1
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
Determinación de la viabilidad de
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus bajo condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro .
TESIS
PARA OBTENER EL GRADO DE:
DOCTORA EN CIENCIAS EN BIOPROCESOS.
PRESENTA:
M. EN C. KARINA CRUZ PACHECO.
México, D.F., a 20 de julio de 2010.
DIRECTOR DE TESIS:
DR. ENRIQUE DURÁN PÁRAMO.
DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS.
UPIBI-IPN
2
3
4
“Me siento satisfecho con el misterio y eternidad de la vida, con el conocimiento de una ínfima parte de la maravillosa estructura del mundo real y con la devota lucha por comprender una fracción, aunque sea mínima, de la Razón que se manifiesta en la naturaleza”.
“Las leyes de la naturaleza manifiestan la existencia de un espíritu superior al hombre, ante el cual, con nuestros modestos poderes debemos ser humildes”.
“Ciencia sin religión es sinónimo de invalidez; religión sin ciencia es ceguera.”
A. Einstein
5
Agradecimientos
Este trabajo de investigación se realizó gracias al apoyo financiero del Programa de Formación de Investigadores (PIFI) SIP-20070160, 20082706, 20091568 y 20101229 del Instituto Politécnico Nacional.
Este trabajo fue realizado en el Laboratorio de Bioconversiones de la Sección de Estudios de Posgrado e Investigación de la Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología (UPIBI) del Instituto Politécnico Nacional.
6
A la comisión revisora de este trabajo:
Dra. Ma. del Carmen Oliver Salvador, Dr. Gustavo Valencia del Toro, Dr. Jorge Yáñez Fernández y Dr. Ramón Villanueva Arce
Gracias a todos por su apoyo, por el tiempo dedicado la revisión de este trabajo, así como todas sus contribuciones para enriquecerlo.
A mi director de tesis, Dr. Enrique Durán Páramo
Gracias por haber dirigido este trabajo de investigación. Gracias por todo el apoyo que me has brindado, por la comprensión y todos tus consejos, los cuales me ayudaron a saltar obstáculos y llegar al final
de esta etapa tan importante para mí.
Gracias por brindarme tu confianza y amistad!!.
A mis padres, Ma.Teresa y J. Guadalupe, y a mi hermano Omar
Gracias a mis padres por su ejemplo, paciencia y cariño que siempre me han brindado.
Gracias a mi familia porque siempre ha estado conmigo.
7
Al Dr. Miguel A. Aguilar Frutis
del Lab. de Pruebas Físicas del CICATA- IPN, gracias por su apoyo para la realización de algunos experimentos.
A mis amigas Verónica Chávez Infante, Mariana Ramírez Mandujano y la maestra
Madga,
por todo el apoyo y ayuda que me brindaron.A mi gran amigo Cesar Estrada Casillas,
porque has estado presente sin importar la distancia y en los momentos difíciles siempre
has tenido las palabras para ayudarme a seguir adelante. Gracias por enseñarme que el
título más importante es la humildad.
A mis amigos que formaron parte importante en esta etapa:
Ma. del Carmen Cruz, Pilar Bremauntz, Leticia Aguilar, Ymazool Meza, Isabel Torres, Yanik Astudillo, Erika Peralta, Ana María, Mariana, C. Mercela , Carlos Tellez, Gil Santomé, Itzamá Y., Oscar M., Héctor
Jiménez y Miguel Espartaco.
A los Dres. Efrén Parada Arias, José Gpe.
Trujillo Ferrara y Heberto Balmori Ramírez,
Gracias por formar parte de esta etapa de mi vida, y por todas sus enseñanzas!!
A mis tíos Ali, Amador, Socorro yEnrique
por su apoyo y confianza y en especial a
Raúl Miranda
por tus lecciones de filosofía que no seolvidan y por ser mi amigo ¡Gracias!.
i INDICE GENERAL
PÁGINA
ÍNDICE DE CAPÍTULOS...
ÍNDICEDECUADROS...
i v
ÍNDICE DE FIGURAS... vii
INDICE DE CAPÍTULOS RESUMEN... 1
SUMMARY... 2
I. INTRODUCCIÓN... 3
II. ANTECEDENTES... 5
2.1. Bacterias ácido lácticas (BAL)... 5
2.1.1. Propiedades fisiológicas y hábitat de las BAL... 6
2.1.2. BAL aplicadas en productos comerciales... 7
2.1.2.1. El yogurt, su valor nutrimental y su importancia en la salud... 8
2.1.3. Efecto de los probióticos en el organismo humano... 10
2.2. Prebióticos... 15
2.3. Aparato digestivo humano y BAL probióticas... 17
2.3.1. Estómago e intestino delgado humano... 17
2.3.2. Colon humano... 20
2.3.3. El intestino humano, la microflora y la adhesión de bacterias probióticas... 21
2.3.3.1. La microflora intestinal... 22
2.3.3.2. Proliferación de las bacterias en el intestino humano... 23
2.3.3.3. La colonización de bacterias en el intestino humano... 24
2.3.3.3.1. Función de la microflora en los mecanismos de defensa del organismo humano... 26
ii 2.3.3.4. Importancia de la barrera mucosa en las defensas del organismo
humano...
