Propagación in vitro de la cactácea Echinocactus platyacanthus Resumen
Echinocactus platyacanthus es una cactácea mexicana que se distribuye únicamente en los estados de Chihuahua, Coahuila, Hidalgo, Guanajuato, Nuevo León, San Luis Potosí, Tamaulipas y Zacatecas. Esta especie es de crecimiento lento y cuenta con pocos individuos jóvenes en la población natural; su uso no permitido en dulces tradicionales y forraje de ganado hacen de ella una especie vulnerable por tanto está enlistada en la NOM-059-SEMARNAT-2010 como "sujeta a protección especial", en la Lista Roja de la IUCN y apéndice II de CITES.
Su importancia biológica, ecológica y económica hacen que la urgencia de conservarla sea propagada por cualquier método, sin embargo las formas tradicionales de propagación ya no son efectivas para abastecer la demanda del mercado comercial. Debido a su lenta reproducción, al saqueo ilegal de sus poblaciones y a la poca tolerancia a cambios abruptos en su hábitat, es necesario implementar nuevas tecnologías que permitan disminuir las presiones que existen en las poblaciones naturales. Se propone el Cultivo de Tejidos Vegetales como una opción viable para su conservación ya que permite propagar numerosas especies a gran escala (Mammillaria, Turbinicarpus, Pelecyphora, Strombocactus entre otros), a partir de estructuras somáticas a mediano plazo.
Este trabajo se centra en la propagación in vitro de E. platyacanthus a partir de 25 semillas que se germinaron en medio Murashige & Skoog (MS) 50/100 y 100% (al 50% de sus componentes inorgánicos y 100% de orgánicos; al 100% de todos sus componentes), y 25 semillas en condiciones de invernadero, de las cuales, germinaron 14 al cabo de 22 días, y 11 en 4 semanas respectivamente. Posteriormente se seleccionaron cuatro plántulas germinadas in vitro y se les hizo un corte transversal para sembrarlas en medio MS (50/100 y 100%) suplementado con ANA/BAP (0/0; 0/1; 1/0 y 1/1 mg/L). La respuesta de los explantes en dichos medios adicionados con hormonas se evaluó semanalmente. Se observó desarrollo de callo de tipo friable y en algunos casos continuó el desarrollo de raíces y espinas del explante original. Debido a un estrés lumínico, los ejemplares sufrieron una severa oxidación que no permitió continuar con el proyecto por la falta de material vegetal.
Introducción
La Biotecnología es la ciencia que se refiere a toda aplicación tecnológica que utiliza sistemas biológicos y organismos vivos para la creación o modificación de productos o procesos para usos específicos (Convenio sobre la Diversidad Biológica, Naciones Unidas, 1999). Esta ofrece herramientas para un desarrollo sostenible de la agricultura y contribuye a satisfacer las necesidades de una población en crecimiento. Uno de los procedimientos más importantes en la Biotecnología es el Cultivo de Tejidos Vegetales (CTV) que se refiere al conjunto de metodologías usadas para obtener plantas completas a partir de pequeñas fracciones de tejido (explantes) en medios nutritivos bajo situaciones controladas de luz, temperatura, pH y humedad. Se utiliza para obtener copias idénticas de plantas en poco tiempo (Olivera, 2013).
Existen tres vías de multiplicación in vitro:
1. Organogénesis: formación de órganos adventicios, como tallos, hojas y raíces. Puede tener una fase intermedia de desarrollo de callo.
2. Embriogénesis somática: formación de embriones que no provienen de la fusión de gametos masculino y femenino, sino que se desarrollan de una célula de cualquier parte de la planta. Puede tener una fase intermedia de desarrollo de callo.
3. Multiplicación a partir de yemas preformadas: éstas se pueden encontrar en la base de las hojas. Las yemas se desarrollarán en tallo luego de ser puestas en contacto con los medios de cultivo (González et al., 2012)
Los reguladores de crecimiento vegetal (RCV), también llamadas hormonas vegetales, son sustancias producidas por células en sitios estratégicos de la planta y que actúan sobre otras células como mensajeros químicos. Son capaces de regular de manera predominante los fenómenos fisiológicos de la planta. Son un factor interno que incide en el desarrollo de una planta, dentro de los procesos que regulan, se encuentran los de correlación, es decir, que recibido el estímulo en un órgano, lo amplifica, traduce y genera una respuesta en otra parte de la planta. Los más utilizados en el CTV son las auxinas y citocininas (Ácido α-naftalenacético (ANA) y 6-N-Bencilaminopurina (BAP)). Se puede señalar que una mayor concentración exógena de citocinina que de auxina favorecerá el desarrollo de hojas y tallos; un balance a favor de las auxinas promoverá el desarrollo de raíces y callo. Concentraciones
relativamente altas de auxinas en presencia o no de citocininas promoverían el desarrollo de embriones somáticos (González et al., 2012)
Es importante mencionar que el CTV ha resultado exitoso en varios miembros de la familia Cactaceae (Mammillaria, Turbinicarpus, Pelecyphora, Strombocactus entre otros), en donde los brotes en la propagación in vitro crecen más rápido y en mayor cantidad en comparación con el cultivo tradicional (Machado y Prioli, 1996).
