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UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA EQUINOCCIAL
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA INGENIERÍA
CARRERA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS
EFECTOS DE LA RADIACIÓN UV-C SOBRE LA FLORA
NATIVA EN LA MORA DE CASTILLA (
Rubus glaucus
) SIN
ESPINAS
TRABAJO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERA DE ALIMENTOS
LORENA ESTEFANÍA SALVADOR VALLEJO
DIRECTORA: BIOQ. MARÍA JOSÉ ANDRADE
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© Universidad Tecnológica Equinoccial. 2013.
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DECLARACIÓN
Yo Lorena Estefanía Salvador Vallejo, declaro que el trabajo aquí descrito es de mi autoría; que no ha sido previamente presentado para ningún grado o calificación profesional; y, que he consultado las referencias bibliográficas que se incluyen en este documento.
La Universidad Tecnológica Equinoccial puede hacer uso de los derechos correspondientes a este trabajo, según lo establecido por la Ley de Propiedad Intelectual, por su Reglamento y por la normativa institucional vigente.
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Lorena Estefanía Salvador Vallejo
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CERTIFICACIÓN
Certifico que el presente trabajo que lleva por título “Efectos de la
radiación UV–C sobre la flora nativa en la mora de Castilla (Rubus glaucus) sin espinas”, que, para aspirar al título de Ingeniera en Alimentos fue desarrollado por Lorena Estefanía Salvador Vallejo, bajo mi dirección y supervisión, en la Facultad de Ciencias de la Ingeniería; y cumple con las condiciones requeridas por el reglamento de Trabajos de Titulación artículos 18 y 25.
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Bioq. María José Andrade
DIRECTORA DE TRABAJO
i El presente trabajo de investigación es parte del proyecto:
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DEDICATORIA
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AGRADECIMIENTO
A mis padres, que han sido la luz durante toda mi vida, han estado a mi lado en cada logro, tropiezo y caída, que han sabido levantarme y darme el amor, apoyo y comprensión necesaria para seguir mi camino y buscar nuevos triunfos y éxitos; que jamás se han rendido y han hecho de mí lo que soy ahora. Por creer en mí en todo momento dándome alas para volar alto.
A toda mi familia, con la que he compartido mis alegrías y tristezas y han estado ahí para darme ánimo siempre.
A mis amigas y amigos que más que eso han sido mis ángeles, mis confidentes, mi familia. Con los que he vivido un sin número de aventuras y me han ayudado de una u otra manera a culminar esta etapa.
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ÍNDICE DE CONTENIDOS
PÁGINA
RESUMEN ... vii
ABSTRACT ... ix
1. INTRODUCCIÓN ... 1
1.1 OBJETIVOS ... 2
2. MARCO TEÓRICO ... 4
2.1 MORA ... 4
2.1.1 TAXONOMÍA ... 5
2.1.2 COMPOSICIÓN QUÍMICA Y NUTRICIONAL ... 5
2.1.3 VARIEDADES DE MORA ... 6
2.1.4 USOS ... 7
2.2 CULTIVO ... 8
2.2.1 CULTIVO DE MORA DE CASTILLA EN EL ECUADOR ... 8
2.3 COSECHA ... 9
2.4 POSTCOSECHA DE LA MORA ... 9
2.4.1 EMPAQUE ... 10
2.4.2 TRANSPORTE ... 10
2.4.3 ALMACENAMIENTO ... 11
2.5 PÉRDIDAS POSTCOSECHA ... 12
2.6 TRATAMIENTOS POSTCOSECHA... 16
2.6.1 TRATAMIENTOS CON FRÍO ... 17
2.6.2 TRATAMIENTOS QUÍMICOS ... 18
2.6.3 ATMÓSFERAS MODIFICADAS Y/O CONTROLADAS ... 19
2.6.4 RADIACIÓN UV ... 19
2.7 RADIACIÓN UV-C ... 20
2.7.1 HORMESIS ... 21
2.7.2 USO DE LA RADIACIÓN UV-C COMO TRATAMIENTO POSTCOSECHA ... 23
3. MATERIALES Y MÉTODOS ... 25
3.1 MATERIAL VEGETAL ... 25
ii
PÁGINA
3.3 SELECCIÓN DE LA DOSIS EFECTIVA DE RADIACIÓN UV-C .... 26
3.3.1 PREPARACIÓN DEL INÓCULO ... 27
3.3.2 INOCULACIÓN ... 27
3.3.3 TRATAMIENTO CON RADIACIÓN UV-C ... 28
3.4 DETERMINACIÓN DE TIEMPO DE DESARROLLO FÚNGICO DE MORA INOCULADA ARTIFICIALMENTE ... 29
3.5 EFECTO DE LA RADIACIÓN UV-C SOBRE EL CRECIMIENTO DE Botrytis ... 29
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ... 32
4.1 AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MOHOS EN MORA ... 32
4.2 SELECCIÓN DE LA DOSIS EFECTIVA DE RADIACIÓN UV-C .... 35
4.3 DETERMINACIÓN DE TIEMPO DE DESARROLLO FÚNGICO EN MORA INOCULADA ARTIFICIALMENTE ... 42
4.4 EFECTO DE LA RADIACIÓN UV-C SOBRE EL CRECIMIENTO DE Botrytis ... 46
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ... 52
5.1 CONCLUSIONES ... 52
5.2 RECOMENDACIONES ... 53
BIBLIOGRAFÍA ... 54
iii
ÍNDICE DE TABLAS
PÁGINA
Tabla 1. Taxonomía de la Mora de Castilla ... 5
Tabla 2. Composición Nutricional de la Mora de Castilla ... 6
Tabla 3. Parámetros de almacenamiento de la Mora de Castilla ... 11
Tabla 4. Tratamientos aplicados a la mora de Castilla sin espinas recién cosechada ... 31
Tabla 5. Desarrollo de Mucor spp. tratado con diferentes dosis de
radiación UV-C ... 36
Tabla 6. Desarrollo de Fusarium spp. tratado con diferentes dosis de
radiación UV-C ... 37
Tabla 7. Desarrollo de Penicillium spp. tratado con diferentes dosis de
radiación UV-C ... 38
Tabla 8. Desarrollo de Alternaria spp .tratado con diferentes dosis de
radiación UV-C ... 39
Tabla 9. Desarrollo Cladosporium spp. tratado con diferentes dosis de
radiación UV-C ... 40
Tabla 10. Desarrollo de Botrytis spp. tratado con diferentes dosis de
radiación UV-C ... 41
Tabla 11. Índice de decaimiento de mora de Castilla durante el tiempo de inoculación ... 43
iv
ÍNDICE DE FIGURAS
PÁGINA
Figura 1. Tabla de color de la mora de Castilla ... 4
Figura 2. Empaque de mora ... 10
Figura 3. Infección de Botrytis cinerea en (a) fruto maduro y (b) fruta en la planta de mora ... 13
Figura 4. Hoja infectada por Oidium spp. ... 13
Figura 5. Planta marchita ... 14
Figura 6. Planta de mora infectada con roya ... 15
Figura 7. Planta de mora infectada con antracnosis ... 15
Figura 8. Planta infectada con agalla de la corona ... 16
Figura 9. Espectro del ultravioleta (longitudes de onda en nm) ... 20
Figura 10. Gráfico dosis-respuesta de la hormesis ... 22
Figura 11. Mora de Castilla sin espinas (a) frutos y (b) selección de frutos para la cosecha ... 25
Figura 12. Inoculación por extensión con perlas de vidrio ... 27
Figura 13. Aplicación de radiación UV-C en placas petri inoculadas con mohos ... 28
v
PÁGINA Figura 15. Fusarium spp. (a) Cultivo luego de 5 días de incubación
en agar Sabouraud a 25ºC y (b) observación microscópica
(100x) ... 32
Figura 16.Penicillium spp .(a) Cultivo luego de 5 días de incubación en agar Sabouraud a 25ºC y (b) observación microscópica
(100x) ... 33
Figura 17.Alternaria spp. (a) Cultivo luego de 5 días de incubación en agar Sabouraud a 25ºC y (b) observación microscópica
(100x) ... 33
Figura 18.Cladosporium spp. (a) Cultivo luego de 5 días de incubación en agar Sabouraud a 25ºC y (b) observación microscópica
(100x) ... 34
Figura 19.Botrytis spp. (a) Cultivo luego de 5 días de incubación en agar Sabouraud a 25ºC y (b) observación microscópica
(100x) ... 34
Figura 20. Desarrollo de moho en mora de Castilla sin espinas a
temperatura ambiente luego de seis días de almacenamiento . 45
Figura 21. Crecimiento de Botrytis en mora almacenada ... 46
Figura 22. Desarrollo de Botrytis con tratamientos T1, T2 y T3 en los días 2, 4 y 6 a temperatura ambiente ... 47
vi
ÍNDICE DE ANEXOS
PÁGINA ANEXO I.
