INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA
SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
“COMPARACIÓN DEL EFECTO NEUROPROTECTOR DEL 17 BETA-ESTRADIOL Y EL 17 ALFA-ETINIL ESTRADIOL EN EL HIPOCAMPO DE LA RATA”
T E S I S
Q U E P A R A O B T E N E R E L G R A D O D E MAESTRO EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN MORFOLOGÍA
P R E S E N T A:
Q . B . P . D E L I A H U I D O B R O P É R E Z
DIRECTOR: DR. OFIR PICAZO PICAZO
MÉXICO, D.F. JUNIO DE 2005
“El presente trabajo de tesis se realizó en el Laboratorio de Farmacología Conductual de la Sección de Estudios de Posgrado e Investigación en la Escuela superior de Medicina del Instituto Politécnico Nacional, bajo la dirección del Dr. Ofir Picazo Picazo.”
Este trabajo de investigación (TESIS) se expuso en el XLVII Congreso Nacional de la Sociedad Mexicana de Ciencias Fisiológicas y en el XXVIII Congreso Nacional de Histología.
A las personas más importantes en mi vida: Alejandro por estar siempre a mi lado, mis padres quienes han sido el mejor ejemplo en mi vida y mi hermano por su apoyo.
AGRADECIMIENTOS
Agradezco al Instituto Politécnico Nacional y a la Escuela Superior de Medicina por abrirme sus puertas y brindarme todo lo necesario para desarrollarme tanto profesional como personalmente.
Agradezco al Programa Institucional de Formación de Investigadores y al Programa Institucional de Becas por el apoyo otorgado.
Gracias al Dr. Ofir Picazo por todo lo que he aprendido al trabajar a su lado, por su tiempo, paciencia y dedicación, al igual que por todos sus consejos.
Mil gracias a la Dra. Adriana Becerril, por abrirme las puertas de su laboratorio y permitirme utilizar el equipo. También le agradezco haber sido una guía y un apoyo constante todo este tiempo, y no solo en lo académico; sino en lo personal.
A mis padres les agradezco infinitamente ser ejemplo, apoyo y compañía, ya que ellos han sido un gran motor que me impulsa a seguir adelante, a mi hermano que ha sido mucho más que mi hermano, siempre ha estado en todo momento para ayudarme.
Todo mi amor y agradecimiento a Alejandro que sin importar la hora o el día siempre estuvo a mi lado apoyándome y ayudándome.
Ariadnna quien es más que una amiga, es como una hermana, siempre ha estado conmigo cuando más la he necesitado; mil gracias por tu amistad.
Mis abuelitos Roberto y Delia que han sido mis admiradores todo este tiempo, que con su elogios y amor me hacen sentir que todo lo puedo. Gracias por levantarme el ánimo, creer y confiar en mí. Gracias a mi abuelita José que desde donde esté no hace más que cuidarme.
Mil gracias a todas las personas que con consejos y otras veces con trabajo, me ayudaron para realizar este trabajo:
Mariano, por ayudarme en las cirugías y enseñarme, a Alfredo, Azucena y Judith, por los consejos que han sido invaluables y a todos mis demás compañeros de laboratorio que con su compañía me hicieron más placentero el trabajo.
Agradezco a todas las personas que de uno u otro modo ha estado conmigo todo este tiempo y me han apoyado para lograr cada una de mis metas.
Agradezco a los miembros del jurado:
Dra. Adriana Becerril Montes Dr. Rafael Campos Rodríguez Dra. Rosa Adriana Jarillo Luna Dr. Joel Lomelí González
Dra. Ericka Monserrat Estrada Camarena Dr. Ofir Picazo Picazo
Por las observaciones hechas a mi trabajo, las cuales fueron muy valiosas.
ÍNDICE
GLOSARIO 11 RELACIÓN DE FIGURAS 12 RESUMEN 15 ABSTRACT 17 INTRODUCCIÓN 19 El 17β-estradiol 19 El 17α-etinil estradiol 26 El fenómeno de excitotoxicidad 28 El ácido kaínico 30 El ácido quinolínico 31 El hipocampo 32 HIPÓTESIS 35 OBJETIVO GENERAL 36 OBJETIVOS PARTICULARES 37 MATERIAL Y MÉTODOS 38 Animales 38 Reactivos 39 Método General 40
Tratamiento hormonal y
administración de neurotoxinas 40 Obtención y selección de cortes 42 Técnica de Nissl 43 Conteo de neuronas en el hilus del hipocampo 45 Análisis estadístico 45
RESULTADOS 46 DISCUSIÓN 57 CONCLUSIONES 66 BIBLIOGRAFÍA 67
GLOSARIO
AMPA Ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isopropiónico C Citocina
DNA Ácido desoxirribonucléico E2 17β-estradiol
EE2 17α-etinil estradiol ER Receptores a estrógeno
ERE “Elementos específicos de respuesta del DNA”
ERK Cinasa reguladora de señales extracelulares ERα Receptor a estrógenos alfa
ERβ Receptor a estrógenos beta G Guanina
GF Factores de crecimiento polipeptídicos i.c.v. Intracerebroventricular
i.p. Intraperitoneal
IGF-1 Factor de crecimiento semejante a insulina 1 Ka Ácido kaínico
LD50 Dosis letal al 50%
MAPK Protein-cinasas activadas por mitógeno mRNA Ácido ribonucléico mensajero
NMDA N-metil-D-aspartato P Fosforilación
PBS Amortiguador salino de fosfatos PI3K Fosfatidilinositol 3-cinasa
QUIN Ácido quinolínico R Receptor
RNA Ácido ribonucléico Sp-1 Proteína Sp-1
RELACIÓN DE FIGURAS
Figura 1. Estructura química del 17β-estradiol
20 Figura 2. Mecanismos de señalización del estrógeno: GF, factores
de crecimiento polipeptídicos; R, receptor; P, fosforilación; ERE,
“elementos específicos de respuesta del DNA; E2, 17β-estradiol;
mRNA, ácido ribonucléico mensajero.
23 Figura 3. 17α-etinil estradiol
27 Figura 4. Ácido kaínico
30 Figura 5. Ácido quinolínico
31 Figura 6. En la imagen de la izquierda el hipocampo se observa de
color azul intenso y en la figura de la derecha el hipocampo esta delineado de color morado
32 Figura 7. Corte horizontal del hipocampo derecho de rata
33 Figura 8. Estereotáxico
41 Figura 9. Vista dorsal de un cráneo de rata
41 Figura 10. Fijación de la cabeza de la rata mediante el
estereotáxico e inserción de la cánula
41 Figura 11. Bomba de microinyección
41 Figura 12. Número de células por milímetro cuadrado en el hilus
del hipocampo después de diferentes tratamientos hormonales. Los datos de la columna derecha representan la media ± el error
estándar de 5 ratas. La línea discontinua significa que no fue posible observar células.
46
Figura 13. Fotografías del hilus del hipocampo derecho de rata.
Fotografías de lado izquierdo objetivo 4X; fotografías de lado
derecho objetivo 40X. A y B. Grupo control, Ciclodextrina y PBS; C y D. Rata tratada con 17β-estradiol; E y F. Rata tratada con 17α-etinil estradiol. Se puede apreciar una morfología de las células del hilus en los tres grupos.
47 Figura 14. Influencia del 17β-estradiol y del 17α-etinil estradiol
sobre el número de neuronas por milímetro cuadrado en el hilus del hipocampo derecho de rata. Cada barra representa la media ± el error estándar del número de células de la zona hilar del hipocampo derecho de 5 ratas.
48 Figura 15. Fotografías de lado izquierdo objetivo 4X; fotografías de
lado derecho 40X. Fotografías del hilus del hipocampo derecho de ratas tratadas con: A y B. 50 nmoles de ácido quinolínico y
ciclodextrina 5%; C y D. 100 nmoles de ácido quinolínico y ciclodextrina 5%.
50 Figura 16. Efecto de diferentes concentraciones de ácido
quinolínico en relación con el número de neuronas en el hilus del hipocampo derecho de rata. Prueba de Dunn * p < 0.05. Cada barra representa la media ± el error estándar del número de células de la zona hilar del hipocampo derecho de 5 ratas.
51 Figura 17. Fotografías de la izquierda objetivo de 4X; fotografías de
la derecha objetivo 40X. Fotografías del hilus del hipocampo
derecho de ratas tratadas con: A y B. 17β-estradiol y 100 nmoles de ácido quinolínico; C y D. 17α-etinil estradiol y 100 nmoles de ácido quinolínico.