El estudio de las cactáceas actualmente ha cobrado un enorme interés, hecho que se sustenta en los diversos valores de uso que se les adjudica: ornamental, medicinal y alimentario principalmente (Díaz et al., 2008).
Una cactácea mexicana que merece especial atención es Echinocactus platyacanthus; endémica de México que se distribuye en la mitad sur del desierto de Chihuahua, en Coahuila, Guanajuato, Hidalgo, Nuevo León, Querétaro, San Luis Potosí, Tamaulipas, Zacatecas, Puebla y Oaxaca. Junto con Ferocactus histrix, es el cactus barril más abundante y extendido en México.
Marco teórico
Los cactos (o cactus) son nativos de América –con excepción de la Rhipsalis baccifera, que se extiende a lo largo de África tropical- y se distribuyen desde el sur de Canadá hasta Argentina, siendo México el país que posee la mayor diversidad de especies dentro de este grupo, además de un alto índice (78%) de endemismo (Hernández y Godínez, 1994). A su vez, la familia Cactaceae se divide en cuatro subfamilias: Pereskioideae, Opuntioideae, Maihuenioideae y Cactoideae (Anderson, 2001).
Existen alrededor de 1400 especies, de las cuales 669 son mexicanas y 518 de ellas son endémicas (Guzmán et al, 2003.)
Morfología
La estructura distintiva en la familia de las cactáceas es la aréola, que está especializada en producir espinas, vástagos, y en ocasiones flores. La aréola se encuentra sobre podarios y costillas, generalmente mantienen dos zonas de crecimiento: en la parte superior, se hallan los meristemos floríferos, y en la inferior, los que producen las espinas. En algunas ocasiones, las aréolas desarrollan tricomas (pelos) que se asemejan a las fibras del algodón.
El tallo conforma casi en su totalidad el cuerpo de la planta, está engrosado por el desarrollo del parénquima, generalmente es de color verde. El tallo puede adquirir tres formas distintas: cladodio (tallo aplanado en forma de raqueta), tallo columnar (forma cilíndrica con o sin ramificaciones) y tallo globoso (casi esférico, con forma de barril). El tallo es una estructura hinchada y carnosa, adaptada para la acumulación de agua, está diseñado de tal forma que conduce el agua directamente a las raíces. Las flores de los cactus comúnmente tienden a ser grandes, vistosas, además de presentarse aisladas.
➢ Echinocactus platyacanthus
E. platyacanthus es una cactácea toneliforme, verde amarillenta y muy maciza. Los ejemplares adultos miden aproximadamente de 0.5 a 2 m de altura y de 0.4 a 0.8 m de ancho. Esta especie requiere ser conservada, ya que se reproduce lentamente y no tolera la alteración de su hábitat, sin una mayor protección podría verse amenazada. Parte de su distribución se encuentra dentro del Área Natural Protegida del Real de Guadalcázar y la Reserva de la Biosfera Tehuacán-Cuicatlán (Jiménez, 2012). Es afectada severamente debido a la destrucción de su hábitat natural por el cambio de uso de suelo (agricultura y ganadería), asentamientos humanos, y por la extracción ilegal para su comercialización (Álvarez, 1997; Huerta y Escobar 1998; Casas et al. 1999). Precisamente por esto se encuentra sujeta a protección especial en la NOM-059-SEMARNAT-2010 (SEMARNAT, 2010), en la lista roja de la IUCN y en el apéndice II de CITES. La regulación de su uso en dulces y forrajes es necesaria para proteger a ésta especie de una baja más rápida. Estudios sobre la demografía de esta especie sugieren que su conservación sólo puede lograrse si se interrumpe la remoción y destrucción de individuos adultos, dado que su valor se aproxima apenas a uno (Jiménez, 2012).
