INM Inmunoglobulinas

(1)

Universidad Nacional Autónoma

de México

Facultad de Estudios Superiores Zaragoza

Laboratorio de inmunología clínica

Obtención y purificación de gammaglobulinas por

precipitación con sulfato de amonio

Equipo:1

Integrantes:



_{Barragán Ponce Sarahí}



_{González Sandoval Perla Victoria}



_{Lara Figueroa Sandra}



_{Morales Arroyo Víctor Jesús}



_{Soon Pérez Mirian}

Universidad Nacional Autónoma

de México

Facultad de Estudios Superiores Zaragoza

Laboratorio de inmunología clínica

Obtención y purificación de gammaglobulinas por

precipitación con sulfato de amonio

Equipo:1

Integrantes:



_{Barragán Ponce Sarahí}



_{González Sandoval Perla Victoria}



_{Lara Figueroa Sandra}



_{Morales Arroyo Víctor Jesús}

(2)

Concentración

• 6.0 a 8.0g/dL

Tamaño

• _{0.1 a}

0.001 μm

Simples o conjugadas Simples o conjugadas Funciones Funciones •_Generales

•Equilibrio ácido-base

•Balance hídrico

•Especificas

• _Actividad

enzimática*

•Coagulación sanguínea

Proteínas plasmáticas

(3)

Tipo % del total de las proteínas

plasmáticas Características

Albúmina 55 • Presión osmótica

• Trasporte de moléculas

Globulinas α₁ 5 Glicoproteína y lipoproteína alta densidad

Globulinas α₂ 9 Haptoglobina, Ceruloplasmina, Protombina , glicoproteinas y lipoproteínas de baja densidad Globulinas β 13 Trasferrina

Fibrinógeno 7 Coagulación sanguínea

Globulinas



11 Inmunoglobulinas

Tabla 2.6 principales tipos de preteinas plasmaticas obetnido de: Montgomery, D., Bioquímica. Barcelona; Medica Salvat editores; 1980: 69

(4)

Clases y subclases de las inmunoglobulinas Cadenas

pesadas Clase Subclase

Gamma () IgG IgG1 (1) IgG2 (2) IgG3 (3) IgG4 (4) Alfa (α,) IgA IgA1 (α1) IgA2 (α2)

Mu (μ) IgM Delta () IgD Épsilon () IgE

Cadenas

ligeras Clase Subclase

Kappa _ _₁ _₂ _₃

Lambda _ _₁ _₂ _₃ __{4 y}_₅

(5)

Características fisicoquímicas de las inmunoglobulinas

Característica IgG IgA IgM IgD IgE Peso molecular

(X105₎ 1.6 1.7 9.0 1.8 2.0

Coeficiente de

sedimentación 7S 7S (9S, 11S, 19S) 19S 7S 8S

# de dominios 4 4 5 4 5

Hidratos de

carbono (%) 2 a 3 7 a 11 12 9 a 14 12

% en plasma 80 13 6 1 0.002

Vida media (días)

21 7 5 2.8 2.3

Cuadro 5.a Características fisicoquímicas de las inmunoglobulinas (adatación) . Neumirovsky, M.S. Hombery, J.C. Fundamentos de inmunología. México; Trillas; 2003: 100

(6)

M

ét

o

d

o

s

d

e

Se

p

ar

ac

ió

n

d

e

P

ro

te

ín

as

M

ét

o

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Se

p

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ac

ió

n

d

e

P

ro

te

ín

as

Específicos

Inmunoprecipitación

Inmunoeletroforesis

Cromatografía de afinidad

(7)

Estos se fundamentan en propiedades biofísicas

especificas

Tamaño

Peso molecular

Carga eléctrica

Punto Isoeléctrico

(8)

(9)

INMUNOPRECIPITACIÓN

• _{Es la técnica mediante la cual un antígeno proteico es}

(10)

Este proceso puede ser usado para aislar y

concentrar un proteína particular de una muestra

que contiene muchos miles de proteínas distintas.