PÁGINA
26
2.4. Inmovilización celular... 27
2.4.1. Atrapamiento celular... 27
2.4.1.1. Soportes utilizados en la inmovilización por atrapamiento... 28
2.5. Simulación gastrointestinal in vitro y estudios de viabilidad bacteriana... 30
III. JUSTIFICACIÓN... 32
IV. OBJETIVOS... 33
4.1. Objetivo general... 33
4.2. Objetivos específicos... 33
V. MATERIALES Y MÉTODOS... 34
5.1. Materiales... 34
5.2. Formulaciones del medio MRS y del buffer BPS... 34
5.3. Cepa... 35
5.4. Cultivo... 36
5.5. Técnica de inmovilización celular por atrapamiento... 36
5.6. Determinación de viabilidad celular por conteo en placa... 37
5.7. Sistema de simulación gastrointestinal in vitro... 38
5.8. Pruebas de estabilidad del soporte de inmovilización (libre de células), en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro... 39
5.9. Cinéticas de pérdida de viabilidad bacteriana (modificado de Mainville, 2005; Ganong, 2002 y De Boever et al., 2000)... 39
5.10. Determinación de viscosidad... 41
5.11. Técnica de adhesión de células de Lactobacillus delbrueckii en mucosa de intestino delgado de rata... 41
5.12. Análisis estadístico... 44
VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN... 45
6.1. Desarrollo del sistema de simulación gastrointestinal in vitro... 45
6.2. Pruebas del soporte de inmovilización en condiciones gastrointestinales simuladas in vitro... 47
iii
PÁGINA
6.2.1. Evaluación cualitativa de las esferas de alginato de calcio tratadas en condiciones gastrointestinales simuladas in vitro... 47 6.2.2. Pérdida de volumen (desgaste) de las esferas de alginato de calcio y de
las cápsulas contenidas en la bebida láctea fermentada ―Yoplus‖ (yogur comercial), tratadas en condiciones gastrointestinales in vitro... 47 6.2.3. Pérdida de volumen (desgaste) de las esferas de alginato de calcio
tratadas en condiciones gástricas, e intestinales (intestino delgado y grueso) in vitro... 50 6.2.4. Fuerza de deformación de las esferas de alginato tratadas en
condiciones gastrointestinales simuladas in vitro... 51 6.3. Selección de las muestras de alimento y bebidas, para evaluar su
efecto sobre la viabilidad de Lactobacillus delbrueckii... 52 6.4. Viscosidad de las muestras de alimento... 54 6.5. Células de Lactobacillus delbriueckii inmovilizadas en esferas de
alginato de calcio... 55 6.6. Viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii en condiciones
gastrointestinales simuladas in vitro... 56 6.6.1. Viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres tratadas en
condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y en presencia de muestras de alimento y bebidas... 56 6.6.2. Viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres e inmovilizadas
tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y en presencia de leche con almidón al 8%... 62 6.6.3. Viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres e inmovilizadas
tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y en presencia de muestra de comida típica mexicana... 65 6.6.4. Viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres e inmovilizadas
tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y presencia de muestra de café negro 1%... 68
iv 6.6.5. Viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres e inmovilizadas
tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y
presencia de muestra de cerveza con alcohol 4.5%... 71
6.7. Adhesión de células de Lactobacillus delbrueckii en la mucosa de intestino delgado de rata... 75
6.7.1. Células libres de Lactobacillus delbrueckii adheridas en la mucosa de intestino delgado de rata... 75
6.7.2 Células de Lactobacillus delbrueckii liberadas de las esferas de alginato de calcio y adheridas en la mucosa de intestino delgado de rata 77 VII. CONCLUSIONES... 80
VIII. PERSPECTIVAS... 81
IX. PRODUCTOS DE INVESTIGACIÓN... 82
X. REFERENCIAS... 83
XI. ANEXO (ARTÍCULO CIENTÍFICO)... 102
v ÍNDICE DE CUADROS
PÁGINA
1. Cepas de Lactobacillus usadas en yogurt o alimentos tipo yogurt... 8
2 Microorganismos considerados como probióticos... 11
3. Efecto benéfico de bacterias y levaduras probióticas... 13
4. Compuestos prebióticos y simbióticos... 16
5. Medio MRS líquido... 34
6. Buffer BPS... 35
7. Evaluación cualitativa de la dureza de las esferas de alginato de calcio después del tratamiento en condiciones gastrointestinales in vitro... 47
8. Fuerza de deformación de las esferas de alginato de calcio, tratadas con jugos gástricos e intestinales in vitro, almacenadas en solución de cloruro de calcio 0.3 M y en solución salina 0.9% a 8ºC... 52
9. Viscosidad de la solución de almidón, leche con almidón y comida típica a 100 rpm y 23ºC... 54
10. Viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres tratadas en condiciones gastrointestinales simuladas in vitro y en presencia de muestras de alimento y bebidas... 60
11. Velocidades de pérdida de viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres bajo condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y en presencia de alimento y bebidas... 61
12. Viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres e inmovilizadas tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y en presencia de leche con almidón... 63
13. Velocidades de pérdida de viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres e inmovilizadas, tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y en presencia de leche con almidón... 64
vi
PÁGINA
14. Viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres e inmovilizadas tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y en presencia de comida típica... 66 15. Velocidades de pérdida de viabilidad de células de Lactobacillus
delbrueckii libres e inmovilizadas tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y en presencia de comida típica... 67 16. Viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres e inmovilizadas
tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y en presencia de café negro 1%... 69 17. Velocidades de pérdida de viabilidad de células de Lactobacillus
delbrueckii libres e inmovilizadas tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y en presencia de café negro 1%... 70 18. Viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres e inmovilizadas
tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y en presencia de cerveza con alcohol 4.5%... 72 19. Disminución de células libres de Lactobacillus delbrueckii durante la
cinética de adhesión en la mucosa de intestino delgado de rata... 76 20. Células de Lactobacillus delbrueckii inmovilizadas en alginato de calcio y
células liberadas del alginato de calcio al medio MRS con intestino delgado de rata... 78
vii ÍNDICE DE FIGURAS
PÁGINA
1. Intestino delgado y grueso humano... 18
2. Esquema de las capas de tejido del intestino humano... 19
3. Esquema de las defensas del intestino humano. Fuente: Bourlioux et al., 2003... 22
4. Estructuras simplificadas de glicoconjugados. GlcNAc, N- acetilglucosamina; NeuNAc, ácido N-acetilneuraminico. Fuente: Bourlioux et al., 2003... 25
5. Estructura del alginato de sodio. Fuente: Nussinovitch, 1997... 28
6. Modelo de ―egg-box‖ de la formación del gel de alginato. Fuente: Nussinovitch, 1997... 29
7. a) Colonias de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus crecidas en agar MRS. b) Tinción Gram de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus... 35
8. Cultivos de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus en incubación... 36
9. Equipo para inmovilizar por atrapamiento... 37
10. Esquema de la técnica de determinación de viabilidad por conteo en placa... 37
11. Esquema del sistema de simulación gastrointestinal humano in vitro... 38
12. Diagrama de bloques de las etapas del estómago e intestino delgado humano simuladas in vitro... 38
13. Disección de rata hembra, cepa Wistar... 42
14. Corte longitudinal del intestino delgado de rata... 42
15. Intestino delgado de rata colocado en caja Petri con buffer BPS... 43
16. Cultivo de células de Lactobacillus delbrueckii en intestino delgado de rata... 43
17. a) Biorreactor de vidrio con tapa desmontable y seguros tipo brida de acero inoxidable. b) Tapa desmontable del biorreactor... 46
viii
PÁGINA
18. a) Baño con control de temperatura; b) Parrilla de agitación magnética;
c) Potenciómetro c/electrodo de pH... 46 19. Sistema de simulación gastrointestinal in vitro... 46 20. Pérdida de volumen de las esferas de alginato de calcio en condiciones
gastrointestinales simuladas in vitro... 48 21. Estabilidad de las cápsulas de gel del producto comercial Yoplus en
condiciones gastrointestinales simuladas in vitro... 49
22. Pérdida de volumen de las esferas de alginato de calcio en condiciones gástricas y de intestino delgado y grueso simuladas in vitro... 50
23. Consumo de yogurt en la población estudiantil de la UPIBI... 53
24. Imágenes de esferas de alginato de calcio sin tratamiento, tomadas con microscopio estereoscopico... 55
25. a)Sección de esfera de alginato de calcio. b) y c) Lactobacillus delbrueckii inmerso en el alginato de calcio... 55 26. Viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres tratadas en
condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y en presencia de muestras de alimento y bebidas... 59 27. Viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres e inmovilizadas
tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y en presencia de leche con almidón... 63 28. Viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres e inmovilizadas
tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y en presencia de comida típica... 66 29. Viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres e inmovilizadas
tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y en presencia de café negro 1%... 69
ix
PÁGINA
30. Viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres e inmovilizadas tratadas en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro y en presencia de cerveza con alcohol 4.5%... 72 31. Disminución de células libres de Lactobacillus delbrueckii durante la
cinética de adhesión en la mucosa de intestino delgado de rata... 76 32. a) Sección de intestino delgado de rata con células de Lactobacillus
delbrueckii adheridas en la mucosa. b) Colonias de Lactobacillus delbrueckii recuperadas de la mucosa de rata y crecidas en agar MRS. c) Células de Lactobacillus delbrueckii adheridas a la mucosa intestinal de rata... 77 33. Células de Lactobacillus delbrueckii inmovilizadas y liberadas al medio
MRS... 78 34. Colonias de Lactobacillus delbrueckii recuperadas de la mucosa de rata
y crecidas en agar MRS... 78
1 RESUMEN
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus es una bacteria ácido láctica probiótica utilizada en la elaboración de productos lácteos como el yogurt. El pH ácido en el estómago y la bilis hepática en el duodeno humano, son factores del sistema digestivo humano que resultan agresivos para la viabilidad de las bacterias probióticas.