➢ Mammillaria schiedeana
Es una especie endémica de México, particularmente de los estados de Guanajuato, Hidalgo, Querétaro, San Luis Potosí y Tamaulipas. Crece en elevaciones de 1.300 a 1.600 m sobre el nivel del mar, en piedra caliza y laderas rocosas. Hasta ahora se conocen otras dos subespecies, Mammillaria schiedeana subs. dumetorum y Mammillaria schiedeana subs. giselae. También conocida como Biznaga de Metztitlán. Es una planta pequeña, con tallos cespitosos de 2.5 a 10 cm de alto y 2 a 4 cm de diámetro. Por su forma y su color dorado en
las espinas es una planta muy apreciada por los coleccionistas. Es recolectada ilegalmente para después ser vendida como ornamento. Está catalogada como amenazada de extinción en la NOM-059-SEMARNAT-2010, vulnerable en la lista de la IUCN y CITES (apéndice II), debido a su restringido rango de distribución, escasa
producción de semillas y baja tasa de germinación.
La pérdida de estas especies tendrían
consecuencias negativas a nivel ecológico, económico y cultural, por ende es urgente contar con un sistema eficiente en aras de su propagación como el Cultivo de Tejidos Vegetales, que permite multiplicar cantidades
masivas de plantas en poco tiempo y a gran escala a partir de tejidos somáticos (Morgan, 2008).
El presente trabajo describe la propagación in vitro de Echinocactus platyacanthus y Mammillaria schiedeana, con el propósito de generar un protocolo que permita obtener plantas completas, como una alternativa para evitar su extinción.
Objetivo general
● Desarrollar un protocolo que permita la propagación in vitro de Echinocactus platyacanthus.
Objetivos particulares
● Lograr el establecimiento aséptico de la especie E. platyacanthus.
● Evaluar la germinación de E. platyacanthus, en medios de cultivo MS al 100 % y 50/100 .
● Conocer las respuestas de los tejidos al estímulo de los reguladores del crecimiento vegetal ANA y BAP en diferentes concentraciones en plántulas germinadas in vitro de E. platyacanthus.
Problema
La especie E. platyacanthus es muy común, pero es de crecimiento lento lo que la hace vulnerable a su eliminación. El tiempo de generación puede ser de 100 años o más; su
crecimiento en el campo es tan lento que las plántulas de dos años llegan a tener sólo 2.5 cm de altura. Tiene una densidad promedio estimada de 15 individuos/hectárea (Hernández et al., 2013)
Se encuentra en riesgo por factores que inciden negativamente en su supervivencia como el uso de sus frutos en dulces tradicionales (acitrón). También se utiliza como forraje vivo para cabras y burros que se alimentan de las estructuras reproductivas (flores y frutas) así como también de los tallos sin espinas (Jiménez, 2012). Debido a su lento crecimiento, baja tasa de germinación y la amenaza bajo la que se encuentra es un candidato potencial para ser propagado por Cultivo de Tejidos Vegetales.
Hipótesis
La propagación de la especie Echinocactus platyacanthus mediante el Cultivo de Tejidos Vegetales y Reguladores de Crecimiento Vegetal será más rápida que por propagación en condiciones naturales .
Metodología
El proceso se llevó a cabo en Laboratorio LACE de Biología y el Invernadero del plantel. Material biológico:
Se empleó un lote de 50 semillas de Echinocactus platyacanthus y 50 de Mammillaria schiedeana donadas por el Jardín Botánico de la UNAM.
Material para medio de cultivo: ● Agua destilada
● Vaso de precipitados de 1L ● Probeta de 100 ml y 1L
● Stocks de macro y micronutrientes, sacarosa y agar ● Parrilla de agitación
● Tiras de pH, hidróxido de sodio 1M y ácido clorhídrico 1M ● 30 frascos de vidrio con tapa de capacidad de 115 ml con
tapa
Material para desinfección: ● Agua destilada
● 4 vasos de precipitados de 500 ml ● Solución jabonosa (detergente líquido)
● Alcohol al 70%
● Solución de hipoclorito de sodio al 30% v/v Material para siembra:
● 4 Pinzas ● 4 Bisturíes ● 8 Cajas petri
● Campana de flujo laminar
● Frasco con alcohol 96% para instrumental ● Rollo plástico de Egapack
Prueba de viabilidad
● 1gr de cloruro de Tetrazolio en ● Agua destilada
Procedimiento:
Elaboración de medio de cultivo: En una parrilla de agitación se preparó medio de cultivo MS agregando los stocks (Tabla 1) al agua destilada en una concentración 50/100 (al 50% de sus componentes inorgánicos y 100% de orgánicos) y 100% (al 100% de todos sus componentes) para la germinación de las semillas y medio MS 50/100 suplementado con ANA/BAP (0/0; 0/1; 1/0 y 1/1 mg/L) para las plántulas regeneradas in vitro. Se agregó la sacarosa, se ajustó el pH a 5.7 con ayuda de hidróxido de sodio 1M o ácido clorhídrico 1M y finalmente se agregó el agar. Posteriormente se vació 25 ml en cada frasco y se esterilizó en autoclave junto con pinzas de disección, bisturíes y cajas petri. Estos se mantuvieron cerrados hasta la siembra.