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Figura 18. Efecto del 17β-estradiol o del 17α-etinil estradiol, frente a la neurotoxicidad inducida por el ácido quinolínico en el hilus del hipocampo derecho de rata. Prueba de Dunn * p < 0.05. Cada barra representa la media ± el error estándar del número de células de la zona hilar del hipocampo derecho de 5 ratas.
53 Figura 19. Fotografías de la izquierda objetivo de 4x; fotografías de
la derecha objetivo de 40x. Fotografías del hilus del hipocampo derecho de ratas tratadas con: A y B. Ciclodextrina 5 % y ácido kaínico 7 mg/Kg; C y D. 17β-estradiol y ácido kaínico; E y F. 17α- etinil estradiol y ácido kaínico.
54 Figura 20. Efecto del 17β-estradiol o del 17α-etinil estradiol, frente
a la neurotoxicidad inducida por el ácido kaínico en el hilus del hipocampo derecho de rata. Prueba de Dunn * p < 0.05. Cada barra representa la media ± el error estándar del número de células de la zona hilar del hipocampo derecho de 5 ratas.
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RESUMEN
La hormona endógena 17β-estradiol (E2) actúa como un potente factor de crecimiento y protección en el cerebro adulto y su disminución se ha relacionado con un aumento en la frecuencia de enfermedades neurodegenerativas.
Por otro lado, el esteroide sintético 17α-etinil estradiol (EE2) es comúnmente usado como componente de anticonceptivos orales así como para el tratamiento de los síntomas de la menopausia y la posmenopausia. Actualmente se sabe que algunos derivados estrogénicos poseen propiedades neuroprotectoras en varios modelos animales. Uno de estos modelos consiste en realizar una lesión cerebral con alguna neurotoxina como el ácido kaínico (Ka) o el ácido quinolínico (QUIN). El objetivo de este estudio consistió en investigar mediante técnicas histológicas la influencia del EE2 sobre la pérdida neuronal inducida por el Ka o el QUIN en la zona hilar del hipocampo.
Se usaron ratas W istar previamente ovariectomizadas. Dos semanas después de la cirugía, los animales se asignaron a uno de los siguientes grupos: Ciclodextrina + PBS; E2 (100µg/rata) + PBS; EE2 (100µg/rata) + PBS; ciclodextrina + Ka (7mg/Kg); E2 + Ka; EE2 + Ka; ciclodextrina + QUIN (50, 100 y 150 nM/µl); E2 + QUIN (100 nM/µl); EE2 + QUIN (100 nM/µl). Las hormonas se administraron i.p. simultáneamente con el Ka (i.p.) y el QUIN (i.c.v); las ratas fueron sacrificadas 96 horas después en el primer caso y 48 horas después en el segundo. Los cerebros se
extrajeron y fijaron en paraformaldehído al 4%. Posteriormente, se disecó la formación hipocampal derecha y se cortó en secciones horizontales (espesor 30 µ). Los cortes se tiñeron con la técnica de Nissl y se analizaron en un microscopio de luz.
Los resultados muestran que el número de células del hilus disminuye tras la administración de Ka. La disminución en el número de células en el caso del QUIN fue dosis dependiente.
Este efecto fue bloqueado tras la administración de EE2 y es similar a los resultados obtenidos con E2.
ABSTRACT
Endogenous hormone 17β-estradiol (E2) acts as a potent growth and protective factor in the adult brain and its decrease is associated with an increase in the frequency of neurodegenerative diseases.
In the other hand, the synthetic steroid 17α-ethinyl estradiol (EE2), is commonly used as a component of oral contraceptives as well as in the treatment of the menopausal and postmenopausal symptoms. At current, it is known that some of the estrogenic derivates have neuroprotective properties in several animal models. One of these consists of the cerebral lesion with a neurotoxin such as kainic acid (Ka) or quinolinic acid (QUIN). The aim of this work was to investigate the influence of the EE2 on the neuronal lost induced by Ka and QUIN in the hilar zone of the hippocampus through hystological techniques.
It was used W istar rats previously ovariectomized. Two weeks after surgery, animals were assigned to one of the following groups: Cyclodextrin + PBS; E2 (100µg/rat) + PBS; EE2 (100µg/rat) + PBS; cyclodextrin + Ka (7mg/Kg); E2 + Ka; EE2 + Ka; cyclodextrin + QUIN (50, 100 y 150 nM/µl); E2 + QUIN (100 nM/µl); EE2 + QUIN (100 nM/µl). Hormones were i.p.
administrated simultaneous with Ka (i.p.) and QUIN (i.c.v.); rats were sacrificed 96 hours later with the former and 48 hours with the latter. Brains were removed and fixed in paraformaldehyde (4%). The right hippocampal formation was dissected and then
cut in horizontal sections (thickness 30 µ). S ections were Nissl stained and analyzed in a light microscope.
Results show a decrease in the number of cells in the hilus after Ka administration. The decrease in the number of cells in the case of QUIN showed a dosis-dependent relationship. These effects were blocked out after the administration of EE2, which was in line with the results obtained with E2.
INTRODUCCIÓN
El 17 ββ -estradiol
En 1850 el Vienés Emil Knauer descubrió que las hormonas presentes en los ovarios eran las responsables de las características sexuales femeninas; y en 1929 Eduard Doisy y Butenandt, cada uno por su lado identificaron en orina de mujeres embarazadas la hormona que inicialmente había estudiado Knauer y la llamaron estrógeno (Oistros=deseos locos, Gennein=engendrar); más tarde en 1932 Doisy aisló otro derivado, el 17β-estradiol (Nieman LK y Loriaux DL, 1993).
Los esteroides son lípidos simples ya que no se hidrolizan para formar ácidos grasos, tienen una gran variedad de funciones, pero los más importantes son los que actúan como hormonas (Wade LG, 1991; Pine SH y cols., 1995).
El 17β-estradiol (Figura 1), es el principal estrógeno y el más potente; durante la primera parte del ciclo menstrual los estrógenos son producidos en el folículo ovárico por las células de la granulosa, después de la ovulación son sintetizados tanto por las células de la granulosa como por las células de la teca, en el humano alcanzan su concentración máxima en la mitad del ciclo siendo de 250 pg/ml, en tanto que su concentración más baja se encuentra en la fase folicular temprana con un valor de 40 pg/ml (Baird DT y Fraser IS, 1974; Goldfien A, 1999). Los niveles plasmáticos de esta hormona reportados, en la rata son
de 17±2 a 21±2 pg/ml con picos de 80 a 140 pg/ml durante varios estadios del ciclo estral (Rusa R y cols., 1999).
Figura 1. Estructura química del 17β-estradiol
El 17β-estradiol tiene diversas acciones además de la función reproductiva, incluyendo acciones en áreas cerebrales que son importantes para el aprendizaje y la memoria, las emociones y los estados de ánimo, así como la coordinación motriz y la sensibilidad al dolor (McEwen BS, 1999).
Varios estudios clínicos sugieren que el 17β-estradiol actúa como un potente factor de crecimiento y protección en el cerebro adulto (W ise PM y Dubal DB, 2000).
El 17β-estradiol es un factor de crecimiento, diferenciación y regula la función en una gran variedad de tejidos blanco, incluyendo el aparato reproductor del macho y la hembra, glándula mamaria, hueso y sistema cardiovascular. Los efectos biológicos predominantes del 17β-estradiol son mediados por dos receptores intracelulares, el receptor alfa (ERα) y el receptor beta (ERβ). De este último hay subtipos del 1 al 6 en el humano;
parecen ser complementarios pero no redundantes (Dhandapani KM y Brann DW, 2002; Toran-Allerand CD y cols., 2002). Los estrógenos son moléculas lipofílicas por lo cual atraviesan la membrana celular con facilidad y pueden llegar a sus receptores (Beato M y Klug J, 2000; Hall JM y cols., 2001). Está bien establecido que a pesar de que ambos receptores presentan la misma afinidad por el 17β-estradiol, muestran diferentes patrones de afinidad por “elementos específicos de respuesta”
del DNA, sugiriendo un patrón diferente de activación de genes por los dos receptores (Hawkins MB y cols., 2000; Harms C y cols., 2001).
