INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL T E S I S

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

SECCIÓN DE GRADUADOS E INVESTIGACIÓN EN ALIMENTOS

EFECTO DE LA GERMINACIÓN SOBRE LAS PROPIEDADES ANTICANCEROSAS DE LA PROTEÍNA DE SOYA

T E S I S

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS EN ALIMENTOS

PRESENTA

MARÍA DEL CARMEN ROBLES RAMÍREZ

DIRECTORAS DE TESIS

DRA. ROSALVA MORA ESCOBEDO DRA. EVA RAMÓN GALLEGOS

México, D.F., Julio de 2010

ORIGINAL PAPER

Effect of Protein Hydrolysates from Germinated Soybean on Cancerous Cells of the Human Cervix: An In Vitro Study

R. Mora-Escobedo&

Maria del Carmen Robles-Ramírez_&

Eva Ramón-Gallegos_&Rafael Reza-Alemán

Published online: 18 August 2009

# Springer Science + Business Media, LLC 2009

Abstract Consumption of soybeans can reduce the risk of different types of cancer. Little is known about the effect of germination on the anticancer properties of soya. This study was done to determine if germination improves the anticancer properties of soybean protein through generation of amino acids or bioactive peptides. Soybean was germinated for 0, 2, 3, 4, 5, and 6 days and proteins were isolated from the seeds.

Isolates with and without ethanol-soluble phytochemicals were hydrolyzed with digestive enzymes and their effect on growth in HeLa and C-33 (epidermoid cervical carcinoma) and HaCaT (non-cancerous human keratinocytes) cells were evaluated with the Alamar Blue method. Germination induced degradation of theα and α’ fractions of β-conglycinin and acid fraction of glycinin, generating low molecular weight peptides. Degrees of hydrolysis ranged from 73–77%. Hydro- lysates inhibited the growth of HeLa cells and C-33 at concentrations exceeding 1.25 mg/ml. Major inhibition was observed with the hydrolysate germinated for 2 days and containing ethanolsoluble phytochemicals (IC50 2.15 and 2.27 mg/ml for HeLa and C-33, respectively). Interestingly, hydrolysate cytoxicity for normal cells was minimal in comparison to cancer cells.

Keywords Cancer . HeLa cells . Soybean protein . Germination . Protein hydrolysates

Introduction

As more is discovered about the beneficial effects of bioactive compounds contained in foods, they are now considered far more than a source of the energy and basic components needed for body maintenance and growth. Due to their relatively low cost, legumes are important foods, particularly in developing countries where they serve as protein sources. Legumes such as soybean have received increasing attention because of their phytochemical content, which consists of active secondary metabolites [1].

Extensive epidemiological data and studies in vitro and in vivo suggest that soybean consumption reduces the development of different types of cancer. To date, a number of nutrients and micronutrients with anticancer properties have been identified in soybean, including isoflavones, phytosterols, inositol hexaphosphate, saponins, protease inhibitors, and bioactive peptides [2–8]. The anticancer properties of soybean may also be due to its amino acid balance, since it has low methionine and high arginine content; both conditions are known to inhibit tumour development [9–12]. Moreover, different amino acids have antioxidant capacity [13]. The antioxidant capacity of cystein and tryptophan were reported by Elias et al. [14].

Khalil et al. [15] demonstrated that the antioxidant capacity of soy protein hydrolysates increases with hydrolysis time, suggesting that this property may be due to short peptides and free amino acids. Oxidation of DNA is one of the main causes of mutation so the antioxidant activity of the hydrolysates could prevent cancer.

Germination can improve legume nutritional quality.

This simple, low-cost process produces a natural product, eliminates or inactivates certain antinutritional factors, and increases the digestibility of proteins and starches in legumes. Germination causes changes in secondary metab- olite distribution, mobilizes the reserve proteins stored in R. Mora-Escobedo (*)

:

:

E. Ramón-Gallegos

:

e-mail: [email protected] R. Reza-Alemán

Campo Experimental Iguala, INIFAP, México

Plant Foods Hum Nutr (2009) 64:271–278 DOI 10.1007/s11130-009-0131-2

the cotyledon protein bodies, changes amino acids compo- sition [1], and produces intermediate molecular weight peptides [16]. It can therefore, improve the nutritional and nutraceutical properties of legumes by modifying metabo- lite contents and generating peptides and amino acids with possible biological activity.

However, there are not studies that investigate the germination influence on the anticarcinogenic properties of soy protein. The aim of this study was to evaluate the cytotoxicity of protein hydrolysates from soybean germi- nated for 0 to 6 days, with and without ethanol-soluble phytochemicals, on HeLa and C-33 cervical-uterine cancer cells and non-cancer cells (HaCaT).

Materials and Methods

Plant Material Seeds of soybeans Glycine max var.

Crystalline were kindly donated by the Centro de Inves- tigación Regional del Pacífico Sur, Campo Experimental Iguala, INIFAP México.

Chemicals Pancreatin from porcine pancreas (8xUSP, P-8445), pepsin from porcine stomach mucosa (3276 U/mg solid, P-6887), and peptidase from porcine intestine mucosa (100 U/g solid, P-7500) were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Cell Culture and Treatment HeLa and C-33 cells lines derived from human epidermoid cervical carcinoma (ATCC), and HaCaT from a non-cancerous human keratinocytes cell line (ATCC), were maintained in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, In vitrogen Co., Carlsbad, CA) supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS, Hyclone) and 1% penicillin-streptomycin (10,000 U/µg/ml, In vitrogen Co., Carlsbad, CA). Cells were grown at 37 °C in a humidified atmosphere containing 5% CO2.

Seed Germination Germination was realized according to Mora-Escobedo et al. method [17]. Seeds were surface- sterilized by soaking for 10 min, at room temperature distilled water containing 28.5 ppm of chloride dioxide.

Seeds were placed in a uniform layer in plastic trays between two layers of filter paper moistened with previ- ously boiled water. The trays were covered and placed in a germination chamber (Ambi-Hi-Lo Chamber, Lab-line instruments Inc., Melrose Park, IL) at 27 °C in the dark.

Seeds were disinfected again after 24 h to prevent the growth of fungi. Germinated seeds were harvested at different intervals (0, 2, 3, 4, 5, and 6 days), lyophilized and ground.

Chemical Analysis of Soybean Meals Moisture, protein, ether extract and ash content were determined for all samples following AOAC methods (925.09b, 954.01, 920.39c, and 923.03, respectively) [18].