Con el propósito de evaluar el efecto de las condiciones gastrointestinales sobre la viabilidad de Lactobacillus delbrueckii, se diseñó un sistema de simulación gastrointestinal in vitro, el cual consistió de dos reactores en donde se simularon las condiciones del estómago (jugo gástrico simulado a pH 2) e intestino delgado humano (jugo pancreático simulado y bilis a pH 6.8). Con la finalidad de proteger a las células de Lactobacillus delbrueckii de las condiciones gastrointestinales simuladas in vitro y mantener su viabilidad, se utilizó la técnica de inmovilización celular por atrapamiento en alginato de sodio al 2%. Además, se evaluó el efecto de algunas muestras de alimento y bebidas sobre la viabilidad bacteriana.
Las células inmovilizadas de Lactobacillus delbrueckii tratadas en condiciones gastrointestinales in vitro con adición de una muestra de leche de vaca con almidón al 8%, mantuvieron su viabilidad 24 veces más que las células libres. Las células libres e inmovilizadas de Lactobacillus delbrueckii tratadas en condiciones gastrointestinales in vitro con adición de una muestra de comida típica mexicana no presentaron diferencias significativas de viabilidad (p>0.05). La viabilidad de las células libres e inmovilizadas de Lactobacillus delbrueckii tratadas en condiciones gastrointestinales in vitro, con adición de una muestra de café negro 1% no presentó diferencia estadística significativa (p>0.05). La adición de una muestra de cerveza contenido alcohol al 4.5%, ocasionó la pérdida total de las células libres e inmovilizadas de Lactobacillus delbrueckii tratadas en condiciones gástricas in vitro.
De acuerdo con los resultados obtenidos, la adición de una muestra de comida típica mexicana contribuyó en el mantenimiento de la viabilidad de Lactobacillus delbrueckii, por el contrario una muestra de bebida con alcohol 4.5% ocasionó la pérdida de viabilidad bacteriana. En este trabajo se desarrollo una técnica para determinar la adhesión de células de Lactobacillus delbrueckii en mucosa de intestino de rata, lográndose la adhesión de células libres y células liberadas del soporte de inmovilización en la mucosa.
Se demostró que las células liberadas del soporte conservaron su capacidad de adhesión a la mucosa y por ende podrían realizar su efecto probiótico.
2 SUMMARY
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus is a probiotic acid lactic bacterium used in the production of functional foods like the yogurt. However, the human gastrointestinal tract has some aggressive conditions such as the acid medium in the stomach and the bile in the duodenum, that can affect the Lactobacillus delbrueckii´s viability.
An in vitro gastrointestinal system was designed to evaluate the bacterial viability under in vitro gastrointestinal conditions. The human stomach conditions (gastric juice, pH 2) and small intestine conditions (pancreatic juice, pH 6.8) were simulated using two biorreactors.
In order to protect the Lactobacillus delbrueckii cells from the simulated gastrointestinal juices a cellular immobilization technique by entrapment in 2% sodium alginate solution was applied. In addition, the effect of meal and beverage samples on the viability of this bacterium was evaluated.
Immobilized Lactobacillus delbrueckii cells in sodium alginate preserved their viability 24 times more than free cells, both treated in gastrointestinal conditions in vitro with a cow milk with 8% starch. Free and immobilized Lactobacillus delbrueckii cells treated in gastrointestinal conditions in vitro with a Mexican typical food sample did not display significant differences of viability (p>0.05).
Immobilized and free Lactobacillus delbrueckii cells lost their viability during the treatment in gastric conditions in vitro with beer.
Free and immobilized Lactobacillus delbrueckii cells treated in gastrointestinal conditions in vitro with a 1% black coffee sample did not display significant differences of viability (p>0.05).
The results showed that the Lactobacillus delbrueckii´s viability was significantly preserved when a meal sample was added into the system, on the other hand, the addition of an alcoholic beverage sample provoked the loss of viability.
Finally, an adhesion technique was developed to determine the level of Lactobacillus delbrueckii cells adhesion in mucus (of rat small intestine). Free cells and released cells from immobilization support got adhered at the mucus. It was demonstrated that released cells from support remained their adhesion capacity at mucus and they could exert their probiotic effect.
3 I. INTRODUCCIÓN
Las bacterias probióticas son de gran importancia para el hombre debido a su efecto benéfico en la salud humana, el cual se relaciona con la disminución de la intolerancia a la lactosa (Isolauri, 2004) y la estimulación del sistema inmune (Aattouri et al., 2001) por citar dos ejemplos. Los géneros más representativos de bacterias lácticas probióticas son los lactobacilos y las bifidobacterias, estas ejercen su efecto protector o terapéutico mediante la secreción de compuestos antimicrobianos como lactocinas, helveticinas, lactacinas, nisina, bifidocinas, por mencionar algunos (Dodd y Gasson, 1994; Gibson, 1999; Gibson y Wang, 1994; Isolauri, 2004) y la competencia por los sitios que ocupan los patógenos en el intestino (Gibson, 1999; Isolauri, 2004; Kailasapathy y Chin, 2000), además se ha encontrado que participan en el metabolismo del colesterol (Isolauri, 2004).
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus es una bacteria láctica probiótica de gran importancia para la industria de lácteos, ya que interviene en el proceso de elaboración del yogurt, además de proporcionarle ciertas propiedades organolépticas (sabor y aroma).
Las bacterias lácticas probióticas, se han adicionado en algunos productos lácteos (yogur y bebidas fermentadas) con la finalidad de contribuir en el tratamiento de problemas gastrointestinales humanos. Sin embargo, hay estudios que demuestran que estos microorganismos pueden perder su viabilidad antes de llegar a su sitio de acción, el colon humano. Tal pérdida de viabilidad puede ocurrir durante la etapa de almacenamiento del producto (Nighswonger et al., 1996; Kailasapathy y Rybka, 1997; Ouwehand y Salminen, 1998) e incluso durante su paso por el tracto gastrointestinal humano. Factores como el jugo gástrico y la bilis hepática presentes en el estómago y duodeno humano respectivamente, pueden ocasionar la pérdida de viabilidad de estas bacterias, autores como Pochart et al., (1992), mencionan que durante su tránsito por el intestino delgado, las bacterias lácticas pueden perder su viabilidad debido al movimiento peristáltico presente en este sitio.
Como una manera de proteger a las bacterias lácticas del efecto nocivo de la bilis hepática y del pH muy ácido debido a la presencia de jugo gástrico en el estómago humano, puede aplicarse la técnica de inmovilización celular por atrapamiento (Cruz, 2007). De esta manera, las bacterias lácticas contenidas en una matriz de soporte orgánico como alginato de sodio, al ser tratadas bajo condiciones gastrointestinales simuladas in vitro pueden resistir de manera más exitosa el efecto nocivo de la bilis y del
4 ácido clorhídrico, lo que puede verse reflejado en un incremento de la viabilidad bacteriana.
