INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS
CAMBIOS BIOQUÍMICOS INDUCIDOS EN CEBOLLA POR LA INOCULACIÓN CON
Trichoderma harzianum Y SU RELACIÓN CON EL CONTROL DE
Sclerotium rolfsii
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRIA EN CIENCIAS
EN
MANEJO AGROECOLÓGICO DE PLAGAS Y ENFERMEDADES
PRESENTA
JAIME ALBERTO APARICIO BELLO
El presente trabajo se realizó en el laboratorio de cultivo de células vegetales del Departamento de Biotecnología y en el laboratorio de fitopatología del Departamento de Interacciones Planta-Insecto del Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional bajo la dirección de los Drs. Gabriela Sepúlveda Jiménez y Roberto Montes Belmont. Para la realización de los estudios se conto con el apoyo económico de CONACyT (becario No. 220003) y del Programa Institucional de Formación de Investigadores de la Secretaría de investigación y Posgrado (SIP) del IPN. La investigación fue realizada con el financiamiento otorgado a los proyectos de la SIP (No. 20090293 y 20100781).
AGRADECIMIENTOS
A la Doctora Gabriela Sepúlveda Jiménez, por darme la oportunidad de integrarme en su grupo de trabajo, ser director de Tesis y apoyarme en cada paso dentro de la Maestría. Al Doctor Roberto Montes Belmont Belmont, por todas las correcciones y paciencia que le aplicó a este trabajo.
Al Doctor Ángel René Arzuffi Barrera, por las valiosas observaciones enfocadas a generar una investigación más seria.
A la Maestra en Ciencias Leticia Bravo Luna, por la confianza y motivación que imprimió en esta investigación.
A la Doctora Emma Zavaleta Mejia, por el esfuerzo e interés que mostró en la realización de la investigación y mi formación.
A la Maestra Hilda Elizabet Flores Moctezuma, por la confianza que puso en mi persona, pero sobre todo por su disponibilidad incansable para esta investigación.
A las Licenciadas Elvia Sosa, Vanessa Yañez y Sara Bahena por la infinidad de apoyos y consejos que me dieron dentro del Posgrado .
Al Concejo Nacional de Ciencia y Tecnología, al Programa Institucional de Formación de Investigadores y a la Secretaria de investigación y Posgrado por las becas otorgadas para la realización de mis estudios.
A la Secretaria del Medio Ambiente y Recursos Naturales, por haber confiado en mis capacidades y proyecto, en especial a los Ingenieros. Noel Cruz, Raúl Molina, Armando Sánchez, al Prof. Daniel Vega y a los licenciados Jerusalén López y Oscar Bernabé
A mi familia, pilar principal de mi formación, amigos, compañeros y mi pareja por todos los apoyos en momentos críticos de mi formación.
Gracias, a ese ser tan grande y indescriptible que me dio la posibilidad de ser, conocer y aprender de la vida.
A mis padres y hermanos por estar presentes en cada logro y tropiezo de mi existencia, gracias por no perder la fe en mí.
A mis abuelos, tíos y primos por ser tan grandes y cariñosos con mi persona. En espacial para ti Bogart Ignacio+, si empre fuiste una inspiración para mí.
A todos mis amigos que fui cosechando dentro del Posgrado: Humberto, Raúl, Jorge, Jan, Meli, Nadia, Lili, Memo, Layo, Blancas, Edith, por todos los momentos chidos que pasamos. Ya casi la hacemos compadrito!!
A mi pareja, que en todo momento me demostró su cariño y apoyo incondicional, gracias por estar junto a mí, infinitamente gracias Eva.
I
Contenido
Página
Índice I
Índice de cuadros III
Índice de figuras IV Resumen V Abstract VII 1. INTRODUCCIÓN 1 2. REVISIÓN DE LITERATURA 3 2.1 Generalidades de la cebolla 3
2.2 Diferencias químicas entre las variedades de cebolla 5 2.3 Enfermedades en cebolla causadas por hongos de suelo 6
2.4 Generalidades de Trichoderma 7
2.5 Efecto de Trichoderma en las plantas 9
2.6 Efecto de Trichoderma en otros hongos 12
2.7 Generalidades de Sclerotium rolfsii 14
2.8 Sclerotium rolfsii en las plantas 15
2.9 Métodos de control de Sclerotium rolfsii 17
3. JUSTIFICACIÓN 19
4. OBJETIVOS 20
5. MATERIALES Y MÉTODOS 21
5.1 Variedades de cebolla 21
5.2 Cepas de hongos utilizadas 21
5.3 Tratamiento con T. harzianum de las semillas de cebolla y evaluación de la germinación
22
5.4 Evaluación del efecto de T. harzianum en el desarrollo de las plantas
23
II
5.6 Determinación del contenido total de flavonoides 26
5.7 Evaluación de la actividad de peroxidasa 27
5.8 Obtención de extractos acuosos de bulbos de cebolla 28 5.9 Efecto de extractos acuosos de bulbos sobre el crecimiento
micelial y producción de esclerocios de Sclerotium rolfsii.
28
5.10 Efecto de la inoculación de T. harzianum en el desarrollo de la severidad de Sclerotium rolfsii
29
6. RESULTADOS 32
6.1 Efecto del tratamiento con T. harzianum en la germinación de las semillas
32
6.2 Desarrollo de la planta en presencia de T. harzianum. 35 6.3 Contenido de compuestos fenólicos en plántulas ybulbos 37 6.4 Contenido de flavonoides totales en plántulas y bulbos. 40 6.5 Actividad de la enzima peroxidasa en bulbos de 8 semanas. 42 6.6 Efecto de extractos acuosos de bulbos sobre el crecimiento
micelial y el número de esclerocios de Sclerotium rolfsii.
6.7 Efecto de la inoculación con Sclerotium rolfsii en bulbos de plantas de cebolla de 8 semanas
43
45
7. DISCUSIÓN 47
8. CONCLUSIONES 53
III
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro Página
1. Principales enfermedades de la cebolla en el estado de Morelos. 6
2. Germinación de las semillas de las tres variedades de cebolla tratadas
con T. harzianum.
33
3. Peso total, de bulbos, hojas y raíz de plantas de 8 semanas tratadas con
T. harzianum.
37
4. Crecimiento micelial de S. rolfsii en presencia de extractos acuosos de
bulbos.
44
5. Efecto de extractos acuosos de bulbos en el número de esclerocios. 45
6. Efecto de S. rolfsii en el índice de severidad y número de esclerocios
presentes en bulbos tratados con T. harzianum.
IV
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura Página
1. Situación nacional de la producción de cebolla. 4
2. Germinación de semillas de la variedad blanca, morada y roja tratadas
con T. harzianum.
34
3. Aspecto de las plantas a las 8 semanas de tratamiento con T. harzianum
y su control
36
4. Contenido de compuestos fenólicos en plántulas de 8 días. 38
5. Contenido de compuestos fenólicos en bulbos de 8 semanas. 39
6. Contenido de flavonoides totales en plántulas de 8 días. 40
7. Contenido de flavonoides totales en bulbos de 8 semanas. 41
V
Resumen
Este trabajo tuvo como objetivo evaluar el crecimiento, el contenido de compuestos fenólicos, flavonoides totales y la actividad de peroxidasa en tres variedades de cebolla con diferentes grados de pigmentación inoculadas con Trichoderma harzianum y la relación con el control a Sclerotium rolfsii. Las variedades de cebolla utilizadas fueron: Cristal White (blanca), Red Satan (roja) y Mata Hari (morada). Las semillas de cada variedad fueron germinadas con sustrato inoculado con T. harzianum cepa Tc74. T. harzianum tuvo un efecto diferencial en la germinación de las semillas que dependió de la variedad. Únicamente en la variedad blanca, T. harzianum estimuló la germinación. Las plantas de 8 semanas inoculadas con T. harzianum, aumentaron 3 veces su peso total, el de los bulbos de 2 a 3 veces, el de las hojas hasta 3 veces y el de raíces de 7 a 11 veces. Las variedades roja y blanca fueron las más beneficiadas por el tratamiento con T. harzianum.