Soybean Protein Isolates Isolates were obtained of defatted flours using the Rickert et al. [19] method. Protein was extracted at room temperature in an alkaline medium Table 1 Chemical composition of meals from germinated soybean

(Dry basis)^a Germination time (days)

Protein^b(%) Ether extract (%) Ash (%)

0 41.17±0.73^a 20.72±0.02^a 5.13±0.00^a

2 43.30±0.40^b 20.71±0.37^a 5.19±0.08^b

3 43.37±0.08^b 20.55±0.22^a 5.26±0.02^bc

4 43.29±0.17^b 22.60±0.04^b 5.36±0.00^c

5 43.76±0.27^b 22.76±0.01^b 5.39±0.07^c

6 43.48±0.39^b 22.62±0.37^b 5.37±0.01^c

aEach value represents the mean of three independent experiments.

Mean ± standard error

bProtein content (N×6.25). Means in a column followed by the same letter were not significantly different, according to Tukey test (p>0.05)

Table 2 Soy protein recoveries and isolate purity Germination

time (days)

0 2 3 4 5 6

Yield^a 61.28 70.58 65.59 60.09 58.49 55.95 Purity^b 92.74 91.6 92.65 92.10 91.45 88.06

a% protein recovery

b% protein in dry base

Fig. 1 Electrophoretic profile of protein isolates from soybean germi- nated for different periods (0, 2, 3, 4, 5, and 6 days). M: molecular weight marker

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(pH 9.0) and precipitated at pH 4.5. Isolates were lyophilized and stored at 4 °C.

Electrophoresis SDS-PAGE was conducted in a Minin- Protean 3 device (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA)

using a 13% polyacrylamide slab gel under reducing conditions at 110 V constant voltage. 10 µg of protein were loaded in each lane, according to the procedure reported elsewhere [20]. A Prestained SDS-PAGE Broad Range Standard (Bio-Rad) was used as molecular weight marker.

Fig. 2 Cytotoxic effect of protein hydrolysates from soy germinated at different times (0–6 days) on mortality of HeLa and C-33 cervical-uterine cancer cells determined by the Alamar Blue method. a and b: Effect of protein hydrolysates containing phytochemicals (ESPC) on HeLa and C-33 cells, respectively. c and d: Effect of protein hydrolysates free of phytochemicals soluble in 70%

ethanol (ESPC) on HeLa and C-33 cells, respectively. Four replicates per determination were done in each of two independent assays per hydrolysate type

Table 3 IC₅₀^aof protein hydrolysates from soy germinated at different times (0–6 days), with and without ESPC^b, against HeLa and C-33 cervical cancer cells and HaCaT non-cancerous cells^c

Germination time (days) Hydrolysates with ESPC (mg/ml) Hydrolysates without ESPC (mg/ml)

HeLa C-33 HaCaT HeLa C-33 HaCaT

Ungerminated 3.90±0.15^bA 4.02±0.18^bA 7.38±0.11^bB 8.42±0.11^cC 8.44±0.08^cC 16.5±0.16^cD

2 2.15±0.04^aA 2.27±0.04^aA 5.68±0.50^aB 7.52±0.12^bC 8.16±0.03^bcD 14.99±0.02^bE

3 4.34±0.08^cA 4.85±0.39^bcA 8.37±0.80^cBC 8.38±0.06^cC 7.59±0.30^bB 16.72±0.02^cD

4 8.72±0.07^dB 5.48±0.18^cA 13.68±0.16^dC 14.59±0.08^dD 13.60±0.28^dC 23.58±5.54^dE

5 8.86±0.15^dA 8.18±0.31^dA 15.54±0.08^eB 15.17±0.08^eB 16.60±0.20^eC >23.00^eD

6 4.03±0.17^bA 4.26±0.21^bA 8.10±0.01^cB 4.01±0.02^aA 4.87±0.18^aA 8.74±0.07^aB

Values are reported as the average ± standard error. Means in a column followed by the same small letter are not significantly different. Values in a row followed by the same capital letter are not significantly different, according to Tukey test (p>0.05)

a: IC50: Concentration at which 50% growth inhibition is observed b: ESPC: 70% ethanol-soluble phytochemicals

c: Four replicates were done per determination

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Extraction of Ethanol-Soluble Phytochemicals Soy protein isolates can retain notable amounts of isoflavones associated with proteins [21], which could have anti- carcinogenic activity [2]. Since the objective of this study was to evaluate the effect of the protein on cancer cells, the isoflavones and other phenolic and saponin com- pounds were extracted from the protein isolates following the method reported for Carrao-Panizzi et al. [22].

Extraction was achieved by using 70% ethanol as solvent for one hour with agitation at room temperature. Total phenolic compounds were determined by Folin-Ciocalteu method.

Enzymatic Hydrolysis The protein isolates were hydro- lyzed by sequential treatment with pepsin, pancreatin and

peptidase according to the method of Lo et al. [23].

Degree of hydrolysis (DH) was determined as percentage of soluble nitrogen in 10% trichloroacetic acid (TCA) [24].

In Vitro Cytotoxicity Assays Cell lines were subcultured into 96-well plates with 100 µl of 10% FBS DMEM (1×

10⁴ cells/well) for 24 h. The cells were then exposed to different concentrations of hydrolysates in 100 µl of 10%

FBS DMEM for 24 h. After incubation, the medium containing the hydrolysates was discarded and cell viability was evaluated by exposure to 100 µl Alamar Blue solution (0.0015% in DMEM) at 37 °C for 24 h. Finally, the fluorescence was measured at excitation 530 nm and emission 590 nm [25], using a Perkin Elmer LS5 Fig. 3 Effect of protein hydrolysates with ESPC from soybeans germinated at different times (0–6 days) on cell mortality in HeLa cervical cancer cells and non-cancerous HaCaT cells

274 Plant Foods Hum Nutr (2009) 64:271–278

equipment. Control cells were exposed to Alamar Blue but not to the hydrolysates. The percentage of viable cells in the population of each concentration was calculated with the formula:

% Mortality¼ 100
% viabilityð Þ

Where: % viability¼Mean fluorescence of treated cells Mean fluorescence of control cells 100 Statistical Analyses Results were expressed as the mean ± standard error, and significance determined with a Tukey test. Differences with p<0.05 were considered statistically significant. Analyses were done using the Excel program (Microsoft).