Dada la importancia de las bacterias lácticas probióticas para el organismo humano y el efecto de las variadas condiciones fisicoquímicas que presenta el tracto gastrointestinal humano sobre la viabilidad de las bacterias lácticas probióticas, en este proyecto se evaluó la viabilidad de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus libre e inmovilizado en alginato de sodio tratado bajo condiciones gastrointestinales simuladas in vitro. Para tal fin, se diseñó un sistema de simulación gastrointestinal in vitro. Además, se evaluó el efecto de la presencia de algunas muestras de alimento similar al que consume la población mexicana, sobre la viabilidad de las células libres e inmovilizadas.
5 II. ANTECEDENTES
2.1. Bacterias ácido lácticas (BAL)
En 1892, Döderlein propusó la existencia de una asociación benéfica de microorganismos (bacterias lácticas) alojados en el organismo humano específicamente en la vagina, los cuales podían prevenir o inhibir el crecimiento de bacterias patógenas por medio del ácido láctico que producían a partir de azúcares. Más tarde en 1989, Fuller llamo probióticos a los suplementos alimenticios microbianos vivos que afectan benéficamente al huésped mejorando su balance microbiano intestinal. En 1908, Élie Metchnikoff mencionó que la longevidad de la población caucásica se debía al consumo frecuente de leches fermentadas. Además, propusó que ―los microorganismos productores de ácido en los productos lácteos fermentados eran capaces de prevenir enfermedades del intestino grueso y con ello prolongar la vida del consumidor‖, por tales motivos es considerado el padre de los probióticos.
El término probiótico significa ―para vivir‖, es una palabra de origen griego. En 1965, Lilly y Stillwell fueron los primeros en utilizar este concepto, definieron a los probióticos como
―sustancias secretadas por un microorganismo el cual estímula el crecimiento de otro, es decir, “...microorganismos que promueven el crecimiento de otros microorganismos”.
Parker en 1974, fue el primero en utilizar el concepto de probiótico como hoy se conoce y los define así: ‖organismos o sustancias que contribuyen en el balance microbiano intestinal‖. Más tarde en 1989, Fuller hace una modificación al concepto de probióticos de Parker y define a los probióticos como ―un suplemento alimenticio microbiano que afecta benéficamente al huésped mejorando su balance microbiano intestinal‖. En esta definición introduce el requerimiento de viabilidad y el efecto benéfico en el huésped.
En 1992, Havenaar y Huis in´t Veld ampliaron la definición de probióticos introduciendo el hábitat especificando el huésped, por lo que los probióticos son definidos como: ―un cultivo o mezcla de cultivos de microorganismos que aplicados en animales o humanos, lo afectan benéficamente mejorando su flora nativa‖. Salminen y Schaafsma en 1996, hicieron algunas adaptaciones al término probióticos, sin embargo se han hecho algunas revisiones al respecto ya que no quedaron bien definidos términos como ― la nutrición del huésped‖, introducido por Salminen.
De acuerdo con las revisiones hechas por Schrezenmeir y Vrese en 2001, la definición más completa de probióticos es aquella que los define como ―una preparación o un producto conteniendo microorganismo definidos y viables en número suficiente, los cuales
6 alteran la microflora (por implantación o colonización) en un compartimiento del huésped y ejercen efectos benéficos en el huésped‖, dada por Havenaar y Huis In´t Veld en 1992.
2.1.1. Propiedades fisiológicas y hábitat de las BAL
Las bacterias lácticas son gram positivas, no esporulan y reaccionan negativamente a la prueba de la catalasa. No tienen citocromos y viven en ambientes anaeróbicos aunque algunas de ellas pueden crecer en presencia de oxígeno, son ácido-tolerantes esto les permite eliminar la competencia de la mayoría de las otras bacterias en ambientes que son ricos en nutrientes, y seguir creciendo durante las fermentaciones lácticas naturales con valores de pH inferiores a 5, son estrictamente fermentativos (Stanier, 1996; Holzapfel et al., 2001)
Orla-Jensen en 1919, subdividió las bacterias lácticas en los géneros Betabacterium, Thermobacterium, Streptobacterium, Streptococcus, Betacoccus, Tetracoccus y Microbacterium. Actualmente, todos los microorganismos probióticos utilizados en alimentos probióticos o suplementos alimenticios pertenecen a los géneros Lactobacillus, Enterococcus o Bifidobacterium. Con excepción de Streptococcus thermophillus, el género Streptococcus esta formado por microorganismos patógenos.
El hábitat de estas bacterias se encuentra en ambientes ricos en nutrientes como los alimentos, también pueden encontrarse en la tierra, agua, abono, agua residual y ensilaje.
Particularmente, las bacterias lácticas habitan la cavidad oral, el tracto intestinal y la vagina y pueden tener efectos benéficos en estos ambientes (Holzapfel et al., 2001).
Las bacterias lácticas presentan requerimientos nutricionales complejos, necesitan vitaminas del grupo B, así como un número considerable de aminoácidos, bases púricas y pirimidínicas. Las bacterias lácticas emplean azúcares como la glucosa y la lactosa para producir ácido láctico mediante fermentación. Los géneros más representativos de las bacterias lácticas son Lactobacillus, Streptococcus, Bifidobacterium y Leuconostoc.
7 2.1.2. BAL aplicadas en productos comerciales
En la elaboración de productos lácteos fermentados se utilizan lactobacilos principalmente (Cuadro 1); sin embargo, se han encontrado cepas de enterococos, pediococos y leuconostoc en el queso (Cogan et al., 2007). Beresford y Williams (2004), identificaron en más de 50 variedades de queso lactobacilos homofermentativos facultativos (LHF) como L. casei, L. plantarum, L. curvatus y en menor grado lactobacilos heterofermentativos como L. brevis. Este tipo de bacterias requieren de aminoácidos para su crecimiento, por lo cual para poder crecer en leche es indispensable que puedan hidrolizar la caseína.
La importancia industrial de las BAL radica en que contribuyen en una gran variedad de reacciones bioquímicas que proporcionan las características organolépticas de los productos lácteos como quesos, leches ácidas y yogures. Por ejemplo, son responsables de convertir el L-lactato a D-lactato durante la maduración del queso, teniendo como resultado la precipitación del Ca D-lactato en concentraciones elevadas de D-lactato. El succinato es un potenciador de sabor del queso Emmental y se encuentra en concentración de 0.8 a 1.4 mg/g. Lactobacillus y pediococcus son capaces de producir acetato y CO2 de lactato en presencia de O2 durante la maduración del queso Cheddar (Cogan et al., 2007). En quesos tradicionales del Mediterráneo se han identificado Enterococcus faecalis, E. faecium y E. casseliflavus (aproximadamente 107 UFC/g), los cuales tienen gran influencia en el sabor y aroma (Franz et al., 1999).
Los productos lácteos fermentados como el yogurt conteniendo bacterias lácticas han sido comercializados desde 1970 en Estados Unidos. La primera generación de estos productos fue elaborada con concentrados de Lactobacillus acidophilus, posteriormente, fueron adicionadas bifidobacterias. El éxito de estos productos radica en su efecto benéfico en la salud del consumidor, el cual se atribuye a las bacterias probióticas que contienen (Sanders et al., 1996).
