1. ASIGNATURA / COURSE
1.1. Nombre / Course Title
BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL I / EXPERIMENTAL BIOCHEMISTRY I
1.2. Código / Course Code
12642
1.3. Tipo / Type of course
Obligatoria / Compulsory
1.4. Nivel / Level of course
Grado / Grade
1.5. Curso / Year of course
Primero / First
1.6. Semestre / Semester
1º / 1st (Fall semester)
1.7. Número de créditos / Number of Credits Allocated
17 créditos (Teoría: 3 créditos, Parte práctica: 14 créditos)/ / 17 credits
1.8. Requisitos Previos / Prerequisites
Ninguno / None
1.9. Requisitos mínimos de asistencia a las sesiones presenciales / Minimum attendance requirement
La asistencia es obligatoria / Attendance is mandatory
1.10. Datos del equipo docente / Faculty data
Ana Ruiz Gómez Departamento: Biología Molecular
(coordinadora) Facultad: Ciencias
Teléfono: 91 196 4640 e-mail: [email protected]
Elena Bogónez Peláez Departamento: Biología Molecular
(coordinadora) Facultad: Ciencias
Teléfono: 91 196 4622
e-mail: [email protected] Isabel Correas Hornero Departamento: Biología Molecular
(Teoria) Facultad: Ciencias
Teléfono: 91 196 4616
e-mail: [email protected] J. Pascual Abad Lorenzo Departamento: Biología Molecular
Facultad: Ciencias
Teléfono: 91 497 4692/5518 e-mail: [email protected] Maria Jesús Bullido Gómez-Heras Departamento: Biología Molecular
Facultad: Ciencias Teléfono: 91 196 4567
e-mail: [email protected] F. Javier Díez Guerra Departamento: Biología Molecular
Facultad: Ciencias Teléfono: 91 196 4612 e-mail: [email protected]
Juan A. Fernández Santarén Departamento: Biología Molecular Facultad: Ciencias
Teléfono: 91 196 4692
e-mail: [email protected]
Miguel Angel Iñiguez Peña Departamento: Biología Molecular Facultad: Ciencias
Teléfono: 91 196 4508
e-mail: [email protected]
Pilar Rodríguez Pombo Departamento: Biología Molecular Facultad: Ciencias
Teléfono: 91 196 4596
e-mail: [email protected]
1.11. Objetivos del curso / Objective of the course
El objetivo de esta asignatura es que los alumnos comiencen a conocer y a familiarizarse con distintas técnicas de laboratorio y aproximaciones experimentales utilizadas en el estudio de las propiedades químicas y físicas de proteínas y ácidos nucleicos, que posteriormente se complementarán con las asignaturas de Bioquímica Experimental II y III.
En la parte correspondiente a los 3 créditos teóricos de esta asignatura se introduce a los alumnos en los conocimientos teóricos de un conjunto de técnicas básicas utilizadas en la experimentación bioquímica. Cada conjunto de técnicas se acompaña de una serie de problemas y/o experimentos tomados de trabajos publicados en revistas internacionales de prestigio con el objetivo de que el alumno pueda poner en práctica los conocimientos teóricos alcanzados.
Los objetivos específicos de las clases prácticas serán:
1. Desarrollar la capacidad del alumno para el diseño de experimentos a partir de unos objetivos experimentales con procedimientos generales;
desarrollar estos experimentos satisfactoriamente solos o en parejas;
interpretar los datos y presentarlos de forma clara en formato escrito en el cuaderno de laboratorio.
2. Aprender la metodología básica de los laboratorios de bioquímica y biología molecular.
3. Desarrollar:
a. La colaboración y el trabajo en equipo.
b. La destreza en el trabajo habitual en un laboratorio (preparación de medios, manejo de aparatos, utilización de programas informáticos básicos, etc).
c. La capacidad de elaborar y mantener un cuaderno de laboratorio claro y completo.
d. La capacidad de análisis e interpretación de los datos obtenidos en el laboratorio.