Results and Discussion

Effect of Germination on Soybean Chemical Composition Proximate analysis showed that crude protein content increased (p≤0.05) at day 2 of germination after which it remained constant until day 6 (Table 1). Similar results have been reported elsewhere [15, 26, 27]. This increase may be due to a synthesis of enzyme proteins or a compositional change following the degradation of other constituents as carbohydrates [28]. The lipid content of seeds did not change until day 4, when it increased 10%

(p<0.05) and then remained unchanged until day 6. In this case, there is divergence among the results obtained by different investigators. Some studies report decrease of lipid Fig. 4 Effect of protein hydrolysates without ESPC from soybeans germinated at different times (0–6 days) on cell mortality in HeLa cervical cancer cells and non-cancerous HaCaT cells

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content during germination [28, 29]; however, Jiménez et al. [26] have also shown the increase of ether extract during the first days of germination, probably due to the increase in carbohydrate metabolism. Ash content increased slightly during germination. Paredes-López and Mora-Escobedo [30] reported similar results for amaranth.

Protein Isolate Production Protein recovery efficiency and isolate purity decreased with germination time (Table 2).

Germination tended to decrease protein recovery which may be attributed to in-situ proteolysis as Bau and Debry reported [31]. Apparently, the new compounds synthesized during germination, and/or the more complex interactions between proteins and other seed components complicated the extraction. On the other hand, total phenolic content in the remaining soy protein, after extraction with ethanol was reduced by 93±2% from original level. Similar behaviour was reported by Lin and Lai [32]. This result was used as an indicator of ethanolic extraction efficiency.

Electrophoresis Protein patterns obtained with SDS-PAGE demonstrated a considerable protein breakdown during germination. Protein bands of the soy protein isolates with molecular weights of 72 and 66 kDa started to degrade progressively on the third day of germination (Fig. 1).

These molecular weights correspond to the α and α’

fractions of β-conglycinin [33] and were preferentially metabolized, as reported by Wilson et al. [16]. The fractions with molecular weights of 38 and 41 kDa also began to disappear at the same time of germination, although the 38 kDa fraction (acid fraction of glycinin) degraded more

slowly. Degradation of the above fractions was accompanied by the appearance of peptides between 25 and 37 kDa and a progressively darker band at 53 kDa. No changes were observed in the bands corresponding to the β fraction (47 kDa) and the basic fraction (21 kDa) of β-conglycinin.

These results coincide with previous reports [16]. Analyzing the electrophoretic pattern, it can demonstrate that there was probably a turnover of proteins and nonprotein nitrogen;

equilibrium resulting of the degradation and synthesis processes during germination.

Enzymatic Hydrolysis Degree of hydrolysis (DH) as expected, was increased with germination time (73.41, 73.55, 75.02, 75.58, 75.70, and 77.14% for 0, 2, 3, 4, 5, and 6 days of germination, respectively) due to natural proteolysis during germination [31], and also perhaps to changes in protein structure that facilitated enzyme access to the protein.

Dikshit and Ghadle [29] obtained similar results using pepsin and trypsin digestion.

In Vitro Cytotoxicity Assays of Hydrolysates Cytotoxicity of the protein hydrolysates of soy germinated for 0, 2, 3, 4, 5, and 6 days, with and without ethanol-soluble phytochem- icals, was evaluated by measuring cellular viability with the Alamar Blue method. Based on protein content, the concen- trations tested of each hydrolysate varied between 0.63 and 20 mg/ml. The effect of germination time on HeLa and C-33 viability exposed to different concentrations of protein hydro- lysates with and without phytochemicals is shown in Fig.2(a–

d). As it can be seen, beginning at the 2.5 mg/ml concentra- tion, the hydrolysate from soy germinated for 2 days with phytochemicals (i.e. without alcohol extraction) inhibited growth in HeLa cells, with 87.0% inhibition at 5 mg/ml; its effect on the C-33 cells was similar (Fig. 2a and b). This hydrolysate had the highest cytotoxic effect, with an IC50of 2.15 mg/ml against HeLa cells and 2.27 mg/ml against C-33 cells (Table 3). From the soy protein hydrolysates without ethanol-soluble phytochemicals (ESPC) tested, soy germinat- ed for 6 days exhibited the highest inhibition. This hydrolysate inhibited growth in HeLa cells beginning at the 5 mg/ml concentration and reached a maximum of 95.2%

inhibition at 10 mg/ml. On the other hand, on the C-33 line this hydrolyzed exhibited inhibition; beginning at 2.5 mg/ml with a maximum of 90.3% at 20 mg/ml (Fig.2c and d). The IC50 was 4.01 mg/ml against HeLa cells and 4.87 mg/ml against C-33 cells (Fig.2c and d).

Isoflavone content is reported to increase in soy between the first and second day of germination with a gradual decrease in following days [34, 35]. Other studies show increased total phenolic compounds [32] and saponin contents [36–38] in germinated soy. These compounds are known to inhibit growth in different cancer cell lines [2,5, 39], which may explain why the protein hydrolysate from Fig. 5 Electrophoretic profile of the hydrolisates with the highest

anticancer activity. a: Protein hydrolisates with phytochemicals of 2 days of germination. b: Protein hydrolisates free of phytochemicals of 6 days of germination

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soy germinated for 2 days, but containing the ESPC, exhibited the highest cytotoxicity. In general, the hydro- lysates with ESPC had lower inhibitory concentrations (greater cytotoxicity) than the hydrolysates without ESPC.

Apparently, the soy protein acts synergistically with the ESPC against cancer cells, due to the isoflavones, phenolic and saponin compounds that have demonstrated cytotoxic effects [5,39].

Cancer therapy is focused on preventing the proliferation of cancerous cells and destroying them with a minimum of collateral effects, which is why the protein hydrolysates were tested against non-cancerous cells (HaCaT). In the assay using the hydrolysates with ESPC, concentrations between 2.5 and 5.0 mg/ml had a comparatively higher inhibitory effect on the HeLa cells and a minimum effect on the HaCaT cells (Fig. 3). At the highest concentrations, growth was inhibited in both cell lines. Beginning at 2.5 mg/ml, the hydrolysate from soy germinated for 2 days had a greater (p<0.05) inhibitory effect on the cancer cells than on the normal cells. In the assays using hydrolysates without ESPC, those germinated at 0 to 3 days exhibited no inhibitory effect on either cell line at concentrations below 10 mg/ml (Fig. 4). At concentrations greater than 10 mg/ml, these hydrolysates notably inhibited the HeLa cells (>80%) but stimulated growth in HaCaT cells. At 20 mg/ml, they inhibited growth in both cell lines. The hydrolysates from soy germinated for 4 or 5 days only inhibited growth in the HeLa cells at 20 mg/ml. Finally, at 5 mg/ml, the hydrolysate from soy germinated for 6 days substantially inhibited growth in the HeLa cells in comparison to the HaCaT cells, but inhibited both lines beginning at 10 mg/ml. Similar results were observed when comparing the C-33 to the HaCaT (data not shown).

