INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA SUPERIOR DE MEDICÌNA
SECCION DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
EFECTO DEL ESTRÉS SOBRE EL TEJIDO LINFOIDE ASOCIADO A NARIZ EN EL RATÓN
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO
DE MAESTRO EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN MORFOLOGÌA
P R E S E N T A
M. C. y P. RIGOBERTO OROS PANTOJA
DIRECTORA DE TESIS
D. EN C. ROSA ADRIANA JARILLO LUNA
El presente trabajo se realizo en el laboratorio de histología e inmunología de la Escuela Superior de Medicina del Instituto Politécnico Nacional, con apoyo de la CGPI con beca institucional de escolaridad durante el periodo agosto/2005 a julio/2004 y la beca del programa institucional de formación de investigadores.
AGRADECIMIENTOS
A mi familia, especialmente a mis padres por estar siempre a mi lado
y en la realización de este trabajo
A mis amigos por su apoyo, en todo momento y a Dani por su paciencia
A mis maestros por sus enseñanzas y la confianza que me han brindado
ÌNDICE
Introducción...14
I. Sistema inmunitario...16
II. Sistema inmunitario de las mucosas...16
III. Eje Hipotálamo-Hipófisis-Adrenal...23
IV. Estrés...24
V. Hormonas del estrés...26
A) Glucocorticoides...26
B) Catecolaminas...27
VI. Modelos de estrés en animales...29
VII. Efectos del estrés sobre el sistema inmunitario...30
Planteamiento del problema...31
Justificación...31
Objetivo general...31
Objetivos específicos...32
Hipótesis...32
Material y métodos...33
Resultados...40
Discusión...68
Conclusiones...82
Problemas pendientes………...…..83
Bibliografía...84
ABREVIATURAS
Ab Anticuerpos
ACTH Hormona adrenocorticotrofica AFC Células formadoras de anticuerpos APC Células presentadoras de antígenos BALT Tejido linfoide asociado a bronquios CGR Receptor de glucocorticoides CPs-IgA Células productoras de IgA secretora CRH Hormona corticotropina
Eje HPA Eje hipotálamo-hipófisis-adrenal ELISA. Inmunoensayo enzimático
GALT Tejido linfoide asociado al tracto gastrointestinal
GC Glucocorticoides
ICAM-1 Molécula de adhesión intercelular
Ig Inmunoglobulina
LIE Linfocitos intraepiteliales
MAdCAM-1 Adesina de mucosas, molécula de adhesión celular 1 MALT Tejido linfoide asociado a las mucosas
NALT Tejido linfoide asociado a nariz PNAd Adesina de nodo periférico
sIgA IgA secretora
SNA Sistema nervioso autónomo SNC Sistema nervioso central
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Sistema inmunitario común de las mucosas
Figura 2. Localización y extracción del NALT
Figura 3. Fotomicrografia, corte de la mucosa nasal de ratón, con NALT Normal
Figura 4. Esquema de distribución de las poblaciones celulares en el NALT
Figura 5. Gráfica, Reconstrucción de la forma del NALT
Figura 6. Gráfica, efecto del estrés en el tamaño del NALT
Figura 7. Gráfica, Linfocitos CD3+ en área parafolicular
Figura 8. Gráfica, Linfocitos CD3+ en área parafolicular
Figura 9. A) Fotomicrografia B) y esquema de Distribución de linfocitos CD3+ en el NALT
Figura 10. Gráfica, Linfocitos CD4+ en área parafolicular
Figura 11. Gráfica, Linfocitos CD4+ en área folicular
Figura 12. A) Fotomicrografia B) y esquema de distribución de linfocitos CD4+ en el NALT
Figura 13. Gráfica, Linfocitos CD8+ en área parafolicular
Figura 14. A) Fotomicrografia B) y esquema de distribución de linfocitos CD8+ en el NALT
Figura 15. Gráfica, Linfocitos B (B220+) en el NALT
Figura 16. A) Fotomicrografia B) y esquema de Distribución de linfocitos B (B220) en el NALT
Figura 17. Gráfica, Linfocitos IgM+ en el NALT
Figura 18. A) Fotomicrografia B) y esquema de distribución de los linfocitos B IgM+ en el NALT
Figura 19. Gráfica, Células plasmáticas IgA+ en el NALT
Figura 20. A) Fotomicrografia B) y esquema de Distribución de células plasmáticas IgA+ en el NALT
Figura 21. Gráfica, Cantidad de macrófagos en el NALT
Figura 22. Fotomicrografia, Macrófagos MAC-3 en el NALT
Figura 23. Gráfica, Reacción a la molécula ICAM-1 en el NALT
Figura 24. Fotomicrografia, Expresión de ICAM-1 en el NALT
Figura 25. Gráfica, Cantidad de linfocitos intraepiteliales CD4+ y CD8+ en el NALT
Figura 26. Fotomicrografia, Linfocitos intraepiteliales CD4+ en el NALT
Figura 27. Gráfica, Cantidad de linfocitos B IgA+ en el NALT
Figura 28. Fotomicrografia, Células plasmáticas IgA+ en la lámina propia
Figura 29. Graficas, Cuantidad de linfocitos B y T en el NALT por citometría de flujo
Figura 30. Graficas, Cantidad de linfocitos T CD4+ y CD8+ en el NALT por citometría de flujo
Figura 31. Gráfica, Niveles de IgA secretora
RESUMEN
EFECTO DEL ESTRÉS SOBRE EL TEJIDO LINFOIDE ASOCIADO A NARIZ EN EL RATÓN
El sistema inmunitario de las mucosas (MALT) comprende tejidos asociados con la superficie de las mucosas respiratoria, digestiva y genitourinaria, los cuales defienden el organismo de antígenos externos.
El tejido linfoide asociado a nariz (NALT) representa un compartimiento inductor de la respuesta inmunitaria y se localiza en piso de la nariz de algunos roedores; mientras que la lámina propia de la mucosa nasal representa al compartimiento efector. El estrés, provoca un incremento de la secreción de hormonas glucocorticoides y catecolaminas por activación del eje hipotálamo-hipófisis-adrenal. Estas hormonas interactúan con receptores de las células inmunitarias ocasionando cambios en su respuesta. El objetivo de este trabajo fue determinar los efectos del estrés sobre la morfología del NALT, el número y distribución de sus células y la secreción de IgA. Se utilizaron ratones Balb/c machos de 9 semanas de edad, divididos en un grupo control y dos grupos problema, a los que se aplicó 3 horas de estrés por inmovilización, durante 4 y 8 días. De cada animal, se obtuvo el NALT y se realizaron tinciones con H-e para estudiar la morfología e inmunohistoquímicas para cuantificar linfocitos B (IgM+, CD45+) y T CD3+ (CD4+ y CD8+), macrófagos, células plasmáticas productoras de IgA y localizar la molécula ICAM-1. En otros grupos de animales se cuantificó la población de linfocitos B y T CD3+, CD4+ y CD8+ por citometría de flujo. La secreción de IgA en el lavado nasal se determinó por ELISA.
En el análisis morfológico, no se observaron cambios en la arquitectura del NALT, sin embargo durante el estrés de 4 días el volumen del órgano disminuyó ligeramente, mientras que a los 8 días éste se incrementó. La expresión de ICAM-1 y la cantidad de macrófagos fueron semejantes en los tres grupos de estudio. La citometría de flujo
mostró que los linfocitos B y T CD8+ disminuyeron en los animales estresados, sin embargo esta modificación no se observó en el análisis morfológico. La citometría de flujo y el análisis morfológico mostraron una disminución de los linfocitos T CD3+ y CD4+ en los animales estresados.
Los linfocitos intraepiteliales CD4+ y CD8+, disminuyeron significativamente con el estrés de 4 días, incrementando su número con el estrés de 8 días. Las células plasmáticas IgA+ mostraron un comportamiento similar, disminuyendo significativamente con el estrés de 4 días e incrementando su número a los 8 días, lo que se correlacionó con los niveles de IgA en el lavado nasal, mostrando diferencias significativas.
Se concluye que el NALT es sensible al esquema de estrés utilizado, afectando tanto a las células de la respuesta inmunitaria celular (linfocitos T) como a las de la respuesta humoral (linfocitos B y células IgA+), posiblemente por la influencia de las hormonas secretadas durante el estrés.