Es importante que las bacterias lácticas probióticas utilizadas en la elaboración de los productos lácteos fermentados no tengan efectos adversos en el sabor y aroma del producto final, deben de sobrevivir en número suficiente y se bebe garantizar su estabilidad física y genética durante el almacenamiento del producto. Como se mencionó anteriormente, Lactobacillus acidophilus es utilizado para elaborar leche ácida y dulce. En la elaboración del yogurt clásico se utilizan Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, sin embargo, el yogurt también puede ser elaborado empleando algunas especies de lactobacilos como Lactobacillus acidophilus. Otro producto lácteo fermentado de gran importancia es el kefir, el cual es elaborado con
8 especies de bacterias lácticas aisladas de la flora nativa como Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei y Lactobacillus reuteri (Heller, 2001).
En países como Brasil se elaboran las bebidas lácticas fermentadas, son productos lácteos preparados con una mezcla de yogurt, suero de leche, pulpa o jugo de fruta y algunos otros aditivos (Penna et al., 2001) sin embargo, el proceso aún no está bien caracterizado.
Cuadro 1. Cepas de Lactobacillus usadas en yogurt o alimentos tipo yogurt.
Cepa probiótica1 Tipo de producto Identificación de especie2
L. acidophilus LA-1 Yogurt L. johnsonii
L. acidophilus LA-7 Yogurt L. acidophilus
L. acidophilus L1 Yogurt para beber L. crispatus
L. acidophilus LA-H3 Yogurt dietético L. acidophilus
L. acidophilus Yogurt L. crispatus
L. acidophilus Yogurt L. acidophilus
L. casei Actimel Yogurt para beber L. paracasei
L. casei Shirota Bebida probiótica L. paracasei
L. casei GG Yogurt para beber L. rhamnosus
L. casei LC-H2 Yogurt dietético L. casei
L. casei Yogurt L. paracasei
L. casei Yogurt L. paracasei
Fuente: Holzapfel et al., 2001.
1cepa indicada por el industrial.
2cepa identificada por análisis de su DNA.
2.1.2.1. El yogurt, su valor nutrimental y su importancia en la salud
El yogurt es uno de los alimentos más conocidos que contienen probióticos, de acuerdo con el Codex Alimentarius el yogur es un producto lácteo coagulado resultante de la fermentación de la leche, llevada a cabo por las bacterias Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Bourlioux y Pochart, 1988). Recientemente, L.
acidophilus, L. casei, L. crispatus, L. rhamnosus, L. gasseri, L. reuteri, L. johnsonii, Bifidobacterium spp., B. bifidum, B. longum y B. infantis han sido adicionadas al yogurt.
Con la finalidad de incrementar el número de BAL que sobreviven al bajo pH del estómago humano, algunas han sido aisladas de la flora intestinal para utilizarlas en la producción de yogurt. Es requisito indispensable que al término de su elaboración el
9 producto tenga una concentración de BAL >108 UFC/mL (Chandan y Shahani, 1993;
Oliveira, 2002) y deben permanecer viables al término de la fecha de caducidad.
La composición nutrimental del yogurt esta basada en la leche a partir de la cual se elaboró y ésta a su vez depende de varios factores: genética de los mamíferos, alimentación, etapa de lactación, edad y factores ambientales como las estaciones del año. Posteriormente, algunas condiciones del tratamiento de la leche que pueden afectar el valor nutrimental del yogurt son: la temperatura, la presión y las condiciones de almacenamiento. Una característica distintiva y final de las propiedades organolépticas del yogurt es debida a los cambios que ocurren durante la fermentación realizada por las BAL utilizadas (Adolfsson et al., 2004).
En general los productos lácteos han sido considerados una excelente fuente de proteínas de alta calidad, calcio, potasio, fósforo, magnesio, zinc y vitaminas como riboflavina, niacina, B6 y B12 (Buttriss, 1997). Durante el proceso de elaboración del yogurt, ocurre una gran pérdida de vitaminas más que de minerales, esto se debe principalmente a que éstas son muy sensibles a factores como la pasteurización, la ultrafiltración, agitación y las condiciones de oxidación. Las BAL pueden influir en el contenido de vitaminas del yogur, ya que requieren vitaminas del grupo B como la B12 (Reddy et al., 1976; Shahani y Chandan, 1979) para su crecimiento, pero algunas cepas son capaces de sintetizar esta vitamina (Kneifel y Mayer, 1991).
La lactosa es el disacárido más importante que se encuentra en los productos lácteos, antes de su absorción en el intestino es hidrolizada por la enzima -galactosidasa (lactasa) en glucosa y galactosa, estos monosacáridos son absorbidos y utilizados como fuente de energía. El contenido de lactosa en el yogurt antes de la fermentación es aproximadamente 6% (Chandan y Shahani, 1993), Lactobacillus delbrueckii y Streptococcus thermophilus son capaces de hidrolizar del 20 al 30% del contenido de lactosa (Bourlioux y Pochart, 1988) posteriormente, una parte es absorbida en forma de glucosa y galactosa y el resto de la glucosa se convierte en ácido láctico. El producto final tiene un bajo contenido de lactosa, lo cual explica porque este tipo de alimento es tolerado por personas que padecen intolerancia a la lactosa.
El yogurt tiene un contenido de proteína alto comparado con la leche, debido a la adición de leche descremada y la concentración del producto al final del proceso. Algunos autores (Rasic y Kurmann, 1978; Shahani y Chandan, 1979) mencionan que la proteína del yogurt es digerida más fácilmente respecto a la proteína de la leche porque esta predigerida por las bacterias. Esto lo confirma la evidencia de un alto contenido de aminoácidos libres
10 principalmente prolina y glicina en el yogurt. Por otra parte, la actividad de enzimas proteasas y peptidasas es preservada durante el tiempo de vida del producto, lo que implica que durante el tiempo de almacenamiento en refrigeración continúan incrementando la concentración de aminoácidos en el producto. Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus durante la fermentación de la leche y almacenamiento del yogurt en refrigeración conserva su actividad proteolítica en comparación con S. thermophillus (Beshkova et al., 1998). Las proteínas del suero y caseínas presentes en el yogurt son de alta calidad biológica, además son ricas en aminoácidos esenciales (Gaudichon et al., 1994). El yogurt tiene una alta concentración de ácido linoleico conjugado, Whigham et al., (2000), reportaron que este ácido tiene propiedades inmunoestimulatorias y anticarcinogénicas. El yogurt es una fuente de calcio y fósforo, debido a que su pH es más bajo que el de la leche, los minerales calcio y magnesio están disponibles en sus formas iónicas, lo cual facilita la absorción de los iones en el intestino (Bronner y Pansu, 1999). Schaafsma et al., (1998) y Kaup et al., (1987), investigaron el efecto de los productos lácteos en la absorción mineral en ratones, reportaron que la lactosa mejora la absorción de calcio, magnesio y zinc y que los ratones alimentados con yogurt mostraron mayor mineralización en huesos en comparación con ratones alimentados con una dieta que contenía solamente carbonato de calcio.