PREPARACIÓN ESCALA DE MAC FARLAND ... 61
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RESUMEN
La variedad de mora “sin espinas” fue desarrollada por el Instituto Nacional
de Investigaciones Agropecuarias (INIAP) en el año 2010.Este es un fruto altamente perecible que sufre pérdidas en el periodo postcosecha, sobre todo por el desarrollo de microorganismos, principalmente mohos. El objetivo del presente trabajo de investigación fue determinar el efecto de la aplicación de la radiación UV-C como tratamiento postcosecha sobre la flora nativa de la mora de Castilla sin espinas. El estudio se dividió en cuatro partes: una primera en la que se aislaron e identificaron los mohos causantes de deterioro en la fruta; en una segunda parte se aplicaron dosis de 1, 3.2 y 5.8 kJ/m2 para seleccionar una dosis efectiva de radiación UV-C que controle el crecimiento fúngico, se lo hizo a través de un ensayo in vitro; en la tercera parte se evaluó el desarrollo de mohos en mora inoculada artificialmente con los inóculos aislados y finalmente se seleccionó el moho que mayor desarrollo presentaba con el fin de evaluar el efecto hormético y fungicida de la radiación UV-C, para lo cual se irradió antes o después de la inoculación artificial en frutos de mora. Se aislaron e identificaron los hongos: Mucor spp., Fusarium spp., Penicillium spp., Alternaria spp., Cladosporium spp. y Botrytis spp. La dosis efectiva con la que se evidenció disminución en el crecimiento fúngico in vitro fue de 1 kJ/m2.
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ABSTRACT
The “thornless” blackberry variety was developed by the National Agricultural
Research Institute (lNlAP) in 2010. This is a highly perishable fruit that suffers high postharvest losses due to the growth of microorganisms, especially molds. The aim of this research was to determine the effect of the application of UV-C radiation as postharvest treatment on native flora of thornless Castilla blackberry. The study was divided into four parts: a first part in which was isolated and identified those molds that cause deterioration on the fruit, in a second part was applied doses of 1, 3.2 and 5.8 kJ/m2 to select an effective dose of UV-C radiation to control fungal growth, it was done in an in vitro testing, in the third part fungal growth was assessed in artificially inoculated blackberries with the isolated inocula and finally the mold that had a higher development was selected in order to evaluate the hormetic and fungicidal effect of UV-C radiation, for this, blackberries were irradiated before or after artificial inoculation. The fungi isolated and identified were: Mucor spp., Fusarium spp., Penicillium spp., Alternaria spp., Cladosporium spp. and Botrytis spp. The effective dose which showed decrease in in vitro fungal growth was 1 kJ/m2.
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1. INTRODUCCIÓN
La mora de Castilla (Rubus glaucus) es una planta de porte arbustivo, semi-erecta y de naturaleza trepadora (Martínez et al., 2007). Para su cultivo se tienen los mejores resultados en altitudes entre 1800 y 2600 msnm, que se clasifican como zonas de clima frío moderado, con temperaturas promedios entre 12 y 18 °C (Sora, Fischer & Flórez, 2006). En el Ecuador es cultivada tradicionalmente en las provincias de Bolívar, Cotopaxi y Tungurahua (Martínez, 2008). La vida útil de la mora es muy corta, de 3 a 5 días, razón por la cual la cosecha y el manejo postcosecha deben ser muy cuidadosos y eficientes. Las pérdidas durante estas etapas son muy altas, alrededor de 60% y 70%, cuando el manejo no se hace adecuadamente (Sora et al., 2006).
Es una fruta altamente perecible y delicada, susceptible a daños mecánicos, lo cual incide en la proliferación de microorganismos fitopatógenos, como son bacterias y mohos, estos daños se producen por una manipulación negligente del producto durante todas las etapas postcosecha (FAO, 1993), produciéndose un deterioro acelerado. Los hongos que atacan esta fruta son principalmente Botrytis, Gymnocoria, Fusarium, Colletotrichum, Oidium, y Peronospora (Franco & Giraldo, s.f.; Martínez et al., 2007).
Para el control del crecimiento de microorganismos en frutas se utilizan tecnologías como pulsos de luz, revestimientos comestibles (ceras), aplicación de pulsos eléctricos, entre otros (Belloso, 2010; Cano, 2001). En los últimos años se ha probado la radiación UV-C como una tecnología postcosecha emergente con buenos resultados en pimiento, brócoli, uvilla, mortiño y otros productos frutihortícolas.
2 producto, por lo que se considera una buena alternativa para conservar y alargar la vida útil de éstos. Según explican González-Aguilar, Rivera-Pastrana, Gardea-Béjar, Martínez-Téllez y Rivera-Domínguez (2007) debido a su bajo costo y fácil aplicación, la radiación UV-C es una buena alternativa para la conservación de frutas y hortalizas, ya que es letal para la mayoría de microorganismos.
Se han realizado diversos estudios de radiación UV-C sobre frutas; en arándanos se redujo el crecimiento de Colletotrichum acutatum (Perkins-Veaziea, Collinsa & Howard, 2008), en fresa se aplicó esta tecnología para controlar la pudrición causada por Botrytis cinerea (Baka, Mercier, Corcuff, Castaigne & Arul, 1999), de igual forma Stevens et al. (1998) realizaron estudios en durazno para el control de Monilinia fructicola retrasando la maduración; en cítricos la aplicación de dosis bajas de radiación UV-C puede inducir resistencia en la piel del fruto contra enfermedades postcosecha (Palou, 2007). Sin embargo, no se han realizado estudios en mora de Castilla sin espinas, por lo cual su estudio es importante para determinar el efecto de la radiación UV-C sobre la flora nativa de la fruta, entendida como el conjunto de microorganismos que viven de forma habitual en un cuerpo sano, conocida también como microbiota o flora normal (Universidad_de_Navarra, 2005).
1.1 OBJETIVOS
Objetivo General
Determinar los efectos de la radiación UV – C sobre la flora nativa en la mora
de Castilla (Rubus glaucus) sin espinas.
Objetivos Específicos
3 Seleccionar la dosis efectiva de radiación UV-C para reducir la carga
bacteriana en la mora de Castilla (Rubus glaucus) sin espinas.
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2. MARCO TEÓRICO
2.1 MORA
La mora de Castilla (Rubus glaucus) es una planta de origen silvestre, la mayoría de variedades que todavía no son identificadas pertenecen a los climas fríos y templados de la Cordillera de los Andes de Ecuador y Colombia, sin embargo también se la puede encontrar en Panamá, El Salvador, Honduras, Guatemala y México (Martínez et al., 2007).
Es una planta perenne, arbustiva semi-erecta, formada por algunos tallos espinosos, que pueden llegar a crecer hasta los 3 metros y tienen un diámetro entre 1 y 2 centímetros; a pesar de que la mayoría de las plantas tienen espinas, existen algunos cultivares que no las tienen, debido a mutaciones o fitomejoramiento. Las hojas están formadas por 3 foliolos de forma ovoide con una longitud de 3 a 5 centímetros y espinas ganchudas (Martínez et al., 2007). El fruto está conformado por pequeñas drupas y dentro de ellas se encuentran las semillas; su maduración no es uniforme, su color va de rojo a negro brillante de acuerdo a su proceso de desarrollo, como se muestra en la figura 1 (Franco & Giraldo, s.f.; OIRSA, 2003).