En plántulas, el contenido de compuestos fenólicos se incrementó con respecto a su control, en un 43.5, 48 y 13 % en las variedades blanca, morada y roja; mientras que el de flavonoides fue 43.5, 51.6 y 16 % más alto en las tratadas que en las control de las variedades blanca, morada y roja. En el caso de los bulbos, el tratamiento con T. harzianum incrementó el contenido de compuestos fenólicos con respecto a su control, en un 20, 70 y 30 % en las variedades blanca, morada y roja. Únicamente en los bulbos de la variedad blanca se encontraron diferencias en el contenido de flavonoides entre las muestras tratadas y el control.
Solamente, en los bulbos de las variedades blanca y morada de las plantas inoculadas con
VI
El crecimiento del micelio solamente disminuyó en presencia de los extractos acuosos de los bulbos de la variedad roja tratada y el número de esclerocios de S. rolfsii no se afectó con los extractos acuosos de bulbos de cebollas sin tratar o tratadas con T. harzianum. Sin embargo, las tres variedades tratadas con T. harzianum tuvieron una menor severidad de la enfermedad por S. rolfsii. Las variedades pigmentadas tratadas con T. harzianum tuvieron una disminución en sus valores de severidad más evidentes que la variedad blanca.
Todos los resultados muestran que el efecto de T. harzianum en la respuesta bioquímica y la resistencia a S rolfsii están relacionadas con el grado de pigmentación de la variedad de cebolla.
VII
Abstract
The objective of this work was to evaluate the development, total content of phenolic compounds and flavonoids, and peroxidase activity from three onion varieties with different pigmentation and inoculated with Trichoderma harzianum and their relationship with the control of Sclerotium rolfsii. The onion varieties used were: Cristal White (white), Red Satan (red) y Mata Hari (purple). Seeds of each variety were germinated with substrate inoculated with T. harzianum strain Tc74. T. harzianum had a differential effect in the seeds germination that it was depended of the variety. Only, T. harzianum stimulated the seed germination of the white variety. In plants of 8 weeks inoculated with T. harzianum had an increase of the total weight (3 times), of the weight of bulbs (2 to 3 times), of leaves (3 times), and roots (7 to 11 times). The red and white varieties were the most favored by the treatment with T. harzianum.
In the seedling, the content of phenolic compounds increased with respect to its control, in a 43.5, 48 y 13 % in the varieties white, purple and red; while the flavonoid content were 43.5, 51.6 y 16 % higher in the treated samples than in the control of the varieties white, purple and red, respectively. In the case of bulbs, the treatment with T. harzianum increased the content of phenolic compounds with respect to its control, in a 20, 70 and 30 % in the varieties white, purple and red. Only, it was found difference in the flavonoid content of bulbs of the white variety.
Only, bulbs of the white and purple varieties inoculated with T. harzianum showed a increase from 2 to 5 times in the peroxidase activity.
VIII
The mycelium growth decreased in the presence of the aqueous extracts of bulbs from the treated red variety and the esclerotia number of S. rolfsii was not affected by the aqueous extracts of onions bulbs without treatment and treated with T. harzianum. However, the three varieties treated with T. harzianum had a lower disease severity by S. rolfsii. The pigmented varieties treated with T. harzianum had a decrease in their severity values more evident than the white variety.
All the results showed that the effect of T. harzianum in the biochemical response and the resistance to S. rolfsii are related with the degree of pigmentation of the onion variety.
1
1. INTRODUCCIÓN
Las variedades de cebolla no pigmentadas son menos resistentes a las enfermedades que las variedades pigmentadas, debido probablemente a diferencias en el contenido de compuestos antimicrobianos. Walker et al. (1929) mostraron que cebollas moradas presentaron una mayor resistencia al “carbón” causado por Colletotrichum circinans presentaron un mayor contenido de los compuestos fenólicos, ácido protocatéquico y catecol; en tanto, las cebollas blancas fueron susceptibles y no se encontraron estos compuestos.
En el caso específico del “tizón sureño de la cebolla” causado por el hongo Sclerotium
rolfsii, una evaluación de resistencia en variedades utilizadas en el estado de Morelos
mostró que las variedades Blanca Morelos, Early supreme y Mata Hari fueron las menos susceptibles; por lo que puede existir una relación entre la resistencia a este patógeno y los compuestos químicos presentes en estas variedades (Hernández-Jiménez et al., 2004).
Los métodos de control químico de Sclerotium spp. causan contaminación del ambiente, por lo que se propone emplear técnicas de control. En diversos cultivos, hongos del género
Trichoderma son empleados como control biológico, con la ventaja de inhibir el desarrollo
del patógeno e inducir respuestas de defensa en la planta, tales como la producción de compuestos antimicrobianos y la actividad de enzimas como quitinasas, glucanasas y peroxidasas. En particular, en ensayos in vitro se conoce que Trichoderma harzianum, cepa Tc74 por parasitismo y antagonismo inhibe el desarrollo y propagación de Sclerotium
2
se inducen en la cebolla por el tratamiento con T. harzianum Tc74 y tampoco se conoce si esto es dependiente de la variedad.
3
2. REVISIÓN DE LITERATURA.
2.1 Generalidades de la cebolla
La cebolla (Allium cepa L) es una planta ampliamente cultivada en el mundo que se originó en Asia Central; muy cerca de Persia donde su cultivo se difundió por todas las regiones del mundo (SIIT, 2009).
La cebolla forma parte de la familia de las Liliáceas. Es una planta bianual, de tallo subterráneo y reducido. El bulbo es un engrosamiento subterráneo del tallo de la planta. La raíz está formada por los filamentos que nacen en la parte inferior del bulbo. La cebolla presenta un sistema radicular formado por numerosas raicillas fasciculadas, de color blanquecino, poco profundas, que salen a partir de un tallo a modo de disco o "disco caulinar". Las hojas son generalmente suaves de forma tubular, tienen una parte basal, formada por las "vainas foliares" engrosadas como consecuencia de la acumulación de sustancias de reserva, y otra terminal, que es la parte verde y fotosintéticamente activa de la planta. Se reproducen por semillas o por pequeños bulbos plantados (SIIT, 2009).
La cebolla contiene, lecitina, pectina, vitaminas B1, B2, B6, C, E y aminoácidos (Corzo et
al., 2007). Es rica en compuestos fenólicos, y flavonoides, que funcionan como
antioxidantes (captación de radicales libres). En particular, la quercetina es el flavonoide antioxidante que representa más del 95% de los flavonoides totales (Rodríguez et al., 2008).
4
Debido a la actividad antimicrobiana que la cebolla posee se recomienda su uso para el control del crecimiento microbiano (Pszczola, 2002).
Varios compuestos activos de la cebolla como la alicina, trisulfuro de dialilo, el ajoene y el fistulosin (octadecyl 3-hidroxiindol) destruyen las células de hongos patógenos (Corzo et
al., 2007).
A nivel mundial, México es el primer productor de cebolla en fresco con más de un millón de toneladas por año. Los principales estados productores son Chihuahua, Baja California, Tamaulipas, Michoacán, Guanajuato y Morelos. En el estado de Morelos, la producción total anual reportada en el 2009 fue de 49 170 000 toneladas, ubicándose en el séptimo lugar de la producción nacional (Figura 1). Entre los principales municipios productores de cebolla se encuentran Axochiapan, Ayala, Tepalcingo, Cuautla y Jonacatepec. (OEIDRUS, 2009 SAGARPA, 2009).
5
2.2 Diferencias químicas entre las variedades de cebolla
Las cebollas son ricas en flavonoides y en compuestos azufrados (sulfóxido alkyl cisteína), responsables de su aroma. Entre los flavonoides, las antocianinas son los responsables del color rosado o violáceo de determinadas variedades de cebolla.
