PCR. Julián Sanz Ortega

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• Concepto • Técnica

• Puesta a punto, problemas • PCR- transcripción inversa

• ¿Qué hacer con el producto de PCR? • Aplicaciones

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Genoma humano

 3.1 x 109 pb

 22,000 genes = 5% of genome

 30% con instrucciones

para hacer proteínas

 70% con instrucciones

para regular la

translación a proteínas de otros genes:

• Ribosomal (rRNA) • Transfer RNA (tRNA) • Small nucleolar RNA

(snoRNA)

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RNA transcription pre-mRNA splicing mRNA ribosome mRNA A(n)

exon intron exon intron exon

Gene

translation

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PCR a “tiempo real”

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Diseño oligonucleótidos

• Longitud: 18-24 nucleótidos. •

“Melting temperatures” (Tm)(G+Cx4,A+Tx2), “Annealing temperatures” (Ta) similares en ambos primers.

(Ta = Tm - 2-4º)

• No complementarios: evitar “primer dimer”. • No secuencias palindrómicas .

Distancia óptima entre oligos: 100-500 bp (parafina

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Diseño de oligos

• Revisar literatura • Genebank

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=Nu cleotide) , buscar “amplimer” y “protocols” para cada gen.

• Online. Ej:

– Primer3: WWW primer tool (University of Massachusetts Medical School, U.S.A.)

– GeneFisher - Interactive PCR Primer Design

(Universitat Bielefeld, Germany)

– PCR Now (Computational Biology Group,

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Confirmar amplificación

• Electroforesis: Tamaño adecuado ¿? • Enzimas de restricción (al menos 2). • PCR nested • Secuenciación. • Hibridación.

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Optimización de PCR

• SIEMPRE examen histopatológico previo. (¿Microdisección?)

• SIEMPRE ajustar condiciones a nuestro laboratorio.

• Sensibilidad y especificidad. Trucos:

– Ta: bajar si no hay producto, subir si bandas inespecíficas.

– MgCl_2:Bajar si bandas inespecíficas.

– Otras: Taq, temperaturas y tiempos, nº ciclos

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Controles

• Control calidad de ADN • Control positivo

• Control negativo: No ADN.

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Evitar contaminaciones

• 2 habitaciones: Pre y post-PCR • Cabinas con RX UV.

• Cuidado con “Hot-Start” !! • Hacer alícuotas.

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RT-PCR

Paso1: Extracción de ARN

Paso2: Transcriptasa inversa: cADN

Paso 3: Amplificación- PCR Paso 4: Visualizar en gel

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ONLINE: www.urogene.org/methprimer 3´-CTACTGATTGCAGG-5´ m 3´-CTACTGATTGCAGG-5´ 3´-UTAUTGATTGCAGG-5´ m 5´-AATAACTAACG-3 3´-UTAUTGATTGCAGG-5´ m 3´-UTAUTGATTGUAGG-5´ PCR 5´-AATAACTAACG-3 3´-UTAUTGATTGUAGG-5´ mismatch No PCR Bisulfite treatment MS PCR

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infeccioso.

• Identificar mutaciones:

– Mutaciones puntuales:

secuenciación, SSCP, RFLP, DGG…

– Deleciones: secuenciación, análisis fragmentos

– Amplificaciones: PCR tiempo real – Traslocaciones: RT-PCR • Identificar polimorfismos • Expresión: – ARNm: RT-PCR – Hipermetilación • Electroforesis • Análisis de fragmentos • Restricción • Técnicas adicionales microARN?

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Diagnóstico

• Traslocaciones específicas: linfomas, sarcomas

• Mutaciones específicas tumores sólidos: GIST, renal, tiroides.

• Cáncer familiar: Colon, mama, riñon.. • Reordenamientos en linfomas.