5 Las raíces se distribuyen en los primeros 30 centímetros del suelo con disposición horizontal y longitudinal de 0.5 a 1.2 metros de largo, éstas sostienen a la planta y permiten su propagación gracias a sus yemas vegetativas que tienen la capacidad de activarse y así producir brotes (Franco & Giraldo, s.f.).
2.1.1 TAXONOMÍA
La Tabla 1 muestra la taxonomía de la mora de Castilla según Reina (1998):
Tabla 1. Taxonomía de la Mora de Castilla Reino Vegetal
Subreino Embriyophyta Clase Angiosperma Subclase Dicotiledónea Orden Tubiflorales Familia Rosáseas Género Rubus Especie glaucus
(Reina, 1998)
2.1.2 COMPOSICIÓN QUÍMICA Y NUTRICIONAL
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Tabla 2. Composición Nutricional de la Mora de Castilla en una porción de 100 g.
Factor Nutricional Cantidad Unidad
Ácido ascórbico 8 mg
Agua 92.8 g
Calcio 42 mg
Calorías 23 kcal
Carbohidratos 5.6 g
Cenizas 0.4 g
Fibra 0.5 g
Fósforo 10 mg
Grasa 0.1 g
Hierro 1.7 mg
Niacina 0.3 mg
Proteínas 0.6 g
Riboflavina 0.05 mg
Tiamina 0.02 mg
(Martínez et al., 2007)
2.1.3 VARIEDADES DE MORA
Existen variedades de mora diseminadas en todo el mundo, alrededor de 300 especies, en zonas frías, frías moderadas y altas. Las variedades que se pueden encontrar a lo largo del callejón interandino, en estado silvestre según Cadena y Orellana (1985) y Martínez et al. (2007) son:
Rubus glaucus Benth.- conocida como mora de Castilla o mora negra o azul. Es de mucho interés por su producción y valor comercial, es la más cultivada en el Ecuador y crece entre los 2500 y 3000 m.s.n.m.
Rubus floribundus HBK.- conocida comúnmente como mora criolla o común, crece desde los 2800 m.s.n.m. a orillas de cercos y quebradas.
7 Rubus adenotrichas.- esta especie crece entre los 2500 y 3000 m.s.n.m. Se la puede encontrar desde el Ecuador hasta México, es una variedad que puede ser cultivada con fines comerciales.
Rubus urticaefolius.- es una especie trepadora y robusta. Crece entre los 2500 y 3000 m.s.n.m. formando cercos a lo largo de caminos.
Rubus trichomallus.- crece desde los 800 hasta los 1200 m.s.n.m. Se la puede encontrar en áreas montañosas de Ecuador, Colombia y se extiende hasta México.
Rubus ruseus.- se la encuentra a grandes alturas, sobre los 3000 m.s.n.m., en diferentes zonas del Ecuador.
Variedad Ollalie.- es originaria de California, fue traída al Ecuador en 1987, es una planta muy productiva y vigorosa. Ésta es cultivada con fines de exportación.
Variedad Brazos.- proviene de Texas y se adaptó al Ecuador sin problema, es buena para la exportación gracias a su alta productividad y rusticidad.
2.1.4 USOS
La mora es una fruta que tiene un tiempo de vida limitado, tiene una descomposición acelerada debido a agentes como hongos, bacterias, enzimas, clima, golpes que se producen durante la cosecha, empacado o transporte; causando pérdidas económicas (Cadena & Orellana, 1985) por lo que es importante conocer usos alternativos para esta fruta.
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2.2 CULTIVO
Para el cultivo de mora de Castilla se deben tomar en cuenta varios parámetros que permiten un adecuado y óptimo desarrollo de la planta, (Cadena & Orellana, 1985; Franco & Giraldo, s.f.; López & Gómez, 2008) por ejemplo:
Suelo.- Puede presentar una topografía irregular, es decir, éste puede ser inclinado, plano, ondulado y laderoso. Además de eso es profundo, suelto y debe contener alto contenido de materia orgánica y buen drenaje y un pH entre 5.5 y 7.5.
Clima.- Esta fruta crece en climas fríos y fríos moderados, aunque se puede adaptar a climas temperados, incluso aumentando su producción. Existe un mejor desarrollo a una altura que oscile entre los 1800 y 2400 metros sobre el nivel del mar.
Humedad relativa.- La humedad óptima para el desarrollo de la planta está entre 70% y 80%.
Brillo solar.- Para un óptimo crecimiento necesita entre 1200 y 1600 horas brillo solar al año.
2.2.1 CULTIVO DE MORA DE CASTILLA EN EL ECUADOR
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2.3 COSECHA
Entre los 6 y 8 meses después de que fue plantada la mora, se puede iniciar su cosecha, su producción irá aumentando conforme se dé el crecimiento y edad del cultivo, estabilizándose al año y medio. En éste tipo de plantas no se puede conocer con exactitud una época fija de cosecha, pues los frutos maduran de forma desigual. Las moras estarán listas para ser cosechadas cuando presenten un color negro morado (Cadena & Orellana, 1985).
Para cosechar la mora, se debe tener mucho cuidado ya que es una fruta susceptible al daño, por lo que es recomendable al momento de recogerlas agarrar la fruta suavemente con el pulgar y el dedo índice, arrancándola delicadamente de la planta. Es mejor realizar la cosecha en las primeras horas de la mañana para que el rocío que pudo existir en ellas, se evapore por completo y de ésta manera evitar que la fruta se dañe ya sea por fermentación, o por el calor excesivo que se puede producir, acelerando su maduración (Casaca, 2005; Montalvo, 2010).
2.4 POSTCOSECHA DE LA MORA
Muchos productos agrícolas necesitan que el manejo postcosecha sea rápido y eficaz para poder evitar en lo posible pérdidas postcosecha y reducción en la características de calidad demandadas por el consumidor (González-Iturriaga, 1987).
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2.4.1 EMPAQUE
Para esta operación, la fruta ya debió ser seleccionada, evitando así que se mezclen frutos con diferentes niveles de maduración. No es aconsejable realizar la cosecha en cestas o canastos, ya que la fruta se estropea demasiado. Se debe cosechar ya directamente en bandejas o recipientes plásticos, pues así se controlan manipulaciones innecesarias por ende se reducen daños hasta en un 99% (figura 2). Según explica Martínez et al. (2007) “no se debe mezclar fruta sana con la dañada o maltratada, las frutas
que van al fondo no deben estar muy maduras, evitar la humedad del empaque y no empacar más fruta de lo que cabe en éste cómodamente.”
Figura 2. Empaque de mora
2.4.2 TRANSPORTE
Los productos frutihortícolas para llegar al mercado necesitan ser transportados, ya sea que se vayan a consumir frescos o vayan a ser sometidos a algún proceso dentro de la agroindustria. Se deben cumplir varios detalles durante esta operación para evitar pérdidas postcosecha, debido al mal manejo del fruto (López, 2000).
11 aproximada de 1ºC y seguir una cadena de frío constante, para poder conservar sus características físicas y químicas (Martínez et al., 2007).
2.4.3 ALMACENAMIENTO
Es necesario que se almacenen los productos frescos para poder alargar la vida útil de éstos. Para frutas y verduras las bodegas refrigeradas son las más usadas, y el tiempo de almacenaje dependerá de la vida útil postcosecha del producto y de las condiciones de operación del almacén (García & García, 2001). Según López (2000), para tener un almacenamiento exitoso de un producto se debe tener en cuenta el control de la respiración y la transpiración, las enfermedades y plagas de la postcosecha, y la conservación de la calidad del producto, para que la fruta llegue en las mejores condiciones.
En la Tabla 3 se muestran algunos parámetros que se deben tener en cuenta al almacenar la mora de Castilla.
Tabla 3. Parámetros de almacenamiento de la Mora de Castilla Punto de congelación -1.7 ºC
Temperatura de almacenamiento -0.5 a 0ºC
Humedad relativa 90 – 95%
Periodo práctico de almacenamiento 2 – 3 días
Contenido de humedad 84.8%
Tasa de respiración 16 a 23 mg CO2/kg/h
(Bejarano, 1992)
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2.5 PÉRDIDAS POSTCOSECHA
Las frutas y hortalizas frescas reciben el nombre de productos perecibles debido a que tienden a deteriorarse ya sea por razones fisiológicas o por la invasión de plagas, infecciones y enfermedades (FAO, 1989). Además de un mal manejo postcosecha, durante el momento de empacar y transportarlas a su destino final.