El ERα, se expresa predominantemente en mama, útero, cérvix, vagina, y en otros varios órganos blanco, en tanto que el ERβ exhibe un patrón de expresión más limitado; se detecta principalmente en ovario, próstata, testículo, bazo, pulmón, hipotálamo y timo. En el cerebro se ha identificado una expresión diferencial regional de estos receptores (Hall JM y cols., 2001;
Kuiper GGJM y cols., 1997).
La molécula de estrógeno presenta cuatro mecanismos de acción: (Figura 2)
1. Mecanismo clásico de la acción del estrógeno (ligando dependiente): En ausencia de hormona, el receptor es secuestrado por un complejo inhibitorio multiprotéico, cerca del núcleo celular, la unión del ligando induce un cambio conformacional en el receptor el cual promueve la homodimerización y una alta afinidad por “elementos específicos de respuesta” del DNA, los cuales se localizan cerca de regiones reguladoras de genes específicos;
teniendo contacto con el aparato general de transcripción, directa o indirectamente vía cofactores; se acepta generalmente que las interacciones receptor estrogénico- coactivador, estabilizan la formación de un complejo principal de trascripción y facilita la disrupción necesaria de la cromatina en los “elementos específicos de respuesta” del DNA.
2. Activación del receptor a estrógenos independiente de ligando: Ahora se acepta que la función de los ER puede ser modulada por señales extracelulares en ausencia de estrógeno, como ocurre en el caso de la habilidad de los factores de crecimiento polipeptídicos (GF) como el factor de crecimiento epidermal y el factor de crecimiento semejante a insulina-1 (IGF-1), para activar ER e incrementar la expresión de genes blanco para ER; es posible que la vía independiente de hormona permita la activación de ER en presencia de bajas concentraciones de estradiol, como se encuentra en los machos; el mecanismo por el cual el ER y la vía de factores de crecimiento convergen no esta muy clara.
3. Acción genómica de ER independiente de “elementos específicos de respuesta” del DNA: La activación de IGF-1 y la expresión de la colagenasa por ERα es mediada por la interacción de receptores con Fos y Jun en los sitios de unión AP-1, los cuales contienen secuencias promotoras ricas en GC las cuales se activan vía un complejo ERα-Sp1.
4. Efectos no genómicos del estrógeno: La observación de efectos biológicos rápidos del estrógeno en hueso, mama,
vasculatura y sistema nervioso sugieren que los estrógenos pueden llevar a cabo un efecto no genómico, posiblemente a través de formas de ER en la superficie celular que están ligados a proteínas transductoras de señales intracelulares.
Hay evidencias de que algunos de los efectos de protección vascular del estrógeno a través de ERα son mediados por un mecanismo no genómico, involucrando una activación bifásica de la sintasa del óxido nítrico endotelial por estrógeno a través de protein-cinasas activadas por mitógeno (MAPK).
Figura 2. Mecanismos de señalización del estrógeno: GF, factores de crecimiento polipeptídicos; R, receptor; P, fosforilación; ERE, “elementos específicos de respuesta del DNA; E2, 17β-estradiol; mRNA, ácido ribonucléico mensajero.
Como se mencionó antes, se ha reportado que el 17β- estradiol posee efectos neuroprotectores. Se han propuesto tres posibles mecanismos para explicar estas acciones; 1) mecanismo genómico mediado por receptores a estrógeno, 2) mecanismo no genómico que involucra la vía de las MAPK y/o la fosfatidilinositol 3-kinasa (PI3K) y 3) vía antioxidante capturando radicales libres. Los dos primeros mecanismos, pueden ser observados a dosis fisiológicas bajas de 17β-estradiol; en
contraste el tercero sólo se observa a dosis no fisiológicas altas de esta hormona (Dhandapani KM y Brann DW, 2002). De acuerdo con estudios realizados con anterioridad, se sabe que el 17β-estradiol protege contra el daño exitotóxico producido por el ácido kaínico mediante una vía genómica (Picazo O y cols. 2003) y que el ERα es un punto crítico en la neuroprotección mediada por estrógenos (Dubal DB y cols., 2001; Harms C y cols., 2001;
Liu R y cols., 2002).
Los esteroides ováricos son de suma importancia en el mantenimiento normal de la función cerebral; la pérdida de estas hormonas en la menopausia puede justificar, al menos en parte, la declinación cognitiva y la neurodegeneración asociadas con la enfermedad de Alzheimer (Behl C y cols., 1997; Dubal DB y W ise PM, 2001) ya que se ha demostrado que tanto los estrógenos naturales como los de origen sintético ayudan a paliar estos desórdenes (Toung TH y cols., 1998; Liu R y cols., 2002).
Conforme las mujeres envejecen y entran en la menopausia pierden la habilidad para producir 17β–estradiol a causa de la depleción de los folículos ováricos, por lo que los niveles sanguíneos de esta hormona en mujeres posmenopáusicas es solo el 1% de los observados en mujeres jóvenes fértiles (Dhandapani KM y Brann DW, 2002).
Además en mujeres posmenopáusicas o con hipoestrogenicidad permanente, aumenta el riesgo de daño cerebral asociado con padecimientos neurodegenerativos como la enfermedad de Alzheimer, la cual disminuye aparentemente con la terapia de sustitución estrogénica (Bi R y cols., 2000;
W ise PM y Dubal DB, 2000; Dubal DB y W ise PM, 2001). En el
mismo sentido, se ha demostrado que el 17β-estradiol ejerce efectos neuroprotectores tanto in vivo como in vitro en modelos de menopausia inducida y natural (Toung TJ y cols., 1998; Dubal DB y cols. 2001). Por ejemplo; algunos estudios in vitro han encontrado que los estrógenos protegen contra el daño neuronal inducido por ciertos aminoácidos excitatorios, por el péptido beta-amiloide o por estrés oxidativo. (Sato K y cols., 2002).
También, el pretratamiento con 17β-estradiol o estriol produce una protección significativa contra la toxicidad por glutamato (Goodman Y y cols., 1996).
También se han visto efectos benéficos del estrógeno con relación a la mortalidad y morbilidad asociada a alguna lesión cerebral. Datos clínicos asocian la terapia de reemplazo hormonal de mujeres posmenopáusicas con una mejora del desarrollo cognitivo junto con una disminución de la incidencia de enfermedades neurodegenerativas como Parkinson y Alzheimer (Bi R y cols., 2000; Harms C y cols., 2001), en tanto que la disminución en la concentración sérica de estrógenos está relacionada con el riesgo de desarrollar Alzheimer (Xia S y cols., 2002). Otros autores proponen que el estrógeno como agente neuroprotector puede contribuir a demorar el desarrollo de esta enfermedad (Goodman Y y cols., 1996; Pike CJ, 1999) y sugieren que la hormona esteroidea 17β-estradiol juega un papel importante en proteger el cerebro de procesos neurodegenerativos (Ramírez AD y cols., 2003).
Los efectos neuroprotectores del 17β-estradiol no son rápidos y requieren un periodo de pretratamiento, sugiriendo que se requiere una alteración de la expresión génica mediada por
receptores a estrógeno para llevar a acabo la neuroprotección.
Así, niveles fisiológicos de estradiol pueden proteger a través de mecanismos dependientes de receptores, mientras que altas concentraciones del mismo pueden actuar a través de mecanismos que no requieren la presencia de receptores a estrógeno (Dubal DB y cols., 2001).
El 17 αα -etinil estradiol
En 1937, Hohlweg y su colega Hans H, Inhoffen agregaron un grupo etinil en la posición 17, sintetizando así el 17α-etinil estradiol, el primer derivado del estrógeno que podía aplicarse efectivamente en dosis oral.
El 17α-etinil estradiol (Figura 3), es un esteroide sintético preparado de la estrona, que difiere del 17β-estradiol por la presencia de un grupo etinilo en el carbono 17 en posición alfa.
El 17α-etinil estradiol es de 30 a 50 veces más activo que el 17beta-estradiol (Wade LG, 1991; Lehninger AL, 1993; Strayer L, 1995), es absorbido rápida y completamente en el tracto gastrointestinal. La sustitución en el carbono 17 inhibe el metabolismo de primer paso (degradación enzimática en hígado) y comparado con otros estrógenos su metabolismo es lento, presenta una biodisponibilidad del 40 %; su ruta principal de biotransformación es vía 2-hidroxilación y la formación de 2- y 3- metil éteres. Su metabolismo de primer paso ocurre principalmente en la pared del intestino (Subramanian S y cols., 2003).