SUMMARY
EFFECT OF STRESS ON MOUSE NASAL-ASSOCIATED LYMPHOID TISSUE
The mucosal immune system (MALT) includes respiratory, digestive and genitourinary mucosal associated tissues, which defend the organism from external antigens. The nose associated lymphoid tissue (NALT) is located in the nose floor of some rodents and represents the inductive compartment of the immunitary response in this organ, whereas the mucosal lamina propria represents the effector compartment.
Stress, cause an increase of glucocorticoids and catecholamines hormones secretion by hipotalamo-hipofisis-adrenal axis activation. These hormones interact with immunitary cells receptors causing changes in their response. The objective (deal) of this work was to determine the stress effects on the NALT morphology, cell number and distribution and IgA secretion.
Balb/c male mice of 9 weeks of age were used, divided in a control group and two problem groups, receiving 3 hours of stress by immobilization, during 4 and 8 days respectively.
From each animal the NALT was obtained and the morphology studied on H-e stained sections. Immunohistochemical methods were used to quantify lymphocytes B (IgM+, CD45+) and T CD3+ (CD4+ and CD8+), macrophages, IgA-producing plasmatic cells and to locate ICAM-1 molecule. From other animal groups the populations of lymphocytes B and T CD3+, CD4+ and CD8+ were quantified by flow cytometry and the IgA secretion was determined by ELISA in the nasal washing.
In the morphologic analysis, not changes were observed in the architecture of the NALT, nevertheless the volume of the organ was diminished during the stress of 4 days and increased at the 8 days, both not significantly. The ICAM-1 expression and the macrophages amount were similar in the three animal groups. In the stressed animals, the flow
cytometry showed decrease of lymphocytes B and T CD8+, however in the morphologic analysis, this modification was not observed. A diminution of lymphocytes T CD3+ and CD4+ in the stressed animals was showed by flow cytometry and morphologic analysis. Also intraepithelial lymphocytes CD4+ and CD8+ diminished significantly with the stress of 4 days, increasing their number with the stress of 8 days. Studied by morphological analysis, the IgA+ plasmatics cells showed a similar behavior, which correlated with IgA levels in the nasal washing, with significant differences.
It is conclude that the NALT is sensible to the stress scheme used, affecting the cellular immune response cells (lymphocytes T) together those of the humoral response (lymphocytes B and IgA+ cells) possibly by the effect of hormones secreted during the stress.
INTRODUCCIÓN
Funcionalmente el aparato respiratorio se divide en tres segmentos: las porciones conductora, respiratoria y de ventilación. La primera a su vez se divide anatómicamente en vías aéreas superiores constituidas por: fosas nasales, cavidad oral y faringe, mientras que las vías aéreas inferiores están comprendidas por: laringe, tráquea, bronquios y bronquiolos preterminales y terminales.
Las fosas nasales de acuerdo al tipo de epitelio de la mucosa que las tapiza, se divide en tres zonas; 1) El vestíbulo, se encuentra situado en el extremo anterior de las fosas nasales, presentando un epitelio plano estratificado no queratinizado, con numerosos folículos pilosos, glándulas sebáceas y sudoríparas. 2) El área respiratoria, comprende la porción más extensa de las fosas nasales; se localiza predominantemente en la parte anterior y piso de la cavidad, con un epitelio que cambia a cilíndrico ciliado pseudoestratificado con células caliciformes (epitelio respiratorio), que a su vez, también recubre la trompa de Eustaquio, amígdalas y nasofaringe. Este tejido descansa sobre una lámina propia que se continúa con el periostio o el pericondrio del esqueleto de la nariz y está constituida por tejido conectivo laxo en el que se encuentran células fijas y libres: fibroblastos, mastocitos, macrófagos, granulocitos, células plasmáticas y linfocitos, además de glándulas mucoserosas. En la mucosa respiratoria, también se encuentra una gran cantidad de células inmunitarias, las cuales se distribuyen en la lámina propia en forma difusa, así como en estructuras foliculares no encapsuladas, o constituyendo el tejido linfoide asociado a la nariz (NALT), el cual forma parte de los tejidos linfoides asociados a las mucosas (MALT). Entre las células del epitelio respiratorio que recubre el NALT, también se encuentra gran cantidad de células M (membranosas o con micropliegues), cuya principal función es la captura y la transitosis de los antígenos desde la porción apical de la célula, hasta la porción basal, en donde muestran el antígeno a las células presentadoras de antígenos. (Giannasca PJ y cols 1997). 3) La
porción olfatoria situada en la región posterior y techo de las fosas nasales, presenta un epitelio cilíndrico pseudoestratificado alto.
En esta porción se distinguen 3 tipos celulares: de sostén, receptoras olfatorias y básales. Las células de sostén son cilíndricas altas, su borde superior está cubierto por microvellosidades, y tienen prolongaciones que rodean y separan a las células olfatorias. Estas células de sostén se localizan en la porción luminal del epitelio, en las caras laterales y están unidas por complejos de unión (zonula ocluyente, zonula adherente y desmonsomas). Las células receptoras olfatorias, son neuronas bipolares modificadas y su porción apical son dendritas modificadas que se ubican en sentido perpendicular a la superficie de la membrana nasal. La célula se estrecha a nivel de las uniones con las células de sostén vecinas. Por encima de la zona estrecha, la dendrita se ensancha y tiene la forma de un bulbo (vesícula olfatoria), la cual presenta varios cilios olfatorios largos, no móviles. La porción basal de la célula se va adelgazando, prolongándose en un axon (amielinico), siendo una fibra del nervio olfatorio. Las células basales, son de aspecto cónico y se encuentran dispersas sobre la lámina basal, se estima que son células madre pluripotenciales que se pueden diferenciar en células de sostén o en células receptoras olfatorias. Por debajo del epitelio en la lámina propia, se encuentran células pigmentarias, células linfoides, además de una gran vascularización sanguínea y linfática que permite la circulación y migración de células en el seno de la lámina propia, desde los tejidos linfoides, así como del epitelio de revestimiento. La región olfatoria presenta glándulas tubuloalveolares (Glándulas de Bowman), las cuales vierten una secreción serosa. La mucosa además de continuarse con el periostio, también presenta una gran cantidad de fibras colinérgicas y fibras adrenérgicas (Geneser F 2002).
SISTEMA INMUNITARIO
Los órganos linfoides se dividen desde un punto de vista funcional en dos categorías: linfoides primarios o centrales y secundarios o periféricos; y desde un punto de vista anatómico-estructural en órganos capsulados y no capsulados.
En los órganos primarios, médula ósea y timo se originan y maduran los linfocitos B y T hasta convertirse en células competentes, capaces de reconocer y responder en forma específica a los estímulos antigénicos. Los órganos linfoides secundarios como los ganglios linfáticos, bazo y tejidos linfoides asociados a las mucosas (MALT), disponen de linfocitos ya maduros e inmunológicamente competentes y es en ellos donde se producen las respuestas inmunitarias frente a estímulos antigénicos. (Tristram GP 2001)
SISTEMA INMUNITARIO DE LAS MUCOSAS
En las mucosas se encuentra la primera línea de defensa contra antígenos externos, ya que un gran número de agentes patógenos las utilizan como vía de entrada. El conjunto de tejidos linfoides organizados y difusos en las mucosas del organismo, se denominan “tejidos linfoides asociados a las mucosas” (MALT) los cuales a través de la inmunidad innata y adquirida mantienen una homeostasis inmunitaria, a lo largo de la gran superficie interior de las víseras, la cual comprende las mucosas oral, nasal, respiratoria, urinaria y gastrointestinal. (Tristram GP 2001)
Características particulares del sistema inmunitario de las mucosas
El sistema inmunitario de las mucosas, además de tener cierta independencia, presenta características únicas que lo diferencian de la inmunidad sistémica:
1.-Tiene células M: que se encargan de transportar por transitosis los antígenos desde la superficie luminal de las mucosas hasta la porción basal del epitelio, donde quedan a disposición de las células inmunocompetentes. (Giannasca PJ y cols 1997)
2.-Produce la inmunoglobulina relacionada con las mucosas (IgA secretora), que tiene como una de sus principales características, presentarse en forma dimérica. (Woof JM y Mestecky J 2005)
3.-Presenta un sistema de transporte para la IgA secretora, el componente secretor.