1.12. Contenidos del Programa / Course Contents
I. Clases Teóricas: Programa
1. Tema 1.- Introducción. La experimentación en Biología.
FRACCIONAMIENTO CELULAR. Introducción. Rotura celular.
2. Tema 2.- CENTRIFUGACION. Comportamiento de una partícula en un campo centrífugo. Conceptos básicos: velocidad de sedimentación, coeficiente de sedimentación, tiempo de sedimentación, campo centrífugo relativo. Tipos de centrífugas y rotores.
3. Tema 3.- Centrifugación diferencial y centrifugación en gradientes de densidad. Centrifugación por velocidad de sedimentación.
Centrifugación por equilibrio de sedimentación.
4. Tema 4.- Aislamiento de partículas subcelulares.
5. Tema 5.- Aplicaciones generales de la centrifugación a problemas de interés biológico.
6. Tema 6.- ELECTROFORESIS. Introducción. Movilidad electroforética.
7. Tema 7.- Electroforesis libre. Electroforesis de zona. Electroforesis en condiciones desnaturalizantes y en condiciones nativas.
8. Tema 8.- Técnicas de transferencia. Aplicación del Western blot al estudio de interacciones moleculares mediante la utilización de técnicas de inmunoprecipitación.
9. Tema 9.- Técnicas de electroenfoque. Electroforesis bidimensional.
10. Tema 10.- Electroforesis de ácidos nucleicos.
11. Tema 11.- Aplicaciones de la electroforesis a problemas de interés biológico.
12. Tema 12.- CROMATOGRAFIA. Introducción. Reparto y adsorción.
13. Tema 13.- Cromatografía de exclusión molecular.
14. Tema 14.- Cromatografía de intercambio iónico.
15. Tema 15.- Cromatografía de afinidad.
16. Tema 16.- Cromatografía líquida de alta resolución, HPLC. FPLC
17. Tema 17- Concentración de macromoléculas. Diálisis y filtración molecular (opc).
18. Tema 18.- Aplicaciones generales de las técnicas cromatográficas a problemas de interés biológico.
19. Tema 19.- TECNICAS RADIOISOTOPICAS. Introducción.
20. Tema 20.- Leyes de desintegración radiactiva.
21. Tema 21.- Medida de radiactividad. Contadores.
22. Tema 22.- Análisis de los resultados de las medidas de radiactividad.
Autorradiografía.
23. Tema 23.- Aplicaciones generales de las técnicas isotópicas a problemas de interés biológico.
II. Clases Prácticas:
1. Proteínas: Constituye el 55% de la parte práctica de la asignatura:
i. Cromatografía de Filtración Molecular: Preparación de la columna de Sephadex G-100. Calibrado de la columna. Separación de proteínas de una mezcla problema. Regeneración de la columna.
ii. Determinación de proteínas y actividades enzimáticas. Método de Bradford. Determinación de la actividad catalasa. Determinación de la presencia de lisozima.
iii. Electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida. Preparación del gel de poliacrilamida. Preparación y carga de las muestras. Tinción del gel de proteínas.
iv. Transferencia de proteínas a membranas de nitrocelulosa o PVDF.
Tinción reversible de proteínas fijadas a filtros de nitrocelulosa y/o PVDF. Detección inmunológica de proteínas.
v. Purificación de la lisozima a partir de clara de huevo.