2.1.3. Efecto de los probióticos en el organismo humano
La incidencia de enfermedades en la población que habita en las grandes ciudades ha ido en aumento, debido a factores como el ritmo de vida acelerado, el estrés, una dieta desequilibrada, la administración frecuente de antibióticos o la presencia de agentes infecciosos tales como E. coli, Salmonella enteritidis y virus (Silva et al., 1999); entre las enfermedades más comunes destacan las infecciones del tracto gastrointestinal, el estreñimiento, síndrome de colon irritable, colitis, alergias causadas por alimentos, diarrea ocasionada por ciertos antibióticos, enfermedades cardiovasculares y algunos tipos de cáncer como el de colon. Estos desordenes se han tratado de remediar suministrando antibióticos, incluso se han empleado agentes vivos denominados bioterapéuticos como la levadura Saccharomyces sp. y bacterias probióticas como Lactobacillus sp. (Oyetayo et al., 2003).
Actualmente, se sabe que los principales microorganismos que tienen efecto probiótico son los lactobacilos y las bifidobacterias, además, se han incluido especies que
11 pertenecen a los géneros Lactococcus, Enterococcus, Saccharomyces (Salminen and von Wright, 1998; Dunne et al., 1999), Propionibacterium (Grant and Salminen, 1998) y Streptococcus thermophillus (Naidu et al., 1999; Sreekumar and Hosono, 2000) (Cuadro 2).
Cuadro 2. Microorganismos considerados como probióticos.
Especie Lactobacillus
Especie
Bifidobacterium
Otras bacterias ácido lácticas No son bacterias ácido lácticas
L. acidophilus B. adolescentis Enterococcus faecalis Bacillus cereus var. toyoi1,2 L. amylovorus B. animalis Enterococcus faecium Escherichia coli strain nissle L. casei B. bifidum Lactococcus lactis3 Propionibacterium
freudenreichii1,2
L. crispatus B. breve Leuconstoc mesenteroides Saccharomyces cerevisiae2 Saccharomyces boulardii2
L. gallinarum1 B. infantis Pediococcus acidilactici3 L. gasseri
L. johnsonii L. paracasei
B. longum Sporolactobacillus inulinus1
L. plantarum B. lactis4 Streptococcus thermophilus3 L. reuteri B. thermophilum Streptococcus salivarius
subsp. thermophilus Lactococcus lactis subsp.
Cremoris L. rhamnosus
L. delbrueckii subsp. bulgaricus3 L. brevis
L. cellobiosus L. curvatus L. casei subsp.
rhamosus L. helveticus L. paracasei subsp. paracasei L. fermentum
Fuente: modificado de Holzapfel et al., 2001.
1 Aplicados en animales.
2 Aplicados principalmente en preparaciones farmacéuticas.
3 Se conoce poco acerca de sus propiedades probióticas o el microorganismo es no probiótico.
4 Probablemente es sinónimo con B. animalis.
La viabilidad de los probióticos puede ser considerada como una medida de su actividad probiótica, sin embargo, hay eventos en los cuales la viabilidad celular no se requiere para
12 llevar a cabo algunas funciones de actividad probiótica, tales como mejorar la digestión de la lactosa, modular el sistema inmune y cierto efecto contra hipertensión. En este sentido, los efectos positivos de las BAL probióticas en la salud humana han sido ligados a células no viables o componentes celulares, productos de actividad enzimática o fermentación (Sanders and in´t Veld, 1999).
Para que un microorganismo sea considerado probiótico debe cumplir ciertas características como las siguientes (Sanders y Klaenhammer, 2001; Colum et al., 2001):
Ser de origen humano,
Ejercer su efecto benéfico en el huésped, No ser patógeno,
No ser tóxico,
Sobrevivir y metabolizar en el intestino humano,
Permanecer viable durante el almacenamiento en refrigeración, Proporcionar propiedades sensoriales a los productos fermentados, Tener capacidad de adherirse en el epitelio intestinal, y
Producir sustancias antimicrobianas.
Algunos de los efectos benéficos de los probióticos en el organismo humano son:
Reducir la severidad y duración de diarrea (Saavedra et al., 1994; Ribeiro y Vanderhoof, 1998; Vanderhoof, 2001.),
Reducir la intolerancia a la lactosa (Isolauri, 2004; Jiang et al., 1996), Disminuir la concentración de colesterol en sangre (Isolauri, 2004),
Proteger contra microorganismos patógenos (Casas y Dobrogosz, 2000;
Isolauri, 2004),
Remediar el estreñimiento (Isolauri, 2004; Walker y Duffy, 1998),
Estimular el sistema inmune (Goldin y Gorbach, 1980; Majamaa et al., 1995;
Kimura et al., 1997; Aattouri et al., 2001; Christensen et al., 2002; Isolauri, 2004).
13 En el Cuadro 3, se presentan algunos microorganismos probióticos y levaduras con efectos probados clínicamente.
Cuadro 3. Efecto benéfico de bacterias y levaduras probióticas.
Cepa Efecto reportado en estudios clínicos Referencia Lactobacillus acidophilus LC1 Mejora el sistema inmune, se adhiere a
células intestinales humanas y ayuda en el equilibrio de la microflora intestinal.
Bernet et al., 1994.
L. acidophilus NCFO1748 Disminuye la presencia de enzimas fecales, previene la diarrea causada por radioterapia, usado en tratamiento de estreñimiento.
Salminen et al., 1993;
Lidbeck et al., 1992.
Lactobacillus rhamnosus GG Trata y previene el rotavirus de diarrea, previene la diarrea aguda, efecto antagónico contra bacterias cancerigenas.
Salminen et al., 1993;
Raza et al., 1995;
Kaila et al., 1992.
Lactobacillus casei Shirota Previene problemas intestinales, reduce enzimas fecales, inhibe el cáncer de vejiga, contribuye en el balance de la microflora intestinal.
Aso y Akazan, 1992;
Spanhaak et al., 1998.
Lactobacillus gasseri Reduce enzimas fecales, sobrevive en el tracto digestivos,
Pedrosa et al., 1995.
Bifidobacterium bifidum Tratamiento del rotavirus de diarrea, contribuye en el balance de la microflora intestinal, auxiliar en el tratamiento de diarrea viral.
Marteau et al., 1990.
Saccharomyces boulardii Previene diarrea ocasionada por C.
difficile.
Castex et al., 1990.
Fuente: Modificado de Dunne et al., 2001.
Intolerancia y mala digestión de la lactosa. En el borde en cepillo en el intestino hay 2 enzimas disacaridasas: la lactasa, que hidroliza a la lactosa y la trehalasa que hidroliza la trehalosa en 2 moléculas de glucosa. La insuficiencia de una o más de las oligosacaridasas en el borde en cepillo (en el intestino) puede producir diarrea, distensión y flatulencia después de la ingestión de azúcar. La diarrea es ocasionada por el incremento en la cantidad de moléculas oligosacáridas osmóticamente activas, que permanecen en el lumen intestinal y generan incremento del volumen del contenido intestinal. Cuando hay bajas concentraciones de lactasa se origina intolerancia a la leche, conocida como intolerancia a la lactosa. Según Adolfsson et al., (2004), más de la mitad de los adultos en el mundo sufren de este padecimiento. La mala digestión de la lactosa es otro padecimiento, en el cual la lactosa permanece en el lumen intestinal y llega al colon en donde es fermentada por la flora colónica. Los bioproductos de esta fermentación son ácidos de cadena corta (lactato, butirato, acetato y propionato), además metano, hidrogeno y dióxido de carbono. Estos ácidos se asocian con los electrolitos y
14 conducen a una carga osmótica que puede ocasionar diarrea. La mala digestión de la lactosa ocasiona inflamación, dolor abdominal, diarrea y flatulencia después de la ingesta de leche. Sin embargo, muchas personas pueden ser intolerantes a la lactosa pero soportan pequeñas cantidades (2-10 g) de lactosa en el alimento (Vesa et al., 2000).