Coşkuntuna y Özer (2008) reportan que los compuestos antifúngicos como los fenoles solubles en agua y flavonas, podrían ser parte de la resistencia en la cebolla a la germinación de esporas y la penetración de hongos patógenos.
Por otro lado, las variedades de cebolla también difieren en su contenido de compuestos fenólicos que pueden estar relacionados con la resistencia ante el ataque de ciertos patógenos (Walker et al., 1929). Abundando en esta investigación en estudios posteriores se encontró que las cebollas pigmentadas contienen ácido protocatéquico y catecol en mayor proporción que las cebollas no pigmentadas. Probablemente las diferencias en el contenido de estos compuestos estén relacionadas con la resistencia al hongo
Colletotrichum circinans. Las pruebas in vitro mostraron que el catecol es el doble de
efectivo que el ácido protocatéquico en el control del desarrollo del patógeno
Colletotrichum circinans (Link y Walker 1933).
Las variedades pigmentadas de la cebolla presentan una mayor cantidad de compuestos fenólicos y de la actividad antioxidante que las variedades no pigmentadas. Al respecto, Prakash et al., (2007) reportan que las capas externas de los bulbos en la variedad roja contiene un mayor contenido de compuestos fenólicos que la variedad blanca. Esto se correlacionó con una mayor capacidad antioxidante en la variedad roja que en la variedad blanca.
6
2.3 Enfermedades en cebolla causadas por hongos de suelo
Como varias plantas hortícolas, la cebolla es atacada por varios microorganismos que reducen su productividad y calidad. Los patógenos más comunes que atacan las raíces y bulbos de la cebolla son del género Pythium, Fusarium, Rhizoctonia y Sclerotium ((Lara y García, 1995; Entwistle, 1990). Para el estado de Morelos, Montes et al. (2003) reportan que en los almácigos de los principales municipios productores de cebolla, se encontró principalmente la incidencia de patógenos de los géneros Fusarium, Rhizoctonia,
Curvularia, Phoma, Alternaria, Sclerotium, Bipolaris, Rhizopus y Penicillium. De todos
estos, Fusarium, Sclerotium y Colletotrichum fueron los que más daños causaron a la cebolla con una incidencia de 82, 89 y 39 % respectivamente (Cuadro 1).
Cuadro 1. Principales enfermedades de la cebolla en el estado de Morelos.
Enfermedad Agente causal Presencia
Pudrición de bulbo y raíz Fusarium oxysporum Campo y almacén (82%)
Tizón sureño Sclerotium rolfsii Campo y almacén
(89%) Ahumado de la cebolla Colletotrichum circinans Campo
(39 %) Montes et al., 2003.
7
2.4 Generalidades de Trichoderma
En laboratorio, los cultivos de Trichoderma en un inicio tienen color blanco posteriormente toman un color verde brillante con esporulación densa, debido a los conglomerados de conidios que se forman en las puntas de las hifas. El micelio es en su mayoría ralo y fino. Los conidióforos son ramificados, parecen un árbol pequeño y presentan como penachos compactados que forman anillos con un sistema de ramas irregular de manera piramidal. Terminan en fiálides donde se forman las esporas asexuales o conidios haploides y su pared está compuesta por quitina y glucanos. Además de los conidióforos, las espora se pueden producir sobre fiálides que emergen directamente del micelio (Harman, 2000).
Los hongos del género Trichoderma, se encuentran en ecosistemas terrestres (suelos agrícolas, pastizales, bosques y desiertos) y acuáticos. Algunas especies son de vida libre en el suelo, oportunistas, simbiontes de plantas, y otras son micoparásitas. Los requerimientos nutrimentales de estos hongos filamentosos son pocos, aunque su crecimiento es favorecido por la materia orgánica, y la humedad. Trichoderma se pueden encontrar en la rizósfera, donde es capaz de competir por nutrimentos y espacio con otros microorganismos. Además, este grupo fúngico es importante para las plantas, al contribuir en el control de hongos fitopatógenos ya que poseen propiedades micoparasíticas y antibióticas, por lo que algunas especies son catalogadas como excelentes agentes de control biológico de hongos causantes de enfermedades para diferentes plantas hortícolas (Druzhinina y Kubicek 2005).
La población de Trichoderma decrece especialmente cuando la humedad del ambiente desciende por largos períodos de tiempo. Otros estudios indican que el pH, la concentración
8
de C02, H2C03, otras sales y el contenido de materia orgánica son factores físicos y
químicos determinantes de la variación poblacional de Trichoderma, además de la presencia o ausencia de otros microorganismos en el ambiente (Fonseca, 1998).
El intervalo de temperatura para el crecimiento de Trichoderma se encuentra entre los 10 y los 40 °C, con una óptima de 25 °C (Alexopoulos et al., 1996). El contenido de humedad que favorece el crecimiento de Trichoderma se encuentra alrededor del 70 y el 80% (Wakelin et al., 1999).
Para su crecimiento Trichoderma tiene un intervalo de pH relativamente amplio, comprendidos entre 2.0 y 9.0, con un pH óptimo entre 4.0 y 7.0 (Domsch et al., 1980).
Trichoderma es un hongo, heterótrofo, aerobio, con una pared celular compuesta de quitina,
de rápido crecimiento que puede utilizar como fuente de carbono a una gran variedad de sustratos complejos como celulosa, quitina, pectina y almidón, aunque puede emplear también ácidos orgánicos y monosacáridos como fuente de carbono. Asimismo,
Trichoderma asimila como fuente de nitrógeno compuestos tales como aminoácidos, urea,
nitritos, amoniaco y sulfato de amonio. Muchas cepas crecen eficientemente en medios sólidos o líquidos y en un amplio intervalo de temperaturas, además son relativamente tolerantes a humedades bajas y tienden a crecer en suelos ácidos (Moore, 1996; Harman et
9
2.5 Efecto de Trichoderma en las plantas
En plantas la resistencia inducida localizada y sistémica, se produce en respuesta al ataque de microorganismos patógenos, al daño físico por insectos, factores ambientales, al tratamiento con diversos inductores químicos y a la presencia de rizobacterias no patógenas. Trichoderma spp. tiene la capacidad de inducir en las plantas cambios en la resistencia contra patógenos. En muchos casos, éstas respuestas son resultado de efectos directos sobre las plantas, como disminución de la actividad de la microflora nociva en la raíz, la generación de compuestos tóxicos en la zona radicular, aumenta la absorción y traslocación de los minerales menos disponibles en la plantas y además puede contribuir a solubilizar nutrientes en el suelo (Harman et al., 2004b; Yedidia et al. 2001).
La colonización de raíces por Trichoderma spp. induce cambios significativos en la planta, específicamente en la maquinaria metabólica. Harman et al. (2004a) obtuvieron los proteomas de plántulas de maíz procedentes de semillas tratadas con Trichoderma cepa T-22. Aproximadamente el 40% de las proteínas que se veían en las muestras tratadas con la cepa T-22 no se encontraron en las plántulas no tratadas. Estos autores concluyeron que
Trichoderma puede modificar fuertemente el metabolismo vegetal.
En algodón, la cepa T. virens indujo la producción de fitoalexinas y resistencia localizada; mientras que en pepino, la colonización de la raíz por Trichoderma cepa T-203 causó un aumento en los niveles de fenólicos glucosilados en las hojas, los cuales están fuertemente asociados a la inhibición del crecimiento de una serie de bacterias y hongos (Harman et al., 2004b).
10 Trichoderma se puede localizar tanto fuera como dentro de la rizósfera; pero es en la
rizósfera donde principalmente coloniza y protege las raíces de las plantas (Lorito, 1998). Al respecto Sid et al. (2000) reportan que semillas de chile tratadas con Trichoderma
harzianum reduce el progreso de la necrosis causada por Phytophthora capsici en los tallos
de plantas de chile. T. harzianum persiste en la semilla tratada y prolifera en las raíces, ejerciendo una protección sobre la parte aérea.