Figure5 shows the protein pattern of hydrolysates that resulted more active against cancer cells, according to cytotoxicity assays. The hydrolysate from soy germinated for 2 days with ESPC, showed two bands of 29 and 35 kDa and three bands of approximately 23, 13 and 6 kDa, respectively. The hydrolysates germinated for 6 days without ESPC only showed peptides smaller than 23 kDa.

Since there is not a marked difference between the two electrophoretic patterns, the higher cytotoxic effect of the hydrolysates from soy germinated for 2 days with ESPC, could be attributed, besides the effect of the protein to compounds soluble in alcohol.

Further studies will be directed to elucidate the bioactive molecules involved in the anticancer properties of germinated soybean protein. Keeping in mind that concentrations higher than 10 mg/ml provide similar mortality for HaCaT and HeLa cells, it should also be characterized for the pharmacokinetics of the active compound in order to establish the optimal dose required to have clinical effects. Based upon a meta-analysis from epidemiologic and animal studies, 5 g/day of soy protein

was found to be associated with significant reduction in the risks of the stated cancers [6]; but there are no studies in vivo with protein from germinated soybean.

Conclusions

Germination can improve the anticarcinogenic effect of soy protein. Hydrolysates from protein isolates of germinated soybean inhibited growth in HeLa and C-33 cervical- uterine cancer cells depending on concentration and had minimum effect on normal cells. The germinated soybean protein could be acting synergistically with alcohol-soluble phytochemicals on cancer cells. Future research needs to focus on identifying the bioactive compounds and the action mechanism of cancer cell inhibition of these hydro- lysates. In vivo studies will also be required in order to confirm the in vitro results and establish the bioavailability of the bioactive molecules and the optimal dose required to have clinical effects. Besides, it would be interesting to consider the possibility to design a drug with therapy purposes.

Acknowledgements This research was financed by the CONACyT (Project 6730), and by grants from the IPN and the COFAA-IPN.

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37. Rupasinghe HPV, Jackson CH, Poisa V, Di Berardo C, Derek J, Jenkinson J (2003) Soyasapogenol A and B distribution in soybean (Glycine max L. Merr.) in relation to seed physiology, genetic variability, and growing location. J Agric Food Chem 51:5888–5894

38. Jyothi TC, Sindhu KTC, Appu Rao AG (2007) Influence of germination on saponins in soybean and recovery of soysapogenol I. J Food Biochem 31:1–13

39. Aparicio FX, García T, Yousef G, Lila MA, González de Mejía E, Loarca G (2006) Chemopreventive activity of polyphenolics from black Jamapa bean (Phaseolus vulgaris L.) on HeLa and HaCaT cells. J Agric Food Chem 54:2116–2122

278 Plant Foods Hum Nutr (2009) 64:271–278

Este trabajo se realizó en el Laboratorio de Química de los Alimentos, del Departamento de Investigación y Graduados en Alimentos, y en el laboratorio de Citopatología Ambiental, del Departamento de Morfología, de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, del Instituto Politécnico Nacional, así como en el laboratorio de Fisiología de la Nutrición del Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán, y fue financiado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (proyectos 59870 y 84507).

Mi agradecimiento a las becas otorgadas por el Consejo Nacional de Ciencia y

Tecnología (CONACyT) durante mis estudios de doctorado (número de registro

205249) y por el Programa Institucional de Formación de Investigadores (PIFI) a

través de los proyectos SIP20070801 (periodo enero-junio de 2007), y

SIP20082533 (periodo enero-junio de 2008).

D E D I C A T O R I A S

A mis hijos Emmanuel y José Luis,

Mis dos amores, el motor de mi vida y la razón de mi existencia. A ustedes dedico este trabajo, que como ustedes saben, es el resultado de un gran esfuerzo, dedicación y horas de desvelo. Gracias por su apoyo y comprensión. Gracias por existir.

A mi papá Abelardo,

Quien desde niña me inculcó, con su ejemplo, el amor por los libros y llenó mi vida de inmensa ternura, amor y alegría. ¡Te extraño mucho papá!

A mi mamá Carmen,

Gracias por tu paciencia y apoyo, por aguantar valiente mis arranques de neurosis y por tu bendición de cada mañana.

A mi esposo Artemio,

Aunque ya no estás conmigo, sé que compartes mi alegría ¡Te amo!

A mis hermanos Lilí, Lalo, Tavo y Lulú,

…a mis cuñados y a mis sobrinos, con mucho cariño. En particular, a la familia Martínez Robles, con todo mi amor e infinito agradecimiento por su gran generosidad e invaluable apoyo en un momento muy difícil de mi vida. ¡Qué Dios los bendiga!

A mis amigos de toda la vida

Lupita, Ana, Queta, Pepe, Güero, Chava, Pedro, Alejandro y Gabriel, con todo cariño.

A mi comadre Alba Laura Vargas,

A quien conocí en este camino y se convirtió en mi compañera de alegrías e infortunios. Gracias por concederme el honor de amadrinar al pequeño Arturito.

A Dios nuestro Señor,

Señor, ha sido tu costumbre llenar mi vida de milagros y éste es uno más. Te

ofrezco humildemente este trabajo en el que tu mano estuvo siempre presente. Yo

sí creo que tú estás “detrás de cada puerta que la ciencia logra abrir”.

A G R A D E C I M I E N T O S

A la Dra. Rosalva Mora, con cariño y agradecimiento,

Un día, hace 5 años, llegué a su oficina solicitando su ayuda. Yo tenía varios años de estar alejada de la vida académica y profesional y le pedí que me permitiera ayudarla en sus proyectos con el fin de actualizarme, recuperar la confianza en mí misma y poder reincorporarme al trabajo. Usted me recibió con un abrazo y desde ese momento depositó su confianza en mi persona, me brindó su amistad y su apoyo… y me cambió la vida.

A la Dra. Eva Ramón,

De quien aprendí que no hay imposibles en la vida, que uno debe perseguir sus sueños y que se pueden alcanzar. Sólo hay que atreverse. Me enseñó, con su ejemplo, a no darme por vencida, a perseverar y enfrentar todas las adversidades con fortaleza y valentía. Gran parte de este trabajo fue posible gracias a su atinada dirección y valiosos consejos.

A la Dra. Gloria Dávila,

A una mente brillante nata, analítica y crítica, se unen otras cualidades como su alto sentido de la responsabilidad, su congruencia y gran profesionalismo, que me quedan como un ejemplo a seguir, además del cúmulo de conocimientos que generosamente compartió conmigo cuando tuve la fortuna de ser su alumna. Mi respeto, mi reconocimiento y agradecimiento profundos.