Las pérdidas postcosecha en mora, son principalmente causadas por enfermedades que afectan a la planta y por ende hacen que se produzcan frutos que no pueden ser comercializados. A continuación se describen las principales enfermedades causadas por microorganismos:
Pudrición del fruto.- producido por Botrytis cinerea, este hongo ataca tanto al fruto inmaduro como al que se encuentra en proceso de maduración, momificando y necrosando al primero y pudriendo al segundo (figura 3a y 3b). Se suele producir debido a un exceso de humedad ya sea del suelo o del ambiente (Casaca, 2005; Franco & Giraldo, s.f.). Este hongo puede tolerar temperaturas entre -1 y 1ºC para crecer y causar deterioro en el producto (Rivera, 2008).
Cuando recién está apareciendo ataca a las yemas necrosándolas y haciendo que se caigan, luego pasa al fruto provocando su pudrición (Martínez et al., 2007).
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Figura 3. Infección de Botrytis cinerea en (a) fruto maduro y (b) fruta en la planta de mora
Mildeo Polvoso.- producido por Oidium spp. o Sphaeroteca spp., este hongo cambia de color a las hojas a un color amarillo y las deforma, en la parte de abajo de las hojas se presenta un polvillo blanco como se observa en la figura 4. Si el ataque llega a ser severo puede incluso deformar el fruto (López & Gómez, 2008).
Para su control se debe podar la planta y quemar el material infectado (Bejarano, s.f.).
Figura 4. Hoja infectada por Oidium spp.
Verticillium spp., Fusarium spp. y Rosellinia spp.- estos hongos hacen que las hojas tomen una tonalidad amarilla y la planta empieza a marchitarse
14 (figura 5). En el tallo se manifiesta con manchas negras y un color azuloso característico. Ataca a la raíz de la planta pudriéndola.
La única forma de controlar dicha enfermedad es mediante es la eliminación o erradicación de las plantas afectadas (López & Gómez, 2008).
Figura 5. Planta marchita
Mildeo Velloso.- producido por Perenospora spp., este hongo se presenta con cuarteamientos en el tallo. Es una enfermedad donde las ramas nuevas empiezan a secarse, ya que se produce un estrangulamiento en la mitad de éstas. Los frutos se decoloran y las drupas se hunden (CORPOICA, 2002).
Para poder controlarlo se debe podar y quemar todo el material afectado.
15 Se debe mantener el cultivo libre de malezas, y aplicar fungicidas a base de cúpricos o azufre (Casaca, 2005; Franco & Giraldo, s.f.).
Figura 6. Planta de mora infectada con roya
Antracnosis.- producida por Colletotrichum spp., este hongo produce manchas oscuras en las ramas y en los tallos (figura 7), estos se pueden agrietar produciendo secado y muerte de la rama (López & Gómez, 2008).
Para su manejo se debe podar y quemar todas las partes afectadas, además de desyerbar para favorecer a la aireación del cultivo.
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Agalla de la corona.- lo produce Agrobacterium tumefaciens, se da la formación de agallas o tumores en el tallo, por lo general cerca del cuello de la raíz, como se puede ver en la figura 8.
Para su control se debe desinfectar el suelo y debe estar bien drenado, además las tijeras podadoras deben desinfestarse. Con la ayuda de una navaja se debe eliminar las lesiones y aplicar cicatrizantes cúpricos (Franco & Giraldo, s.f.).
Figura 8. Planta infectada con agalla de la corona
2.6 TRATAMIENTOS POSTCOSECHA
Generalmente los productos frescos se deterioran y descomponen después de la cosecha, ya sea por la actividad enzimática o por microorganismos; por lo que se hace de suma importancia destruir los agentes del deterioro sin que los productos pierdan sus características ni su valor nutricional (FAO, 1993).
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2.6.1 TRATAMIENTOS CON FRÍO
Según Juliarena y Gratton (2008), “el frío produce una reducción de la velocidad de los procesos químicos, metabólicos y de crecimiento de microorganismos. Por lo tanto el descenso en la temperatura producirá retraso en los cambios que se puedan producir en los alimentos durante el almacenamiento.”
El pre-enfriamiento es un proceso necesario para mantener la calidad de los productos y maximizar su vida postcosecha. Es beneficioso aun cuando el producto posteriormente retome la temperatura ambiente, debido a que su deterioro es proporcional al tiempo expuesto a temperaturas altas (López, 2003).
Existen varias clases de pre-enfriamiento, como son pre-enfriamiento con agua, pre-enfriamiento al vacío, pre-enfriamiento con hielo molido o en cubo y pre-enfriamiento con aire forzado. Sin embargo, el método recomendado para el enfriamiento de la mora es el de aire forzado (Montalvo, 2010).
Pre-enfriamiento con aire forzado.- Este tipo de pre-enfriamiento es bastante rápido y se basa en el movimiento forzado de aire frío a través de los orificios de las gavetas, para de esta manera promover el movimiento de aire más caliente de las frutas hacia un extractor de aire, y gracias a una manta evita que el aire caliente se disperse en el cuarto (Fonseca, 2011).
Las moras necesitan ser enfriadas con aire forzado y una humedad relativa alta entre el 90 y 95 %, en las siguientes 2 horas después de haber sido cosechadas y así bajar su temperatura interna entre 0 y 5 ºC. El enfriamiento por aire forzado es hasta 5 veces más rápido que el que es en un cuarto frío (Montalvo, 2010).
18 ya que microorganismos patógenos pueden ingresar al tejido y causar daños (Fonseca, 2011).
Pre-enfriamiento al vacío.- Se basa en el efecto de enfriamiento que se produce por la evaporación del agua que se encuentra en la superficie del producto, en donde se toma el calor latente de éste cuando se lo somete a un ambiente al vacío, correspondiente al punto de ebullición del agua a la temperatura del alimento (Barreiro & Sandoval, 2006).
Pre-enfriamiento con hielo molido.- Este tipo de tratamiento es probablemente de los más antiguos, donde se suele colocar una cobertura de hielo antes de cerrar el envase, con el transcurso del tiempo éste se va derritiendo y el agua va enfriando a las capas inferiores. También se puede intercalar capas de hielo y producto, o se puede realizar una modificación usando agua y hielo concomitantemente (López, 2003).
2.6.2 TRATAMIENTOS QUÍMICOS
En las últimas décadas la práctica de tratar el producto durante la postcosecha se ha convertido en parte integral del procesamiento y mercadeo a gran escala comercial de frutas de importancia mundial. Además los compuestos aplicados no deben ser fitotóxicos, para que no afecten la calidad del producto y cumplan con los límites de tolerancia para el consumo humano (Barriga-Olivares, 1987).
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2.6.3 ATMÓSFERAS MODIFICADAS Y/O CONTROLADAS
Las atmósferas controladas son aquellas en donde se modifica la composición gaseosa de la atmósfera, es decir, se enriquece con CO2 y se
disminuye considerablemente el O2, se realiza un control constante del
producto. Las atmósferas modificadas utilizan una mezcla de gases, nitrógeno mezclado con CO2 y reducción de O2, según los requerimientos
del producto, no se realiza control al cerrar el envase (Gracía, s.f.; Orjuela, Pinilla & Rincón, 2002).
Este tratamiento se usa en productos que toleran altos niveles de CO2,
modificando el aire con un porcentaje entre el 15 y 20 % de CO2, actúa como
un fungistático para ayudar a controlar pudriciones producidas por patógenos como Botrytis cinerea en frutas como las moras, fresas, entre otras (FAO, 2003).
2.6.4 RADIACIÓN UV
La radiación ultravioleta es producida por el sol y es un esterilizador natural. Se encuentra ubicada en una región de energía del espectro electromagnético que está entre la luz visible y los rayos X; se divide en 4 áreas diferentes estos son rayos UV vacío, UV-A, UV-B y UV-C, cada uno con una longitud de onda diferente (figura 9), la misma que se expresa en nanómetros, y va desde 10 hasta 400 nm, (González, 2001) como se indica a continuación:
UV vacío: (10 – 200 nm).- desinfección con ozono
UV-C: (200 – 300 nm).- con capacidad germicida, es una luz de onda corta.