Además de micoparasitismo y antibiosis, otros mecanismos de protección con el que actúa
Trichoderma incluye la competencia por nutrientes o espacio, el control de microflora
deletérea de la raíz, tolerancia al estrés a través de un incremento en el desarrollo de la raíz y de la planta, inducción de resistencia, solubilización de nutrientes inorgánicos e inactivación de las enzimas de los patógenos (Harman, 2000; Alatonare et al., 1999; Kleifeld y Chet. 1992).
Diferentes especies de Trichoderma incrementan el crecimiento radical, el desarrollo y peso de las plantas mediante una serie de mecanismos (Lorito, 1998).
En plantas de chile, la presencia de Trichoderma incrementó la emergencia de plántulas, tamaño, área foliar y peso seco (Kleifeld y Chet 1992). Cruz y Cisterna (1998) indican que
T. harzianum en chile, incrementó la longitud y el peso seco de raíces, la altura de planta, el
número y peso seco de hojas, el área foliar, el diámetro de tallos y número de flores. En este mismo sentido, Gravel et al. (2007) reportaron que la producción in vitro del ácido indolacético (AIA) en raíz de tomate se incrementó con la presencia de T. atroviride en comparación con el control así como también se acumuló fosforo en hoja. Conjuntamente se incrementó la longitud y el peso fresco del tallo, y de las raíces en plántulas inoculadas.
11
La solubilización de fosforo en la raíz se asocia a menudo con la promoción del crecimiento vegetal. El equilibrio entre el crecimiento vegetativo y reproductivo es controlado por hormonas de señalización dentro de la planta y pueden por lo tanto influir en éste. En concentraciones relativamente altas, las auxinas naturales, como AIA, estimulan la elongación de ramas, mientras que la reducción de este, genera la elongación de la raíz. Yedidia et al., (2000) reportaron que la respuesta general de defensa de las plantas incluye la inducción de proteínas como respuesta a patogénesis, la acumulación de fitoalexinas, y la deposición de polímeros estructurales, como la calosa y lignina. Se hace especial hincapié en la acumulación de hidrolasas en la planta, tales como quitinasas y β-1,3-glucanasas, con potencial antimicrobiano. Otro grupo de enzimas incluye las peroxidasas, las cuales juegan un papel clave en los mecanismos de resistencia de la planta, ya que están involucradas en la formación de barreras estructurales.
Las isoenzimas de peroxidasa contribuyen a la producción de un entorno fungitóxico para hongos patógenos, generalmente asociado a la aparición de lesiones o la penetración de éstos. La generación de dichos compuestos parece jugar un papel en la tolerancia de la raíz de la planta a la colonización por patógenos (Yedidia et al., 2000).
En particular, para el caso de cebolla, Coşkuntuna y Özer (2008) germinaron semillas de cebolla con esporas de Trichoderma y después de ponerlas en contacto con el hongo F.
oxysporum, encontraron que la interacción Trichoderma-semilla redujo en un 73 % el
crecimiento del hongo patógeno. Este mismo efecto se obtuvo en campo, con lo que concluyeron que T. harzianum tiene la capacidad de estimular la producción de compuestos químicos asociado con una mayor protección contra la pudrición basal causada por F.
12
2.6 Efecto de Trichoderma en otros hongos
El género Trichoderma está compuesto por un gran número de especies que actúan como agentes de control biológico debido a sus propiedades antagonistas. Las cepas de
Trichoderma ejercen un biocontrol contra hongos fitopatógenos de manera indirecta a
través de la competencia por nutrientes y espacio, modificando las condiciones medioambientales, promoviendo el crecimiento, los mecanismos de defensa y la antibiosis en las plantas; o directamente por mecanismos como el micoparasitismo.
Los mecanismos directos e indirectos actúan coordinadamente y su importancia en el proceso de biocontrol depende de la cepa de Trichoderma empleada, el hongo contra el cual ejercerá control como antagonista, el tipo de planta o cultivo, además de las condiciones ambientales como pH, disponibilidad de nutrientes, temperatura y concentración de hierro, principalmente (Benítez et al, 2000).
La lisis es el mecanismo en el cual intervienen las enzimas hidrolíticas producidas por los microorganismos antagonistas como factores biocontroladores. Trichoderma causa la lisis de la pared celular de hongos patógenos y esta actividad se correlaciona con el grado de control biológico que se puede obtener por parte de Trichoderma (El-Katatny et al., 2001).
Trichoderma spp. produce celulasas que degradan in vitro la celulosa de las paredes
celulares de microorganismos Oomicetos; además de glucanasas y quitinasas que catalizan la hidrólisis de la quitina y de los β-1,3 glucanos de las paredes celulares de microorganismos Deuteromicetos (Cotes, 1993).
13
Los principales mecanismos por los cuales Trichoderma spp. lleva a cabo su antagonismo contra los patógenos de las plantas incluyen la degradación y posterior asimilación de los hongos (De la Cruz et al,.1995). Esta actividad antifúngica involucra la producción de antibióticos, incluyendo compuestos que afectan la integridad de las membranas fungosas, competencia por nutrientes clave y la producción de enzimas que degradan la pared celular de los hongos (Ait-Lahsen et al., 2001). A nivel celular causan vacuolación, granulación, coagulación, desintegración y lisis (Bell et al.. 1982; Chet y Baker, 1981).
En el caso de Oomycetes sp. cuya pared celular contiene β - 1,3-glucano y celulosa, se sugiere que la β -1,3-glucanasa es la enzima principal en la lisis de la pared celular durante la acción micoparasítica (De la Cruz et al.1995); mientras que en Botrytis cinerea. (Deuteromycete) las enzimas quitinolítica y glucanolíticas de T. harzianum P1 interactuaron sinérgicamente en la inhibición de la germinación de las esporas y la elongación de las hifas de Sclerotium rolfsii (El-Katatny et al., 2001).
Harman (2000), describe el proceso de micoparasitismo como un proceso complejo, que involucra el crecimiento trófico del agente de biocontrol hacia el hongo objetivo, el enrollamiento mediado por lectina y la adherencia de las hifas en torno al patógeno. Finalmente el ataque y disolución de la pared celular ocurre por la actividad de las enzimas que puede asociarse con una penetración física de la pared celular.
Diversas especies de Trichoderma se asocian con un antagonismo de la fase vegetativa de
Phytophthora. En este caso, Trichoderma crece sobre Phytophthora y parasita sus hifas, el
14
crecimiento del patógeno, seguido por una vacuolación del contenido celular que eventualmente resulta en lisis de las hifas del patógeno (Harman, 2000).
2.7 Generalidades de Sclerotium rolfsii
Sclerotium rolfsii es un hongo que en condiciones favorables produce abundante micelio en
los tejidos infectados. Las hifas son relativamente grandes, de 5 a 9 micrones de diámetro. Son hialinas de paredes delgadas en forma de gancho a nivel de las septas. El micelio al crecer tiende a formar rizomorfos que ya crecidos se expanden en forma de abanico, teniendo una coloración blanca. Una vez infectados los tejidos, la masa de micelio puede aparecer de 2 a 10 días. La penetración ocurre cuando el patógeno produce una enzima que destruye las paredes de las células externas del hospedero, resultando una destrucción de los tejidos y en la formación de micelio y esclerocios. Aproximadamente después de 7 días de la infección, aparecen los esclerocios, que se forman a partir del micelio cuando los rizomorfos se entrecruzan y empiezan a formar cuerpos esféricos inicialmente blancos y después toman una coloración café claro u obscura. Estos esclerocios miden en promedio de 0.5 a 2.0 mm de diámetro, pero algunos pueden llegar a 8 ó 10 mm de diámetro (Singh y Dwivedi 1991).
El hongo sobrevive en forma de segmentos de hifas o esclerocios en plantas infectadas o residuos de plantas en el suelo, no produce ningún tipo de espora asexual (Punja, 1985).
