Identificación inequívoca de variedades comerciales de cítricos

(1)

Identificación inequívoca de variedades

comerciales de cítricos

Dra. Victoria Ibáñez González

Técnico Producción y Desarrollo- ANECOOP

E-mail: [email protected]

(2)

Identificación inequívoca de variedades comerciales de cítricos.

1. Identificación varietal actual y futura. 2. Objetivo 1 proyecto GOCITRUS

3. Protocolo de identificación generalizado por GOCITRUS. 4. Marcadores moleculares: tipos y usos.

5. Ejemplos aplicados:

- Nules-Arrufatina-Nero. - 3 Clones comerciales - W.Murcott-Tango

6. Coste de obtención y uso de marcadores. 7. Validez del protocolo

8. Review: antes y después de GOCITRUS. 9. Conclusiones

(3)

Bioquímico (sustancia medible: brix, acidez)

Morfológico (forma hoja, fruto…) Molecular (secuencia de ADN)

1. Identificación varietal

Identificación (marcadores) MOLECULARMENTE (ADN) Cambios en la secuencia de ADN AMBIENTE Actual AMBIENTE Corto plazo AGRONÓMICAMENTE (DHE)

Brix, Acidez, forma hoja,

fruto…

AGRONÓMICAMENTE (DHE)

Brix, Acidez, forma hoja,

fruto… Creación Unidad Identificación Varietal Molecular Sub-objetivo GOCITRUS Determinan Si un material vegetal puede registrarse como variedad comercial

CPVO-TP/201/2 (Pomelo-pummelo) CPVO-TP/201/1 (Mandarinas) CPVO-TP/202/1 (Naranjas) CPVO-TP/203/1 (Limas-limones)

(4)

2. Objetivo 1 proyecto GOCITRUS

 Objetivo 1 proyecto GOCITRUS: Generalización sistema identificación apoyado en base de datos Citruseq.

 R3: Secuenciación de variedades no incluidas en la base de datos Citruseq/Citrusgenn.

 > 25% mandarinas comerciales españolas.

 > 10% naranjas comerciales españolas.

 R4 Obtención de marcadores moleculares de nuevas variedades seleccionadas

 Al menos 1 marcador inequívoco de:

 25% variedades de mandarinas

(5)

3. Protocolo de identificación generalizado por GOCITRUS.

ENFOCADO PRINCIPALMENTE A IDENTIFICAR VARIEDADES PROCEDENTES DE MUTACIÓN

• MANDARINAS

Clementinas Híbridos

Satsumas

• NARANJAS

ADMIXTURE, HIBRIDOS MUTACION

Images from López-García, Antonio

2018-Genomics of the origin and evolution of citrus. Nature. 554,311-316.

• LIMONES 291 Variedades Comerciales España https://www.mapa.gob.es/app/regVar/default.aspx https://cpvo.europa.eu/en/applications-and-examinations/cpvo-varieties-database MANDARINO 52% NARANJO 24% LIMONERO 8% POMELO 3% PUMMELO 2% PATRONES_11% > 50% son mutación !!!

(6)

4. Marcador molecular.

❑ Marcador Molecular = Biomarcador Genético = Marcador Genético FRAGMENTO DE ADN LOCALIZADO

❑ ADN

A T C G

El orden de las bases determina el mensaje.

(7)

4. Marcador molecular. USOS.

✓ EL ADN ES EL MISMO EN TODAS LAS CÉLULAS DE CADA SER VIVO

✓ EL ADN NO CAMBIA ENTRE TEJIDOS O EDAD. _AMBIENTE

✓ Cualquier material vegetal: hoja, raíz, pulpa, zumo…

✓ Cualquier especie, variedad…

✓ Cualquier momento de desarrollo de la planta: plántula, adulto

❑ Utilidad de los marcadores moleculares

Plantón Árbol Fruto Hoja

• Selección Asistida por Marcadores (SAM)

(8)

- Distancia genética - Biomarcadores genéticos - AFLPS, RAPDS… - SSR (microsatélites) - Variaciones estructurales - Indels - SNP

• Dos especies remotas

• Híbridos inter e intraespecíficos. • Padre/Hijo

Requiere Secuenciación

POR CRUCE POR MUTACIÓN

• Espontánea

• Inducida

Ejemplo: Clementina Fina y Clemenules

- Distancia genética - Biomarcadores genéticos - AFLPS, RAPIDS… - SSR (microsatélites). - Variaciones estructurales - Indels - SNP