Figura 3. 17α-etinilestradiol
Es usado comúnmente como componente estrogénico de anticonceptivos orales y es ampliamente utilizado en el tratamiento de los síntomas de la menopausia y la posmenopausia. Actúa a través de la regulación de la expresión génica como el 17β-estradiol (Nikov GE y cols., 2001).
Entre los efectos terapéuticos indeseables se encuentra la acción en el tracto reproductor femenino, donde el 17α-etinil estradiol estimula la proliferación y diferenciación en la trompa de Falopio y aumenta la actividad muscular en ésta; también aumenta la cantidad de agua en el moco cervical y favorece la contracción del miometrio; así mismo favorece la retención de agua y sodio, lo cual puede resultar en edema, ganancia de peso y tendencia a aumentar el busto. Cambios en la líbido y retirada del sangrado menstrual son también reportados, así como dolores de cabeza depresión, mareo e intolerancia a la glucosa.
Presenta un LD50 en ratas de 2952 mg/Kg.
Interesantemente, la acción neuroprotectora de este esteroide se ha explorado muy poco y no se conoce su actividad en el modelo animal para estudiar daño cerebral que involucra la inyección de neurotoxinas. Sin embargo, existe un estudio en cultivos organotípicos de hipocampo de ratas, cuyos resultados sugieren un efecto neuroprotector de esta hormona frente al estrés oxidativo inducido por deficiencia de oxígeno o por aumento de radicales libres (Behl C y cols., 1997).
El fenómeno de excitotoxicidad
El glutamato es el principal neurotransmisor excitador del sistema nervioso central de los mamíferos y actúa tanto a través de receptores acoplados a canales iónicos (ionotrópicos) como a receptores acoplados a proteína G (metabotrópicos). Los receptores ionotrópicos de glutamato son complejos formados por 4 o 5 subunidades y se dividen en grupos según su comportamiento farmacológico, se denominan según la molécula agonista que lo activa: NMDA (N-metil-D-aspartato), AMPA (ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoazolpropiónico) y kainato (Lerma J y cols., 2001).
Existe la posibilidad que la activación de los receptores a glutamato contribuya al proceso de muerte celular en desordenes neurodegenerativos crónicos como las enfermedades de Huntington, Parkinson y Alzheimer (Meldrum BS, 2000).
El glutamato exógeno bloquea la recuperación de cisteína, mediante la inhibición del antiporte glutamato-cisteína, produciendo una disminución de cisteína intracelular, la cual es
uno de los tres aminoácidos del glutatión; la falta de éste conduce a la acumulación de especies reactivas de oxígeno y la entrada de iones calcio, produciendo finalmente muerte celular (Liu R y cols., 2002).
Cuando el estrés es severo, conduce a la muerte celular por necrosis; cuando es menos severo, la apoptosis puede ser la consecuencia. El mecanismo primario involucrado, es un desequilibrio relacionado con la entrada excesiva de iones sodio y calcio a través de canales dependientes de ligando y voltaje. El aumento de la concentración intracelular de iones activa varias enzimas que contribuyen a la muerte celular por varios mecanismos. Existe una interacción compleja entre los cambios iónicos, alteraciones en el metabolismo energético con envenenamiento de la mitocondria y daño por radicales libres u oxidación (Meldrum BS, 2000).
Los mecanismos de excitotoxicidad están basados en la sobreexcitación de las neuronas como resultado de la estimulación propagada y continua de los receptores a aminoácidos excitadores, lo que produce serias alteraciones en la fisiología de las neuronas, conduciéndolas a la muerte (Pérez- Severiano F y cols., 2004).
Los daños excitotóxicos y oxidativos pueden contribuir a la degeneración neuronal en varios desordenes, incluyendo isquemia y daños cerebrales traumáticos, ataques epilépticos, enfermedad de Alzheimer y Parkinson (Goodman Y y cols., 1996;
Kuroki Y y cols., 2001).
Dentro de las sustancias excitotóxicas se encuentran el ácido kaínico y el ácido quinolínico.
El ácido kaínico
Este agente tóxico fue aislado de Digenea, una alga roja que se encuentra en aguas tropicales y subtropicales y fue usado por siglos como un antihelmíntico (Coyle JT, 1987). En 1953 Murakami y colaboradores aislaron el ingrediente activo antihelmíntico y lo llamaron ácido digénico y posteriormente fue renombrado ácido kaínico (kainato) después de que los japoneses nombraran al alga Kaininso.
El ácido kaínico (Figura 4) es un análogo conformacional del ácido L-glutámico y es el agonista prototípico de la clase kainato de los receptores ionotrópicos del glutamato; induce convulsiones y neurodegeneración in vivo y es usado para inducir epilepsia experimental en roedores.
Figura 4. Ácido kaínico
El modelo de lesión neuronal con ácido kaínico a nivel del hilus del hipocampo esta perfectamente estandarizado y se sabe que a la dosis de 7 mg/Kg se observa una perdida neuronal a nivel del hilus del hipocampo sin que esta sea total o tan elevada
que no sea posible proteger frente a este daño, ya que esta neurotoxina a dosis más elevadas es usada para inducir epilepsia en roedores.
El ácido quinolínico
El ácido quinolínico (Figura 5) es un metabolito endógeno del triptofano, produce disminución en el número de axones en el cuerpo estriado; esta lesión es muy similar a la que se observa en la enfermedad de Huntington. Sin embargo, este agente es capaz de dañar otras áreas cerebrales en función de su concentración, como es el caso del hipocampo. El ácido quinolínico es un agonista de los receptores NMDA. (Brickell KL y cols., 1999; Kuroki Y y cols., 2001)
Figura 5. Ácido quinolínico
El hipocampo
El hipocampo es una parte del cerebro localizada debajo del lóbulo temporal, es un órgano par; (Figura 6) así que se tiene un hipocampo derecho y uno izquierdo, forma parte del sistema límbico y participa en la memoria y las emociones. Su nombre deriva de su forma curva la cual se asemeja a la de un caballito de mar que en griego es hippocampus (Guyton AC y Hall JE, 1996).
Figura 6. En la imagen de la izquierda el hipocampo se observa de color azul intenso y en la figura de la derecha el hipocampo esta delineado de color morado
El hipocampo se dividie en distintas regiones: el giro dentado (GD), las áreas CA1, CA2, CA3 (CA deriva de cornu ammonis, por su forma de cuerno de carnero) y el hilus, perfectamente bien delimitado por la región CA3 y el giro dentado (Figura 7).
Figura 7. Corte horizontal del hipocampo derecho de rata
La influencia hormonal en los procesos de memoria parece involucrar acciones en áreas cerebrales como el hipocampo (Meldrum BS, 1999) el cual es el principal blanco de muerte neuronal en desórdenes neurodegenerativos como la enfermedad de Alzheimer (Behl C y cols., 1997).
A nivel del hilus del hipocampo es posible observar una disminución en el número de células, tras la aplicación selectiva de dosis bajas de ácido kaínico o quinolínico. Este modelo de lesión neuronal se utiliza ampliamente para cuantificar los efectos neuroprotectores de diversas sustancias, incluídas las hormonas esteroideas que se utilizan en este trabajo.
El hipocampo expresa ambas isoformas del receptor a estrógenos ERα y ERβ, esto ha sido demostrado mediante la detección del mRNA de ambas isoformas (Gu Q y cols., 1999), pero se ha visto una mayor concentración de ERα que ERβ por medio de técnicas inmunocitoquímicas (Harms C y cols., 2001;
Meldrum BS, 2000). A nivel del hilus se observan niveles apreciables de inmunoreactividad neuronal de ER (Pike CJ,
CA1
CA2
CA3 GD
Hilus
1999). Del mismo modo por hibridación in situ e inmunocitoquímica se ha detectado el mRNA para las 5 subunidades que forman los receptores de tipo kainato (KA1, KA1, GluR5-7) en la mayoría de los tipos celulares del hipocampo (W ilding TJ y Huettner JE, 1997).
HIPÓTESIS
Si el 17α-etinil estradiol tiene propiedades neuroprotectoras similares a las demostradas por el 17beta- estradiol frente al ácido kaínico, entonces el número de neuronas por milímetro cuadrado en el hilus del hipocampo no se alterará tras la inyección simultánea de la hormona y el ácido kaínico o el ácido quinolínico.