Diarrea. A principios del siglo XX, se pensaba que las bacterias utilizadas para hacer yogurt tenían beneficios en la prevención y tratamiento de la diarrea (Metchnikoff, 1901).
González et al., (1995) utilizó una combinación de lactobacilos y bifidobacterias como bacterioterapia para contrarrestar diarrea infantil causada por E. coli, salmonella y shigella. Bifidobacterias y lactobacilos en forma individual y en combinación han sido adicionados en alimentos para infantes, obteniendose buenos resultados (Bennet et al., 1992; Langhendries et al., 1995). Estudios realizados por Van Neil et al., en 2002, demostraron que el uso de cepas de Lactobacillus es una alternativa efectiva y segura en el tratamiento de infecciones agudas y diarrea en niños, ya que pueden reducir la frecuencia y la duración. Tojo y colaboradores en 1987 observaron que Bifidobacterium breve tiene efecto positivo contra campylobacter en infantes.
El mecanismo por el cual las BAL pueden contribuir en el tratamiento contra diarrea es desconocido, sin embargo, se sugiere que este tipo de bacterias tienen la capacidad de reestablecer la microflora intestinal y así incrementar la barrera intestinal y competir contra los microorganismo patógenos por los sitios de adhesión en la mucosa intestinal humana (Adolfsson et al., 2004).
Cáncer en colon. Es una de las más importantes causas de muerte, los factores que propician el desarrollo de esta enfermedad son de origen genético y el medio ambiente (interacción entre alimentación, epitelio y flora intestinal). Los productos lácteos fermentados o las bacterias utilizadas para la fermentación de la leche han mostrado tener un efecto positivo en cáncer de colon y otros tumores (Reddy y Rivenson, 1993;
Ayebo et al., 1981; Shackelford, 1983). Wollowski et al., (1999), investigaron el efecto protector de diferentes cepas de BAL, utilizaron leche fermentada contra 1,2- dimetilhidrazina (DMH) que es un inductor de cáncer en ratones. Evidenciaron que el tratamiento con Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus durante 4 días protegió el colon del ratón del efecto negativo del DMH, esto no ocurrió cuando se suministró S.
thermophilus.
15 Se ha sugerido que los mecanismos de protección de las BAL contra carcinogénesis en colon se relacionan con la mejora de la respuesta inmune, la supresión de bacterias intestinales dañinas, el secuestro de mutágenos potenciales, la producción de compuestos mutagénicos y la reducción del pH en colon. Así mismo, Pedrosa et al., (1995) demostraron que la alimentación con yogurt o el suministro de Lactobacillus reduce la presencia de enzimas fecales (azoreductasa y nitroreductasa) que tienen la capacidad de producir metabolitos carcinogénicos.
Estas bacterias ejercen su efecto protector o terapéutico mediante la secreción de compuestos antimicrobianos como lactocinas, helveticinas, lactacinas, nisina, bifidocinas, por mencionar algunos (Dodd y Gasson, 1994; Gibson y Wang, 1994; Gibson, 1999;
Isolauri, 2004) y la competencia por los sitios que ocupan los patógenos en el intestino (Isolauri et al., 1994; Gibson, 1999; Kailasapathy y Chin, 2000; Isolauri, 2004).
2.2. Prebióticos
El término prebiótico fue introducido por Gibson y Roberfroid en 1995, ellos definen a los prebióticos como ―un ingrediente alimenticio no digerible que afecta benéficamente al huésped selectivamente estimulando el crecimiento y/o actividad de uno o un limitado número de bacterias en el colon". En 2001 Cummings y colaboradores definen a estos ingredientes alimenticios como cadenas largas no digeribles por enzimas digestivas del organismo humano, pero si son digeribles por los probióticos en el intestino grueso (colon).
La función de los compuestos prebióticos es estimular de manera selectiva el crecimiento y la actividad de especies de bacterias específicas en el intestino, usualmente bifidobacterias y lactobacilos, beneficiando así la salud humana (Gibson et al., 1995;
Gibson, 1999; Kontula et al., 1999; Adhikari et al., 2000; Isolauri, 2004; Rastall, 2004).
Recientemente los prebióticos se emplean como simbióticos, una combinación de compuestos prebióticos con microorganismos probióticos, cuya finalidad es potenciar el crecimiento de los probióticos en el organismo humano. En el Cuadro 4, se presentan ejemplos de algunos compuestos utilizados como prebióticos y algunos simbióticos probados en el organismo humano. Dos prebióticos de interés potencial son la inulina y la oligofructosa, se extraen de raíces de achicoria principalmente y no son digeribles por enzimas del tracto digestivo humano, pero si son digeribles por algunas bacterias que
16 forman parte de la flora intestinal principalmente, lactobacilos y bifidobacterias (Gibson, 1999).
Otro prebiótico importante es la lactulosa que es un derivado de la lactosa y ha sido utilizado desde hace cuarenta años como prebiótico en fórmulas infantiles, con el objetivo de incrementar el número de lactobacilos en el intestino de infantes (MacGillivray et al., 1959). Lactitol es un prebiótico derivado de la lactosa, el cual junto con la lactulosa se ha relacionado su efecto en el tratamiento de enfermedades como encefalopatía, así como remediación del cáncer colorectal (Kontula et al., 1998). En adultos el consumo de fructo- oligosacáridos tienen un efecto positivo que se ve reflejado principalmente en un incremento de bifidobacterias en las heces (Wang y Gibson, 1993; Buddington et al., 1996; Gibson et al., 1995).
Cuadro 4. Compuestos prebióticos y simbióticos.
Prebióticos
Fructooligosacáridos (FOS) Inulina
Oligofructosa Lactulosa Lactitol
Galactooligosacáridos (GOS)
Simbióticos
Bifidobacteria + FOS Lactobacilos + Lactitol Bifidobacteria + GOS
17 2.3. Aparato digestivo humano y BAL probióticas
2.3.1. Estómago e intestino delgado humano
El alimento en el estómago se mezcla con ácido clorhídrico, moco y pepsina, después es liberado a una velocidad controlada hacia el duodeno. La mucosa gástrica contiene muchas glándulas profundas, que secretan moco. Las células de las glándulas gástricas secretan jugo gástrico, el cual contiene diversas sustancias como enzimas (pepsina y lipasa), iones (sodio, cloro, magnesio, hidronio, potasio) y moco. El ácido clorhídrico ayuda en la digestión proteínica, proporciona el pH necesario para activar la pepsina (principal enzima del jugo gástrico), además estimula la salida de la bilis y del jugo pancreático y puede eliminar muchas de las bacterias ingeridas como un mecanismo de defensa (Ganong, 2002).