INMUNOELECTROFORESIS

(11)

Cromatografía de afinidad

(12)

(13)

(14)

(15)

(16)

(17)

La solubilidad de las proteínas disminuye

directamente con la concentración de sales Pur_eza Tem pera tura pH

Sulfato

de

amonio

Sulfato

de

amonio

Alta solubilidad Poca variación en rango de temperatura (0°C a -30°C)

pH 5.0 a 9.8

(18)

Fenómeno “salting in” y “salting out”

(19)

Precipitación con Sulfato de

amonio

(20)

(21)

(22)

(23)

(24)

(25)

Ventajas

Barato

Reactivos de fácil acceso

La solubilidad del sulfato de amonio

es alta (533 g/L)

La solubilidad del sulfato de amonio

es alta (533 g/L)

Rangos altos de pH y temperatura

Precipita mayor que con cloruros

Desventajas

Tener en cuenta la pureza de la sal

Iones amonio interfieren en el

análisis directo del nitrógeno

Iones amonio interfieren en el

análisis directo del nitrógeno

Purificar la proteína mediante el uso

de la diálisis

(26)

Diálisis

Se basa en la

separación de dos

diluciones de

concentraciones

diferentes por una

membrana

semipermeable.

Se basa en la

separación de dos

diluciones de

concentraciones

diferentes por una

membrana

semipermeable.

(27)

(28)

Escala de McFarland

Tubo BaCl2

1% mL

mL

H2SO4 1 %

1 0.1 9.9 2 0.2 9.8 3 0.3 9.7 4 0.4 9.6 5 0.5 9.5 6 0.6 9.4 7 0.7 9.3 8 0.8 9.2 9 0.9 9.1 10 1.0 9.0

Patrones de

turbidez

(29)

Azida de sodio

Inhibición enzimática

(30)

antitetánica

Anti hepatitis B

antirrábica

Aplicaciones de las

inmunoglobulinas.

(31)

Anti

sarampionosa

Anti

sarampionosa

Antirubiolica

_{Gammaglobulina}

inespecíficas

(32)

Alacrán

(33)

Efectos adversos

comunes

• _Escalofríos

• _{Dolor de cabeza}

• _{Dolor de espalda}

• _Malestar

• _Fiebre

• _Prurito

• _Nauseas

• _{Hipotensión o}

hipertensión

• _Sobrecarga

liquida

Efectos adversos

raros

• _{Dolor torácico}

• _Migraña

• _{Fallo renal}

• _{Hepatitis C}

Efectos adversos

muy raros

• _Trombosis

• _Muerte

• _Alopecia

• _{Hepatitis no}

infecciosa

(34)

.

Realice una precipitación del suero al 45% de saturación de

sulfato de amonio.

Realice una precipitación del suero al 45% de saturación de

sulfato de amonio.

Por cada 1.25mL de suero, se adiciona 1mL de solución saturada de

(NH4)₂SO₄

Por cada 1.25mL de suero, se adiciona 1mL de solución saturada de

(NH4)2SO4

La adición se hace gota a gota con agitación

constante.

La adición se hace gota a gota con agitación

constante.

Seguir agitando durante 10 minutos más.

Centrifugue por 5 minutos a 5000rpm .

Resuspender el precipitado en solución

salina a un volumen original de suero.

Resuspender el precipitado en solución

salina a un volumen original de suero.

Realice una segunda precipitación al 33%.

Centrifugar por 5 minutos a 5000rpm.

Redisuelva el paquete en solución salina 0.85%

y colóquelo en un tubo de diálisis.

Redisuelva el paquete en solución salina 0.85%

y colóquelo en un tubo de diálisis.

Dialice contra solución salina hasta eliminar el

(NH4)₂SO_4.

Dialice contra solución salina hasta eliminar el

(NH4)2SO4.

Comprobar que se eliminó todo el (NH4)2SO4 haciendo una

prueba con cloruro de bario.

Comprobar que se eliminó todo el (NH4)2SO4 haciendo una

prueba con cloruro de bario.

(35)

Referencias

• _{Koolman J y Klaus H. Bioquímica: texto y atlas. 3ed. Madrid: Medica}

Panamericana, 2004. 78-79.

• _{Donald Voet, Judith G Voet y Charlotte Pratt. Fundamentos de bioquímica: la vida}

a nivel molecular. 2 ed. Buenos aires: Médica Panamericana,2009. pg. 101-108

• _{Marcarulla J y Goñi Félix M. Lecciones de bioquímica estructural. 3 ed. Barcelona:}

Reverte. 1984. 115-117.

• _{Fiorentino Gómez Susana et al. La inmunología en el diagnostico clínico. Santafé}

de Bogotá: Centro editorial Javeriano. 1994. 47- 55.

• _{Portillo D J, Fernández del Barrio T y Salido P F. Aspectos básicos de la}

bioquímica clínica. España: Ediciones Días de Santos. 1997.

• _{Rojas, E.O. Inmunología (de memoria) 2a ed. Bogota; Editorial medica}

panamericana; 2001: 123-146

• _{Voet, D. Bioquimica 3a ed. Buenos aires; Editorial medica panamericana; 2006:}