15
Es un patógeno esencialmente de suelo, que causa enfermedad en un amplio intervalo de hospederos, más de 500 plantas en el mundo, como son frutales, malezas, hortalizas y plantas forestales (El-Katatny et al.,2001).
S. rolfsii es capaz de sobrevivir en un amplio intervalo de condiciones ambientales, el pH
óptimo de crecimiento del micelio es de 3.0 a 5.0 y la germinación de los esclerocios ocurre entre pH de 2.0 y 5.0. La germinación se inhibe a pH mayor de 7.0 y el máximo crecimiento del micelio ocurre entre 25 y 35º C con muy poco desarrollo o ninguno a 10º o 40º C. El micelio muere a 0° C, y los esclerocios sobreviven a temperaturas de -10 ºC. El crecimiento del micelio y la germinación de los esclerocios ocurren rápidamente con luz continua, pero también puede desarrollarse en obscuridad completa si las condiciones son favorables (Punja, 1985).
2.8 Sclerotium rolfsii en las plantas
Al ser un patógeno de suelo, S. rolfsii se desarrolla en la naturaleza cerca o sobre la superficie del mismo y usualmente ataca el cuello de la raíz de la planta. Como primer síntoma, se presenta una lesión acuosa en la base de los tallos a nivel de la superficie del suelo, después se extiende rápidamente y estrangula al tallo; en las plantas herbáceas y plántulas las plantas se marchitan y se caen. En las plantas maduras de tomate y chile la corteza del tallo se pudre, pero el cilindro central permanece sano; conforme avanza la pudrición, las plantas se marchitan pero permanecen erectas. En muchos hospederos las hojas marchitas gradualmente se vuelven cafés y quedan colgando (Aycock, 1966).
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Cuando los tallos de las plantas herbáceas se deterioran aparecen masas de micelio blanco en el sitio de la lesión, la cual puede extenderse en el suelo circundante al tallo. Poco después que aparece la masa de micelio se empiezan a formar cuerpos redondeados de color blanco que posteriormente sé tornan lisos y de color café claro, café obscuro o negro llamados esclerocios, estos son las estructuras de resistencia que le sirven para sobrevivir en condiciones adversas (Punja, 1985).
Los esclerocios se forman en los tejidos enfermos cerca de la superficie del suelo. En bulbos y los tubérculos los tejidos se vuelven blandos y se colapsan, formándose micelio en las áreas podridas (Aycock, 1966).
Los esclerocios pueden persistir en los suelos por varios años. Cuando los bulbos o raíces carnosas son infectados, es frecuente que se desarrolle una pudrición de las escamas externas o los tejidos internos de la raíz. Todo el bulbo o la raíz puede pudrirse, desintegrarse y ser sustituido por los restos de la planta entretejidos con el micelio del hongo (Aycock, 1966). En la cebolla, Sclerotium rolfsii genera amarillamiento y marchitez empezando por las partes más bajas, los bulbos se vuelven blandos y se colapsan (Jenkins y Averre 1986).
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2.9 Métodos de control de Sclerotium rolfsii
Para el control de Sclerotium rolfsii se usan métodos químicos, culturales y alternativamente el control biológico, el cual tiene un efecto a largo plazo y un menor impacto ambiental (Montes-Belmont et al., 2003). S. rolfsii es diseminado a través de prácticas culturales como el barbecho o el arado del suelo contaminado, trasplante de plántulas contaminadas, el agua, el viento y por propagaciones vegetativas y semillas. Dentro de las prácticas culturales que se recomiendan para el control de Sclerotium está el arado profundo y superficial (Jenkins y Averre, 1986). También están las prácticas de exclusión, remoción de plantas y suelo, tratamiento de suelo, tratamiento de plantas, rotación de cultivos, uso de variedades resistentes o una combinación de todas estas prácticas. La siembra en áreas con climas fríos es una condición en donde el hongo no se desarrolla; la remoción de plantas enfermas cuando empiezan a parecer síntomas de la enfermedad puede ayudar a reducir las fuentes de inóculo primario. En algunos casos la remoción del suelo de áreas localizadas de infección puede evitar la diseminación. El tratamiento del suelo con solarización, la aplicación de fungicidas o fumigantes de suelo, los abonos orgánicos, los fertilizantes o los tratamientos biológicos pueden ayudar a controlar a S. rolfsii (Singh y Dwivedi, 1991).
La aplicación de fertilizantes como amonio, urea, nitrato de amonio y bicarbonato de amonio, que liberan amoniaco inhibe la germinación de esclerocios y retarda el desarrollo del micelio y además aumenta la microflora antifúngica del hongo. Los fertilizantes de calcio incrementan los niveles de calcio en los tejidos de las plantas y esto protege de la
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acción del ácido oxálico y enzimas degradadoras de la pared celular producidas por el hongo (Punja, 1985).
Otro método que se recomienda es la adición de cal al suelo para subir el pH a 6.5 y así evitar el rápido desarrollo del hongo. Las densidades de siembra deben ser más espaciadas para prevenir el contagio entre plantas (Jenkins y Averre 1986).
En el control químico se utilizan comúnmente fungicidas como el pentacloro-nitrobenceno (PCNB). La aplicación de éste y otros productos en grandes superficies no es práctico, por los grandes volúmenes de producto que se requieren. Además de que el efecto del PCNB varía año con año y se han encontrado cepas del hongo patógenos resistentes al PCNB (Shim et al., 1998).
El control biológico se efectúa con los hongos Trichoderma, Penicillium spp. y
Gliocladium virens o con la bacteria Bacillus subtilis (Coşkuntuna y Özer,, 2008).
Penicillium notatum también mostró en pruebas de laboratorio e invernadero una acción
antagónica. Inhibe la germinación de esclerocios, invasión y maceración de éstos, supresión del crecimiento saprófito y de la producción de esclerocios del patógeno (Díaz y Castro, 1977).
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3. JUSTIFICACIÓN
México es el primer productor mundial de cebolla, esta es la tercera hortaliza más consumida en el país. Como otras hortalizas, las enfermedades causadas por hongos reducen la producción y calidad del producto final. Diversos estudios proponen que las variedades blancas son menos resistentes a las enfermedades que las pigmentadas, diferencia que puede estar relacionada con el contenido de compuestos antimicrobianos. Entre los hongos que infectan a la cebolla destacan especies del género Sclerotium. Para su control se usan métodos químicos a la par de los culturales y una alternativa puede ser el control biológico. Este último tiene un efecto a largo plazo, un menor impacto ambiental y económico en agricultores. En tal sentido, se propone el uso de Trichoderma harzianum, que es un hongo que inhibe el desarrollo y propagación de Sclerotium. Se ha reportado que
T. harzianum induce cambios en el crecimiento y en la resistencia de varias plantas. Sin
embargo, no se conoce si el tratamiento con T. harzianum en variedades de cebolla induce respuestas bioquímicas que las protejan contra S. rolfsii. Por lo cual, es importante evaluar los cambios bioquímicos inducidos en tres variedades de cebollas (blanca, morada y roja) tras la inoculación con T. harzianum y su relación con el control de Sclerotium rolfsii.
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4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general
Evaluar el efecto de Trichoderma harzianum Tc74 sobre la germinación, desarrollo, el contenido de compuestos fenólicos, flavonoides y actividad de peroxidasa de tres variedades de cebolla con diferentes grados de pigmentación y su relación con el control de Sclerotium rolfsii.
4.2 Objetivos específicos
Evaluar el efecto de la inoculación con Trichoderma harzianum sobre la germinación y el desarrollo de tres variedades de cebolla.
Determinar en plantas inoculadas con Trichoderma harzianum: el contenido de compuestos fenólicos y flavonoides totales, la actividad de peroxidasas y la incidencia de Sclerotium
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5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 Variedades de cebolla
Para este trabajo se usaron 3 variedades de cebolla: (1) Crystal White (blanca) de producción mexicana, (2) Red Satán (roja) producida por la empresa Nunhems (USA) y (3) Mata Hari (morada) producida por la empresa Service Plus (Francia) dentro de la línea comercial “Pour le Goût”. Las semillas de las variedades blanca y roja se adquirieron del distribuidor “Rancho los Molinos S. A. de C. V.”.