En personas normales la mucosa gástrica no se irrita o digiere, debido a la presencia del moco contenido en el jugo gástrico. El moco esta constituido por glucoproteínas denominadas mucinas, cada mucina tiene cuatro subunidades unidas por puentes disulfuro; el moco forma un gel filante que cubre la mucosa.
El estómago presenta valores de pH de 1 a 2, que favorecen el inicio de la digestión de los alimentos en el estómago, además en este intervalo de pH se estimula la secreción de bilis hepática al duodeno, en esta región el pH es > 6.5 (Ganong, 2002). El alimento en el estómago es mezclado y molido gracias al movimiento peristáltico el cual puede durar hasta 10 segundos y presentarse de 3 a 4 veces por minuto.
La secreción de la pepsina y del ácido clorhídrico, se atribuye a la influencia cefálica (respuestas mediadas por el vago e inducidas por la actividad en el sistema nervioso central), gástrica (respuestas reflejas locales y la gastrina) e intestinal (reflejos y efectos de la retroalimentación hormonal sobre la secreción gástrica iniciados a partir de la mucosa del intestino delgado). Sin embargo, también existen factores externos como la ingesta de alcohol y cafeína, que actúan directamente sobre la mucosa estimulando la secreción gástrica.
En el estómago existen bacterias anaerobias facultativas como lactobacilos y estreptococos en concentración reducida debido al ambiente ácido, así mismo, hay levaduras en una concentración de 100 UFC/mL aproximadamente (Rastall, 2004).
El proceso digestivo inicia en la boca y en el estómago, se completa en el lumen y en las células de la mucosa del intestino delgado. En el intestino delgado los contenidos
18 procedentes del estómago se mezclan con las secreciones de las células de la mucosa, con el jugo pancreático y la bilis hepática. De tal manera que en el intestino delgado se lleva a cabo la absorción de los productos de la digestión y de las vitaminas y los líquidos.
La primera sección del intestino delgado se denomina duodeno, en la primera porción del duodeno hay un ambiente agresivo, debido a que los contenidos del estómago son vaciados en este sitio a través del píloro. La segunda sección del intestino delgado se conoce como yeyuno y comprende aproximadamente el 40% del total de este órgano, finalmente, la tercera sección es el íleon y comprende el 60% del intestino delgado (Figura 1).
Figura 1. Intestino delgado y grueso humano.
La bilis, el jugo pancreático y los jugos intestinales en conjunto, neutralizan el ácido gástrico, el pH del contenido duodenal es de 6.0 a 7.0 es neutro cuando el quimo llega al yeyuno. La bilis está constituida por sales biliares (sales de sodio y potasio de los ácidos biliares), ácidos biliares, pigmentos biliares, sales inorgánicas y otras sustancias disueltas en una solución electrolítica alcalina, tiene un valor de pH de 6.2 a 8.5. La bilis es clave importante dentro del proceso digestivo, puesto que proporciona los ácidos biliares que emulsionan las partículas de grasa de los alimentos y contribuyen en la absorción de los productos finales de la digestión de las grasas a través de la membrana de la mucosa intestinal.
Toda la membrana intestinal se encuentra cubierta por vellosidades de 20 a 40 por mm2 de mucosa. Cada vellosidad intestinal consiste en una proyección en forma de dedo de 0.5 a 1.0 mm de largo, recubierta por una capa de epitelio columnar que contiene una red de capilares y un vaso linfático. Las extensiones finas del músculo liso de la submucosa corren longitudinalmente hasta la punta de cada vellosidad (Figura 2). Los bordes libres
19 de las células del epitelio de las vellosidades están separadas en microvellosidades y el glucocáliz, una capa amorfa abundante en aminoazúcares y azúcares neutros. Las microvellosidades y el glucocáliz constituyen el borde en cepillo, así mismo las células están unidas entre sí mediante uniones estrechas. La capa exterior de la membrana celular de las células de la mucosa contiene muchas de las enzimas involucradas en el proceso digestivo iniciado por las enzimas salivales, gástricas y pancreáticas incluidas diversas disacaridasas, peptidasas y enzimas involucradas en la degradación de los ácidos nucleicos. Se estima que la superficie interna de un cilindro de mucosa del tamaño del intestino delgado es de 3300 cm2, las vellosidades incrementan esta superficie de contacto a 100 000 cm2 y las microvellosidades incrementan esta superficie a 2 000 000 cm2 (Ganong, 2002).
Figura 2. Esquema de las capas de tejido del intestino humano.
En el intestino delgado se encuentra un gran número de bacterias, principalmente anaerobios facultativos como lactobacilos, estreptococos y enterobacterias; anaerobios como Bifidobacterium sp., Bacteroides sp. y clostridios en una concentración de 104 a 108 UFC/mL (Rastall, 2004).
El peristaltismo empuja el quimo del intestino delgado hacia el intestino grueso (colon).
Las contracciones de segmentación son contracciones anulares regulares que ocurren a lo largo del intestino y su función es mover el alimento hacia delante y atrás e incrementar la exposición del alimento a la superficie de la mucosa.
20 2.3.2. Colon humano
La función de este órgano es la absorción del agua, sodio y otros minerales, en el colon se convierten alrededor de 2 L de quimo isotónico que ingresan a diario del íleon, en 250 mL aprox. de heces sólidas.
El diámetro del colon es aproximadamente de 6.5 cm y tiene una longitud de 100 cm en personas vivas (Ganong, 2002; Tortora y Grabowski, 2002). Las glándulas colónicas consisten en proyecciones de la mucosa secretoras de moco. Entre el intestino delgado y el colon se encuentra la válvula ileocecal, cuya función importante es evitar que los contenidos colónicos regresen al íleon.
Los movimientos del colon incluyen las contracciones de segmentación y las ondas peristálticas similares a las que ocurren en el intestino delgado. Gracias a estas contracciones los contenidos del colon se mezclan y además, estos son más expuestos con la mucosa de tal manera que la absorción se facilite.
En el colon, los ácidos biliares procedentes del intestino delgado tienen efecto antibacteriano inhibiendo el crecimiento de cepas de Escherichia coli, Klebsiella sp., and Enterococcus sp. Cuando se encuentran estos ácidos en forma desconjugada, el efecto es más inhibitorio para bacterias gram positivo (Dunne et al., 2001).
En esta región del tracto digestivo es en donde habitan el mayor número de bacterias, en concentración de 1011 a 1012 UFC/mL. En mayoría se encuentran anaerobios obligados y en menor proporción aerobios facultativos, la microflora está dominada por anaerobios estrictos como Bacteroides sp., clostridios y otras familias en las que se encuentran Clostridium mega-genus, Ruminococcus sp., Butirovibrio sp., Fusubacterium sp., Eubacterium sp., Peptostreoptococcus sp., Bifidobacterium sp., y Atopobium sp. También existen anaerobios facultativos como lactobacilos, enterococos, estreptococos y Enterobacteriaceae. Por último, las levaduras se encuentran en concentración baja de 102 a 104 UFC/mL (Gibson y Roberfroid, 1995). Además, en las heces pasan grandes masas de bacterias.
El colon es estéril en el momento del nacimiento, pero la flora bacteriana se establece en la vida temprana. En el colon se produce y se absorbe amoniaco también, con el suministro de compuestos como lactulosa se puede reducir el contenido en exceso del amoníaco y evitar que se presenten problemas como encefalopatía hepática.