Desinfección de semillas.
Las semillas se lavaron con agua destilada y detergente líquido en agitación constante en una parrilla de agitación magnética durante 15 minutos. Después se sumergieron en alcohol etílico al 70%, durante 1 minuto en agitación constante; enseguida se sumergieron en una solución al 30% v/v de hipoclorito de sodio. Bajo condiciones asépticas, en una campana de
flujo laminar, para eliminar los restos de hipoclorito de sodio se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril. Las semillas se colocaron en una caja Petri y con la ayuda de pinzas de disección se sembraron 12 semillas de E. platyacanthus en medio de cultivo MS 50/100 y 13 semillas en MS 100% (Figura 1). Se realizó lo mismo con las semillas de Mammillaria schiedeana.
Siembra in vitro y en invernadero
Dentro de la campana de flujo laminar, previamente desinfectada con alcohol al 96° se destapó cada frasco y se colocó la tapa hacia arriba cerca del mechero. Con ayuda de pinzas de disección, se colocaron entre cinco y cuatro semillas por frasco. Se tomó la tapa y se pasó rápidamente por la flama y se tapó el frasco con las semillas. Los bordes de la tapa se sellaron usando un rollo de plástico (Egapack). Los frascos se mantuvieron en un sitio donde recibieron luz suficiente de dieciséis horas y ocho horas de oscuridad; y una temperatura aproximada de 25°C.
Para ambas especies se realizó un grupo control in vitro y en sustrato. En las instalaciones del invernadero se sembraron 25 semillas en una charola de germinación con sustrato (esterilizado) para cactáceas (Tepojal, composta y tierra negra (3:1:1)). Se regaron una vez por semana y se monitorearon hasta su germinación.
Prueba de viabilidad
Se disolvió 1gr de cloruro de Tetrazolio en 100ml de agua destilada, se rompió la testa para exponer al embrión a la solución y se humedecieron con Tetrazolio en una caja petri, ésta se mantiene 24 horas en la oscuridad para evitar que la luz interfiera con las reacciones de oxidación del embrión. Pasado este tiempo se observó en cada parte seccionada de la semilla su coloración.
Multiplicación de brotes
Después de 60 días a partir de la germinación de E. platyacanthus, de la concentración 50/100 se eligieron cuatro plántulas de 5mm o más de altura que habían desarrollado raíz. Se les realizó un corte transversal, obteniendo ocho explantes y se sembraron dos en cada frasco, teniendo los siguientes tratamientos para activar las aréolas:
● Tratamiento 1: MS 50/100 adicionado con hormona BAP (1 mg/ L).
● Tratamiento 2: MS 50 /100 adicionado con hormona ANA (1 mg/L) y BAP (1 mg/ L). ● Tratamiento 3: MS 50/100 adicionado con hormona ANA (1mg/L)
● Tratamiento 4: MS 50/100 (testigo).
*En el caso de contaminación por hongos y/o bacterias se realizó un cambio de medio de cultivo en un nuevo frasco con las mismas concentraciones de RCV, realizando una desinfección previa.
Resultados y Análisis
➢ Germinación y prueba de viabilidad de Mammillaria schiedeana
Después de que algunos medios de cultivo MS 50/100 y 100% presentaran contaminación por bacterias y de no observar germinación durante 5 semanas, se llevó a cabo una prueba de viabilidad de semillas con Tetrazolio (una semilla es viable cuando su embrión está vivo), mediante esta técnica se comprobó si las semillas estaban vivas o muertas. Se usan como indicador de viabilidad las sales de Tetrazolio, estas sales son incoloras pero cuando se reducen adquieren un color rojo intenso. Si la semilla es viable su embrión se teñirá de rojo con la solución de Tetrazolio; por el contrario, si la semilla no es viable, es decir, está muerta: su embrión no se colorará de rojo. El resultado se expresa en porcentaje de semillas viables del lote, en este caso el porcentaje de viabilidad de Mammillaria schiedeana fue 28%, es decir, no viables (Imagen 1 y 2).