4.-Tiene células T con propiedades reguladoras o efectoras especificas para la mucosa, entre las que se encuentran los LIEs CD4+ y CD8+ (TCR γδ / αβ). (Cheroutre H 2005, Okuda M y Pawankar R 1992)
5.-Es un sistema inmunitario polarizado hacia las mucosas, el cual permite a los linfocitos activados migrar de manera selectiva hacia los tejidos linfoides difusos, situados por debajo del epitelio. (Csencsits KL y cols 1999)
Distribución y sitios de activación de la inmunidad de mucosas
El tejido linfoide de mucosas se organiza anatómica y funcionalmente en dos zonas: a). de procesamiento e inicio de la respuesta inmunitaria. Este compartimiento inductor dispone de elementos celulares como son macrófagos, linfocitos T, linfocitos B, y células dendríticas foliculares e interdigitantes.
Funcionalmente estas células se comportan de manera semejante a las que participan en la inmunidad sistémica, siendo necesarias para realizar la captura y procesamiento de antígenos y para iniciar la respuesta inmune. Esta zona inductora se localiza principalmente en los tejidos linfoides organizados, los cuales forman folículos asociados a las mucosas. (Kiyono H y Fukuyama S 2004, Sminia T y Kraal G 1999)
De acuerdo a su localización anatómica, se denominan:
Tejido linfoide asociado a la nariz (NALT)
Tejido linfoide asociado al tracto gastrointestinal (GALT) Tejido linfoide asociado a bronquios (BALT).
Tejido linfoide asociado al tracto genitourinario.
b). de respuesta humoral y celular, el compartimiento efector en el cual la mayor parte de células inmunes son linfocitos T CD4+ Th0 y células plasmáticas productoras de IgA. Las APC (células presentadoras de antígenos) y los linfocitos T y B activados en el compartimiento inductor, drenan por vía linfática hacia los nódulos linfoides cervicales posteriores, en donde participan en los procesos de proliferación y diferenciación de los linfocitos B. Posteriormente los linfocitos T CD4+ antígeno- específicos y los linfocitos B IgA+ migran por vía linfática y sanguínea hacia las zonas efectoras como el epitelio y la lámina propia de la mucosa en donde efectúan la respuesta inmune. En este compartimiento efector (lamina propia o tejido no NALT), los linfocitos B IgA+ y los plasmablastos diferenciados en AFCs IgA debido a la presencia de citocinas producidas por el fenotipo Th2 (IL-5 e IL-6), producen la IgA dimérica, la cual se une a receptores poliméricos de inmunoglobulina Ig (componente secretor), situados en la membrana basal de las células epiteliales de la mucosa respectiva. Por último el componente secretor se encarga de mediar el transporte y excreción de la IgA secretora. (Wu HY y cols 1996, Kiyono H y Fukuyama S 2004, Bienenstock J y McDermott RM 2005, Shimada S y cols 1999)
ARQUITECTURA HISTOLÓGICA DEL NALT
El tejido linfoide asociado a nariz (NALT) forma parte del sistema inmunitario de las mucosas (MALT). Es un órgano linfoide par que se desarrolla en algunos roedores después de la primera semana de nacimiento (Mebius R 2003, Ying X y cols 2005, Harmsen A y cols 2002);
tiene la forma de un cilindro de aproximadamente 3 mm de longitud y descansa a ambos lados del tabique sobre el piso de la cavidad nasal.
(Asanuma y cols 1997, Heritage y cols 1998, Sminia T y Kraal G 1999) Debido a su localización anatómica, se considera un análogo del anillo de Waldeyer humano (Boyaka NP y cols 2000) y funcionalmente se compara con la placa de Peyer por presentar características inductoras similares. (Kiyono H y Fukuyama S 2004)
La función atribuida al NALT, es proporcionar un sistema de defensa en las vías aéreas superiores. (Csencsits y cols 1999, Boyaka PN y cols 2000). El NALT es un compartimiento inductor y corresponde a la porción de células linfoides organizadas. En este sitio se inicia la respuesta inmunitaria, además de ser el sitio de cambio de isotípo de inmunoglobulina IgM+ por IgA+ (Shikina T y cols 2004); una vez terminado este proceso, las células plasmáticas productoras de IgA, migran hacia la lámina propia sobre la que descansa el tejido organizado, en este sitio que es la porción efectora, se lleva acabo la producción de
IgA secretora la cual se encuentra presente en el moco nasal. (Figura 1) En cuanto a su estructura, el NALT está compuesto principalmente
por linfocitos T (predominando los CD4+) y linfocitos B en cantidades similares. El órgano se encuentra regionalizado de acuerdo al patrón de distribución de cada tipo celular; los linfocitos B se localizan preferentemente en la porción central del órgano, conformando la zona B o folicular, mientras que los linfocitos CD3+ se distribuyen en la periferia de la zona B, conformando la zona T o parafolicular. Otras poblaciones presentes son células dendríticas y macrófagos (Asanuma H y cols, 1997). Además en el epitelio respiratorio que recubre el NALT, otra forma
epiteliales. (Giannasca PJ y cols 1997, Park HS y cols 2003, Cleary PP y cols 2004), Aunque algunos antígenos solubles como la toxina del vibrión cólera, pueden atravesar las uniones estrechas entre las células epiteliales, lo que provoca la respuesta inmunitaria tanto en el compartimiento inductor como en el efector de forma directa. Otro tipo de células encontradas son los linfocitos intraepiteliales CD3+CD4+ y CD3+CD8+, los cuales se encuentran incluidos en todo el epitelio, no solo el que recubre al NALT.
El NALT presenta una red reticular que se distribuye en la totalidad del órgano; no presenta irrigación linfática aferente ya que la entrega de antígenos ocurre principalmente por los procesos de transitosis en las células M, sin embargo el tejido presenta irrigación linfática eferente, la cual drena predominantemente hacia los nódulos linfoides cervicales posteriores, mientras que el drenaje linfático de la mucosa nasal ocurre principalmente hacia los nódulos linfoides cervicales superficiales.
Además, debido a la expresión de moléculas de adhesión en las vénulas de endotelio alto, a este componente se le atribuye la función de permitir el ingreso, alojamiento y organización de las células en el tejido (Butcher EC y cols 1980, Csencsits KL y cols 1999, Drayton LD y cols 2004).
El NALT, en una gran cantidad de trabajos, se ha reportado que juega un papel muy importante en el sistema de defensa del tracto respiratorio alto en los roedores, ya que se ha demostrado que puede provocar respuestas inmunitarias, tanto locales como sistémicas, por lo que se ha considerado un modelo muy efectivo para inducir inmunidad.
(Tamura S y cols 1998, Zuercher AW y cols 2002, Liang B y cols 2001, Balmelli C y cols 2002, Rojas-Hernández S y cols 2004).
Figura 1. Sistema inmunitario común de las mucosas. Los antígenos son transportados desde el lumen, hacia el NALT y la placa de Peyer a través de las células (M) incluidas en el epitelio sobre estos órganos linfoides. Posteriormente las células dendríticas captan, procesan y presentan antígenos a los linfocitos CD4+, que al ser estimulados inducen el desarrollo de células B IgA comprometidas en el centro germinal del folículo linfoide. Después del cambio de isotípo de IgM a IgA, las células B migran desde el NALT y la placa de Peyer, hacia los nódulos linfoides cervicales posteriores y mesentéricos respectivamente. Finalmente, las células B IgA+ y los linfocitos CD4+, migran a través del dúcto torácico y la circulación sanguínea, hacia los sitios efectores (lámina propia nasal e intestinal); en donde las células TH2 producen IL-5 e IL-6, que inducen la diferenciación de células B IgA+ y plasmablastos, en células plasmáticas productoras de IgA dimérica. La IgA dimérica al unirse con receptores poliméricos de inmunoglobulina en la membrana basal de las células epiteliales (componente secretor), resulta en la IgA secretora. (Kiyono H y Fukuyama S 2004).