A los doctores Nimbe Torres y Víctor Manuel Ortiz,

Por sus valiosos consejos, por darse el tiempo, entre sus múltiples ocupaciones, para enseñarme algunas técnicas de biología molecular y su generosidad al permitirme utilizar su laboratorio para realizar parte de mi trabajo.

A los doctores Georgina Calderón y Reynold Farrera, Por sus consejos y por animarme a emprender esta aventura.

Al Dr. Humberto Hernández,

Por el tiempo que dedicó a la revisión de este trabajo.

A mis compañeros,

Tanto de Alimentos como de Citopatología Ambiental, de quienes siempre recibí palabras de afecto y apoyo. Gracias por compartir conmigo sus conocimientos, por su apoyo moral y material, por alegrar mi estancia en los laboratorios, comunicarme su entusiasmo y su juventud. Gracias por tratarme como a una más de ustedes y alegrarme la existencia.

Al Instituto Politécnico Nacional

y en particular a mi alma mater, la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, a quien debo mi formación académica, y por haberme dado la oportunidad de hacer lo que más me gusta: enseñar.

“Tuve la fortuna de encontrar a gente buena que me apoyó, me enseñó, y me guió a lo largo de toda esta aventura. A mis maestros, asesores, tutores y compañeros, a mis amigos, a mi familia y, por supuesto, a Dios… ¡Muchas gracias!”

.

Hay una fuerza motriz más poderosa que el vapor, la electricidad y la energía atómica: la voluntad.

Albert Einstein

Í N D I C E

Página

ÍNDICE DE FIGURAS I

ÍNDICE DE CUADROS III

RESUMEN IV

ABSTRACT V

1. INTRODUCCIÓN 1

2. ANTECEDENTES 3

2.1. Cáncer 3

2.2. Soya 8

2.2.1. Composición de la soya 9

2.2.2. Componentes anticancerígenos y anticancerosos de la soya

12

2.2.2.1. Isoflavonas 12

2.2.2.2. Saponinas 15

2.2.2.3. Ácido fítico 17

2.2.2.4. Péptidos y proteínas biológicamente activos 19

2.2.2.5. Metionina y arginina 22

2.3. Germinación 25

3. JUSTIFICACIÓN 28

4. HIPÓTESIS. 29

5. OBJETIVOS 29

5.1. Objetivo general 29

5.2. Objetivos específicos 30

6. MATERIALES Y MÉTODOS 32

6.1. Semillas 33

6.2. Proceso de germinación 33

6.3. Análisis químico proximal de las harinas de soya 33

6.4. Obtención de los aislados proteínicos de soya 34

6.5. Caracterización de los aislados proteínicos de las harinas 34

de soya germinada a diferentes tiempos

6.5.1. Contenido de proteína 34

6.5.2. Electroforesis 34

6.5.3. Composición de aminoácidos 35

6.5.4. Determinación de genisteína y daidzeína 36 6.5.5. Determinación de compuestos fenólicos totales 36

6.5.6. Determinación de saponinas 37

6.6. Extracción de isoflavonas. 37

6.7. Hidrólisis de los aislados. 38

6.7.1. Grado de hidrólisis 38

6.8. Ensayos de citotoxicidad in vitro 39

6.8.1. Método de azul alamar 39

6.8.2. Método de rojo neutro 40

6.9. Determinación de apoptosis por la técnica de Ladder 40 6.10. Determinación de la actividad de caspasas 8 y 9 41

6.11. PCR Tiempo Real 42

6.11.1. Extracción del RNA total 42

6.11.2. Obtención de cDNA por transcripción reversa 43 6.11.3. Cuantificación de expresión de genes por PCR-

tiempo real

43 6.12. Secuenciación e identificación de péptidos por LC-MS/MS 45

6.13. Ensayo in vivo 46

6.13.1 Dietas 46

6.13.2. Animales 47

6.13.3. Detección de apoptosis en los tejidos tumorales 47

6.13.4. Determinación de daño tisular 48

6.13.5. Determinación de actividad antitumoral 50

7. Análisis estadístico 50

8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 51

8.1. Germinación 51

8.2. Análisis proximal de las harinas de soya germinada. 51

8.3. Obtención de aislados proteicos 53

8.4. Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE de los 54

aislados proteínicos de soya germinada

8.5. Análisis de aminoácidos de los aislados proteínicos 56

8.6. Fitoquímicos solubles en etanol 57

8.7. Hidrólisis enzimática de los aislados proteínicos 59 8.8. Ensayos de citotoxicidad in vitro de los hidrolizados de soya

germinada sobre células HeLa

60 8.9. Ensayos de citotoxicidad in vitro de los hidrolizados de soya

germinada sobre células C-33

70 8.10. Efecto de la arginina sobre la viabilidad de células HeLa 71 8.11. Separación de las fracciones proteicas del hidrolizado con

mayor actividad citotóxica.

72 8.12. Determinación de la muerte por apoptosis de células

expuestas a los hidrolizados más activos

73 8.12.1. Determinación de la fragmentación del DNA 74 8.12.2. Determinación de la actividad de caspasas 75

8.12.3. Morfología celular 78

8.13. Expresión de TOP2A, PTTG1 y DP 78

8.14. Identificación de los péptidos bioactivos por LC-MS/MS 81

8.15. Ensayo in vivo 86

9. CONCLUSIONES 94

10. PERSPECTIVAS Y PRODUCTIVIDAD DEL PROYECTO 96

10.1. Publicaciones. 97

10.2. Presentaciones en congresos. 98

11. NOMENCLATURA 100

11. BIBLIOGRAFÍA 102

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura Título Página

1 Desarrollo y propagación del cáncer. 5

2 Estructura de las isoflavonas. 13

3 Estructura de la soyasaponina. 16

4 Estructura del ácido fítico. 18

5 Inhibidor de proteasas Bowman Birk. 20

6 Secuencia y función de la lunasina. 22

7 Metabolismo de la arginina. 24

8 Cambios bioquímicos ocurridos durante la germinación. 26 9 Efecto de hidrolizados de proteína de soya germinada 3

días sobre células HeLa y CaLo de cáncer cérvico-uterino

28 10 Diagrama de flujo del diseño experimental. 31 11 Algunos aspectos del manejo de los animales 49 12 Soya sin germinar y germinada durante 1 a 6 días. 51 13 Perfil electroforético de los aislados proteicos de la soya

germinada.

55 14 Efecto de los hidrolizados de proteína de soya germinada

sobre la viabilidad de células HeLa de cáncer cérvico- uterino. Método de azul alamar.

61

15 Efecto de hidrolizados de proteína de soya germinada (con FQSE) sobre la viabilidad de células HeLa de cáncer cérvico-uterino y células no cancerosas (HaCat). Método de azul alamar.