UV-B: (280 – 315 nm).- es nociva para la piel, produciendo eritema o
golpe solar, es una luz de onda media.
20
Figura 9. Espectro del ultravioleta (longitudes de onda en nm) (UV-Consulting_Peschl_España, 2008)
Según Portero (s.f.), la radiación UV tiene efectos sobre las proteínas y los ácidos nucleicos. Dosis altas de UV-B pueden desnaturalizar proteínas; mientras que si se desea una acción bactericida se logra con longitudes de onda corta, es decir UV-C.
2.7 RADIACIÓN UV-C
La luz UV-C es una forma de radiación no ionizada que no penetra más allá de las superficies, generalmente se la conoce como germicida, éste efecto se logra especialmente a longitudes de onda cercanas a 250 nm. Ésta puede inactivar bacterias, hongos y virus (Fonseca, 2009). Tiene la ventaja de no producir residuos químicos, subproductos o radiación, además que es un tratamiento seco y frío. Se debe tomar en cuenta la composición de cada producto alimenticio, para poder determinar la dosis de radiación UV-C (Guerrero-Beltrán & G.Barbosa-Cánovas, 2004).
21 en que la luz UV-C que es absorbida por el ADN detiene el crecimiento celular, por ende, provoca muerte celular, el daño se da a nivel del ácido nucleico (Guerrero-Beltrán & G.Barbosa-Cánovas, 2004), el fenómeno que ocurre recibe el nombre de dimerización de ADN, ya que la luz absorbida promueve que se formen enlaces entre nucleótidos adyacentes, creándose moléculas dobles o dímeros; un número suficiente de éstos dentro de un microorganismo impide que este pueda replicar su ADN y ARN, por lo tanto se impide su reproducción (Wright & Cairns, s.f.).
Este tipo de radiación de manera artificial se logra con la ayuda de lámparas que generan luz UV al pasar una descarga eléctrica a través de un tubo de cuarzo que contiene vapor de mercurio a baja presión (García, s.f.).
La técnica de usar radiación UV-C como germicida, fue desarrollada por Cleanlight BV en los países bajos, sin embargo en sus inicios era peligroso para las personas que se exponían a ella, es por ello que Arne Aiking desarrolló la Tecnología de Protección de Cultivos con UV, en donde el productor puede aplicar Cleanlight en cultivos de invernadero sin dañar a los trabajadores ni al cultivo (Reho, 2011).
Cabe señalar que la luz UV-C no alcanza toda la superficie del hongo ya que no erradica o elimina por completo al micelio; además con dosis muy bajas no mata a las esporas, pero previene la formación de nuevas esporas al eliminar al micelio que las genera (Reho, 2011).
2.7.1 HORMESIS
22 estimulante, un intervalo de dosis moderadas con una respuesta nula o casi nula y un intervalo de dosis altas con una respuesta inhibitoria o tóxica (Vincent, 2007).
Figura 10. Gráfico dosis-respuesta de la hormesis
La luz UV-C induce a la resistencia a varios factores en tejidos vía hormesis, es decir, la iniciación de una reacción positiva bajo una dosis baja de radiación (Fonseca, 2009). Según Guerrero-Beltrán y G.Barbosa-Cánovas (2004), “cuando se aplica luz UV-C a las frutas o vegetales, además de reducir la carga microbiana en la superficie, se da un fenómeno llamado efecto hormético, este efecto ayuda a mejorar la resistencia a microorganismos como mohos y levaduras, ya que estimula la producción de fenilialanina amonio – liasa que induce la formación de compuestos fenólicos (fitoalexinas), que son tóxicos para éstos.”
Se han realizado numerosos estudios sobre hormesis, entre los cuales se puede citar:
23 En frutillas al aplicar radiación UV-C en dosis que van de 0.43 a 4.30 kJ/m2 se retrasó el ablandamiento del tejido que tiene influencia en antioxidantes y la actividad enzimática. Tratamientos utilizando dosis de hormesis, inducen la expresión de los genes de defensa, que evitan la degradación de la pared celular que controla el ablandamiento y defiende a la fruta contra enfermedades como aquellas causadas por Botrytis cinerea (Ribeiro, Canada & Alvarenga, 2012).
En tomates el tratamiento UV-C mejoró el valor nutricional y aumentó el nivel de licopeno sin modificar sus propiedades físicas. A dosis bajas aproximadamente de 4 kJ/m2, la radiación puede inducir la expresión de un número de genes de defensa, y suprimir la expresión de genes implicados en la pared celular de desmontaje, metabolismo lipídico y la fotosíntesis. Los genes de defensa retrasan el ablandamiento de tejidos, conservan los atributos nutricionales y sensoriales, ayudando a aumentar la vida útil de los frutos (Ribeiro et al., 2012).
En manzanas, la radiación UV-C aplicada (1.2 kJ/m2) ayuda en la desinfección de la superficie, detiene a las enzimas oxidativas, previene el oscurecimiento del tejido y desarrollo de malos olores. Además, ésta crea una película seca protectora que inhibe el crecimiento microbiano y el escape de jugo, esta película es muy delgada y no es percibida por los consumidores (Ribeiro et al., 2012).
2.7.2 USO DE LA RADIACIÓN UV-C COMO TRATAMIENTO
POSTCOSECHA
24 Este tipo de tratamiento se viene usando desde hace varios años, en diferentes tipos de productos postcosecha, con el objetivo de alargar la vida útil de éstos y evitar en lo posible el uso de químicos.
Algunos ejemplos del uso de radiación UV-C en productos postcosecha se describen a continuación:
Andrade, Moreno, Henríquez, Gómez y Concellón (2010), usaron radiación UV-C sobre carambola mínimamente procesada, alargando su tiempo de vida útil a 7 días, además que se redujo el crecimiento de mohos.
Para el control de Cenicilla polvorienta en fresas se utilizó luz UV-C, demostrando que es tan eficaz como usar tratamientos químicos. Con el tratamiento con UV-C el porcentaje de plantas infectadas fue del 2 al 3%, mientras que en aquellas que eran control el porcentaje fue del 14%. El porcentaje de fresas podridas fue un 1/3 más bajo que aquellas que formaban parte del grupo control (Reho, 2011).
En otro estudio realizado en fresas, se probaron 3 tiempos y 3 distancias diferentes de exposición a la luz UV-C, concluyendo que a una distancia de 40 cm y un tiempo de exposición de 7.5 minutos las características microbiológicas, físico – químicas y sensoriales eran aceptables (Beltrán, Ramos & Álvarez, 2010).
Estudios realizados sobre zapallo fresco cortado, mostraron que dosis de 2.08 y 3.14 kJ/m2, tuvieron efectos positivos en el control de la carga microbiana, además de las características sensoriales, además de que se extendió su vida útil (Sosa, 2009).
González-Aguilar et al. (2005), demostraron que dosis de radiación UV-C ≤10 minutos en frutos de mango, duraznos y nectarina, son
25
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 MATERIAL VEGETAL
El presente trabajo de investigación se realizó con mora de Castilla sin espinas (Andimora; código genético MA100), una variedad desarrollada por el INIAP (Martínez, 2010); cultivada en la provincia de Tungurahua, cantón Ambato, barrio Huachi sector La Magdalena.
Inmediatamente después de la cosecha los frutos de la mora se trasladaron al laboratorio de Biotecnología de la Universidad Tecnológica Equinoccial (Quito). La mora fue cosechada manualmente en perfecto estado, sin lastimaduras ni rasguños, es importante señalar que su estado de madurez no debía estar completamente desarrollado (rojizo), como se observa en la figura 11.
Figura 11. Mora de Castilla sin espinas (a) frutos y (b) selección de frutos para la cosecha
3.2 AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MOHOS EN
MORA
Para la primera fase de este estudio se procedió a aislar e identificar los mohos causantes de las pérdidas postcosecha en mora de Castilla sin
26 espinas (Rubus glaucus), con el fin de determinar la flora fúngica nativa de esta fruta.