Diferencias entre los componentes del MALT
Dentro del sistema inmunitario del MALT, cada órgano linfoide asociado a las mucosas, muestra características morfológicas y funcionales únicas, que lo diferencian de otros.
1.-La aparición de los diferentes órganos linfoides, se encuentra programada genéticamente, y su desarrollo puede acelerarse por la exposición a antígenos. (Mebius RE 2003)
2.-A partir de una estimulación antigénica, pueden inducir respuestas tanto locales como sistémicas. (Wu HY y cols 1996, Wu HY y Russell NL 1997)
3.-La capacidad de inducción de la respuesta inmunitaria es variable y requiere diferente cantidad de antígenos.
4.-Las moléculas de adhesión expresadas en cada tejido linfoide pueden ser las mismas, pero cuantitativamente pueden ser diferentes, por lo que muestran un patrón de expresión único. (Csencsits KL y cols 1999)
5.-Los tejidos linfoides vinculados con las mucosas, se localizan estratégicamente en diferentes sitios del organismo y con diferente capacidad de respuesta, formando una primera línea de defensa contra antígenos externos. (Tristram GP 2001)
6.-Los compartimientos inductores y efectores actúan de forma similar, pero el tipo y calidad de las respuestas humorales y celulares pueden diferir.
7.-La función y la morfología de los tejidos linfoides, depende del número de antígenos al que se encuentra expuesto y de la calidad de la respuesta inmunológica. En los estados libres de microorganismos, los tejidos linfoides se encuentran hipofuncionales y presentan disminución de volumen. Por otro lado, su función y su tamaño se incrementan, cuando la exposición a antígenos es mayor.
7.-El drenaje linfático de los componentes del MALT, ocurre hacia los ganglios regionales más cercanos. Por ejemplo, el NALT drena preferentemente hacia los nódulos linfoides cervicales posteriores y el
GALT drena hacia los nódulos mesentéricos. (Mebius RE 2003 Sminia T y Kraal G 1999)
EJE HIPOTALAMO-HIPOFISIS-ADRENAL
El hipotálamo es un centro de integración que recibe y monitorea información acerca del ambiente, y además coordina las respuestas a través del sistema nervioso central, autónomo y endocrino. Las principal información que recibe es la visual, olfativa, auditiva y sensitiva.
Dentro de las funciones del hipotálamo está la de controlar la secreción de hormonas hipofisiarias, controlar las acciones involuntarias por medio del SNA (sistema nervioso autónomo) y regular la motivación y los instintos por medio del sistema límbico. El núcleo paraventricular del hipotálamo secreta la hormona corticotropina (CRH) dentro del sistema portahipofisiario, la cual regula subsecuentemente la producción de hormona adrenocorticotrofica (ACTH) en la glándula hipófisis anterior. La hormona ACTH a su vez actúa en la corteza de la glándula suprarrenal provocando la secreción de cortisol. Durante los periodos de estrés se produce una sobreestimulacion hipotalámica, lo cual provoca una hipersecreción hormonal.
El sistema de estrés está constituido por el eje hipotálamo- hipófisis-adrenal (HPA) y el sistema simpático sistémico, los cuales se encuentran controlados por señales limbicas, circadianas, neurosensoriales y hormonales. Las situaciones de estrés, tales como la hipoglicemia, procesos inflamatorios, fiebre, trauma, ejercicio intenso, cirugía y problemas emocionales pueden activar este sistema. (Paca´k K y Palkovits M 2001)
ESTRÉS
Actualmente el estrés se define como un “estado de amenaza para la homeostasis, durante el cual se activa una respuesta adaptativa compensatoria”. (McEwen BS 1998)
Cannon (Paca´k K y Palkovits M 2001) en 1929 fue el primer investigador en introducir el término de homeostasis, el cual definió como un conjunto de mecanismos fisiológicos coordinados que mantienen la mayoría de los procesos del organismo en estados constantes. Cannon señala que el sistema nervioso simpático es esencial para restaurar la homeostasis alterada por el estrés y para promover la sobrevivencia del organismo, además mencionó la existencia de respuestas al estrés, especificas para cada tipo de agente estresor. Posteriormente, Selye en 1936 (Paca´k K y Palkovits M 1991) introdujo el termino “Estrés” y lo popularizó como una idea científica. Dentro de sus principales efectos, describió una tríada patológica que consiste en: hipertrofia suprarrenal, ulceración gastrointestinal e involución timolinfática, la cual fue provocada por diferentes estresores. Debido a que las diferentes respuestas específicas convergen en el estado de estrés, lo refirió como un componente no especifico compartido. Posteriormente introdujo el término de “síndrome de adaptación general” con sus tres fases sucesivas:
alarma, resistencia y agotamiento. Además propuso que la mayoría de los estímulos agotadores, inducen dos tipos de respuestas: 1).- respuesta general al estrés, en la cual todos los agentes estresantes, implican el eje HPA. 2).- la respuesta individual al estrés, mediada por factores condicionantes como la predisposición determinada genéticamente.
Recientemente, McEwen BS (McEwen BS 1998) introdujo el término de alostasis y la definió como la capacidad de adaptarse exitosamente a los cambios. Durante este proceso activo de adaptación, se producen respuestas que involucran el SNA y eje HPA, los cuales al ser activados, intervienen directa o indirectamente en la producción de varios mediadores como el cortisol, catecolaminas, citocinas, mediadores tisulares y genes de expresión temprana.
De acuerdo a la duración, el estrés se clasifica en:
Estrés agudo: En el sentido de la lucha, se considera simple, intermitente y de exposición por tiempo limitado.
Durante el estrés agudo se produce una respuesta adaptativa, la cual provoca que los procesos fisiológicos inhiban o estimulen varios sistemas y/o sus componentes, para movilizar las reservas energéticas hacia órganos prioritarios como los sistemas muscular y nervioso.
Estrés crónico: (carga de tensiones acumulativas); es la exposición a agentes estresantes en forma prolongada y continua.
Los agentes estresantes se incluyen dentro de los principales acontecimientos de la vida diaria y se pueden dividir en:
Físicos: frío, calor, ruido, vibración, ejercicio intenso, trauma, cirugía, radiación etc.
Químicos: venenos, fármacos etc.
Psicológicos: procesos emocionales y cambios de comportamiento.
Sociales: desempleo, falla de relaciones interpersonales, nivel socioeconómico etc.
Biológicos: enfermedades infecciosas.
El estrés por dolor y el estrés metabólico puede ser provocado por de algunos de los agentes previos, como son el frío, el calor, el trauma, la cirugía, químicos, venenos, fármacos, etc. (Paca´k K y Palkovits M.
2001)
En relación con la función inmunitaria se sabe que el estrés provoca un incremento en la secreción de hormonas glucocorticoides y catecolaminas, las cuales son reguladas por el eje hipotálamo-hipófisis- adrenal; estas hormonas interactúan con receptores de las células inmunitarias, provocando cambios en su respuesta que incluyen, modificaciones en el tráfico y proliferación celular, cambios en la secreción de citocinas y anticuerpos y en la actividad citolítica. (Dhabhar FS y McEwen BS 2001, McEwen BS 1998, Padgett DA y Glaser R 2003)
HORMONAS DEL ESTRÉS
Glucocorticoides
Como ya se mencionó, el estrés producido por estímulos fisiológicos, emocionales o cognitivos negativos, incrementan en el hipotálamo la producción de CRH y en la hipófisis anterior de ACTH, la cual a su vez controla la actividad de las zonas fasciculada y reticular de la corteza suprarrenal. Específicamente en la zona fascicular, la ACTH estimula la producción de cortisol y el incremento de esta hormona, provoca hiperplasia de las células, lo que conlleva a hipertrofia de la glándula suprarrenal. (Guyton AC 2003)
El término glucocorticoides se aplica a todos los esteroides suprarrenales que tienen acción principalmente en el metabolismo intermediario. El cortisol o hidrocortisona, es una molécula liposoluble que atraviesa la membrana de las células blanco por difusión simple y se une a receptores para glucocorticoides (GCR). Los GCR se dividen estructuralmente en tres partes: un dominio N-terminal o de transactivacion, un dominio de unión a ADN (dedos de zinc), y un dominio C-terminal de unión a ligando. El complejo ligando-receptor se transloca al núcleo y se une a sitios específicos del ADN, regulando la síntesis de RNA. En los macrófagos y linfocitos T, los GCR son el receptor primario para glucocorticoides; los cuales medían la influencia de los glucocorticoides en la función inmune (Padgett DA y cols 2003).