(9)

✓ VARIACIONES ESTRUCTURALES

Original T A A T T C T A C G A T G G T T T T C T T C A C C A A G Delecion 5 pb T A A T T C T A C T T T T C T T C A C C A A G

Insercion 2 pb T A A T T C T A C G A G G T G G T T T T C T T C A C C A Duplicacion 3 pb T A A T T C T A C G A T G G T A C G A T G G T T T T C T

✓ SNP (Single Nucleotide Polymorphism) ✓ INDEL (INserción, DELeción)

Elegante

Elefante

La comida del perro se la comió el abuelo

El perro se comió la comida de la abuela El perro se comió a la abuela

El perro se comió la comida del abuelo

4. Marcadores usados en el protocolo generalizado por GOCITRUS.

Cambia una letra _{Pérdida o ganancia de unas pocas letras.}

Pérdida, Ganancia o reoganizaciones (Inversion, translocación) de

(10)

1. Secuenciar genoma (variedad)

2. Alinear con referencia.

3. Comparar genomas

Base datos: CITRUSEQ-CITRUSGENN ADN Fragmentos pair-end fragmentos

✓ SNPs: .vcf ✓ INDELs: .vcf

✓ VE (Dup/Del), (Trans/Inv): Scripts; .bam, .tdf, LOH…etc

4. Selección, Interpretación y reconstrucción in silico secuencia variedad A.

5. Verificación variantes en bancada por PCR. Diseño oligonucleótidos. Sec Pto.

CATTCTGTAATGTTTATGTGTAGATTCTAGCTCAAAGGGTTTCGCTGTTTGATTATGAGCTTGTTGA GGGAAACCAAGGGAAGAGAAGGTTGATTGCTTTTGGAAAGTTTGCTGGTAGAGCTGCCATAATTGACT TGTTGAAAGGATTAGGCCAGCGTATTGTCACGGGATGAGTGTTTTGCGCAGCTAACCCGTGCGGCACTT AGACAACTTTGCCGAATGTTGCTAAGTAAGCCTAGAGATTCTCGGAATAGAGAAGAGAGCAATTGAGC CAAAGAAGAAACTTGTATTGCACAAAGAGAGATTACAATGCTTGTTGTAGTGTTTGTTGGATACAAA TGCCTAATGCCATCCCATATTTATAGGGGAGGCTTGCCAAGCTCTAGAGATTCTAGAGAATTCTACCAT GTTCCTAGAATTCTAGATATT

6. Verificación con muestras ciegas.

PERMITEN DISCRIMINAR ENTRE Especies Híbridos Mutaciones

SET DE MARCADORES MOLECULARES 4. Protocolo de identificación generalizado por GOCITRUS.

(11)

5. Ejemplo IDENTIFICACIÓN variedades procedentes de mutación

W.Murcott

Arrufatina Nero Clemenules

TANGO

1 Cambio estructural = 1 Marcador de Identificación

Identificación inequívoca

Clon 1 Clon 2 Clon 3

Parental

(12)

Cromosomas clementina

1 2 3 4 5 6 7 8 9 5. Ejemplo Arrufatina y Nero

IDENTIFICACIÓN variedades procedentes de mutación

Parental (Clemenules) Natural (Arrufatina) Inducida (NERO) Cromosoma 3

(13)

Cromosomas clementina

1 2 3 4 5 6 7 8 9 5. Ejemplo Arrufatina y Nero

Parental (Clemenules) Natural (Arrufatina) Inducida (NERO) Cromosoma 3

(14)

5. Ejemplo IDENTIFICACIÓN

variedades procedentes de mutación. CLONES VARIETALES

W.Murcott

Arrufatina Nero Clemenules

TANGO

• > 95% genomas procedentes de mutación tienen variaciones estructurales.