OBJETIVO GENERAL
Investigar mediante técnicas histológicas la influencia del 17α-etinil estradiol sobre la pérdida neuronal inducida por el ácido kaínico o el ácido quinolínico en la zona hilar del hipocampo.
OBJETIVOS PARTICULARES
• Cuantificar el número de células en el hilus del hipocampo después de la administración intraperitoneal de ácido kaínico en ausencia y presencia de estradiol o 17α-etinil estradiol.
• Cuantificar el número de células en el hilus del hipocampo después de la administración intracerebroventricular de ácido quinolínico en ausencia y presencia de estradiol o 17α-etinil estradiol.
Material y métodos
Animales
:Se utilizaron ratas hembra de la cepa Wistar, con peso entre 250 y 300 g, las cuales se mantuvieron en un ciclo de luz oscuridad de 12:12 h con libre acceso a comida y agua.
Para reducir los niveles plasmáticos de hormonas esteroideas las ratas fueron ovariectomizadas bajo anestesia con 2,2,2 tribromoetanol al 2% en una dosis de 0.2 g/Kg; 15 días después de la cirugía, se dividieron en 11 grupos de 5 ratas cada uno, los cuales se enumeran a continuación con su respectivo tratamiento:
GRUPO TRATAMIENTO
1 Ciclodextrina 5% (0.5 ml/rata) + Amortiguador de fosfatos salino (PBS) 0.01M pH 7.4 (0.5 ml/rata) 2 17β-estradiol (100 µg/rata) + PBS
3 17α-etinil estradiol (100 µg/rata) + PBS 4 Ciclodextrina + Ácido kaínico (7 mg/Kg) 5 17β-estradiol + Ácido kaínico
6 17α-etinil estradiol + Ácido kaínico
7 Ciclodextrina + Ácido quinolínico 50 nmoles 8 Ciclodextrina + Ácido quinolínico 100 nmoles 9 Ciclodextrina + Ácido quinolínico 150 nmoles 10 17β-estradiol + Ácido quinolínico 100 nmoles
11 17α-etinil estradiol + Ácido quinolínico 100 nmoles
Tanto el 17β-estradiol como el 17α-etinil estradiol, fueron disueltos en β-ciclodextrina al 5%; mientras que el ácido kaínico y el ácido quinolínico se disolvieron en amortiguador de fosfatos salino (PBS) 0.01M, pH 7.4.
Reactivos:
Alcohol etílico 96° Reasol Alcohol etílico absoluto anhidro J.T. Baker Agua Milli-QXileno Merck Formaldehído J.T. Baker Azul de toluidina Gurr’s Ácido acético glacial
Hidróxido de sodio
Gelatina Sigma Chemical Éter Aldrich
Cloruro de sodio J.T. Baker Fosfato dibásico de sodio anhidro J.T. Baker
Fosfato monobásico de sodio monohidratado Técnica Química β-Ciclodextrina Sigma Chemical
17β-estradiol Sigma Chemical
17α-etinilestradiol Sigma Chemical Ácido kaínico Sigma Chemical Ácido quinolínico Merck
2,2,2 tribromoetanol Fulka Dextrosa monohidratada J.T. Baker Benzal Degasa Resina sintética
Método general:
Tratamiento hormonal y administración de neurotoxinas
Los animales ovariectomizados recibieron una sola inyección intraperitoneal de las hormonas o su vehículo; 20 minutos después se inyectó el ácido kaínico o su vehículo intraperitonealmente utilizando para ello una jeringa de 1 ml.
Para encontrar la dosis adecuada de ácido quinolínico a emplear se hizo una curva dosis respuesta con esta neurotoxina.
Inyectandola intracerebroventricularmente Para esto el animal fue anestesiado con 2,2,2-tribromoetanol al 2% en una dosis de 0.2 g/Kg. La cabeza se colocó en un aparato estereotáxico (Figura 8) con el cráneo expuesto, se taladró un trépano en las siguientes coordenadas de acuerdo al atlas estereotáxico de Paxinos y Watson (1986); 0.9 mm posterior a bregma y 2 mm lateral respecto a la línea media en el hemisferio derecho (Figura 9). Con el propósito de administrar la neurotoxina en el ventrículo derecho, la aguja se introdujo 3 mm de la superficie cerebral (Figura 10), dicha aguja se conectó por medio de una cánula con una jeringa Hamilton de 1µl acoplada a una bomba de microinyección (Figura 11).
Figura 8. Estereotáxico Figura 9. Vista dorsal de un cráneo de rata
Se inyectó 1 µl de la solución de ácido quinolínico a una velocidad de 25 nl/seg para asegurar una difusión lenta. Después la aguja fue retirada, el trépano fue tapado con cera para hueso y la piel fue suturada.
Figura 10. Fijación de la cabeza de la Figura 11. Bomba de microinyección rata mediante el estereotáxico
e inserción de la cánula
Obtención y selección de cortes
48 y 96 horas después de la administración del ácido quinolínico y del ácido kaínico respectivamente, las ratas fueron sacrificadas con vapores de éter (ver diagrama de flujo), para posteriormente obtener los cerebros, mismos que se fijaron por inmersión al menos durante 96 horas a 4 °C en paraformaldehído al 4% en PBS 0.01 M pH 7.4.
Al término de la fijación los cerebros fueron enjuagados en PBS y la formación hipocampal derecha fue disecada. Con el fin de proteger a las células de romperse al momento de la congelación las piezas se sumergieron en una solución de dextrosa al 30% por 48 horas a 4°C, tras lo cual se realizaron cortes de 30µ de espesor en criostato, mismos que fueron recuperados por flotación en PBS.
Los cortes fueron observados en microscopio de campo claro a 400 aumentos y se seleccionaron los que se encontraban entre las coordenadas dorsoventrales -4.5 mm y -7.5 mm relativo
Sacrificar ratas
Extraer y fijar cerebro
Disecar hipocampo
Hacer cortes de
30µ Teñir por
Nissl Contar
neuronas en el hilus
Análisis estadístico
a bregma; que corresponden a la porción temporal del hipocampo la cual es más sensible al ácido kaínico que la porción septal (Picazo O y cols., 2003). Estos cortes se montaron en portaobjetos previamente gelatinizados (gelatina 2%); por animal se montaron 5 portaobjetos de 6 cortes cada uno, teniéndose un total de 25 portaobjetos (150 cortes) por grupo en promedio.
Posteriormente se procedió a teñirlos mediante la técnica de Nissl.
Técnica de Nissl
Esta técnica de coloración específica para los somas neuronales está basada en lo siguiente: En las células vivas los agrupamientos fosfóricos de los ácidos nucleicos están íntimamente ligados a grupos amino de las proteínas (o de lipoproteínas); ahora bien la coloración de ácidos nucleicos por un colorante básico, como el azul de toluidina, implica una competencia entre los cationes del colorante y los de los grupos amino, cargados positivamente. Los grupos amino de nucleoproteínas son inactivados por el formaldehído, en el cual como ya mencionamos se fijaron las piezas; esto libera los grupos fosfóricos susceptibles de fijar un colorante básico en este caso el azul de toluidina a pH 4.0. Esta inactivación se lleva a cabo por etapas, en el curso de las cuales se forman los complejos ácido nucleico – colorante. Desde este punto de vista, el DNA no reacciona como el RNA, en razón del carácter básico más fuerte de la fracción proteica (histonas); por lo que los núcleos de las neuronas en el hilus del hipocampo están muy
débilmente teñidos, no así la sustancia de Nissl y los nucleolos.
(Ganter P y Jollès G, 1969).
Para llevar a cabo esta coloración (ver diagrama de flujo) se rehidrataron los cortes con agua Milli-Q para luego colorearlos por goteo con Azul de toluidina (pH 4.0) por 25 minutos. Después se eliminó el exceso de colorante con 2 baños de agua Milli-Q y se deshidrataron las preparaciones con alcohol etílico en concentraciones crecientes desde 70% hasta absoluto, 3 minutos en cada alcohol. Posteriormente, los cortes fueron aclarados con 2 baños de Xileno de 5 minutos cada uno, para finalmente cubrir los cortes con resina sintética.