Se pesó una muestra de 30 g de mora y se suspendió en 270 ml de agua destilada estéril, (dilución 10-1), se homogenizó y a partir de ésta se prepararon dos diluciones sucesivas (10-2 y 10-3), en tubos de ensayo que contenían 9 ml de agua destilada estéril. Se procedió a colocar 1 ml de cada dilución en placas petri por la técnica de vertido utilizando agar Sabouraud (Acumedia). Las muestras se incubaron de tres a cinco días a una temperatura de 25ºC.
Al finalizar el tiempo de incubación, se observaron los distintos tipos de moho que se podían distinguir según el tipo de colonia y color. Con la ayuda de una aguja de inoculación se tomó una porción del micelio y se inoculó en el centro de una caja petri con agar Sabouraud, con el objetivo de aislar la colonia. Cada moho aislado se incubó a 25ºC de tres a cinco días. Este procedimiento se repitió hasta obtener cultivos puros.
Para la identificación (determinación del género de los mohos aislados) se realizó una tinción con azul de lactofenol en una placa portaobjetos, se observó y comparó al microscocopio (modelo CX31 Olympus – Japón) la morfología del hongo con el manual Introductionto Food – Borne Fungi (Samson, Hoekstra, Frisvad & Filtenborg, 1995).
3.3 SELECCIÓN DE LA DOSIS EFECTIVA DE RADIACIÓN
UV-C
Para la selección de la mejor dosis de radiación UV-C, que controle el crecimiento de mohos en la mora, se realizó un ensayo denominado
27
3.3.1 PREPARACIÓN DEL INÓCULO
En la preparación del inóculo se usó las cepas fúngicas que previamente fueron aisladas e identificadas que tenían un crecimiento de siete días a 25ºC en agar Sabouraud.
Se preparó una suspensión de propágulos y micelios en una solución salina al 0,85% estéril. La concentración de esporas se determinó mediante el estándar de Mac Farland #2.
La escala de Mac Farland estima las poblaciones microbianas comparando índices de turbidez del estándar con los logrados del cultivo microbiano. Se prepara con cloruro de bario al 1% y ácido sulfúrico al 1% (Arcos, Ossa & Díaz, 2004). Su preparación se detalla en el Anexo I.
3.3.2 INOCULACIÓN
Se trabajó con el estándar de Mac Farland #2, el mismo que equivale a 6 x 108 UFC/ml, la turbidez se midió utilizando un espectrofotómetro (GENESYS 20 – Thermo Spectronic). Se inoculó 100µl de las suspensiones preparadas
por la técnica de extensión con perlas de vidrio estériles en placas petri con agar Sabouraud (figura 12).
28
3.3.3 TRATAMIENTO CON RADIACIÓN UV-C
Se procedió a poner las placas petri (destapadas) inoculadas en la cámara de radiación UV-C, bajo cuatro lámparas de luz UV-C (lámpara UV-C Germicidal G30T8), a una distancia de 30 cm y se irradiaron con dosis de 1, 3.2 y 5.8 kJ/m2, la intensidad de la radiación se midió con un radiómetro digital (UVX Radiometer UVP). Una vez irradiadas las muestras, se incubaron de tres a cinco días a 25ºC. Se trabajó con dos grupos de muestras, irradiadas (tratadas) como se observa en la figura 13, y no irradiadas (control) que sólo fueron inoculadas; ambas muestras se incubaron a 25ºC durante 5 días.
Figura 13. Aplicación de radiación UV-C en placas petri inoculadas con mohos
29
3.4 DETERMINACIÓN DE TIEMPO DE DESARROLLO
FÚNGICO DE MORA INOCULADA ARTIFICIALMENTE
Se colocó fruta sana recién cosechada en bandejas plásticas con tapa (de 250 g) y se inoculó mediante aspersión con la ayuda de un atomizador con una suspensión de esporas, según se indicó en la sección 3.3.1, de los hongos previamente aislados. Las bandejas se mantuvieron a temperatura ambiente y en la oscuridad. Cada dos días se determinó el índice de daño de la fruta.
Se prepararon 2 grupos: tratadas (inoculadas artificialmente) y bandejas control (fruta sana sin inoculación).
Para la evaluación del decaimiento que sufría la fruta se utilizó la siguiente escala subjetiva de desarrollo fúngico de 1 a 4, donde: 1 - 1.9 = no hay desarrollo; 2 – 2.9 = desarrollo ligero; 3 – 3.9 = desarrollo moderado; 4 = muy desarrollado; según la metodología utilizada por Cárdenas (2011), con una ligera modificación.
3.5 EFECTO DE LA RADIACIÓN UV-C SOBRE EL
CRECIMIENTO DE
Botrytis
Siendo Botrytis cinerea el principal hongo causante de pérdidas postcosecha, se determinó el efecto hormético que tiene la luz UV-C sobre este microorganismo. Se realizaron 6 tratamientos diferentes en la fruta que se describen en la Tabla 4.
30 UV-C. Para evaluar la efectividad del tratamiento en los dos casos, se sometió a iguales condiciones de incubación y almacenamiento frutos de mora sana sin inoculación artificial y sin tratamiento UV-C, y fruta sana inoculada artificialmente y tratada con luz UV-C.
La dosis utilizada coincide con la dosis que se seleccionó en un estudio previo del efecto de la radiación UV-C sobre el tiempo de vida útil de mora
de Castilla sin espinas almacenada en refrigeración (Padilla, 2013)
.
31
Tabla 4. Tratamientos aplicados a la mora de Castilla sin espinas recién cosechada
TRATAMIENTO DESCRIPCIÓN
T1: Fruta sana
(control)
Fruta recién cosechada. Se colocó en bandejas plásticas y se
almacenó a temperatura ambiente en completa oscuridad.
T2: Fruta +
Inoculación
Fruta inoculada artificialmente. Se preparó una suspensión de
esporas, como se señaló en la sección 3.3.1. Se inoculó la fruta
mediante aspersión con un atomizador y se colocó en bandejas
plásticas. Se almacenó a temperatura ambiente en completa
oscuridad.
T3: Fruta +
Radiación UV-C
(1kJ/m2)
Fruta recién cosechada tratada con radiación UV-C. Se irradió la
fruta a 1kJ/m2 tanto la parte superior como la inferior y se colocó
en bandejas plásticas. Se almacenó a temperatura ambiente en
completa oscuridad.
T4: Fruta +
Radiación UV-C
(1 kJ/m2) +
Inoculación
Fruta recién cosechada tratada con radiación UV-C y
posteriormente inoculada con Botrytis. Se preparó una suspensión de esporas, como se señaló en la sección 3.3.1. Se inoculó la fruta
mediante aspersión con un atomizador y se irradió a 1kJ/m2. Se
colocó en bandejas plásticas y se almacenó a temperatura
ambiente en completa oscuridad.
T5: Fruta +
Inoculación +
Tratamiento
UV-C (1kJ/m2)
Fruta recién cosechada inoculada con Botrytis y posteriormente tratada con radiación UV-C. Se preparó una suspensión de
esporas, como se señaló en la sección 3.3.1. Se inoculó la fruta
mediante aspersión con un atomizador y se irradió a 1kJ/m2. Se
colocó en bandejas plásticas y se almacenó a temperatura
ambiente en completa oscuridad.