64

16 Efecto de hidrolizados de proteína de soya germinada (sin FQSE) sobre la viabilidad de células HeLa de cáncer cérvico-uterino y células no cancerosas (HaCat). Método de azul alamar.

65

17 Efecto de hidrolizados de proteína de soya germinada (con FQSE) sobre la viabilidad de células HeLa de cáncer cérvico-uterino y células no cancerosas (HaCat). Método del rojo neutro.

68

18 Efecto de hidrolizados de proteína de soya germinada (sin FQSE) sobre la viabilidad de células HeLa de cáncer cérvico-uterino y células no cancerosas (HaCat). Método

69

de rojo neutro.

19 Efecto de la arginina sobre la viabilidad de células HeLa de cáncer cérvico uterino.

72 20 Citotoxicidad de las fracciones proteicas obtenidas por

ultrafiltración del hidrolizado de proteína de soya germinada durante 6 días sin FQSE.

73

21 Perfil electroforético del DNA genómico de células HeLa expuestas a los hidrolizados más activos.

74 22 Morfología celular y actividad de caspasa 8 de células

expuestas a los hidrolizados más activos.

76 23 Morfología celular y actividad de caspasa 9 de células

expuestas a los hidrolizados más activos.

77 24 Cambio en la expresión relativa del RNA mensajero de

TOP2A, PTTG1 y DP, en células HeLa tratadas con la fracción peptídica más activa (FA).

81

25 Estructura tridimensional de la leginsulina y del dominio EGF_CA tipo factor de crecimiento epidermal (EGF).

86 26 Curva de crecimiento de células HeLa en ratones

desnudos.

88 27 Degradación de tumores inducida por los tratamientos

con proteína de soya.

90 28 Índice apoptótico en los tumores de los diferentes grupos

dietarios.

91 29 Cambio en el peso corporal promedio de los diferentes

grupos dietarios durante el tratamiento.

93

ÍNDICE DE CUADROS

Cuadro Título Página

1 Composición de la soya y de sus fracciones estructurales 10

2 Clasificación de proteínas de la soya 11

3 Composición de las dietas experimentales 46

4 Análisis proximal de las harinas de soya germinada 52 5 Rendimiento y pureza de los aislados proteicos de soya 54 6 Composición de aminoácidos (g/100g de proteína) de los

aislados proteínicos de soya germinada

57

7 Contenido de compuestos fenólicos totales, isoflavonas y saponinas en los aislados proteicos

58

8 Grado de hidrólisis obtenido después de la hidrólisis enzimática con pepsina, pancreatina y peptidasa, de aislados proteínicos de soya germinada

60

9 IC

de los hidrolizados de proteína de soya germinada sobre células HeLa de cáncer cérvico-uterino (comparación de los métodos de azul alamar y rojo neutro)

62

10 IC

de los hidrolizados de proteína de soya germinada, con y sin FQSE , sobre células HeLa y

C-33 de cáncer cérvico-uterino

70

11 Péptidos identificados en la fracción peptídica más activa por LC-MS/MS

83

12 Actividad antitumoral in vivo de la proteína de soya 88 13 Porcentajes de apoptosis y necrosis en los tumores de

los diferentes grupos dietarios

88

14 Cambio en el peso corporal e ingesta de alimento de los diferentes grupos dietarios

93

R E S U M E N

Numerosos datos epidemiológicos, y de estudios in vitro e in vivo, sugieren que el

consumo de soya reduce el riesgo de desarrollar varios tipos de cáncer. El objetivo de

este trabajo fue investigar si la germinación puede mejorar las propiedades

anticancerosas de la proteína de soya a través de la generación de péptidos bioactivos

y/o la modificación en la composición de aminoácidos. Para tal fin primero se obtuvieron y

caracterizaron los aislados proteínicos de semillas de soya germinadas durante 0 a 6

días, encontrando que la germinación indujo un aumento en el contenido de proteínas,

lípidos, compuestos fenólicos totales, isoflavonas y saponinas, así como en el contenido

de aminoácidos hidrofóbicos y de ácido aspártico, pero una disminución en arginina y

lisina. El perfil electroforético de los aislados reveló la degradación gradual de las

fracciones α y α’ de la β-conglicinina, y de la fracción ácida de la glicinina, a partir del

tercer día de germinación. Los aislados completos y los extraídos previamente con etanol

acuoso se hidrolizaron con enzimas digestivas y se evaluó su efecto sobre el crecimiento

de células HeLa y C-33 de cáncer cérvico uterino y sobre células no cancerosas (HaCat)

por los métodos de azul alamar y rojo neutro. Los hidrolizados inhibieron el crecimiento de

las células cancerosas de una manera dependiente de la concentración siendo mínimo su

efecto sobre las células normales. El hidrolizado de proteína de soya germinada durante 2

días, no extraído con etanol, fue el que mostró mayor efecto citotóxico (IC

de 2.15

mg/ml). Entre los hidrolizados libres de fitoquímicos solubles en etanol el de 6 días fue el

mejor con un IC

de 4.02 mg/ml. Una fracción peptídica (FA), obtenida por ultrafiltración

de este hidrolizado, fue la más activa y su perfil electroforético reveló tres bandas

principales de 6, 11 y 21 kDa. Esta fracción indujo la disminución de la expresión de los

genes TOP2A y PTTG1 (dos genes considerados como blancos terapéuticos) y como

consecuencia provocó la apoptosis de las células cancerosas, tanto por la vía extrínseca

como por la intrínseca, activando la cascada de caspasas y produciendo fragmentación

del DNA. El análisis por LC-MS/MS de FA mostró que el péptido bioactivo podría ser la

leginsulina, un péptido involucrado en la transducción de señales de las células de la

soya. El ensayo in vivo mostró que la proteína de soya germinada inhibe el crecimiento

del tumor hasta en un 98% provocando la muerte de las células cancerosas tanto por

necrosis como por apoptosis. Este es el primer trabajo que revela que la germinación

puede mejorar el efecto anticanceroso de la proteína de soya. La proteína de soya

germinada durante 2 días podría utilizarse como ingrediente de alimentos funcionales.

A B S T R A C T

Extensive epidemiological, in vitro, and animal data suggest that soybean consumption reduces the risk of developing several types of cancer. The aim of this work was to investigate if germination improves the anticancer properties of soybean protein through generation of bioactive peptides and/or the modification of the amino acid composition.