Agua Milli-Q 2 veces (1 minuto)
Azul de Toluidina (25 minutos)
Agua Milli-Q 2 veces (1 minuto)
Etanol 96%
(3 minutos)
Montar con resina sintética
Xileno II (5 minutos) Xileno
I (5 minutos) Etanol 100%
(3 minutos) II Etanol 100%
(3 minutos) I
Etanol 70%
(3 minutos)
Conteo de neuronas en el hilus del hipocampo
El número de neuronas teñidas con la técnica de Nissl en el hilus del giro dentado fue estimado contando aquellas que presentaran la morfología característica, células grandes, redondeadas de núcleo grande y con uno o varios nucleolos.
Este conteo se realizó con un microscopio de campo claro que contenía una rejilla acoplada a uno de sus oculares, esta rejilla en combinación con el objetivo de 40X (mediante el cual se realizó el conteo) presenta un área de 0.0144 mm2 (0.12 mm x 0.12 mm). El número de campos contados por corte fue de 12, lo que equivale a un área de 0.1728 mm2. En promedio se contaron 18 cortes por animal y por lo tanto 89 cortes por grupo.
Finalmente se tomaron fotografías de los cortes más representativos de cada uno de los grupos experimentales.
Análisis estadístico
Las gráficas de los registros del número de células en los dismintos ensayos experimentales se realizaron con la ayuda del programa Sigma Plot para W indows versión 8.0 y el análisis estadístico se realizó con el programa Sigma Stat para W indows versión 2.03.
Los datos están expresados como la media ± el error estándar de cada grupo y fueron analizados usando un Análisis de Varianza de Kruskall Wallis y una prueba post-hoc; la prueba de Dunn. Un valor de p < 0.05 fue considerado estadísticamente significativo. El número de animales en cada grupo fue de 5.
RESULTADOS
Los resultados obtenidos de este trabajo se encuentran resumidos en la figura 12. Todos los datos están expresados como el promedio del número de neuronas más menos el error estándar para cada uno de los grupos tratados.
GRUPO NÚMERO DE
CÉLULAS/mm2
Ciclodextrina 5% + PBS 0.01M pH 7.4 283 ± 12
17β-estradiol (100µg/rata) + PBS 0.01M pH 7.4 280 ± 4 17α-etinil estradiol (100µg/ rata) + PBS 0.01M pH 7.4 285 ± 6
Ciclodextrina 5% + Ácido Quinolínico 50Nm 247 ± 9
Ciclodextrina 5% + Ácido Quinolínico 100nM 219 ± 5
Ciclodextrina 5% + Ácido Quinolínico 150nM ---
17β-estradiol (100µg/rata) + Ácido Quinolínico 100nM 286 ± 3 17α-etinil estradiol (100µg/ rata) + Ácido Quinolínico 100nM 283 ± 4
Ciclodextrina 5% + Ácido Kaínico (7mg/Kg) 189 ± 5
17β-estradiol (100µg/rata) + Ácido Kaínico (7mg/Kg) 271 ± 3 17α-etinil estradiol (100µg/ rata) + Ácido Kaínico (7mg/Kg) 266 ± 4
Figura 12. Número de células por milímetro cuadrado en el hilus del hipocampo después de diferentes tratamientos hormonales. Los datos de la columna derecha representan la media ± el error estándar de 5 ratas. La línea discontinua significa que no fue posible observar células.
En este estudio el grupo control (Grupo 1) es el que fue tratado con los vehículos, tanto de las hormonas como de las neurotoxinas (Figura 13A y B); es decir, ciclodextrina al 5% y PBS 0.01M pH 7.4 respectivamente.
Figura 13. Fotografías del hilus del hipocampo derecho de rata. Fotografías de lado izquierdo objetivo 4X; fotografías de lado derecho objetivo 40X. A y B. Grupo control, Ciclodextrina y PBS; C y D. Rata tratada con 17β-estradiol; E y F. Rata tratada con 17α-etinil estradiol. Se puede apreciar una morfología de las células del hilus en los tres grupos.
En los grupos 2 y 3 diseñados para comprobar que ninguna de las hormonas por si mismas tuvieran algún efecto sobre el número de neuronas en el hilus del hipocampo, a los cuales sólo se les inyectaron las hormonas (Figura 13C, D, E y F). Se
A
C
B
F D
E
Número de células/mm2
0 50 100 150 200 250 300
Ciclo + PBS E2 + PBS EE2 + PBS
observó que las neuronas presentes en el hilus del hipocampo de las ratas tratadas sólo con hormonas no presentan una morfología distinta de la que presentan las neuronas observadas en el grupo control (Figura 13A y B); así mismo parece no existir una modificación en el número de neuronas tras la administración de las hormonas, para corroborar esto se hizo el análisis estadístico del conteo de células y se obtuvo la Gráfica de la figura 14. En ésta, el eje de las ordenadas representa el número de células por milímetro cuadrado y en el eje de las abscisas se encuentran representados los grupos experimentales cada uno conformado por 5 ratas.
Figura 14. Influencia del 17β-estradiol y del 17α-etinil estradiol sobre el número de neuronas por milímetro cuadrado en el hilus del hipocampo derecho de rata. Cada barra representa la media ± el error estándar del número de células de la zona hilar del hipocampo derecho de 5 ratas.
No existe diferencia entre el número de neuronas de los grupos tratado con las hormonas respecto del grupo control (ANOVA de Kruskall Wallis H = 1.477, g.l. = 2, p = 0.478).
En las fotografías de la figura 15 se muestran los resultados del experimento de dosis – respuesta, donde en las figuras 15A y B, se observa el hilus del hipocampo de rata tratado con 50 nM de ácido quinolínico donde parece no haber una variación en el número de neuronas, aunque el tejido tuvo un daño general, las células de la zona CA3 se observan con sobre coloración; en el grupo tratado con 100 nM de ácido quinolínico (Figura 15C y D) tampoco se apreció claramente una variación en el número de neuronas en el hilus, aunque se observó una menor densidad celular en la zona CA3; en el caso del grupo tratado con 150 nM se tuvo una pérdida total del tejido, por lo que no se tienen imágenes del mismo.
De la cuenta neuronal de estos grupos se obtuvo la Gráfica de la Figura 16 donde se puede observar que a la dosis de 50 nM de ácido quinolínico se aprecia una ligera tendencia de disminución del número de neuronas, ya que solo se perdió el 12.72 % de la población celular estudiada.
Figura 15. Fotografías de lado izquierdo objetivo 4X; fotografías de lado derecho 40X.
Fotografías del hilus del hipocampo derecho de ratas tratadas con: A y B. 50 nmoles de ácido quinolínico y ciclodextrina 5%; C y D. 100 nmoles de ácido quinolínico y ciclodextrina 5%.
En cambio, a la dosis de 150 nM de ácido quinolínico, como ya se mencionó, se obtuvo una pérdida total del tejido. Mientras que a la dosis intermedia de 100 nM de ácido quinolínico se indujo una clara disminución del número de neuronas por milímetro cuadrado, obteniéndose una pérdida del 22.61% de células (ANOVA de Kruskall Wallis H = 64.955, g.l. = 3, p <
0.001; prueba de Dunn p < 0.05). Por esta razón, la dosis elegida de esta neurotoxina para estudiar el efecto neuroprotector de las hormonas antes mencionadas fue de 100 nM.
A B
D C
Número de células/mm2
0 50 100 150 200 250 300
Ciclo + PBS Ciclo + AQ 50 Ciclo + AQ 100 Ciclo + AQ 150
*
*
Figura 16. Efecto de diferentes concentraciones de ácido quinolínico en relación con el número de neuronas en el hilus del hipocampo derecho de rata. Prueba de Dunn * p < 0.05.
Cada barra representa la media ± el error estándar del número de células de la zona hilar del hipocampo derecho de 5 ratas.
Una vez que se decidió la dosis de ácido quinolínico a utilizar, se procedió a probar su efecto neuroprotector, en los grupo 10 y 11 que recibieron ácido quinolínico y 17β-estradiol o 17α-etinil estradiol. Con el tratamiento con 17β-estradiol (Figura 17A y B) se observó que la pérdida neuronal inducida por esta neurotoxina es inhibida, aunque el tejido en general se sigue observando dañado; así mismo en el hilus de ratas tratadas con 17α-etinil estradiol (Figura 17C y D) también se observa que la acción de la neurotoxina es inhibida ya que no se observa que haya una pérdida neuronal, pero en este caso el tejido no se observa dañado.