5.2 Cepas de hongos utilizadas
De la colección de cepas del Laboratorio de Fitopatología del CeProBi, se utilizó la cepa 12 de Sclerotium rolfsii, que proviene de plantas de frijol, colectada en Yautepec, Morelos. Esta cepa fue seleccionada por su capacidad de producción de esclerocios y su mayor severidad (Ruiz, 2010).
La cepa Tc74 de Trichoderma harzianum, fue proporcionada por el M. en C. César Guigón-López del Centro de Investigación para los Recursos Naturales, Chihuahua. Esta cepa mostró diferencias altamente significativas en su crecimiento y actividad micoparásitica in vitro contra el patógeno Phytophthora capsici (Guigón-López y González-González, 2003).
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5.3 Tratamiento con T. harzianum de las semillas de cebolla y evaluación de la germinación
De cada una de las tres variedades, se pusieron 100 semillas en una caja Petri acondicionada con círculos de papel (servitoalla).
El inoculo de T. harzianum, se preparó colocando en un vaso de precipitado y con agitación suave, 15 ml de agua destilada con 0.170 g de granos de trigo inoculados con T. harzianum, conteniendo 4.08 x 107 esporas/ ml. Posteriormente esta mezcla se adicionó a cada una de las cajas Petri con las semillas. En el caso de los controles, a cada caja se le adicionó 15 ml de agua destilada. Cada 24 horas se cuantificó el número de semillas germinadas.
El valor de n fue de 5. Se obtuvieron los promedios y la desviación estándar de cada determinación. Se aplicó un análisis de varianza de una sola vía (p<0.05) y se aplicó la prueba de Tukey para obtener las diferencias entre los tratamientos.
La viabilidad de las semillas se expresó como el porcentaje de germinación calculado con la siguiente fórmula:
Donde:
Ng = número de semillas germinadas al último día de la medición
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Para calcular la velocidad de germinación, se consideraron los valores de la fase lineal de la curva de germinación de cada repetición (en todos los casos fueron del día 3 al día 6) con los que se obtuvieron las ecuaciones de regresión, donde la pendiente representó la velocidad de germinación expresada como el número de semillas germinadas por día.
Para la velocidad de germinación el valor de n fue igual a 5. Con todos los resultados se obtuvieron los promedios y la desviación estándar de cada determinación. Se aplicó un análisis de varianza de una sola vía (p<0.05) y se aplicó la prueba de Tukey para obtener las diferencias entre los tratamientos.
5.4 Evaluación del efecto de T. harzianum en el desarrollo de las plantas
Las semillas de las tres variedades se pusieron a germinar en condiciones ambientales en almacigo (29 ± 3 ºC) con una mezcla de sustrato: Metromix y Peat Moss en una proporción de 3:1 (p:p). Las plántulas se dejaron en almacigo por 30 días y posteriormente se trasplantaron a macetas de 1 kilogramo y medio.
El sustrato que se utilizó para las plantas se mezcló con granos de trigo inoculado con T.
harzianum a una concentración de 4.08 x107 esporas/ kg de sustrato (Bravo y Ruíz 2008). Los controles fueron plantas crecidas sin la inoculación de T. harzianum. Las plantas de cebolla se regaron cada tercer día con 400 ml de agua por maceta. Cada 20 días se fertilizó con triple 17 (Nitrógeno-Fósforo-Potasio) en una proporción de 2 g/ L. Para mantener el
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número de esporas en el sustrato, mensualmente, a cada maceta se le adicionó 0.170 g de trigo inoculado con Trichoderma, equivalente a 4.08 x107 esporas/ kg de sustrato.
Después de 8 semanas, las plantas se extrajeron de sus macetas, se les retiró el exceso de sustrato en raíces y bulbos, y se midió el peso total, el peso de las hojas, del bulbo y de las raíces.
El valor de n fue igual a 4. Con todos los resultados se obtuvieron los promedios y la desviación estándar. Se aplicó un análisis de varianza de una sola vía (p<0.05) y se aplicó la prueba de Tukey para obtener las diferencias entre los tratamientos.
5.5 Determinación del contenido total de compuestos fenólicos
Para obtener el extracto con metanol, en el caso de las plántulas de 8 días se tomó todo el tejido y para el caso de las plantas de 8 semanas se utilizó sólo tejido de los bulbos. En ambos casos, el tejido se secó a temperatura ambiente y se maceró en un mortero hasta obtener un polvo fino. De donde se tomaron 0.20 g que se colocaron en un tubo Eppendorf, se le adicionó 2 ml de metanol al 100 %, se homogenizó con un macerador manual y se centrifugó a 3000 rpm. El sobrenadante se separó y se usó para realizar las diferentes evaluaciones.
Para la determinación de compuestos fenólicos se siguió el método reportado por Shohael
et al. (2006). Para esto, se tomaron 100 µl del sobrenadante y se depositó en un tubo de
Folín-25
Ciocalteu. Se mezcló en un vortex y se dejó reposar por 6 minutos. Posteriormente se añadieron 500 µl de carbonato de sodio al 20%, se mezcló y se puso a incubar por 30 minutos.
La absorbancia se leyó a 760 nm en un espectrofotómetro (Thermo Spectronic, modelo Genesys 2).
Para calcular el contenido total de compuestos fenólicos en las muestras se utilizó como un estándar al compuesto fenólico, ácido gálico. Con éste compuesto fenólico a diferentes concentraciones se construyó una curva estándar. La ecuación de regresión que se obtuvó de la curva estándar fue:
y = 0.08x – 0.0098
en donde “x” es la concentración expresada en µg de Ac. gálico/mL y “y” es la absorbancia a 760 nm.
Los resultados fueron expresados como mg equivalentes de ácido gálico (mg EAG) por gramo de peso seco (g PS).
El valor de n fue igual a 5. Con todos los resultados se obtuvieron los promedios y la desviación estándar. Se aplicó un análisis de varianza de una sola vía (p<0.05) y se aplicó la prueba de Tukey para obtener las diferencias entre los tratamientos.
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5.6 Determinación del contenido total de flavonoides
Para determinar el contenido total de flavonoides, se partió del mismo extracto metanólico utilizado en la determinación de compuestos fenólicos y siguiendo el método reportado por Shohael et al, (2006). De este extracto se tomaron 250 µl, a los que se les agregó 1.25 ml de agua desionizada más 75 µl de nitrito de sodio al 5 %. Se mezclaron en vortex y se dejó reposar por 6 minutos.
A esta mezcla, se le adicionó 150 µl de cloruro de aluminio al 10 % y nuevamente se pusó a reposar por 5 minutos. Posteriormente se añadieron 500 µl de hidróxido de sodio 1M más 2.5 ml de agua desionizada y se dejó reposar por 30 minutos. Después de éste tiempo, se leyó la absorbancia a una longitud de onda de 510 nm.
Para cuantificar el contenido total de flavonoides en las muestras, se utilizó como un estándar al flavonoide, catequina. Con el que se construyó una curva estándar con diferentes concentraciones de catequina.
La ecuación de regresión de la curva estándar fue:
y = 0.0069x + 0.0004
donde “x” es la concentración expresada en µg de catequina/mL y “y” es la absorbancia a 510 nm.
Los resultados fueron expresados como mg equivalentes de catequina (mg EC) por gramo de peso seco (g PS).
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El valor de n fue igual a 5. Con todos los resultados se obtuvieron los promedios y la desviación estándar. Se aplicó un análisis de varianza de una sola vía (p<0.05) y se aplicó la prueba de Tukey para obtener las diferencias entre los tratamientos.