Soy protein isolates were obtained from soy germinated for 0-6 days. Germination induced the increase in the content of proteins, lipids, total phenolic compounds, isoflavones and saponins, as well as the content of hydrophobic amino acids and aspartic acid, but a decrease in arginine and lysine. The electrophoretic pattern of protein isolates showed that germination induced degradation of the α and α’ fractions of β-conglycinin and acid fraction of glycinin, from the third day of germination. Isolates with and without ethanol-soluble phytochemicals were hydrolyzed with digestive enzymes and their effect on growth in HeLa and C-33 (epidermoid cervical carcinoma) and HaCaT (non-cancerous human keratinocytes) cells was evaluated with the Alamar Blue and neutral red methods. The hydrolysates inhibited growth of the HeLa and C-33 cells depending on concentration but their effect on normal cells was minimal. Optimum inhibition was observed with the soybean hydrolysate germinated for two days and containing ethanol-soluble phytochemicals (IC

= 2.14 mg/ml). Among the hydrolysates without ethanol-soluble phytochemicals that from soy germinated for six days exhibited maximum inhibition (IC

de 4.02 mg/ml). A peptide fraction (AF) obtained by ultrafiltration of this hydrolysate was the most active; its electrophoretic profile revealed three major bands of 6, 11 and 21 kDa.

This peptide fraction induced decreased expression of the genes TOP2A and PTTG1 (two

genes considered as therapeutic targets) and consequently caused the apoptosis of

cancer cells, via both the extrinsic and intrinsic routes activating the caspase cascade and

causing DNA fragmentation. LC-MS/MS (liquid chromatography-mass spectrometry)

analysis of AF showed that the bioactive peptide might be the leginsulin, a peptide

involved in signal transduction of soybean cells. The in vivo assay showed that the protein

of soy germinated for two days inhibits tumor growth by 98% causing cancer cells death by

both necrosis and apoptosis. This is the first study that reveals that germination can

enhance the anticancer effect of soy protein. Germinated soybean protein could be used

as an ingredient in functional foods.

1. INTRODUCCIÓN

Son varios los motivos que han impulsado el estudio de los efectos de la dieta sobre la salud del ser humano. Se sabe que enfermedades tales como ciertos tipos de cáncer, aterosclerosis y osteoporosis, entre otras, afectan amplios sectores de la población y están relacionadas con el exceso y/o con la falta de consumo de ciertos alimentos (WHO/FAO, 2003; Davila, 2003). En los últimos años los alimentos se han considerado no sólo como una fuente de energía y componentes básicos para el mantenimiento y crecimiento del cuerpo sino también como una fuente de compuestos bioactivos que pueden ejercer efectos benéficos en el hombre. La tendencia actual es la de consumir alimentos que proporcionen todos los nutrientes, y que además aporten fitoquímicos que se han asociado a la prevención de ciertas patologías. A los alimentos que cumplen con estas características se les conoce como alimentos funcionales. Generalmente, los alimentos funcionales se consumen en raciones normales en la dieta diaria y pueden ser de origen completamente natural o aquellos a los cuales se les han agregado ingredientes que inducen los efectos benéficos, o que el tratamiento tecnológico aplicado les aumenta la biodisponibilidad de sus constituyentes (Davila y col., 2003).

Las leguminosas, por su relativamente bajo costo, son alimentos importantes, particularmente en países en vías de desarrollo, donde ellas representan una importante fuente proteica. Recientemente el interés en el estudio de las leguminosas ha aumentado debido a su contenido en fitoquímicos los cuales son metabolitos secundarios biológicamente activos sintetizados por las plantas (Davila, 2003).

La incidencia de cáncer de mama, colon, cuerpo uterino y próstata, entre otros, es más baja en los países asiáticos que en los occidentales (Iwasaki y col., 2008).

Entre los muchos factores que pueden contribuir a las diferencias epidemiológicas

entre estas poblaciones está la mayor ingesta de soya y productos de soya en la dieta tradicional asiática (Persky, 1995).

Numerosos datos epidemiológicos, y de estudios in vitro e in vivo, reunidos durante varios años, sugieren que el consumo de soya reduce el riesgo de desarrollar varios tipos de cáncer. Diversas investigaciones han identificado, a la fecha, una serie de nutrientes y micronutrientes de la soya que tienen propiedades anticancerosas. Éstos incluyen isoflavonas, fitosteroles, hexafosfato de inositol, saponinas, así como proteínas y péptidos biológicamente activos tales como los inhibidores de proteasas, las lectinas, péptidos de bajo peso molecular y el recientemente descubierto péptido lunasina (Barnes, 1995; Hawrylewicz y col., 1995; Kennedy, 1995; Rao y Sung, 1995; Kim y col., 2000; Galvez y col., 2001;

Vucenik y Shamsuddin, 2003)

Los péptidos bioactivos están entre los muchos componentes funcionales identificados en los alimentos en años recientes. Éstos son pequeños fragmentos de proteína que tienen efectos biológicos una vez que son liberados durante la digestión gastrointestinal en el organismo o por algún proceso tecnológico. Se han descrito biopéptidos con actividades antihipertensiva, inmunomodulatoria, opioide, antioxidante, hipocolesterolémica, antiobesidad y anticancerígena aislados de diferentes fuentes alimenticias, entre ellas, la soya (Wang y González, 2005).

Parte de las propiedades anticancerosas de la soya también se han atribuido a su

balance de aminoácidos. La soya tiene bajos niveles de metionina y un alto

contenido de arginina. Ambas condiciones inhiben el desarrollo del tumor, según lo

revelan algunos estudios (Breillout y col., 1990; Hawrylewicz y col., 1991; Millis y

col., 1998; Lind, 2004). A lo anterior, hay que agregar la capacidad antioxidante de

diferentes aminoácidos, lo cual se ha demostrado en diferentes estudios (Marcuse,

1962; Elías y col., 2005). Se ha demostrado que la capacidad antioxidante de

hidrolizados de proteína de soya aumenta al aumentar el tiempo de hidrólisis, así

que los responsables pueden ser péptidos cortos o incluso aminoácidos libres (Peña-Ramos and Wiong, 2002; Khalil y col., 2006).

La germinación es un tratamiento sencillo y económico que da como resultado un producto natural, permite eliminar o inactivar ciertos factores antinutricionales y aumenta la digestibilidad de proteínas y almidones de las leguminosas. Durante la germinación se producen diferentes cambios en la distribución de metabolitos secundarios, movilización de las proteínas de reserva que están almacenadas en los cuerpos proteicos de los cotiledones y cambios en la composición de aminoácidos (Davila, 2003), produciéndose además, péptidos de peso molecular intermedio (Wilson y col., 1986; Mora-Escobedo y col., 2009). De tal manera que la germinación podría mejorar las propiedades nutricionales y nutracéuticas de las leguminosas al modificar el contenido de los diferentes metabolitos y, en particular, generando péptidos y aminoácidos con posible actividad biológica.

