como ya se mencionó las proteínas se unen a los mtercambiadores de iones a través de la formación de uniones e l t c t r o d i t b ~ entre cargas de signo opuesto entre las

macromoléculas adsorbidas y el iutercambiador de iones. Estas uniones electrostáticas

se están disociando oonstantemeate y reformado a medida que los iones de sal

compiten por los sitios de unión. Cuaudo las saistancias que se van a separar se mueven lentamente en comparación a l líquido ehyente se obiienen los picos mejor resuekos.

. .

Las umdiciones cromatogrbas experimentales más adecuadas para la mejor

separación heron regulador de fosfhtos 0.05

M

pH 7, aij0 de 0.5 ml / min, longitud de onda

de 280 nm, concentración de la rrmestra 10 @mi y el programa, ñnal fue el siguiente:

PROGRAMA

t(min) % A %B

O 100 O

3 100 O

25 60 40

40 20 80

45 20 80

50 100 O

60 100 O

Con este programa se aprovechó el tiempo para realizar el mayor número de myecciones posibles.

Utiazmdo las umdiciones antexiores, se logró obtener el cromatograma que se

muestra en la ñgura 5. Como se puede observar se colectaron 4 picos, los dos pximeros son

quimopapaínas y los dos úitimos son caricaína [2b pero como se observa en el cromatograma

el pico mucad0 como I esta krmado por otros dos picos, por lo tanto se procedió a realizar una recxomatograña para colectarlos por separado, el cromatograma obtenido se muestra en la ñgura 6.

En la electroforesis en gel de polkdamida los componentes aislados de

quiihopapaína mostraron ser homogéneos [4].

En

la ñgura 7 se muestra una placa de electrokresis realizada en gel de polianilamida de las caricainas cisteínicas del íátex de

En los resubdos de electroenfoque las dos k m s de la caricaína enfocaron exactamente en la h j a del cátodo, mdicando que sus puntos isoeléctncos frieron mayores o iguaies que 11.0 [4].

papaya a PH 7.

d1

I

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I I I I I I I I i í I I I I I I I 1ii.l I I I I I I I t i l I I I I I I I i í I I I I I I I I tí11 I I I I l l I I I I I I l l ,

10 20 30 40 50 i

!

Fig.5. ~

TIEMPO

(e).

,

#

O

00

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I

O

m _I

H

-r-

W

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1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

10 20 30

Fig.6.

_TIEMPO

(min).

I I ~ ~ I I ~ ~ ~ I I I ~ I I I I ~

40

. .

1

2

3

4

5

6

Fig.7.

látex dc papaya a pH 7.0. Ranuras 1 y 2, papaína proteinasa i2

ranuras 5 y 6, quiinopapaína

Ekctroforesis en gel de poliacrilamida de las proteinasas cisteínicas del ranura 3 ,

Donde : FH = Fracción nativa.

y = Señal de dicroísmo al tiempo t.

y" = Ssñiil de d i c r o h o del estado nativo. yo =

Se&d

de dicroímno del estado ñnal

Las constantes de velocidad de las reacciones se caladaron construyendo gráñcas de in (y

-

y.) wntra el tiempo, a diferentes temperaturas. En la figura 8 se muestra el gráñco

o b t d o a un pH de 2.5 y una temperatura de 51.8 "C y en la Tabla 1 se reportan las constantes de velocidad al miSrno pH (2.5) a diferentes temperaturas. Con las wnstantes de velocidad de reacción de las temperaturas eehidindas se construyeron gráficas de Eying, para cada valor de pH, con las d e s se calcularon la entalpía y la entropía de activación de la desoiturdhción, según la ec. 1, (@.9), los resultados se dan en la Tabla 2.

hi

( K / T) in (KB / h)

-

AG* I

RT

=

h

-

AH*/

RT

+

AS*/R

...

1).

Donde : T = Temperatura.

AG* = Cambio de energía iibre. A H* = Entalpie de activacián.

A S

*

= Entropía de activación.

K. = Cte.deBoltannnn.

h = Cte. dePlanck.

2 -

I-

0 -

*

9 - I -

-2

-

\

1

T n n p n b n 5t.ñ C , Pn 2.5

1

=-I

=\

1 1

o 10 20 y> u)

t ( m i n )

Figura 8. Cmética de desnaturalización de la caricha.

-10-

fi

-1 1-

1 I

0.003M O . w e o 4 0.oOJoB 0.- 0.00310 0.00312 0.00314 0.00316 1

/ T e )

I _ _ _ .

w

."

TABLA 1

Constantes de velocidad a diversas temperaíuras a un pH de 2.5.

329.35 324.95 323.35 320.35 317.25 O. 18286 0.12846 0.08495 0.01586 0.00543

TABLA

2.

Entalpías y entropías de activación de la desnaturalización teamica de la caricha, a diversos

valores de pH.

PH 2.009 2.208 2.534 2.907 3.221 3.510 3.894 AH* (KCdmol) 22.635 44.495 60.495 82.440 84.667 89.543 92.409

AS* (CdK mol)

En los estudios reatuados anteriormente se ha observado que, para diversos

mtervalos de pii, la entalpía de activación de la desnaturalización permanece

aproximadamente -ante, el desplegamiento de todas las proteínas mducidas es reversible

Analizando los resultados de la Tabla 2 se observa claramente que tanto la entalpía como la entropía de activación de la desnaturciluación, de la caricaína dismi~uyen con el pH

Las gráñcas de E m g a cada pH son lineales, lo que mdica que el cambio de la capacidad calorifica durante el desplegamiento entre el @ado nativo y el de transición es despreciable. [MI.

PERSPECTIVAS.

Falta por estudiar la d e m t u r h c i ó n térmica de la caricaha,-por medio de la técnica de dicroísmo

circular,

a dif'erentes velocidades de calentamiento, con el objeto de profundizar

en el conocimiento de irreversibi?itiad que caracteriza su desuituralización.

El CUTSO que debe tomar la iuvestigrción sobre la Cancha, es hacia el conocimiento de su estabiüdad ténnica,con presencia de agentes desestabiluantes (GUWCI, Urea), su naturalezD iónica.

Reelizar

estudios más detallados de la protonación de residuos, para explicar porque los parámetros tennodinámicos disminuyen con el valor del pH.

1.

-

Daniel C.

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