T6: Fruta +
Radiación UV-C
(1kJ/m2) +
Inoculación +
Tratamiento
UV-C (1kJ/m2)
Fruta recién cosechada tratada con radiación UV-C posteriormente
inoculada con Botrytis y nuevamente tratada con radiación UV-C. Se preparó una suspensión de esporas, como se señaló en la
sección 3.3.1. La mora se irradió a 1kJ/m2 tanto la parte superior
como la inferior, se inoculó, con la suspensión de esporas
mediante aspersión con un atomizador e inmediatamente se las
expuso a radiación de 1kJ/m2. Se empacó en bandejas plásticas a
32
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MOHOS EN
MORA
Una vez obtenidas las cepas puras los hongos que se identificaron fueron los siguientes:
Mucor spp. (figura 14a y 14b)
Figura 14. Mucor spp. (a) Cultivo luego de 5 días de incubación en agar Sabouraud a 25ºC y (b) observación microscópica (100x)
Fusarium spp. (figura 15a y 15b)
Figura 15. Fusarium spp. (a) Cultivo luego de 5 días de incubaciónen agar Sabouraud a 25ºC y (b) observación microscópica (100x)
a b
33 Penicillium spp. (figura 16a y 16b)
Figura 16. Penicillium spp .(a) Cultivo luego de 5 días de incubaciónen agar Sabouraud a 25ºC y (b) observación microscópica (100x)
Alternaria spp. (figura 17a y 17b)
Figura 17. Alternaria spp. (a) Cultivo luego de 5 días de incubaciónen agar Sabouraud a 25ºC y (b) observación microscópica (100x)
a b
34 Cladosporium spp.(figura 18a y 18b)
Figura 18. Cladosporium spp. (a) Cultivo luego de 5 días de incubación en agar Sabouraud a 25ºC y (b) observación microscópica (100x)
Botrytis spp.(figura 19a y 19b)
Figura 19. Botrytis spp. (a) Cultivo luego de 5 días de incubación en agar Sabouraud a 25ºC y (b) observación microscópica (100x)
Los hongos nombrados anteriormente en general causan pérdidas postcosecha en frutas y vegetales. En este sentido, estudios realizados en Colombia con fresas determinaron que hongos de los géneros Alternaria,
a b
35 Aspergillus, Botrytis, Cladosporium, Epicoccum, Fusarium, Geotrichum,
Mucor, Penicillium y Rhizopus son causantes de pérdidas postcosecha en este producto (Cordero, Yánez, Angel & Gálvez, 2003). Así mismo se realizaron aislamientos e identificación en diferentes frutas y hortalizas como: aguacate, manzana, carambola, papa, cebolla, uva, mandarina, entre otros y los hongos que causaban pérdidas postcosecha fueron: Alternaria, Fusarium, Penicillium, Mucor, Botrytis, Rhizopus, Geotrichum;alterando el aspecto físico, valor nutricional y disminuyendo el tiempo de conservación de estos productos(Trigos, Ramírez & Salinas, 2008). Gran parte de estos hongos se encontró en la mora de Castilla sin espinas, siendo microorganismos propios de la fruta que bajo malas prácticas de manipulación y almacenamiento pueden llegar a desarrollarse y disminuir su vida útil.
4.2 SELECCIÓN DE LA DOSIS EFECTIVA DE RADIACIÓN
UV-C
Se probaron 3 diferentes dosis: 1, 3.2 y 5.8 kJ/m2. La primera (1 kJ/m2) fue la que mejores resultados produjo en cuanto al control del crecimiento de los diferentes hongos. En las tablas 5 (Mucor spp.), 6 (Fusarium spp.), 7 (Penicillium spp.), 8 (Alternaria spp.), 9 (Cladosporium spp.) y 10 (Botrytis spp.); se puede observar el efecto de la radiación UV-C sobre el desarrollo de estos hongos durante el almacenamiento.
36
Tabla 5. Desarrollo de Mucor spp. tratado con diferentes dosis de radiación UV-C
Mucor spp.
Tiempo de incubación
25 °C (días)
Tratamiento Radiación UV-C
Control 1 kJ/m2 3.2 kJ/m2 5.8 kJ/m2
3
4
5
37 En la tabla 6 se observa el desarrollo de Fusarium spp. donde existió crecimiento en todas las muestras, sin embargo en la muestra con radiación de 1 kJ/m2 es la que mayor reducción tiene con respecto a las otras dos dosis y la muestra control.
Tabla 6. Desarrollo de Fusarium spp. tratado con diferentes dosis de radiación UV-C
Fusarium spp.
Tiempo de incubación
25 °C (días)
Tratamiento Radiación UV-C
Control 1 kJ/m2 3.2 kJ/m2 5.8 kJ/m2
3
4
38 En el ensayo realizado con Penicillium spp. (tabla 7) tanto la dosis de 1 kJ/m2 como la dosis de 5.8 kJ/m2 tuvieron un comportamiento similar en la reducción del desarrollo de este microorganismo, sin embargo en el día tres la dosis de 1 kJ/m2 presentó un mejor resultado.
Tabla 7. Desarrollo de Penicillium spp. tratado con diferentes dosis de radiación UV-C
Penicillium spp.
Tiempo de incubación
25 °C (días)
Tratamiento Radiación UV-C
Control 1 kJ/m2 3.2 kJ/m2 5.8 kJ/m2
3
4
39
Tabla 8. Desarrollo de Alternaria spp .tratado con diferentes dosis de radiación UV-C
Alternaria spp.
Tiempo de incubación
25 °C (días)
Tratamiento Radiación UV-C
Control 1 kJ/m2 3.2 kJ/m2 5.8 kJ/m2
3
4
5
40
Tabla 9. Desarrollo Cladosporium spp. tratado con diferentes dosis de radiación UV-C
Cladosporium spp.
Tiempo de incubación
25 °C (días)
Tratamiento Radiación UV-C
Control 1 kJ/m2 3.2 kJ/m2 5.8 kJ/m2
3
4
5
41 Los resultados obtenidos en el ensayo con Botrytis spp. se observan en la tabla 10. En el día tres de incubación las muestras tratadas con la dosis de radiación de 1 kJ/m2 presentaron menor crecimiento de este hongo, en las muestras en las que se aplicaron dosis de 3.2 y 5.8 kJ/m2 el crecimiento fue elevado. El efecto germicida de la radiación UV-C depende del tipo de microorganismo, concentración y de la dosis aplicada.
Tabla 10. Desarrollo de Botrytis spp. tratado con diferentes dosis de radiación UV-C
Botrytis spp.
Tiempo de incubación
25 °C (días)
Tratamiento Radiación UV-C
Control 1 kJ/m2 3.2 kJ/m2 5.8 kJ/m2
3
4
42 Es fundamental medir la dosis que se vaya a aplicar, la misma que dependerá de la naturaleza del producto. Si ésta es menor a la que se requiere, los microorganismos no se ven afectados, y si es mayor a la requerida la fruta sufrirá daños irreversibles (Anónimo, 2013). Las placas que fueron irradiadas con 3.2 y 5.8 kJ/m2 presentaron un alto índice de crecimiento, por lo tanto, se pudo determinar quela dosis que permitió el control del desarrollo fúngico fue la de 1 kJ/m2. En estudios similares en hojas de espinaca en las que se aplicaron dosis de 2.4, 7.2, 12 y 24 kJ/m2, se determinó que las dosis de 2.4 y 24 kJ/m2 redujeron el crecimiento de bacterias como Listeria monocytogenes y Salmonella entérica (Escalona, Aguayo, Martínez-Hernández & Ártes, 2010) en un ensayo in vitro. A diferencia de Beltrán et al. (2010), que realizaron estudios para determinar la distancia y el tiempo de radiación óptima para reducir carga microbiana en frutillas, obteniendo resultados favorables en todas las condiciones ensayadas (combinación de 3 distancias y 3 tiempos de radiación), sin embargo se definió que la mejor combinación fue la que se realizó a una distancia de 40 cm y un tiempo de 7,5 minutos. Así mismo en lechuga “hoja de Roble” se probaron diferentes dosis de radiación (1.18, 2.37 y 7.11 kJ/m2
) mostrando todas resultados efectivos, no obstante la dosis más alta tuvo mayor impacto sobre la flora microbiana, a pesar de que a los 7 días de almacenamiento (5ºC) la lechuga empezó a presentar senescencia (Allende, McEvoy, Luo, Artes & Wang, 2006); es importante determinar la dosis óptima de radiación que reduzca la carga microbiana y mantenga las características del producto, razón por la cual se seleccionó la dosis de 1 kJ/m2 para posteriores ensayos.
4.3 DETERMINACIÓN DE TIEMPO DE DESARROLLO
FÚNGICO EN MORA INOCULADA ARTIFICIALMENTE
43 artificialmente; se realizó un análisis cualitativo a través de un índice de decaimiento, usando una escala subjetiva de 1 a 4, donde 1 – 1.9 = no hay desarrollo, 2 – 2.9 = desarrollo ligero, 3 – 3.9 = desarrollo moderado y 4 = muy desarrollado. Las muestras se compararon con un control (mora sin inoculación artificial). Los resultados que se obtuvieron se muestran en la Tabla11. Para un mejor entendimiento ver el Anexo II.