Preparación de la resina de intercambio iónica CM-celulosa y purificación de la lisozima. Ensayo enzimático y determinación de proteínas por la técnica de Lowry. Electroforesis en geles de SDS- poliacrilamida de las fracciones del proceso de purificación.
vi. Fraccionamiento subcelular de hígado de rata. Obtención de las fracciones mitocondrial y citosólica. Determinación de proteínas.
vii. Actividad piruvato quinasa (PK) en la fracción citosólica de hígado de rata. Efecto de la concentración de sustrato en la velocidad inicial. Regulación de la actividad enzimática PK por los efectores alostéricos fructosa 1,6-bisfosfato y L-alanina. Determinación de parámetros cinéticos.
viii. Actividad succinato deshidrogenasa (SDH) en la fracción mitocondrial de hígado de rata. Establecimiento de las condiciones de ensayo en velocidad inicial: tiempo de reacción, concentración de enzima. Efecto de la concentración de sustrato.
Inhibición por malonato de la SDH. Determinación de parámetros cinéticos.
2. DNA: Constituye el 45% de la parte práctica de la asignatura.
i. Aislamiento de DNA genómico de hígado de rata.. Análisis de la muestra obtenida, determinación de la concentración de DNA, electroforesis en geles de agarosa
ii. Amplificación del exón 3 de la globina por PCR. Visualización del producto de PCR por geles de agarosa
iii. Aislamiento del plásmido pBluescript por el método de lisis alcalina. Crecimiento de bacterias en presencia de amplicilina y purificación del plásmido por minipreps. Determinación de la concentración de DNA por Absorbancia a 260 nm y en geles de agarosa.
iv. Clonaje del producto de la PCR en pBluescript. Digestiones del producto de la PCR y del plásmido purificado con la enzima Bam H1. Desfosforilación del plásmido pBluescript. Purificación y cuantificación de los DNAs digeridos. Ligación. Preparación de bacterias competentes. Transformación de bacterias, siembra en placa e identificación de colonias recombinantes.
v. Análisis de los clones recombinantes. Análisis por PCR de colonias.
Análisis por minipreps y digestiones de los DNAs recombinantes.
Southern-blot.
1.13. Referencias de Consulta Básicas / Recommended Reading.
1. Clases teóricas:
Bibliografía general:
No se sigue un libro específico para todo el temario. La relación que se indica a continuación incluye los textos generales más utilizados.
Principios y técnicas de Bioquímica Experimental. Bryan L. WILLIAMS, Keith WILSON. Ed. Omega.
Técnicas instrumentales de análisis en Bioquímica. J.M.
GARCÍA-SEGURA y cols. Ed. Síntesis (Madrid)
Instrumentos y técnicas de Bioquímica. Terrance G.
COOPER. Ed. Reverté S.A.
An Introduction to Practical Biochemistry. David T.
PLUMMER. McGRAW-HILL Book Company (UK) Limited (London).
A Biologist's Guide to Principles and Techniques of Practical Biochemistry. Keith WILSON and Kenneth H.
GOULDING.
Técnicas de Bioquímica y Biología Molecular. D.
FREIFELDER. Ed. Reverté S.A.
Bibliografía específica:
La serie IRL Press ha editado libros específicos de la mayoría de las técnicas de experimentación utilizadas en el laboratorio y son de gran utilidad para cada uno de los capítulos específicos tratados en la asignatura.
Por ejemplo, para el capítulo de técnicas de centrifugación: Centrifugation. A Practical Approach.
Edited by D. Rickwood.
Para el Cap€tulo de t‚cnicas de electroforesis: Gel Electrophoresis of Proteins. A Practical Approach.
Edited by B.D. Hames and D. Rickwood.; etc.
Pƒginas web:
Ademƒs existen, hoy d€a, pƒginas web muy ilustrativas y didƒcticas sobre los diferentes tipos de t‚cnicas.
WWW.CHROMATOGRAPHY.AMERSHAMBIOSCIENCES.COM Entrar en el apartado ‘LC Chromatography’ y elegir uno de los ejemplos: ‘Affinity Chromatography, Desalting&Gel Filtration, Ion Exchange, etc’. Podremos ver animaciones (‘Animations’) que facilitan el entendimiento del funcionamiento bƒsico de cada cromatograf€a y las explicaciones te•rico-prƒcticas de cada t‚cnica cromatogrƒfica (‘Basic Principles’).