• Errores filiación, metástasis de laboratorio • Infeccioso

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THYROID TUMORS • PAX8/PPARg rearrangement • RAS mutation • RET mutation • bRAF mutation • Mitochondrial DNA mutation FOLLICULAR CA PAPILLARY CA TUMOR CLS. HÜRTHLE

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www.ensembl.org (SNPs) K

ACTTCCTTATGATCACAAATGGGAGTTTCCCAGAAACAGGCTGAGT -L--P--Y--D--H--K--W--E-=F=-P--R--N--R--L--S--F--G--K--T--

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-Rhabdomyosarcoma

Botryoid NA NA NA Good

Spindle cell NA NA NA Good

Embryonal Gains of 2, 7, 8, 12, 13; GF2, GOK, NA Good

losses of 1, 6, 9, 14, 17 PTCH TP53

Alveolar t(2;13)(q35;q14); PAX3-FKHR 75% Poor

t(1;13)(p36;q14) PAX7-FKHR 10%

Undifferentiated NA NA NA Poor

- EWS family

EWS/PNET t(11;22)(q24;q12) EWS-FLI-1 85–95%

Good (type I) t(21;22)(q22;q12) EWS-ERG 5–10%

t(7;22)(p22;q12) EWS-ETV1 <1%

t(17;22)(q21;q12) EWS-E1AF <1%

t(2;22)(q33;q12) EWS-FEV <1%

Inversion of 22q EWS-ZSG <1%

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Clear cell sarcoma t(12;22)(q13;q12) EWS-ATF1 90% Poor

Extraskeletal myxoid t(9;22)(q22–23;q11–12) EWS-TEC (CHN) 75% Good

chondrosarcoma t(9;15)(q22;q21) TCF12-TECNA

t(9;17)(q22;q11) TAF2N-TEC 25%

Extraskeletal mesenchymal CS der(13;21)(q10;q10) NA Poor

Synovial sarcoma t(X;18)(p11;q11) SYT-SSX1 65% Poor

SYT-SSX2 35%

SYT-SSX4 rare

Congenital/infantile-fibrosarcoma t(12;15)(p13;q25) ETV6-NTRK3 80%

Inflammatory myofibroblastic tumor t(1;2)(q25;p23) TPM3-ALK NA Good

t(2;19)(p23;q13) TPM4-ALK NA

t(2;17)(p23;q23) CLTC-ALK NA

t(2;11;2)(p23;p15;q31) CARS-ALKNA

Myxoid/round cell liposarcoma t(12;16)(q13;p11) TLS-CHOP 95% Good

t(12;22)(q13;q12) EWS-CHOP rare

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Tenosynovial giant cell tumor t(1;2)(p11;q35–37) NA 40% NA Good

t(1;5)(p11;q22–31) 10%

t(1;11)(p11;q11–12) 10%

t(1;8)(p11;q21–22) 10%

Lipoblastoma Rearrang. 8q12, polysomy 8 PLAG1 70% Good

Malignant peripheral nerve sheath tumor

Complex changes NA NA Poor

DFSP Ring chromosome with sequences from chromosomes 17 and 22,

t(17;22)(q22;q13) COL1A1-PDGFB >99% Good

Giant cell fibroblastoma (juvenile form of DFSP)

t(17;22)(q22;q13) COL1A1-PDGFB

Desmoid tumor +8, +20, Deletion (5)(q21–22) NA

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Tumors Using Multiplex Polymerase Chain Reaction (Chen at al, JMD 2007)

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Pronóstico

• Mutaciones específicas: GIST, carcinomas renales y de tiroides.

• Inestabilidad de microsatélites en carcinoma colo-rectal

• Pérdidas 1p/19q en oligodendroglioma • Diferentes genes de fusión

(traslocaciones) en sarcomas?

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Tratamiento

• Enfermedad mínima residual (mama

aprobado por FDA), micrometástasis.

• Tratamiento “a la carta”:

– Respuesta a inhibidores de EGFR (Gefitinib) en Cáncer de pulmón. – Respuesta a Imatinib en GIST. – Her2 (FISH)

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• PCR es una técnica de amplificación.

• Útil para detectar mutaciones genómicas

(deleciones, puntuales, reordenamientos ..), polimorfismos o agentes infecciosos.

• Útil para estudiar la expresión de ARNm (RT-PCR) y la metilación.

• Aplicaciones al diagnóstico, pronóstico y tratamiento.

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