5.7 Evaluación de la actividad de peroxidasa
Para efectuar la evaluación de la actividad de la enzima peroxidasa se siguió el método descritó por Stasolla y Yeung (2007). El buffer de extracción contenía fosfato de sodio 100 mM, EDTA 1mM, DTT 1mM, a pH 7. Se tomaron 200 mg de tejido vegetal fresco de cada bulbo que se homogeneizó con un macerador manual con 1.5 ml de buffer de extracción. El extracto se centrifugó a 3000 rpm y el sobrenadante se separó y se usó como el extracto enzimático.
Para realizar el ensayo de la enzima se preparó una mezcla que contenía: 798 µl de buffer de fosfato de sodio 50 mM (pH 6), 100µl del extracto enzimático, 100 µl de H2O2 al 0.3% y
1 µl de guayacol 3M. Toda la mezcla se agitó vigorosamente y se leyó la absorbancia en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 470 nm. La actividad de la enzima se expresó como µmoles de tetraguayacol/ min/ g de peso fresco.
El valor de n fue igual a 5. Con los resultados se obtuvieron los promedios y la desviación estándar. Se aplicó un análisis de varianza de una sola vía (p<0.05) y se aplicó la prueba de Tukey para obtener las diferencias entre los tratamientos.
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5.8 Obtención de extractos acuosos de bulbos de cebolla
Los bulbos frescos de cebolla tratada y control, se sumergieron en hipoclorito de sodio al 3 % por tres minutos, se enjuagaron con agua destilada estéril y se secaron. En un mortero se maceraron 40 g de tejido hasta llegar a una pasta suave y homogénea, se le adicionaron 100 ml de agua destilada y ésta mezcla se centrifugó a 10 000 rpm por 10 minutos a 4 ºC. El sobrenadante (extracto) se filtró al vacio con papel filtro Whatman No. 1 y se esterilizó por filtración a través de una membrana de nitrocelulosa de 0.22 µm (Millipore). Con el extracto esterilizado se preparó medio de cultivo conteniendo extracto al 20%. Para esto, 16 ml del extracto esterilizado se adicionaron y homogeneizaron con 64 ml de medio Papa Dextrosa Agar (PDA) estéril a una temperatura entre los 30 a 35 ºC. El medio de cultivo se vació en cajas Petri y se dejó solidificar. Todo se realizó bajo condiciones de asepsia.
5.9 Efecto de extractos acuosos de bulbos sobre el crecimiento micelial y producción de esclerocios de Sclerotium rolfsii
Cada una de las cajas Petri que contenía extracto de cebolla tratada con T. harzianum, extracto de cebolla sin tratar y PDA (sin extracto) se inocularon con S. rolfsii, Para esto, se colocó un disco de micelio de 5 mm en el centro de cada caja Petri y se incubaron a 27 ºC. Para cada uno de los tratamientos se realizaron 5 repeticiones y su control. Las variables de respuesta fueron: el crecimiento micelial y la producción de esclerocios.
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El área de crecimiento micelial (mm2) de S. rolfsii se evaluó al tercer día de incubación en ausencia y/o presencia del extracto acuoso. Sé tomaron fotografías digitales diariamente de los tratamientos y con ayuda del software ImageJ® (versión 1.4) se calculó el área de crecimiento. Después de evaluar el crecimiento micelial todas las cajas Petri se mantuvieron a temperatura de laboratorio (28 3 °C) por 30 días. Al final de éste periodo se cuantificó en cada caja Petri el número total de esclerocios.
El valor de n fue igual a 5. Con todos éstos resultados se obtuvieron los promedios y la desviación estándar. Se aplicó un análisis de varianza de una sola vía (p<0.05) y se aplicó la prueba de Tukey para obtener las diferencias entre los tratamientos.
5.10 Efecto de la inoculación de T. harzianum en la severidad de daño de Sclerotium
rolfsii
Para obtener el inoculo de S. rolfsii, a bulbos de cebolla comercial se les realizó un corte de 3 cm2, donde se colocaron discos con micelio del hongo y se mantuvieron a temperatura de laboratorio por tres días en una cámara húmeda.
Los bulbos de cebolla de 8 semanas tratadas y sin tratar con T. harzianum se inocularon colocando en cada uno, cuatro discos de 5 mm de diámetro con micelio de S. rolfsii proveniente de los bulbos de cebolla comercial infectados. La humedad del sustrato se mantuvo constante para favorecer el crecimiento micelial del hongo. Cada dos días, se monitorearon las plantas para ver el avance del patógeno. Después de 15 días de
30
observación se procedió a extraer las plantas del sustrato para evaluar la severidad del patógeno en los bulbos de cada una de las variedades y su control.
El índice de severidad se evaluó en 15 plantas por tratamiento utilizando la ecuación reportada por Hernández et al. (2004).
La fórmula utilizada para estimar el índice de severidad fue
Donde: IS = Índice de severidad; XKi = Nivel del daño en el momento i
Nki = Número de plantas con daño en el momento i
Nj= Número total de plantas evaluadas
La escala nominal que se utilizó fue: 1: plantas sanas
2: plantas sin síntomas, con esclerocios en el suelo
3: plantas amarillentas con presencia de micelio y esclerocios a su alrededor 4: plantas con síntomas de marchitez y pudrición además de micelio y esclerocios
Para cada tratamiento también se evaluó el número esclerocios por planta y se obtuvo el promedio y la desviación estándar. El valor de n fue igual a 15. Los datos fueron analizados
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con un análisis de varianza de una sola vía (p<0.05) y se aplicó la prueba de Tukey para obtener las diferencias entre los tratamientos.
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6. RESULTADOS
6.1 Efecto del tratamiento con T. harzianum en la germinación de las semillas
La viabilidad de las semillas de las tres variedades de cebolla oscilo entre 76 y 93 % (Cuadro 2). A los 7 días, en la variedad blanca tratada con T. harzianum se encontró un mayor número de semillas germinadas por día y una mayor velocidad de germinación que su control (Figura 2a y Cuadro 2). Por el contrario, en las otras dos variedades, a los 7 días de germinación se encontró en el control un mayor número de semillas germinadas por día que en las tratadas con T. harzianum (Figuras 2b y c). Sin embargo, el análisis estadístico indico que en la variedad morada la velocidad de germinación fue similar; mientras que en la variedad roja la velocidad de germinación fue mayor en el control que en las semillas tratadas con T. harzianum (Cuadro 2).
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Cuadro 2. Germinación de las semillas de las tres variedades de cebolla tratadas con T.
harzianum.
Los resultados son el promedio ± desviación estándar, n = 5. Se aplicó un análisis de varianza de una sola vía, letras diferentes indican diferencia estadística significativa (p<0.05, prueba de Tukey). Tratamiento Germinación (%) Velocidad de germinación (semillas germinadas/día) Blanca control 85 11.53 ± 1.34 a Blanca tratada 92 17.73 ± 0.82c Morada control 93 18.40 ± 0.39c Morada tratada 82 17.98 ± 1.12c Roja control 88 14.68 ± 0.27b Roja tratada 76 12.98 ± 0.57 a
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Figura 2. Germinación de semillas de la variedad blanca (a), morada (b) y roja (c) tratadas
con T. harzianum. Los resultados son el promedio ± desviación estándar, n=5. Se aplicó una prueba de t. Letras diferentes indican diferencia estadística significativa (p<0.05).
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6.2 Desarrollo de la planta en presencia de T. harzianum
Las plantas de 8 semanas inoculadas con T. harzianum, mostraron un aumento en su desarrollo al compararlas con sus controles (Figura 3). En las tres variedades, con el tratamiento con T. harzianum, el peso total aumento hasta tres veces más que su control. La variedad roja y la blanca tratadas con T. harzianum fueron las que presentaron el mayor peso total (Cuadro 3).
El peso de los bulbos tratados con T. harzianum fue de 2 a 3 veces mayor que el peso de los bulbos sin tratamiento. Los bulbos de la variedad blanca tratada fueron los que presentaron el mayor desarrollo. El peso de las hojas de las tres variedades tratadas con T. harzianum aumentó hasta 3.4 veces con respecto a su control. Para el caso de las raíces, se encontró que después del tratamiento el peso se incrementó en un intervalo de 7.4 a 11 veces más con respecto a sus respectivos controles (Cuadro 3).