2. Clases Prácticas:
Libros:
Arriaga D de., Soler J., Busto F. y Cadenas E. Manual de ejercicios de cinética enzimática. Servicio de Publicaciones de la Universidad de Le•n, 1999.
Cƒrdenas J., Fernƒndez E., Galvƒn F., Mƒrquez A:J: y Vega J.M. Problemas de Bioquímica. Editorial Alhambra, 1988.
Copeland, R.A. Enzymes: A practical introduction to structure, mechanism and data analysis. Wiley-VCH, 2† ed., 2000.
Segel I.H. Cálculos en Bioquímica. Editorial Acribia, 1982
Direcciones web de inter‚s:
http://depa.pquim.unam.mx/proteinas/enzcatal/liszqui m.html
http://www.brenda-enzymes.info/
http://www.ebi.ac.uk/thornton- srv/databases/enzymes/
http://molvis.sdsc.edu/visres/index.html
http://minnie.uab.es/~veteri/21206/ELECTROFORESIS%
20(II).ppt
http://minnie.uab.es/~veteri/21206/cromatografia%20(I ).ppt
http://cursweb.educadis.uson.mx/roca/documentos
http://www.molecularstation.com/protein/western- blot/
http://www.molecularstation.com/dna/restriction- enzyme-digestion/
http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.ht m#Métodos%20de%20transferencia%20a%20filtros
http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.ht m
http://www.bio.davidson.edu/COURSES/genomics/meth od/Westernblot.html
http://www.bio.davidson.edu/COURSES/genomics/meth od/SDSPAGE/SDSPAGE.html
http://www.bio.davidson.edu/COURSES/genomics/meth od/Southernblot.html
http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/pcr.html
http://www.biotech.iastate.edu/lab_protocols/plasmid _isolation_analysis.html
2. Métodos Docentes / Teaching methods
Clases de teoría: clases presenciales de 50 minutos con tutorías que se realizan los miércoles a las 16:30h, previa cita.
Clases prácticas: se realizarán en los laboratorios del Departamento de Biología Molecular del edificio de Biología. Estas clases se imparten en sesiones de tarde de lunes a viernes. En las clases prácticas se proporcionará un guión a los alumnos. Cada sesión comenzará con una explicación de una hora de la actividad a desarrollar en la misma que incluirá: objetivos, metodología, resultados previsibles, análisis de los mismos y su presentación en el cuaderno de laboratorio. Los laboratorios de prácticas tienen disponibles un cañón y ordenadores para poder utilizarlos en la explicación. Se proporcionará a los alumnos las fuentes bibliográficas y páginas web utilizadas, así como fotocopias de lo explicado. Tras la finalización de los distintos bloques se realizará un seminario de puesta en común de los resultados obtenidos por los alumnos en las prácticas realizadas.
Tutorías: se realizarán tutorías individuales previo contacto telefónico o mediante correo electrónico con los profesores.
3. Tiempo estimado de Trabajo del Estudiante / Estimated workload for the student
4. Métodos de Evaluación y Porcentaje en la Calificación Final / Assessment Methods and Percentage in the Final marks
Teoría:
Examen escrito (35 % de la calificación final de la asignatura)
La evaluación de esta parte de la asignatura se lleva a cabo mediante un examen en el que se incluyen preguntas teóricas, problemas y/o ejemplos de experimentos tomados de publicaciones científicas.
Parte práctica (65 % de la calificación final de la asignatura), la evaluación consta de:
Examen escrito (85 %)
Cuaderno de laboratorio (15 %)
En el caso de alumnos repetidores, la nota del cuaderno de laboratorio se conservará en las dos convocatorias del año académico inmediatamente posterior al de realización de la asignatura.
5. Cronograma* / Course calendar
Al inicio del Curso Académico 2009-2010 se anunciará el número de grupos y la fecha de inicio de las clases prácticas.