En el presente trabajo se investigó la utilización de la germinación para mejorar las propiedades anticancerosas de la proteína de soya a través de la generación de péptidos bioactivos y/o la modificación en la composición de aminoácidos, y se profundizó en los posibles mecanismos de acción y la identidad del ingrediente activo.

2. ANTECEDENTES

2.1. Cáncer

El cáncer es una de las enfermedades crónicas no infecciosas de mayor

incidencia en el mundo. En 2007, fallecieron en el mundo por alguna neoplasia 7.9

millones de personas que representan 13% de las defunciones generales. De

acuerdo con las estimaciones de la Organización Mundial de la Salud, se espera

que las muertes por neoplasias sigan en aumento y alcancen 12 millones de casos para 2030 (OMS, 2010)

En el año 2008, los tumores malignos representaron la tercera causa de muerte en México. En los hombres, 14.8% de las defunciones por tumores malignos correspondieron al de próstata y 12.8% al de tráquea, bronquios y pulmón. En las mujeres, 11.2% de las defunciones por cáncer correspondieron al del cuello del útero (cervicouterino) y 13.4% al de mama. Actualmente, una de cada cuatro mujeres entre 30 a 64 años, fallece por alguno de estos dos tipos de cáncer (INEGI, 2010).

El cáncer engloba una gran variedad de padecimientos que tienen como denominador común la proliferación celular incontrolada (Cortinas, 1997). Las células cancerosas pueden considerarse como células propias alteradas que han escapado a los mecanismos de regulación normal del crecimiento. Estas células dan lugar a clonas que pueden alcanzar un tamaño considerable, con producción de un tumor o neoplasia (Goldsby, 2004; Pecorino, 2006). El tumor que no es capaz de crecer por tiempo indefinido y que no invade los tejidos circundantes sanos se denomina benigno. El que prosigue su crecimiento y se vuelve invasor de forma progresiva se llama maligno; el término cáncer se refiere de manera específica a un tumor maligno. Además de crecimiento incontrolado, los tumores malignos emiten metástasis; en este proceso se desprenden del tumor pequeños cúmulos de células cancerosas que invaden los vasos sanguíneos o linfáticos y se transportan hacia otros tejidos, en los que no dejan de proliferar. De esta manera, un tumor primario de determinada localización probablemente origine uno o varios tumores secundarios en otros sitios (Goldsby, 2004).

Los tumores malignos o cánceres se clasifican de acuerdo con el origen

embrionario del tejido del que se deriva la masa. En su mayor parte (más de 80%)

son carcinomas, es decir, tumoraciones que se originan en tejidos endodérmicos o

ectodérmicos, como la piel o el revestimiento epitelial de los órganos y las

glándulas internas. La mayor parte de los cánceres de colon, mama, próstata y

pulmón corresponde a carcinomas. Las leucemias y los linfomas son tumores malignos de las células hematopoyéticas de la médula ósea. Las leucemias proliferan como células independientes, en tanto que los linfomas tienden a crecer como masas tumorales. Los sarcomas, que son malformaciones menos frecuentes, se derivan de tejidos conjuntivos mesodérmicos, como hueso, grasa y cartílago (Cortinas, 1997; Goldsby, 2004).

Figura 1: Desarrollo y propagación del cáncer

El tratamiento de células cultivadas normales con carcinógenos químicos, radiaciones y ciertos virus, puede alterar su morfología y propiedades de crecimiento. En algunos casos este proceso, conocido como transformación, vuelve a las células capaces de producir tumores cuando se inyectan a diversos animales. Se dice que estas células han experimentado transformación maligna y con frecuencia manifiestan propiedades in vitro semejantes a las de las células cancerosas. Gracias a esto, se ha podido estudiar de manera extensa el proceso de la transformación maligna como modelo de inducción del cáncer. Se ha demostrado que inducen transformación celular diversos agentes químicos (p. ej., reactivos alquilantes del DNA) y físicos (p.ej., luz ultravioleta y radiaciones ionizantes) que producen mutaciones. La inducción de la transformación maligna

INICIO

PROMOCIÓN

PROGRESIÓN

Daño al ADN por exposición a agentes físicos, químicos o biológicos

Promotores estimulan división celular y transformación a estado precanceroso

Mitogénesis, sobrevivencia inmune, metástasis y angiogénesis

tiempo

tiempo Célula normal

con carcinógenos químicos o físicos parece abarcar etapas múltiples y por lo menos dos fases diferentes: inicio y promoción. El inicio abarca cambios del genoma pero no produce, por sí mismo, transformación maligna. Si la mutación no produce la muerte celular y no se repara adecuadamente, la célula se convierte entonces en una célula “iniciada”. Después del inicio, diversos promotores estimulan la división celular y producen esta transformación alcanzando un estado precanceroso con lesión focalizada (Goldsby, 2004). Algunos neoplasmas pueden pasar de un grado de malignidad muy poco apreciable a un crecimiento extraordinariamente rápido. A estos procesos se les describe como progresión de la neoplasia. Este proceso, que supone un incremento de malignidad o incluso la transición de un tumor benigno a uno maligno, implica cambios de actividad biológica y de morfología. En esta tercera etapa en el desarrollo del cáncer, se han identificado múltiples cambios en el número y estructura de los cromosomas de las células tumorales a medida que se vuelven invasivos (Figura 1) (Cortinas, 1997).

Se ha demostrado que diversos virus inducen transformación maligna. Los

genomas virales que se integran al azar en el DNA cromosómico del huésped,

incluyen a varios genes que se expresan muy al principio de la replicación viral y

codifican a proteínas que desempeñan una función en la transformación maligna

de las células infectadas. En algunos casos, la transformación inducida por

retrovirus se relaciona con la presencia de oncogenes, o “genes del cáncer”, de

los que es portador el retrovirus (Goldsby, 2004). Tal es el caso del virus del

papiloma humano (VPH), principal causa del carcinoma cervicouterino, el cual

integra al genoma del huésped los genes E6 Y E7 que actúan como oncogenes

que promueven el crecimiento del tumor y la transformación maligna al codificar

para dos proteínas que inhiben a las proteínas supresoras de tumores p53, pRB y

p21 (Pecorino, 2006). De igual manera, en las células normales existen genes

celulares normales o fisiológicos llamados protooncogenes que tienen la

capacidad potencial de convertirse en oncogenes cuando son mutados o alterados

en su expresión, y cuya actividad exacerbada o desregulada, constituye una etapa

decisiva en la formación de un tumor. La mayor parte de los oncogenes (virales y