El incremento del cortisol, afecta en forma general el metabolismo de los carbohidratos, lípidos y proteínas; además alteran funciones vitales entre las que se incluyen las reacciones inflamatorias e inmunomoduladoras.
La secreción excesiva de glucocorticoides tiene efectos nocivos para el sujeto como son:
1.-Incrementa la gluconeogénesis y la resistencia a la insulina, debido al aumento en la secreción de adrenalina.
2.-Disminuye la captación de glucosa por las células, ocasionando hiperglicemia, con la finalidad de redirigir las reservas energéticas hacia las células de mayor importancia.
3.-Incrementa el catabolismo proteico.
4.- Incrementar y redistribuir la grasa corporal.
5.-Provoca la involución del tejido linfoide, de la respuesta inflamatoria y de la inmunidad celular y humoral
6.-Incrementa la secreción de ácido clorhídrico en él estomago debido a hiperestimulación simpática.
7.-Provoca retención de sodio y redistribución de los fluidos corporales.
8.-Disminuye la secreción de hormonas gonadales.
Catecolaminas
Las catecolaminas son hormonas metabotrópicas originadas a partir del aminoácido tirosina y son secretadas en la médula de la glándula suprarrenal. Estas hormonas desempeñan un papel primordial en la activación general, producida en situaciones del estrés.
El estrés físico o mental puede ocasionar la estimulación de nervios simpáticos que inervan la médula suprarrenal, lo que ocasiona la liberación de catecolaminas a la circulación sanguínea.
La adrenalina y noradrenalina se encuentran muy relacionadas con las reacciones de lucha o huida ante estímulos estresantes. La síntesis de adrenalina se incrementa en situaciones de estrés físico, cólera y conductas de alto riesgo. En cambio la noradrenalina se relaciona más con los estados de estrés psíquico como ansiedad, miedo y angustia.
(Guyton AC 2003)
Las catecolaminas pueden provocar efectos fisiológicos directos o indirectos de forma inmediata o tardía en todo el organismo. Los efectos inmediatos permiten una reacción de alarma, la cual es indispensable para ejercer una actividad física vigorosa. Durante esta reacción, se produce incremento del gasto cardiaco, aumento de las resistencias periféricas y de la presión arterial debido a la vasoconstricción, dilatación pupilar e incremento de la fuerza y el flujo sanguíneo en los músculos activos. Los efectos tardíos se dan principalmente a nivel del metabolismo tisular, como son: la lipólisis, la glucogenolisis hepática y muscular con hiperglicemia. Estos mecanismos permiten redirigir y abastecer al organismo de la energía necesaria, para mantener la reacción de alarma. (Paca´k K y Palkovits M 2001, Guyton AC, 2003).
En los órganos blanco y numerosas células del sistema inmunitario, las catecolaminas median sus funciones a través receptores adrenérgicos expresados en la superficie de las células. Los receptores se encuentran acoplados a proteínas G y se dividen en dos subgrupos;
receptores (α y β). Los receptores β2 son los que parecen tener mayor importancia en el sistema inmunitario, presentan 7 dominios transmembranales y se encuentran presentes en muchos tipos celulares como macrófagos y células T. La activación del receptor β2 provoca la señalización citoplasmática, a través del complejo de proteínas G, en donde la subunidad α se activa cuando se une a GTP y activa adenilato ciclasa, la cual cataliza la síntesis de cAMP a partir de ATP y activa posteriormente a la proteína cinasa A (PKA). La activación de la cascada de cAMP, provoca la fosforilación de factores de trascripción (CREB) por PKA dependientes de cAMP. A partir de elementos conservados, CREB estimula la trascripción basal de genes, que son capaces de activarse en respuesta a cAMP. El elemento conservado de respuesta a cAMP, se ha identificado en la región promotora de varios genes como el de la interleucina 6 (IL-6). Así la elevada producción de catecolaminas durante el estrés, puede modificar la expresión de varios genes relacionados con la respuesta inmunitaria. (Padgett DA y Glaser R 2003).
Modelos de estrés en animales
Hans Selye (Paca´k K y Palkovits M 2001) en 1936, fue el primer investigador que utilizó el modelo de estrés por inmovilización en ratas, las cuales manifestaron varios signos que caracterizaron un síndrome ocasionado por el estrés. La manifestación mas evidente fue la presencia de hipertrofia de la glándula adrenal, la cual se atribuyó a una
sobreestimulacion por las hormonas ACTH secretadas por la hipófisis anterior. Otra manifestación fue la presencia de ulceración gástrica, la cual se atribuyó al incremento en la secreción de ácido clorhídrico por las células parientales en el estómago; también se encontró involución del sistema timo linfático, la cual se atribuyó a la implicación del eje
hipotálamo-hipófisis-adrenal así como del sistema nervioso autónomo.
El estrés ocasionado por la inmovilización, ocasiona la activación de varios sistemas efectores del estrés, con la finalidad de contrarrestar el agente nocivo que lo está originando. La activación o presentación de la respuesta, ocurre dentro de los primeros 30 minutos de iniciada la inmovilización. Sin embargo cuando hay sobre activación de estos sistemas, en lugar de ocasionar respuestas que ayuda a proteger al organismo, se produce habituación y agotamiento de los sistemas, lo cual ocasiona efectos adversos (Paca´k K y Palkovits M. 2001).
En estos mismos animales de experimentación, se observó que los esquemas de estrés por inmovilización, ocasionaron una fuerte activación de c-fos en varias regiones cerebrales, en un periodo de 30 a 120 minutos después del estímulo, lo cual provocó que una gran cantidad de sistemas, fueran influenciados por este agente estresante. La expresión de c-fos se encontró en grupos de células noradrenérgicas y catecolaminérgicas, las cuales se ha demostrado que desempeñan un papel importante en la activación del eje HPA inducido por el estrés. Además, después de 3 horas de inmovilización, se encontró incremento en la expresión de mRNA correspondiente a otras hormonas secretadas en la hipófisis como la TRH y CRH. Por lo tanto, la activación de varias regiones cerebrales,
numerosas funciones en el organismo por la vía de los sistemas nervioso autónomo y endocrino.
Por otro lado cuando se compararon las regiones cerebrales activadas, por diferentes situaciones estresantes como la inmovilización, la hipoglicemia, el frío, la hemorragia, y el dolor, se observó que el modelo de estrés por inmovilización es uno de los más efectivos para producir activación de una mayor cantidad de regiones cerebrales. Además se encontró que cada agente estresante, utiliza vías neuroendocrinas específicas. (Pacak K y Palkovits 2001)
Efectos del estrés sobre el sistema inmunitario
Frente al estrés, el organismo se protege a través del SNA-eje HPA, el sistema inmunitario, cardiovascular y metabólico, por medio de respuestas contra el estrés interno y externo. (Guyton AC 2003)
El cortisol es el principal glucocorticoide involucrado en la inmunomodulacion, el cual ejerce efecto sobre prácticamente todas las células del sistema inmunitario. La hormona se une a receptores citoplasmáticos, formando complejos hormona-receptor que entran al núcleo y regulan la trascripción de diversos genes, lo que ocasiona efectos inmunosupresores y anti-inflamatorios Además el SNA y el eje HPA provocan supresión de las respuestas de fase aguda y de la inmunidad mediada por células. (Padgett DA y Glaser R 2003).
El estrés agudo, provoca por un periodo de 3 a 5 días, efectos inmunitarios que dependen de la secreción adrenal, lo que origina migración y redistribución de macrófagos y linfocitos a través del cuerpo, con marginación de las células en la pared de los vasos sanguíneos y otros compartimientos como la piel, nódulos linfoides y médula ósea. Con esta respuesta, el organismo establece un periodo de alarma, durante el cual posiblemente se incrementa la vigilancia inmunológica y permite una mayor y más rápida migración celular a un sitio de demanda. Si las señales hormonales disminuyen y no hay desafío, las células regresan a la circulación. (Padgett y Glaser 2003)
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Identificar los efectos del estrés sobre las células del tejido linfoide asociado a nariz (NALT) en el ratón.