Imagen 1 y 2. Semillas de Mammillaria schiedeana en microscopio Zeiss en aumentos A-.8 y
B-3.2 después de realizar la prueba con Tetrazolio.
➢ Germinación de Echinocactus platyacanthus
Se decidió trabajar con Echinocactus platyacanthus, debido a la disposición de semillas y a su categoría de riesgo. Las semillas de E. platyacanthus se sembraron en los medios de cultivo MS 50/100 y 100% y en tierra (testigo) el día 24 de Octubre del año 2016. En el medio de cultivo MS 50/100, el 38% de las semillas germinaron mientras
que en el medio de cultivo MS 100 sólo el 36% de las semillas lo hicieron (Gráfica 1), por lo que funcionó mejor el medio de cultivo MS 50/100 (Imagen 3).En total germinaron 11 semillas del grupo control en tierra en cuatro semanas, sin embargo sufrieron constante contaminación, por lo que a pesar de ser desinfectadas no sobrevivieron.Los explantes del tratamiento 2 (Figura 5-B) fueron los que mayor crecimiento tuvieron, en estos se obtuvo notablemente la presencia de callo friable, desarrollo de raíces del explante original y un crecimiento acelerado en comparación a los tratamientos 3 y 1 (Figura 5-C y A), en los cuales el crecimiento se vio lento y la aparición de callo no fue abundante. El callo friable tiene la característica de que las células tienen el espacio necesario para dividirse, a diferencia de un callo compacto las células están demasiado cerca, evitando una división celular adecuada. Sin embargo, en el tratamiento 4 (Figura 5-D), se observaron mejores resultados que en el tratamiento 3 y 1. Se cree que este resultado sucedió a la concentración endógena de hormonas en el explante, probablemente una alta concentración de ANA y BAP que por separado como en los tratamientos 3 y 1. En condiciones in vitro explantes de E. platyacanthus crecieron en 7 semanas bajo los tratamientos con ANA (1 mg/L) y BAP (1 mg/L), y en 4 semanas más alcanzaron una talla aproximada de 5 mm aproximadamente. En contraste en su ambiente natural, le toma 1 año en crecer 1 cm.
Se observaron resultados favorables cuando las hormonas se encuentran en combinación (tratamiento 2) o cuando no se aplican (Tratamiento 4), debido a que los efectos de las hormonas endógenas que posee la planta naturalmente se vieron potenciados por estos tratamientos (Tabla 2).
Debido a un estrés lumínico, consecuencia de no tener las instalaciones adecuadas de una cámara de incubación donde la luz y temperatura son controladas, los explantes en los diferentes tratamientos con RCV sufrieron una oxidación severa que mató al tejido (Figura 6), lo que eliminó la posibilidad de continuar registrando resultados del material vegetal en esta investigación. Sin embargo, los resultados obtenidos con los tratamientos 2 y 4, indican que el CTV es viable para la propagación de la especie Echinocactus platyacanthus, además de otras cactáceas y suculentas.
A
B A
Imagen 3. Germinación de E. platyacanthus en A-MS 50/100 y B-100%. Se observa rompimiento de testa y
desarrollo de raíz.
Figura 5. Tratamientos A-1; explante sin desarrollo aparente de callo, B-2; desarrollo de callo friable, espinas y
raíz, C-3; explante sin desarrollo aparente de callo y D-4; desarrollo de callo y espinas.
Figura 6. Explantes oxidados
por estrés lumínico. Conclusión
El cultivo de plantas in vitro es una estrategia de conservación de especies con problemas poblacionales, como un lento desarrollo y la escasez de ejemplares jóvenes que permite propagar a la especie multiplicándola rápidamente. Los resultados obtenidos en la presente investigación, sugieren que propagar Echinocactus platyacanthus mediante Cultivo de Tejidos y aplicando reguladores de crecimiento vegetal(hormonas) pues utilizar este método en lugar de propagación tradicional ofrece un mejor control sobre la contaminación, un factor
que perjudica la germinación; más un crecimiento mucho más rápido de la planta (5 mm en cuatro semanas) en comparación con el crecimiento en condiciones de campo (1 cm por año).
Estas plántulas obtenidas a corto plazo posteriormente pueden ser utilizadas en programas de inserción.
Dichos programas pueden emplearse, incidiendo benéficamente en la conservación de la especie de una manera más rápida y eficaz.
De haber podido continuar con la investigación, las plántulas hubieran sido trasplantadas al invernadero del plantel.
Se recomienda ampliamente continuar con este estudio ya que en esta investigación se sentaron las bases para protocolos de especies de la misma familia de Echinocactus platyacanthus.
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