Figura 17. Fotografías de la izquierda objetivo de 4X; fotografías de la derecha objetivo 40X. Fotografías del hilus del hipocampo derecho de ratas tratadas con: A y B. 17β-estradiol y 100 nmoles de ácido quinolínico; C y D. 17α-etinil estradiol y 100 nmoles de ácido quinolínico.
Para corroborar lo observado en los distintos cortes, se graficó el número de células para cada uno de los (Figura 18).
Donde se observa que no hay diferencia en el número de células con respecto del grupo control tras el tratamiento simultáneo de la neurotoxina con el 17β-estradiol o el 17α-etinil estradiol, esto se confirmó al hacer el análisis estadístico correspondiente (ANOVA de Kruskall Wallis H = 45.464, g.l. = 3, p < 0.001, prueba de Dunn p < 0.05).
A B
C D
*
Número de células/mm2
0 50 100 150 200 250 300
Ciclo + PBS Ciclo + AQ 100 E2 + AQ 100 EE2 + AQ 100
Figura 18. Efecto del 17β-estradiol o del 17α-etinil estradiol, frente a la neurotoxicidad inducida por el ácido quinolínico en el hilus del hipocampo derecho de rata. Prueba de Dunn
* p < 0.05. Cada barra representa la media ± el error estándar del número de células de la zona hilar del hipocampo derecho de 5 ratas.
Para corroborar que el 17α-etinil estradiol, presenta un efecto neuroprotector similar al que ejerce el 17β-estradiol, se probaron ambas hormonas pero con otra neurotoxina, en este caso el ácido kaínico. Así en las fotografías de la figura 19 se puede observar pérdida neuronal en la zona del hilus así como una ligera degeneración de la zona CA3 en el grupo tratado sólo con ácido kaínico (Figura 19A y B); por otra parte en la misma zona cerebral de ratas previamente tratadas con 17β-estradiol (Figura 19C y D) se ve que esta pérdida neuronal inducida por el ácido kaínico es inhibida. Una imagen similar puede observarse
en el hilus del hipocampo de ratas tratadas con 17α-etinil estradiol (Figura 19E y F).
Figura 19. Fotografías de la izquierda objetivo de 4x; fotografías de la derecha objetivo de 40x. Fotografías del hilus del hipocampo derecho de ratas tratadas con: A y B. Ciclodextrina 5 % y ácido kaínico 7 mg/Kg; C y D. 17β-estradiol y ácido kaínico; E y F. 17α-etinil estradiol y ácido kaínico.
A
C
E F
B
D
Para ratificar esto, se realizó la gráfica de la figura 20 donde se encuentra representado el grupo control, el grupo tratado sólo con ácido kaínico donde se representa una disminución del 33.22% del número de células por milímetro cuadrado en el hilus del hipocampo y los grupos de interés:
aquellos tratados simultáneamente con las hormonas y la neurotoxina. En el grupo que recibió además de ácido kaínico 17β-estradiol el número de células por milímetro cuadrado en el hilus del hipocampo no se modificó con respecto del grupo control (ANOVA de Kruskall Wallis H = 50.296, g.l. = 3, p <
0.001. Prueba de Dunn p < 0.05).
Por otro lado, en la barra que corresponde al grupo tratado con 17α-etinil estradiol y ácido kaínico tampoco se observa una disminución en el número de neuronas con respecto del grupo control.
Número de células/mm2
0 50 100 150 200 250 300
Ciclo + PBS Ciclo + Ka E2 + Ka EE2 + Ka
Figura 20. Efecto del 17β-estradiol o del 17α-etinil estradiol, frente a la neurotoxicidad inducida por el ácido kaínico en el hilus del hipocampo derecho de rata. Prueba de Dunn * p
< 0.05. Cada barra representa la media ± el error estándar del número de células de la zona hilar del hipocampo derecho de 5 ratas.
*
DISCUSIÓN
En este trabajo se utilizaron ratas como animales de experimentación dado que en ellas el estradiol ejerce un efecto similar al observado en humanos, esto es, un aumento en la sobrevivencia neuronal y la inducción de plasticidad sináptica (Wise PM y Dubal DB, 2000).
El modo de administración de las hormonas y las neurotoxinas está fundamentado en estudios que demuestran que el pretratamiento hormonal (Dubal DB y cols., 1999) o la coadministración con la neurotoxina es indispensable para observar la acción neuroprotectora del estrógeno (Ciriza I y cols., 2004).
La administración de las hormonas permitió poner de manifiesto es que ninguna de ellas por si mismas causaron una disminución del número de células en el hilus del hipocampo, dicha observación coincide con lo descrito por Sato y colaboradores (2002), quienes aplicaron estradiol y otros xenoestrógenos en cultivos organotípicos de hipocampo y no observaron efectos sobre la viabilidad neuronal en ninguna de las regiones de esta estructura cerebral.
El ácido quinolínico se inyectó intracerebroventricularmente porque de inyectarse intraperitonealmente antes de llegar al cerebro sería metabolizado ya que como se mencionó es un metabolito de la vía del triptofano (Kuroki Y y cols., 2001).
En este trabajo se observó que el ácido quinolínico disminuyó el número de células en el hilus del hipocampo de manera dosis dependiente, de tal forma que el 12.72% de las células del hilus murieron tras la administración intracerebroventricular de 50 nM de la toxina. En este sentido, existen diversos trabajos que apoyan esto, como el de Kuroki Y y colaboradores (2001) donde esta misma dosis induce una disminución de la densidad celular en la zona CA1, pero no el hilus del hipocampo. Estas observaciones apoyan lo encontradó en este trabajo tras la administración de la dosis baja de ácido quinolínico. En cuanto a la dosis de 100nM, se obtuvo una disminución mayor, de 22.61%, la cual si fue diferente al grupo control. Lo que también coincide con los resultados observados por Kuroki Y y colaboradores (2001). Respecto a la dosis de 150 nM no se encuentran reportes anteriores donde se administre esta dosis; en este caso se encontró una pérdida total de células en la zona hilar del hipocampo, de manera que el tejido se deshizo por completo, no permitiendo la obtención de cortes. No obstante, es necesario realizar más experimentos para controlar otras variables que pudieran estar influyendo sobre la pérdida neuronal observada a esta dosis alta de la neurotoxina. Algunas de estas variables incluirían: la cepa y la edad de las ratas, el estado general de las mismas, las variaciones inherentes a la técnica etc.
El ácido quinolínico como ya se mencionó, es un metabolito endógeno del triptofano que en condiciones normales no se encuentra en concentraciones elevadas en el cerebro, porque no es un metabolito de la vía principal que sigue el triptofano (Coomes MW, 2002). Por otro lado, se han observado grandes
concentraciones de esta neurotoxina en niños y adultos que sufrieron algún trauma craneoencefálico (Bell MJ y cols., 1999;
Sinz EH y cols., 1998).
De acuerdo a los resultados obtenidos, en este trabajo, tanto el 17β-estradiol como el 17α-etinil estradiol poseen un efecto neuroprotector frente a la pérdida neuronal inducida por el ácido quinolínico a la dosis de 100 nM, efecto que es similar para ambas hormonas.
Las propiedades neuroprotectoras del 17β-estradiol frente al ácido kaínico ya habían sido reportadas (Picazo O y cols., 2003), no así la acción del 17α-etinil estradiol frente a esta toxina. En este estudio se reporta que esta hormona posee propiedades nueroprotectoras similares a las observadas con el 17β-estradiol, siempre y cuando se inyecten a la dosis de 100µg.
La comparación del efecto neuroprotector ejercido por ambas hormonas frente a la neurotoxicidad inducida tanto por el ácido kaínico como por el ácido quinolínico sugiere un mecanismo similar para ambas hormonas frente a la excitotoxicidad inducida por las dos neurotoxinas.
En cuanto al mecanismo de la acción neuroprotectora, estudios anteriores han reportado que para el 17β-estradiol no se involucra la vasculatura, sino que este actúa directamente a nivel tisular ya que ni la presión sanguínea en el cerebro ni el riego sanguíneo cerebral, se modifican por efecto hormonal (Dhandapani KM y Brann DW, 2002).