JUSTIFICACIÓN
La mucosa nasal es una vía de entrada y primer sitio de contacto para múltiples antígenos tanto aéreos como bucales. El NALT es una estructura linfoide organizada que se encuentra situada estratégicamente en la porción del tracto respiratorio alto, que tiene la capacidad de iniciar respuestas inmunitarias tanto locales como sistémicas las cuales han sido poco estudiadas.
Por tal motivo la posible alteración en la morfología y función del NALT, podría explicar el incremento en la susceptibilidad del tracto respiratorio a enfermedades infecciosas provocadas por el estrés.
OBJETIVO GENERAL
Analizar los efectos del estrés, sobre la cantidad y distribución de las células del sistema inmunitario en el tejido linfoide asociado a la nariz, así como los cambios en la secreción de IgA al líquido nasal.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
1.-Determinar las características morfológicas normales del NALT.
2.-Obtener ratones con estrés agudo obtenidos por método de inmovilización,
3.-Determinar cambios en el tamaño y forma del NALT de ratones sometidos a estrés.
4.-En el NALT de ratones normales y sometidos a estrés, identificar y cuantificar por inmunohistoquímica las poblaciones celulares CD3+, CD4+, CD8+, linfocitos B (IgM+ y CD45+), células plasmáticas IgA+ y macrófagos, así como la expresión de la molécula ICAM-1.
5.-En el compartimiento epitelial del NALT de ratones normales y estresados, Identificar y cuantificar por inmunohistoquímica los linfocitos CD4+ y CD8+ presentes.
6.-En el tejido no NALT (la lámina propia) de ratones normales y estresados, identificar linfocitos B IgA+.
7.-En el NALT de ratones normales y estresados, cuantificar el número e isotipo de linfocitos T y B, por medio de citometría de flujo.
8.-En muestras de lavado nasal de ratones normales y estresados, cuantificar anticuerpos IgA mediante inmunoensayo enzimático (ELISA).
HIPÓTESIS
Si el estrés provoca un incremento en la secreción de hormonas glucocorticoides y catecolaminas y si estas tienen influencia sobre las células del sistema inmunitario asociado a la mucosa nasal, entonces los ratones sometidos a estrés, presentarán modificaciones en el tamaño del NALT, en el número y distribución de las células inmunitarias así como en la secreción nasal de IgA.
MATERIAL Y METODOS Animales
Se utilizaron ratones Balb/c machos con un peso entre 21-24 g proporcionados por Harlan México, el manejo de los animales se realizo de acuerdo a las normas de la Comisión de Bioética de la ESM. Los ratones se dividieron en tres grupos de 7 animales cada uno; un grupo control, uno con tratamiento de estrés de 4 días y otro con tratamiento de 8 días.
Reactivos necesarios para realizar las inmunohistoquimicas:
-Anticuerpos monoclonales de rata anti-ratón conjugados con biotina: anti CD3+, anti CD4+, anti CD8, anti CD45+ (B220+), anti-CD54+
(ICAM-1), anti-Mac-3 (DB PharMingen Technical Data Sheet).
-Anticuerpos policlonales de cabra anti-ratón conjugados con peroxido: anti-IgM+ y anti-IgA+ (Serotec)
-Diaminobencidina (Pierce)
-Estreptavidina conjugada con peroxido (Zymed Laboratories Inc).
Reactivos para procesamiento del tejido no NALT -Paraformaidehido
-EDTA (Etilendinitrilotetracetato disodico) (baker analized)
Tratamiento de estrés.
Los animales fueron sometidos a un esquema de estrés por inmovilización en contenedores cilíndricos apropiados al tamaño del animal (5 cm. de largo, 3 cm de alto y 3.5 cm de diámetro) con ventilación adecuada. Antes y después del periodo de estrés, los animales se mantuvieron en jaulas durante los días de tratamiento, ingiriendo agua y comida a libre demanda. Los animales control se mantuvieron en las mismas condiciones.
Los animales problema se sometieron diariamente a 3 horas de estrés, bajo un horario establecido (8:00-11:00 AM). Para evitar el estado de adaptación al estrés durante la inmovilización, los ratones se estimularon cada 30 minutos de la manera siguiente: 1.-Agitación de los contenedores durante 10 segundos, iniciando el ciclo a los 10 minutos.
2.-Rotación de los contenedores durante 10 segundos, iniciando el ciclo a los 20 minutos. 3.-Por ultimo, se sumergió la cola de los animales en agua fría durante 10 segundos, iniciando el ciclo a los 30 minutos.
Día Agitación de los contenedores
Rotación de los contenedores
Inmersión de la cola en agua fría
1 x x
2 x x x
3 x x
4 x x x
Sacrificar el grupo de ratones controles y estresados durante 4 días
5 x x
6 x x x
7 x x
8 x x x
Sacrificar el grupo de ratones estresados durante 8 días
Obtención y procesamiento del material biológico.
Posterior al tratamiento, los animales se anestesiaron profundamente con vapores de éter, se sangraron por punción cardiaca directa y se sacrificaron por decapitación. Se procedió a realizar lavado nasal con 2 ml de solución salina estéril, colocando un catéter en la tráquea, para realizar infusión retrógrada y colectar el liquido de lavado nasal en tubos Eppendorff, después se almacenó en congelación para cuantificar posteriormente la sIgA (IgA secretora) mediante ELISA tipo emparedado. Por último se realizaron curvas de concentración y cuantificación de proteínas por el método de Bradford.
Para la obtención del NALT, después del lavado nasal se removió la piel de la cabeza, se retiró el maxilar inferior y los tejidos blandos, como lo describen (Asanuma y cols, 1997; Heritage y cols, 1998). Las cabezas se inmovilizaron en una placa de cera, colocando el paladar superior en posición ventral para su disección con la ayuda de microscopio estereoscópico, para la cual se realizó se dos incisiones verticales con hoja de bisturí del #20 desde el vértice del paladar por la parte interna de los dientes incisivos, siguiendo las porciones laterales hasta la base del paladar por la parte interna de los dientes molares.
Enseguida el colgajo fue sujetado por el vértice, con pinzas de punta fina y se realizó tracción hacia la base del paladar, retirándolo por completo.
(Figura 2-A y B)
Figura 2. Localización y extracción del NALT. A) El esquema muestra la situación aproximada del órgano y B) muestra la localización del NALT en el piso de la nariz, al separar el paladar del cráneo.
A
B
El paladar extraído se colocó en contenedores de aluminio de 1 cm³, sobre una base de medio de inclusión hidrosoluble (Tissue-tek), con el NALT en posición ventral, éste fue cubierto con una segunda capa de tissue-tek y se congeló en isopentano. Las muestras fueron almacenadas a –70° C, hasta su corte en criostato.
Después de extraído el NALT los cráneos fueron fijados por inmersión en paraformaldehido al 4% por 24 horas. Después de lavado, se descalcificaron con EDTA al 8% p.H 7.6, realizando un cambio diario durante 8 días. Al término se procesaron para su inclusión en parafina.
Procesamiento
De las muestras del NALT congeladas se obtuvieron cortes de 7 µm de espesor, se colocaron en series de portaobjetos previamente tratados con gelatina la 1%. Algunos se fijaron en acetona durante 20 minutos y otros en formaldehído al 4% durante el mismo tiempo.
Los cortes del NALT fijados en formaldehído y cortes de 7 µm de espesor, obtenidos de las muestras incluidas en parafina se tiñeron con hematoxilina y eosina para un análisis morfológico general.
Tinciones
En los cortes fijados en acetona se realizaron las tinciones inmunohistoquímicas para identificar las siguientes poblaciones celulares:
por inmunohistoquímica directa, células plasmáticas productoras de IgA e IgM utilizando anticuerpos policlonales de cabra anti-IgM y anti-IgA de ratón conjugado con HRP (Serotec). Utilizando el método de inmunohistoquímica indirecta se detectaron linfocitos T CD3+, CD8+, CD4+, y por la expresión del antígeno Mac 3 en los macrófagos, así como la expresión del antígeno CD54+ (ICAM-1+) en el endotelio y las vénulas del endotelio alto, utilizando los respectivos anticuerpos monoclonales de ratón, conjugados con biotina (Pharmingen). Posteriormente se aplicó estreptavidina conjugada con peroxidasa (Jackson Immuno Reserch).