(15)

Cromosoma 1 Cromosoma 6 Cromosoma 2 Cromosoma 7 Cromosoma 3 Cromosoma 8 Cromosoma 4 Cromosoma 9 Cromosoma 5 5. Ejemplo IDENTIFICACIÓN CLONES VARIETALES: CLON 1

BAJADA DE COBERTURA EN CROMOSOMA 6

(16)

• CROMOPLEXIA entre los cromosomas 2 y el cromosoma 3. Scripts SV… CLON 1 PARENTAL Chr2 Chr2 Chr3 3' 5' 5' 5' 3' G F D H 5' C 2'-3 2-2' 3' E 3' 55 40 45 50 3' 30 35 20 25 0 5 10 15 3-2' 5' 5' 5' 5' 50 55 30 35 40 45 0 5 10 15 3' 3' 3' 3' C D E F 20 25 G H 2' 2 3' 3 CLON 1 Pa rental 5. Ejemplo IDENTIFICACIÓN CLONES VARIETALES: CLON 1

ESTRUCTURA UNICA

(17)

Cromosoma 1 Cromosoma 6 Cromosoma 2 Cromosoma 7 Cromosoma 3 Cromosoma 8 Cromosoma 4 Cromosoma 9 Cromosoma 5 6. Ejemplo IDENTIFICACIÓN CLONES VARIETALES: CLON 2

• DELECIÓN EN CROMOSOMA 3

(18)

• Deleción Cromosoma 3 (0,6 Mb) Deleción Cromosoma 8 (3,2 Mb)

6. Ejemplo IDENTIFICACIÓN CLONES VARIETALES: CLON 2

• Translocación recíproca en los cromosomas 9

• Nuevos cromosomas: de 56,2 Mb y 6,4 Mb 3' 5' 5' 5' FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 55 60 F I3' E G 5' 50 10 E F GI 15 20 3' 3' 0 5 25 30 35 40 45 50 55 C LON 2 Par ent al ESTRUCTURAS UNICAS Identificación inequívoca 5' 5' 5' 5' C D 3' 3' 20 0 5 10 25 C D 3' 3' 15 CLON 2 Parental 5' 5' 5' 5' 0 5 10 15 20 B 30 35 25 3' 3' 55 40 A 45 50 A B 3' 3'

(19)

Cromosoma 1 Cromosoma 6 Cromosoma 2 Cromosoma 7 Cromosoma 3 Cromosoma 8 Cromosoma 4 Cromosoma 9 Cromosoma 5 No Variaciones Estructurales DELECION o DUPLICACION 6. Ejemplo IDENTIFICACIÓN CLONES VARIETALES: CLON 3

(20)

6. Ejemplo IDENTIFICACIÓN CLONES VARIETALES: CLON 3 Scripts SV…

• CROMOPLEXIA entre los cromosomas 3, 4 y 5

• Chr 3/4 de 23.7 Mb • Chr 5/3 de 51.8 Mb • Chr 5/4 de 44.4 Mb CLON 3 PARENTAL 5' 5' 3' BBBBBBBBBBBBBBBBBBBB 3' 55 40 B F 45 3' 50 30 E 35 D 20 5' 25 0 5 A C 10 15 4/5 3/5 3/4 5' 5' 5' 3' 55 3' 45 50 E 35 F 40 30 25 3' C D 20 A B 10 15 0 5 4 5 3 ESTRUCTURAS UNICAS Identificación inequívoca

(21)

5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 3' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' B BBBBBBBBBBBBBBBBBBB A D E F C 5' B 3' 3' 3' 3' 55 50 40 45 25 30 35 0 5 10 15 20 9 4' 4-5 5' 3-5 3' 3-4 7 8' 8 9' 6' 7' 6 1' 1 2' 2 3' 3' 3' 3' 3' 3' 3' 3' 3' 3' 3' 3' 3' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 3' 5' FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF 0 30 5' F 3' 3' 2'2 3' D 10 15 20 25 G 45 50 55 1' 1 3' 3' 35 40 5 E I 3 4'4 5' 5 6'6 7'7 8' 8 9'-9 9-9' 3' 3' 3' 3' 3' 3' 3' 3' C 3' 3' 3' 3' 3' A B 5' 5' 3' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 3' 3' 3' D 3' B 3' 3' 3' 3' 3' 3' 3' 5' 3' C 3' E 1 2'-3 2-2' G 3' 3' 8 9' 6' 7' 6 1' F 3' 3-2' 7 A H 8' 15 20 9 4'4 5'5 25 35 0 5 10 30 40 45 50 55

CLON 1 CLON 2 CLON 3

5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 3' 3' 55 3' 3' 45 50 30 3' 3' 35 3' 3' 40 3' 3' 3' 3' 3' 20 3' 3' 25 3' 3' 3' 0 5 10 15 7'7 8'8 9'9 4'4 5'5 6'6 1'1 2'2 3' 3 VARIEDAD 6. Ejemplo IDENTIFICACIÓN CLONES VARIETALES

(22)