Tabla 11. Índice de decaimiento de mora de Castilla durante el tiempo de inoculación
Inóculo
Tiempo de incubación a 25 ºC (días)
0 2 4 6
Índice de decaimiento
Mucor 1 1 2.5 3.3
Penicillium 1 1 2.5 3.4
Fusarium 1 1 2.3 3.6
Alternaria 1 1 2 3.5
Cladosporium 1 1 2.5 3.5
Botrytis 1 1 3.5 4
Control 1 1 2.5 3.1
44 Estudios con Botrytis han demostrado su predominio sobre la flora nativa de frutilla (Fraire, Yánez, Nieto & Vázquez, 2003) y brócoli (Fraire et al., 2010), en los que se observó crecimiento a partir de las 48 horas de inoculación.
45
Mucor Penicillium
Fusarium Alternaria
Cladosporium Botrytis
Control
46
4.4 EFECTO DE LA RADIACIÓN UV-C SOBRE EL
CRECIMIENTO DE
Botrytis
En investigaciones realizadas acerca de los efectos de radiación UV-C se afirma que los mecanismos de resistencia al decaimiento son inducidos y activados por la radiación UV-C y el mecanismo por el cual el tratamiento de radiación UV-C reduce el desarrollo del decaimiento de la fruta se puede relacionar con el incremento de compuestos antifúngicos en la piel de la fruta (González-Aguilar, Wang, Buta & Krizek, 2001; Mercier, Roussel, Charles & Arul, 2000). La radiación tiene resultados positivos en el control de enfermedades en las frutas (Khademi, Zamani, Ahmadi & Kalantari, 2013; Latorre, Rojas, Díaz & Chuaqui, 2012).
Figura 21. Crecimiento de Botrytis en mora almacenada a temperatura ambiente
La radiación UV-C mata a los conidios de Botrytis tanto los que se cultivan in vitro como in vivo en heridas de frutas, (Mercier, Baka, Reddy, Corcuff & Arul, 2001); los resultados obtenidos de los recuentos de UFC/g de Botrytis en la mora almacenada a temperatura ambiente con diferentes tratamientos
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5
0 1 2 3 4 5 6
L
o
g
UFC
/g
Tiempo de almacenamiento (días)
47 se encuentran en la figura 21. En las figuras 22 y 23 se puede observar el desarrollo del hongo sobre la fruta inoculada artificialmente.
Tratamiento Tiempo de almacenamiento (días)
2 4 6
T1
T2
T3
Figura 22. Desarrollo de Botrytis con tratamientos T1, T2 y T3 en los días 2, 4 y 6 a temperatura ambiente
La muestra T1 (control) presentó una mayor carga microbiana en comparación al resto de los tratamientos, se observó un incremento de 1.1 unidades logarítmicas a lo largo del periodo de almacenamiento (figura 21), la muestra control permitió evaluar el desarrollo de la flora nativa de la fruta
a b c
d e f
48 por lo que se tomó como base frente al resto de tratamientos. Cuando la fruta fue inoculada artificialmente con Botrytis (tratamiento T2) se observó en el día dos mayor población que en los demás tratamientos (figura 22e) presentando un incremento de 1.8 unidades logarítmicas con respecto al día inicial, a partir de éste día la población disminuyó y se mantuvo constante hasta el final del almacenamiento (figura 21). Este comportamiento probablemente estaría relacionado con la competencia que podría existir entre la flora nativa con el inóculo de Botrytis añadido al fruto.
Se ha comprobado el efecto germicida de la radiación UV-C en frutos como manzanas (Manzocco et al., 2011), cítricos (Kinay, Yildiz, Sen, Yildiz & Karacali, 2005), entre otros. Cuando se aplicó la dosis de 1 kJ/m2 (tratamiento T3), se observó una disminución de 0.5 unidades logarítmicas de la carga microbiana con respecto a las muestras control (figura 21), comprobándose su efecto germicida (figura 22g), pese a que entre el día dos y día seis se produjo un incremento a razón de 0.204 UFC/g•día; en las muestras control este incremento fue de 0.158 UFC/g•día. La aplicación de
dosis bajas de radiación UV-C como tratamiento postcosecha retrasó el desarrollo de la flora nativa de mora por dos días. Así mismo la radiación UV-C en mango, durazno y nectarina resultó ser eficiente para disminuir el deterioro fúngico (González-Aguilar et al., 2005).
49 desarrollo fúngico que las muestras control (figuras 22a, 22b, 22c, 23a, 23b y 23c).
Tratamiento Tiempo de almacenamiento (días)
2 4 6
T4
T5
T6
Figura 23. Desarrollo de Botrytis con tratamientos T4, T5 y T6 en los días 2, 4 y 6 a temperatura ambiente
En el día cero el tratamiento T5, en el que se evaluó el efecto de la radiación UV-C posterior a la inoculación artificial, presentó una disminución de 0.7 unidades logarítmicas en comparación con las muestras control; a diferencia
a b c
d e f
50 de los resultados obtenidos con el tratamiento T4 en el que se reportó una efectividad aproximada del 50% superior a la obtenida con T5 (Tabla 12).
Tabla 12. Desarrollo de Botrytis en mora de Castilla sin espinas
Tratamiento
Tiempo de almacenamiento (días)
0 2 4 6
Log10 UFC/g
T1 3.0556 3.5722 3.4945 4.1407 T2 2.2749 4.0524 3.3266 3.4335 T3 2.5096 3.2317 3.4262 3.8064 T4 1.6766 1.4259 2.6151 3.8325 T5 2.3117 1.7781 2.4586 3.4934 T6 1.6368 2.6401 3.2810 3.6861
La reducción de la población observada indicaría el efecto fungicida que tiene la radiación UV-C (1 kJ/m2), que se basa en la alteración que produce la irradiación en el ADN de la célula, lo que impide su proliferación y por ende la reducción de la carga microbiana en el producto (Domínguez & Parzanese, s.f.); sin embargo es importante observar si existe una carga microbiana alta, ya que el efecto de la radiación UV-C se puede ver reducido por lo que probablemente necesitaría dosis más altas para su control (Cárdenas, 2011). Se observó un comportamiento similar en el crecimiento fúngico (días dos, cuatro y seis) entre los tratamientos T4 y T5, evidenciándose una tasa de crecimiento de 0.65 y 0.61 UFC/g•día,
respectivamente; manteniendo T4 menos desarrollo fúngico hasta el día dos de almacenamiento. Este resultado es similar al observado en frutillas tratadas con radiación UV-C, donde la infección fúngica se hizo visible a partir de las 72 horas post-inoculación, estando éstas a temperatura ambiente (Nigro, Ippolito, Lattanzio, Venere & Salerno, 2000; Pombo, 2009).
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5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1 CONCLUSIONES
Se aisló e identificó los principales mohos causantes de pérdidas postcosecha en mora de Castilla sin espinas: Mucor, Fusarium, Alternaria, Penicillium, Cladosporium y Botrytis.
La aplicación de dosis bajas de radiación UV-C (1, 3.2 y 5.8 kJ/m2) redujo el desarrollo fúngico de los mohos en el ensayo in vitro, sin embargo la dosis de 1 kJ/m2 presentó mejores resultados (mayor inhibición) por lo que se seleccionó para evaluar su efecto hormético sobre frutos de mora de Castilla sin espinas.
La inoculación artificial de hongos en mora produjo deterioro de la fruta entre los días dos y cuatro. En el día cuatro, Botrytis fue el hongo que presentó mayor crecimiento sobre la fruta produciendo la pérdida de la calidad comercial de la fruta para este día de almacenamiento, mientras que los frutos inoculados con los hongos Mucor, Fusarium, Alternaria, Penicillium y Cladosporium, si bien presentaron deterioro, fue en menor proporción. Debido a que Botrytis es el principal moho causante de pérdidas postcosecha en este fruto, fue seleccionado para evaluar el efecto de la radiación UV-C sobre su desarrollo.
Se comprobó el efecto hormético y fungicida de la radiación UV-C (1 kJ/m2) en mora, ya que el tratamiento retrasó el crecimiento de Botrytis durante cuatro días, tanto al realizar la inoculación del hongo posterior al tratamiento UV-C en la mora como cuando los frutos fueron tratados luego de la inoculación.