Previa a las tinciones la actividad de la peroxidasa endógena se bloqueó incubando los cortes en una solución de H2O2 al 0.3% y NaN3 al 0.1% en PBS, durante 10 minutos. Los tiempos de incubación con los anticuerpos primarios fue de 1-2 horas y para la estreptavidina de 1 hora, ambos a temperatura ambiente y en cámara húmeda. Después de cada incubación se realizaron lavados suaves con PBS. La reacción de peroxidasa se revelo según el método de Karnovsky con DAB (Pierce).
Las muestras se contracolorearon con hematoxilina de Harris (dilución 3:1 agua destilada/hematoxilina), se deshidrataron y cubrieron con resina sintética. Para cada uno de los anticuerpos se realizaron tinciones control siguiendo el mismo protocolo, excepto que el primer anticuerpo se sustituyó en PBS. En las tinciones control para los anticuerpos anti-IgM y anti-IgA de ratón, las muestras se incubaron con un anticuerpo irrelevante peroxidado.
Análisis microscópico y cuantificación de las células.
Una vez realizadas las tinciones del NALT de todos los grupos, en los cortes teñidos con H-E se procedió a medir el área total del tejido linfoide asociado a nariz en µm², utilizando el software Imagen Pro Plus, previamente calibrado a un objetivo 20x. El análisis se realizo en las tinciones inmunohistoquimicas a nivel de la porción media del NALT.
Las células se contaron en áreas constantes de 12538 µm2, 25050 µm2 y 30013 µm2 para cada tipo celular: Para los linfocitos T CD3+, CD4+, CD8+ en las zonas parafolicular y folicular 12538 µm2. Los linfocitos B IgM+ y CD45+ se contabilizaron en la zona folicular, en una área de 25050 µm2, mientras que los macrófagos F4/80+ se contabilizaron en la base del NALT, en una área 12538 µm2. Las AFC-IgA+ en el NALT se contaron en una área de 30013µm2, en los cortes de la porción media del tejido, mientras que se utilizó un área constante de 25050 µm2, para contabilizar las AFC-IgA+ en la lámina propia.
Para valorar la intensidad de reacción al marcador CD54+ (ICAM-
siguientes valores; contraste 30%, Brillo 45%, saturación 63%; mientras que el microscopio se ajustó a un objetivo de 20x, con una intensidad de luz y apertura del diafragma en 0. El área utilizada fue 30013µm2, con un rango de intensidad media de color mínimo de 10 y máximo de 150%.
Para la cuantificación de linfocitos intraepiteliales CD4+ y CD8+, se realizó en la longitud promedio del epitelio respiratorio del NALT, la cual fue de 780 µm lineales. Por último el volumen del NALT se obtuvo por la suma del área total del tejido en los cortes seriados por animal y de cada respectivo grupo. Cada uno de los conteos se realizó por duplicado.
Obtención de linfocitos para citometría de flujo.
Después de remover el NALT, la obtención de linfocitos se realizó de la siguiente forma: el paladar del ratón, conteniendo el NALT se colocó en una caja de Petri con 10 ml de medio RPMI-1640, se realizó un raspado suave con una espátula para separar el NALT del paladar, después se disgregó el NALT con el émbolo de plástico de una jeringa y se recuperó la suspensión celular, la cual se filtró en tela de organza de 10 × 10 cm. con una abertura de 1mm y se colocó en tubos cónicos de 15 ml. La suspensión celular se centrifugó a 1500 rpm/10 min. a 4° C, se desechó el sobrenadante y se resuspendió la pastilla en 1 ml de RPMI- 1640. Finalmente se ajustó a 1x106 células, para realizar las diferentes inmunotinciones para citometría de flujo.
Inmunotinción de linfocitos para citometría de flujo
La tinción de los linfocitos se realizó con anticuerpos anti-ratón (Becton Dickinson Technologies, Gaithersburg, MD) obtenidos de PharMingen (San Diego, CA) con fluorocromos conjugados biotinilados.
Para linfocitos (Lc) T CD3+ anticuerpos marcados con fluorocromos peridinin chlorophyll protein (PERCP), o con fluorescein isothiocynate (FITC). Para controles de isotipo, anticuerpos anti-IgG2a marcados con Phicoerithrin (PE) y Ab anti-IgG2b con (FITC), además se utilizó el anti- CD4+ (FITC) y anti-CD8+ (PE) y para los Lc B el CD45 RO (B220) con
(PE). Los anticuerpos se diluyeron 1:100 con amortiguador de fosfatos con albúmina sérica bovina p.H 7.4 (PBA) (10 mg/ml) y se colocaron 10 µl de cada anticuerpo, por cada millón de células, incubando en oscuridad a 4°C por 30 min. al término de ese tiempo se lavaron con PBA y se desechó el sobrenadante, al paquete celular se le agrego 400 µl de para- formaldehído al 1% y se guardo en oscuridad a 4 º C hasta su lectura en el Clitómetro de flujo FACSCAN (Becton Dickinson, San Jose, CA), cada conteo se realizo en un mínimo de 10,000 eventos. En las muestras para lectura de CD4+ contra CD8+ y CD3+ contra B220, se combinaron los anticuerpos marcados con diferentes fluorocromos, además de utilizar un control. El análisis de resultados, se llevó a cabo mediante el software (winMDI 2.8)
Cuantificación de IgA en líquido nasal por ELISA
Se colocó en cada pozo 100 µg/ml de inmunoglobulinas de conejo anti-IgA de mieloma de ratón y se incubo durante 18 h a 4° C; después de tres lavados con amortiguador de fosfatos-tween 20 p.H 7.2 (PBS-T) se aplicaron las muestras de líquido nasal sin diluir incubándose durante 2h a 37° C; al término, las placas se lavaron 5 veces con PBS-T y 5 veces con PBS, posteriormente se incubaron durante 2h a 37° C con el conjugado de cabra anti-IgA de ratón (Serotec) diluido 1:1000 en PBS-T.
Finalmente, las placas se lavaron 3 veces con PBS-T y 3 veces con PBS.
Posteriormente se adicionó el sustrato (Ortofenilendiamina). Después de 15 minutos a temperatura ambiente, la reacción se detuvo con ácido sulfúrico al 2.5 M se determinó la absorbancia a una longitud de onda de 490 nm. La curva estándar se hizo utilizando una IgA de mieloma de ratón (Sigma), el rango de concentración fue de 5 µg a 150 ng.
Análisis estadístico
Utilizando la prueba de ANOVA de una vía, se compararon los grupos experimentales de cada protocolo con su respectivo testigo. Los datos se analizaron mediante el software Sigma Stat y se graficaron
RESULTADOS
Efecto del estrés en la morfología del tejido linfoide asociado a nariz.
En los cortes teñidos con H-E el NALT se observó como dos masas ovoides situadas a los lados de la línea media en la cara nasal del paladar. Por su forma, se pueden describir tres caras, la basal apoyada sobre el paladar, la medial revestida por epitelio respiratorio, el cual en todos los grupos presentó características normales y una cara lateral en relación con la pared lateral de la nariz. En la estructura del NALT, no se identificaron nódulos linfoides típicos. En relación a la irrigación se identificaron vénulas convencionales y de endotelio alto (HEV) así como arteriolas. (Figura 3). Los animales de los grupos estresados durante 4 y 8 días, no presentaron cambios en la morfología del NALT comparados con el grupo control.
ER
CL
CB
LP
Figura 3. Morfología del NALT. ER epitelio respiratorio, CL cara lateral, CB cara basal, LP lámina propia. H-e. 4x.