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Figura 3. Aspecto de las plantas a las 8 semanas de tratamiento con T. harzianum (T) y su
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Cuadro 3. Peso total, de bulbos, hojas y raíz de plantas de 8 semanas tratadas con
T. harzianum.
Variedad Peso total (g) Peso bulbo(g) Peso hojas(g) Peso raíz(g) Blanca control 2.92 ± 1.01a 0.64 ± 0.18ab 2.42 ± 0.89a 0.10 ± 0.05a Blanca tratada 9.38 ± 3.78b 2.01 ± 1.36b 6.77 ± 2.61bc 0.88 ± 0.40b Morada control 1.97 ± 0.72a 0.60 ± 0.39a 1.28 ± 0.35a 0.07 ± 0.07a Morada tratada 5.96 ± 2.51ab 1.24 ± 0.32ab 3.68 ± 1.16ab 0.52 ± 0.12ab Roja control 3.09 ± 0.87a 0.79 ± 0.13ab 2.22 ± 0.78a 0.08 ± 0.01a Roja tratada 10.18 ± 2.13b 1.47 ± 0.40ab 7.72 ± 1.29c 0.89 ± 0.51b
Los resultados son el promedio ± desviación estándar, n = 4. Se aplicó un análisis de varianza de una sola vía, letras diferentes por columna indican diferencia estadística significativa (p<0.05, prueba de Tukey). * Número de veces que se aumento después del tratamiento.
6.3 Contenido de compuestos fenólicos en plántulas ybulbos
Antes del tratamiento con T. harzianum, las plántulas de la variedad roja fueron las que presentaron el mayor contenido de compuestos fenólicos. Sin embargo, con el tratamiento con T. harzianum, en las plántulas de las tres variedades se generó un aumento en el contenido de compuestos fenólicos con respecto a los encontrados en sus controles. En el
(3)* (3)* (3)* (3)* (2)* (2)* (3)* (3.4) * (3)* (9)* (7.4)* (11) *
38
caso de las plántulas de las variedades blanca y morada éste aumento fue del 43.5 y 48 % respectivamente; mientras que para las plántulas de la variedad roja aumento en un 13 % (Figura 4).Las diferencias estadísticas permiten afirmar que el tratamiento tuvo un efecto en el contenido de los compuestos fenólicos.
Figura 4 .Contenido de compuestos fenólicos en plántulas de 8 días. Los resultados son el
promedio ± desviación estándar, n = 5. Se aplicó un análisis de varianza de una sola vía, letras diferentes entre variedades indican diferencias estadísticas significativas (p<0.05, prueba de Tukey). * mg EAG/g PS: mg equivalentes de ácido gálico/g de peso seco.
El contenido de compuestos fenólicos de los bulbos tratados con T. harzianum se incrementó con respecto a su control. Los incrementos fueron del 20 % más para la variedad blanca tratada, 70 % para la variedad morada y 30 % para la variedad roja (Figura
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5). Estos resultados indican diferencias de respuesta entre variedades a la inoculación por
Trichoderma. La variedad morada es en la que muestra el mayor cambio en el contenido de
compuestos fenólicos, seguida de la variedad roja y la blanca.
Por otra parte, los bulbos de la variedad roja fueron los que presentaron el mayor contenido de compuestos fenólicos, seguidos de los bulbos de la variedad morada y la blanca.
Figura 5. Contenido de compuestos fenólicos en bulbos de 8 semanas. Los resultados son
el promedio ± desviación, n = 5. Se aplicó un análisis de varianza de una sola vía, letras diferentes entre variedades indican diferencias estadísticas significativas (p<0.05, prueba de Tukey). * mg EAG/g PS: mg equivalentes de ácido gálico/g de peso seco.
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6.4 Contenido de flavonoides totales en plántulas y bulbos
En las plántulas tratadas de las variedades, blanca, morada y roja, el contenido de flavonoides totales se aumento en 43.5, 51.6 y 16 % respectivamente comparadas con sus controles. Por otra parte, antes del tratamiento con T. harzianum, las plántulas de la variedad roja fueron las que presentaron el mayor contenido de flavonoides totales, pero después del tratamiento con T. harzianum, las plántulas de las variedades roja y morada fueron las que presentaron el mayor contenido de flavonoides totales (Figura 6).
Figura 6. Contenido de flavonoides totales en plántulas de 8 días. Los resultados son el
promedio ± desviación estándar, n = 5. Se aplicó un análisis de varianza de una sola vía, letras diferentes entre variedades indican diferencias estadísticas significativas (p<0.05, prueba de Tukey).
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En los bulbos de las variedades morada y roja tratados y sin tratar con T. harzianum se encontró que el contenido de flavonoides totales fue similar. Solamente en los bulbos de la variedad blanca se encontraron diferencias entre las muestras control y las tratadas en el contenido de flavonoides totales (Figura 7). Los resultados también muestran que la variedad roja antes y después del tratamiento es la que presenta el mayor contenido de flavonoides, seguida de las variedades morada y blanca.
Figura 7. Contenido de flavonoides totales en bulbos de 8 semanas. Los resultados son el
promedio ± desviación estándar, n = 5. Se aplicó un análisis de varianza de una sola vía, letras diferentes entre variedades indican diferencias estadísticas significativas (p<0.05, prueba de Tukey).
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6.5 Actividad de la enzima peroxidasa en bulbos de 8 semanas
En los bulbos de las plantas blanca y morada que fueron tratadas con T. harzianum, la actividad de la enzima peroxidasa fue mayor que la encontrada en los controles (2.5 y 4.6 veces, respectivamente), por otro lado, aunque en la variedad roja se observó un incremento entre las plantas tratada y las control, este no fue significativo (Figura 8). De las tres variedades tratadas con T. harzianum, los bulbos de la variedad morada y la blanca fueron los que presentaron la mayor actividad de la enzima.
Figura 8. Actividad de peroxidasa en bulbos de 8 semanas. Los resultados son el promedio
± desviación estándar, n = 5. Se aplicó un análisis de varianza de una sola vía, letras diferentes entre variedades indican diferencias estadísticas significativas (p<0.05, prueba de Tukey).
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6.6 Efecto de extractos acuosos de bulbos sobre el crecimiento micelial y el número de esclerocios de Sclerotium rolfsii
En el cuadro 6 se muestra la evaluación del efecto de los extractos acuosos de bulbos sobre el crecimiento micelial de S. rolfsii. Con los extractos de bulbos provenientes de la variedad blanca tratada con Trichoderma se observó un mayor crecimiento micelial que con el extracto de bulbos sin tratar y con el medio de cultivo sin extracto. En el caso de los extractos de bulbos de la variedad morada tratada se observó un crecimiento del micelio similar al encontrado con el extracto de bulbos sin tratar, pero ambos fueron menores en crecimiento al del medio de cultivo sin extracto. Por el contrario con extractos de bulbos de plantas tratadas de la variedad roja se encontró un menor crecimiento micelial que con el extracto de bulbos de plantas sin tratar y en el medio de cultivo sin extracto (Cuadro 4).
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Cuadro 4. Crecimiento micelial de S. rolfsii en presencia de extractos acuosos de bulbos.
Los resultados son el promedio ± desviación estándar, n = 5. Se aplicó un análisis de varianza de una sola vía, letras diferentes indican diferencia estadística significativa (p<0.05, prueba de Tukey).
La evaluación del número de esclerocios mostró que con los diferentes extractos no se afectó la producción de esclerocios (Cuadro 5).
Extracto de bulbo Área de crecimiento micelial (mm2)
Sin extracto 33.30 3.23de
Blanca control 28.10 2.59cd
Blanca tratada 34.99 2.52e
Morada control 26.51 1.40abc
Morada tratada 27.81 1.72bcd
Roja control 26.99 4.25abc