6. Ejemplo IDENTIFICACIÓN variedades procedentes de mutación

W.Murcott Arrufatina Nero

Clemenules

TANGO

Parental

(23)

6. Ejemplo TANGO

NO SE APRECIAN CAMBIOS COBERTURA ➔

NO DELECIÓN NI DUPLICACIÓN GRANDES FRAGMENTOS

Cromosoma 1 Cromosoma 6

(24)

Script SV… W .Mu rc ot t Tan go • DELECION cromosoma 2 (6 Mb) +

• INSERCIÓN TANDEM cromosoma 2 homólogo

• INVERSION en cromosoma 4 (3.97 Mb) W .Mur cot t Tan go Par en tal In du ci a 5' 5' 5' 5' D D 3' 3' A A B C B C 45 30 3' 35 40 3' 25 10 B C 15 D 20 0 A A 5 B C D 5' 5' 5' 5' 3' 3' 3' 3' 30 15 20 25 5 10 0 B A A B A B A B ESTRUCTURA UNICA Identificación inequívoca

(25)

5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' A D 3' 3 8 9' 9 4' 4 5' 5 6' 6 10 7' 7 A B A 0 8' 1' 1 2' 2 15 20 3' 5 35 3' 25 3' B C B C D 3' 3' 3' 3' 3' 40 3' 3' 3' 3' 45 50 3' 3' 3' 55 3' A B 30 TANGO W.MURCOTT 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 8 9' 9 4' 4 5' 5 6' 6 5 10 7' 7 3' 3 8' 1' 1 2' 2 3' A D A B C 15 20 3' 3' 3' 3' 25 3' 3' 3' 3' 3' 3' 3' 3' D 40 0 35 45 3' 55 50 3' A B 3' A B B C 30 Usos:

Identificación de variantes estructurales presentes en la variedad de mandarina TANGO

certificación.cyberagropolis.com ➔ _{Certificación Variedad} Protegida Tang-Gold

(26)

6. Coste de OBTENCION y USO de marcadores moleculares

2. Coste de Uso de marcadores moleculares ➔ IDENTIFICACION.

1. COSTE de obtención de marcadores

moleculares.

1. Extraer ADN: 2-6h 2. Realizar PCR: 2-4h

Aproximadamente: - 5-6 meses

- 1500-2000 € reactivos + personal =10 000 €/variedad

Aproximadamente: - 1-2 días

(27)

7. Validez del protocolo

• PREVIO A GOCITRUS

• Analizado más de 50 genomas procedentes de mutación

• > 95% genomas procedentes de mutación tienen variaciones estructurales.

Tipología de variantes estructurales

> 150

Número de variantes estructurales por genoma

0 5 10 15 20 25 30 1 2 3 4 5 6 7 Nu m ero de geno m a s (%)

(28)

8. Antes y Después de GOCITRUS

GOCITRUS. BASE DE DATOS CITUSEQ-CITRUSGENN

Contiene > 350 genomas de cítricos. Ancestrales, réplicas…

• 324 Registros comerciales de cítricos en España (291 variedades + 33 patrones).

• 83 secuenciadas

• 24 en proceso de secuenciación

• 1/3 registro secuenciado a finales de 2020

• 1 marcador inequívoco de variedades procedentes de mutación a mitad de 2021:

• 25% de variedades de mandarinas

• 10% de naranjas dulces.

• Polémicas derivadas de la incertidumbre en la identificación varietal.

• Marcadores existentes ínfimamente eficientes para variedades derivadas

(29)

CONCLUSIONES

- El objetivo 1 del proyecto es la generalización de un protocolo de obtención de marcadores moleculares de tipo variación estructural, indel e SNP validado previamente.

- Protocolo dirigido principalmente a la identificación de variedades procedentes de mutación (> 50% variedades comerciales) dado que los anteriores marcadores empleados no

resultaban eficaces en este grupo.

- Los MM pueden ser empleados en cualquier especie, en cualquier tipo de tejido y en cualquier estado de desarrollo de una planta.

- Trazabilidad (evitar errores):

- Vivero: garantizar identidad del material adquirido por agricultores. - Distribuidores: garantizar identidad material comercializado. MARCA. - Consumidores: garantiza la identidad del producto adquirido.

- A finales de 2020, 1/3 de las variedades comerciales españolas estarán secuenciadas. - A mitad de 2021 25% mandarinas y un 10% naranja dulce tendrá 1 marcador inequívoco.

(30)

¿PREGUNTAS?