NALT
ORGANIZACIÓN DEL NALT
Efecto del estrés en la morfología del NALT (compartimiento inductor)
En cuanto a la arquitectura histológica del NALT, las tinciones por inmunohistoquímica revelaron varios patrones de distribución celular, que fueron determinados principalmente por la organización de los linfocitos B y T. Los linfocitos B IgM+, IgA+ y CD45+, se encontraron distribuidos principalmente en el centro del NALT, formando un folículo linfoide en el cual no se observan centros germinativos (zona de linfocitos B); mientras que los linfocitos T CD3+, CD4+ y CD8+ se encontraron rodeando a los linfocitos B, constituyendo la zona de distribución de linfocitos T o área parafolicular (Figura 4). Sin embargo no se encontraron límites bien definidos entre las dos zonas, ya que parte del área parafolicular se encontró mezclada con folicular. Tanto el área de cada zona como la cantidad de células, fueron similares entre las poblaciones de linfocitos B y T.
Por otro lado los linfocitos T CD3+ y CD4+, también se encontraron en la zona folicular, mientras que los CD8+ presentaron un patrón de distribución más circunscrito al área parafolicular. La inmovilización durante 4 y 8 días, no alteró los patrones de distribución de los linfocitos B, T y sus subpoblaciones.
Figura 4. Distribución de las poblaciones celulares en el NALT. Los linfocitos B se ubican predominantemente en el centro (B) y los linfocitos T (T) hacia la periferia del órgano. La cara medial del NALT está revestida por epitelio respiratorio, mientras que la lateral se relaciona con las paredes laterales de las fosas nasales.
Efecto del estrés sobre la forma del NALT
La forma total del NALT se calculó graficando el volumen promedio por el nivel de 24 cortes seriados tomados desde la parte anterior hasta la porción posterior del órgano. Uniendo los puntos se observó que el órgano muestra una forma cilíndrica, cuyos extremos presentan un volumen menor que la porción central; esta forma fue semejante en los tres grupos estudiados. (Figura 5) Sin embargo, parece observarse una disminución con el estrés de 4 días y una recuperación con el estrés de 8 días.
Cara medial Cara lateral
0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8 2 0 2 2 2 4 2 6
Volumen promedio en µm2
2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 1 2 0 0 1 4 0 0 1 6 0 0 1 8 0 0 2 0 0 0 2 2 0 0
C O N T R O L 4 D IA S 8 D IA S
Figura 5. Reconstrucción de la forma del NALT. En esta gráfica se representa la forma del NALT, la cual fue similar en los tres grupos de estudio,. Los puntos representan en nivel de los cortes seriados y el volumen promedio obtenido desde la porción anterior hasta la porción posterior del órgano.
Efecto del estrés sobre el volumen del NALT.
El volumen total del órgano de cada ratón, se obtuvo sumando el área de cada una de las 32 muestras seriadas. Los animales del grupo control mostraron un volumen promedio de 2.95±0.56 mm3, mientras que el grupo estresado durante 4 días presentó un volumen de 2.68±0.42 mm3 y los de8 días 3.27±0.65 mm3. El análisis estadístico por ANOVA de una vía no mostró diferencias significativas (F2,15=1.44; P 0.27). Sin embargo, comparando los grupos control y el de 4 días se observa una tendencia hacia la atrofia del tejido. Por otro lado, el volumen de NALT de los animales estresados durante 8 días, mostró un incremento con respecto al grupo testigo(Figura 6).
4 DIAS
mm3
0 1 2 3 4 5
CONTROL 8 DIAS
Figura 6. Efecto del estrés en el tamaño del NALT. Esta gráfica compara el volumen total promedio en mm3 de los dos grupos problema con el grupo testigo. La aplicación de estrés por 4 días, ocasionó disminución en el volumen del tejido, mientras que a los 8 días, se observó una recuperación. El análisis estadístico, no mostró diferencias significativas entre los tres grupos de estudio (F2,15=1.44; P 0.27).
Efecto del estrés en las poblaciones celulares del NALT
Linfocitos T CD3+
Las inmunotinciones para identificar a los linfocitos CD3+
mostraron, que en los tres grupos de estudios, estos se localizan predominantemente en el área parafolicular, con pocas células en el área folicular (Figuras 7-A y B), observándose además algunos linfocitos CD3+
incluidos en el epitelio que recubre el NALT.
Figura 7. Distribución de linfocitos CD3+ en el NALT. A) La figura muestra los linfocitos marcados con el anticuerpo anti-CD3+ (flecha). 10x B) En el esquema, los puntos rojos muestran el patrón de distribución de estas células en el NALT.
En la cuantificación de los linfocitos CD3+ un área de 12538 µm2 ubicados en la zona parafolicular, se observó que los animales sometidos a estrés por 4 y 8 días tuvieron 249±7.5 y 223±10.6 células respectivamente, y el grupo control, 237±12.3.
Comparando estos tres grupos por ANOVA de una vía; se encontraron diferencias significativas entre el grupo de control y el grupo de estrés de 8 días (F2,15=9.525; P 0.002), este último también mostró diferencias significativas con el grupo de estrés de 4 días (F2,15=9.525; P 0.035). Sin embargo entre el grupo control y el grupo de estrés de 4 días no hubo diferencias significativas (P 0.0059). (Figura 8).
De la misma forma comparando el número de linfocitos CD3+ en el área folicular, del grupo control, 25±2.9 con el número de células del grupo de 4 días, 18±1.5 y el de 8 días, 17±1.3. Se encontraron diferencias significativas del grupo control con los grupos de estrés de 4 y 8 días (F2,15=23.902; P 0.001). Sin embargo entre los dos grupos problema, no hubo diferencias significativas (P 0.766). (Figura 9). La disminución en la
A
B
cantidad de estas células, ocurrió tanto en el área parafolicular como en la folicular.
Figura 8. Linfocitos CD3+ del área parafolicular. La gráfica compara el número de células entre los tres grupos de estudio. Con respecto al grupo control, el número de linfocitos disminuyó significativamente con el estrés de 8 días (F2,15=9.525; P 0.002). También se encontraron diferencias significativas entre los dos grupos problema (F2,15=9.525; P 0.035).
4 DIAS
Numero de células CD3+ en área parafolicular
0 50 100 150 200 250 300
CONTROL 8 DIAS
P 0.035 P 0.002
4 DIAS
Numero de células CD3+ en área folicular
0 5 10 15 20 25 30 35
CONTROL 8 DIAS
P <0.001 P <0.001
Figura 9. Cantidad de linfocitos CD3+ en área folicular. La gráfica compara el número de células de los dos grupos problema con el testigo. Con respecto al grupo control, el numero de linfocitos disminuyó con el estrés durante 4 y 8 días (F2,15=23.902;
P 0.001). Entre los dos grupos problema no hubo diferencias significativas.
Linfocitos T CD4+
En la tinción inmunohistoquímica, no se alteró la distribución de los linfocitos CD4+ en el NALT por el estrés. La mayoría de las células se distribuyeron en el área T o parafolicular predominado hacia la base del NALT (Figura 10-A), mientras que el área folicular presentó pocas células (Figura 120-B).
Figura 12. Distribución de linfocitos CD4+ en el NALT. A) La figura muestra los linfocitos marcados con anticuerpos anti-CD4+. 10x. B) En el esquema, los puntos representan el patrón de distribución de estas células en el NALT.
El número de linfocitos CD4+ en un área de 12538 µm2, fue el siguiente; en el grupo testigo, el promedio de linfocitos CD4+ localizados en el área parafolicular fue de 215±5.3; comparado con esta cifra, el número de células fue menor en el grupo de animales sometidos a estrés durante 4 días, el cual mostró un promedio de 173±12.3 células y aun menor en el grupo de 8 días, 159±7.6 células (Figura 11). Comparando el grupo control con los grupos de estrés de 4 y 8 días respectivamente, se encontraron diferencias estadísticas significativas (F2,15=63.593; P 0.001 y P 0.001) así como entre los dos grupos problema (F2,15=23.902; P 0.015).
En relación al área folicular, no hubo diferencias significativas entre los tres grupos de estudio (F2,15=23.902; P 0.699). El grupo testigo mostró un promedio de 27± 1.5 células, mientras que los estresados durante 4 y 8 días, presentaron respectivamente 26±1.4 y 27±2 células. (Figura 12).
Los resultados muestran una disminución en el número de linfocitos CD4+, principalmente en el área parafolicular.