A nivel celular, el efecto neuroprotector del 17β–estradiol puede ser ejercido por múltiples mecanismos que a su vez
depende de múltiples factores, incluyendo la dosis de la hormona, el tipo de daño celular o la región del cerebro (Dubal DB y cols., 1999; W ise PM y Dubal DB, 2000; Dubal DB y cols., 2001). Algunos autores sugieren que este efecto se ejerce predominantemente por un mecanismo no genómico rápido, inherente a las propiedades químicas de la molécula como antioxidante (Moosmann B y Bel C, 1999). Esta propiedad se puede deber a la presencia del anillo fenólico A del esteroide, el cual es un potente donador de electrones y capturador de radicales libres que puede prevenir el daño membranal inducido por la peroxidación lipídica (Behl C y cols., 1997; McEwen BS y Alves SE, 1999; Dhandapani KM y Brann DW, 2002; Xia S y cols., 2002). Como ya se mencionó anteriormente, éste no es el único mecanismo propuesto para explicar las propiedades que posee el estrógeno sobre la protección de tejido cerebral, ya que también se habla de su papel sobre la modulación de calcio intracelular, la inhibición directa de receptores NMDA, la estimulación de la glutamato ciclasa y la estabilización de la función mitocondrial (Morley P y cols., 1992; McEwen BS y Alves SE, 1999; Dubal DB y cols., 1999; Harms C y cols., 2001; Xia S y cols., 2002). Durante mucho tiempo se pensó que estos mecanismos no genómicos, sobre todo la propiedad antioxidante de la molécula y la regulación de la homeostasis del calcio, eran los responsables de retardar la iniciación y la progresión de la neurodegeneración en la enfermedad de Alzheimer (Goodman Y y cols., 1996). Actualmente se considera que altas concentraciones (niveles farmacológicos) de estradiol pueden actuar a través de mecanismos que no requieren la presencia de receptores a estrógenos, sino mediando efectos antioxidantes y/o
estimulando canales membranales (Dubal DB y cols., 2001;
Harms C y cols., 2001).
Otros autores sugieren que el mecanismo mediante el cual el 17β-estradiol ejerce su efecto neuroprotector es mediante una vía no genómica que involucra la activación de la MAPK. Esta hipótesis se ha comprobado en neuronas hipocampales con daño excitotóxico producido por glutamato (Singer CA y cols., 1999; Bi R y cols., 2000; Dhandapani KM y Brann DW, 2002), asi como en cultivos neuronales (Bi R y cols., 2000). También, se ha visto que la activación de PI3K (fosfatidilinositol 3 cinasas) es crucial para el efecto neuroprotector del 17β-estradiol contra la excitotoxicidad por glutamato; este efecto es abolido por la coadministración de una inhibidor selectivo de esta cinasa, lo cual reafirma esta teoría (Dhandapani KM y Brann DW, 2002).
Por otro lado, hay autores que mencionan una cinasa reguladora de señales extracelulares (ERK) como mediadora de la neuroprotección por estrógenos después de la toxicidad por ácido quinolínico en el hipocampo de rata, la cual a su vez desencadena una cascada se segundos mensajeros (Kuroki Y y cols., 2001). Se sugiere que esta ERK es activada por receptores membranales a estrógenos (Nadal A y cols., 2000; Razandi M y cols., 1999).
En contraste con todos los autores que plantean neuroprotección por vía no genómica, otros mencionan que el mecanismo mediante el cual el estradiol ejerce su efecto neuroprotector es una vía clásica mediada por receptores nucleares (McEwen BS, 1999; Dubal DB y cols., 1999; Xia S y cols., 2002; Ramírez AD y cols., 2003). Apoyando esta idea, está el hecho de que para ejercer este efecto en un modelo de
isquemia cerebral se requiere pretratamiento, ya que los efectos neuroprotectores no son rápidos y dependen de la activación de receptores a estrógeno. Estos últimos, como se sabe, median una alteración de la expresión génica, además este efecto es bloqueado con antagonistas de receptores a estrógeno (Dubal DB y W ise PM, 2001; Dhandapani KM y Brann DW, 2002).
También se ha observado que para que este mecanismo de neuroprotección se lleve a cabo se requieren niveles fisiológicos de la hormona (Dubal DB y cols., 2001).
Así, el 17β-estradiol a dosis fisiológicas ejerce efectos primeramente a través de la activación de un receptor a estrógenos y subsecuentemente la transcripción de genes. Los genes precisos regulados por 17β-estradiol para ejercer su efecto neuroprotector no han sido identificados, pero se sabe que aumenta la expresión del gen antiapoptótico bcl-2 (Dhandapani KM y Brann DW, 2002). Dubal y colaboradores en 1999, sugirieron que el ERβ podía estar involucrado en la neuroprotección mediada por hormonas y que esto mejoraba la función cognitiva y disminuía la neurodegeneración asociada con Alzheimer y derrame cerebral en mujeres con reemplazo hormonal (Dubal DB y cols., 1999).
Posteriormente, estos mismos autores observaron que la deleción del ERα, abole completamente las acciones protectoras del estradiol en todas las regiones del cerebro; mientras que su habilidad para proteger contra daño cerebral, es preservada totalmente en ausencia de ERβ, de manera que el ERα y no el ERβ como se pensó en un principio, es el receptor que media la neuroprotección por estrógenos (Dubal DB y cols., 2001).
Se ha visto que el estradiol protege por un mecanismo que diminuye la apoptosis (Dubal DB y W ise PM, 2001). Frente a este tipo de muerte celular, el pretratamiento con la hormona protege algunas de las áreas cerebrales, entre ellas el hipocampo, pero no a todas (Harms C y cols., 2001). Además, este efecto es bloqueado por antagonistas del receptor a estrógenos lo que indica que el estradiol previene la muerte celular por apoptosis mediante un mecanismo genómico. Apoyando esto, está el hecho de que en cultivo hipocampal hay aumento de los niveles de las proteína Bcl-2 y Bcl-XL después de la aplicación del estradiol (Pike CJ, 1999; Dubal DB y cols., 2001; Harms C y cols., 2001).
Bcl-2 es un factor de sobreviviencia que puede bloquear ambas muertes celulares, necrosis y apoptosis (Dubal DB y cols., 1999), en tanto que Bcl-XL disminuye la proteolisis mediada por caspasas y la muerte celular inducida por la proteína β-amiloide (Pike CJ, 1999). La identificación de un supuesto elemento específico de respuesta del DNA en el gen bcl-X sugiere que este efecto de protección neuronal es mediado por una vía genómica clásica (Pike CJ, 1999).
La fuerte expresión del ERα y la modulación de las proteínas Bcl por estradiol en el hipocampo, indican que la prevención de apoptosis, pero no de necrosis por estradiol, posiblemente depende de la inducción de la proteína Bcl y la densidad de ERα (Harms C y cols., 2001). Estas evidencias sugieren que ERα es una liga crítica que determina la habilidad de niveles fisiológicos de estradiol para ejercer neuroprotección (Dubal DB y cols., 2001; Liu R y cols., 2002)
Aunque las hormonas esteroideas son metabolizadas extensivamente, particularmente en el hígado, se ha podido demostrar en varios casos que la hormona por si misma, no un metabolito, produce la respuesta, vía la modulación del mecanismo de expresión de genes (Beato M y Klug J, 2000;
Picazo O y cols., 2003). Al respecto se puede mencionar que los metabolitos 2 y 4 hidroxilados de los estrógenos pueden dañar directa o indirectamente el DNA, las proteínas y los lípidos (Lu WY y cols., 2000), justificando así los efectos adversos de la terapia de sustitución estrogénica. Se ha visto que la terapia postmenopausal con estrógenos mas progestina aumenta el riesgo de tromoembolismo venoso en mujeres con enfermedades cardiacas coronarias, sugiriendo un aumento de 2 a 4 veces el riesgo; esa terapia estrogénica oral produce altas concentraciones de hormona en el hígado; este efecto de “primer paso” puede alterar la producción hepática o el metabolismo de factores de coagulación, comparado con no usuarias, así las mujeres quienes toman estrógenos en etapa posmenopausal tienen niveles séricos de factor VII y proteína C elevados, diferencias que pueden ser trombogénicas (Grady D y cols., 2000)
Simon y colaboradores en 2001, reportaron que la terapia hormonal con estrógenos conjugados equinos y progestina no producía efectos significativos en el riesgo de derrame cerebral en mujeres posmenopáusicas con enfermedad coronaria, haciendo la aclaración que otros estudios reportan una disminución o aumento del riesgo de derrame cerebral con terapia hormonal (Simon JA y cols., 2001)
