celular
JAVIER LEÓN SERRANO
RESUMEN
La diferenciación de una célula animal consiste en la reprogramación genética de una célula madre, y supone la activación y represión de miles de genes en un pro-ceso secuencial, hasta dar una célula terminalmente diferenciada. Los factores de transcripción controlan la expresión de los genes uniéndose a secuencias específicas en su promotor, pero la activación correcta del gen requiere la combinación de va-rios factores de transcripción que cooperan para remodelar la cromatina y permitir el acceso y activación de la RNA polimerasa. Esta revisión se centrará en la diferen-ciación de las células embrionarias pluripotentes y de las células madre hematopo-yéticas. Gracias al establecimiento de líneas de células madre embrionarias murinas y humanas se han identificado genes responsables del mantenimiento de la pluripo-tencia, codificando la mayoría para factores de transcripción. La combinación de va-rios de estos factores (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog, Lin28) es capaz de conver-tir fibroblastos de adultos en células madre pluripotentes. Las nuevas tecnologías de análisis masivo del genoma han evidenciado que estos factores forman redes que ac-túan coordinadamente para mantener el estado indiferenciado y pluripotente. La di-ferenciación de la células madre hematopoyéticas hasta los distintos tipos celulares maduros de la sangre es también controlada por factores de transcripción, algunos actuando a nivel de la célula madre y otros en progenitores comprometidos a los dis-tintos linajes (linfoide, mieloide). Es revelador que la mayoría de los oncogenes iden-tificados en leucemias son versiones mutadas de genes de factores de transcripción que han demostrado ser necesarios para la correcta hematopoyesis en ratones altera-dos genéticamente. Esto confirma los genes del cáncer no sólo operan en el control de la proliferación sino también en el de la diferenciación celular.
SUMMARY
Animal cell differentiation means a genetic reprogramming of a stem cell, involving activation and repression of thousands of genes en a sequential pro-cess to give a terminally differentiated cell. Transcription factors control gene expression by binding to specific sequences in their promoters, but the proper gene activation requires the combination of several transcription factors that cooperate to remodelate the chromatin and allow the access and activation of the RNA polymerase. This review will focus in the differentiation of embr-yonic stem cells and hematopoietic stem cells. After the establishment of mu-rine and human embryonic stem cells we have identified genes responsible for the maintenance of the pluripotency, most of them encoding for transcription factors. A combination of some of these factors (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Na-nog, Lin28) is capable to convert adult fibroblasts in pluripotent stem cells re-program. The new technologies of genome-wide analysis have revealed that these factors are organized in networks that act coordinately to maintain the pluripotent and undifferentiated state. The differentiation of hematopoietic stem cells to the different blood mature cell types is also controlled by trans-cription factors. Interestingly, most of the of the oncogenes identified in leu-kemia are mutated versions of genes encoding transcription factors required for the proper hematopoiesis in genetically altered mice. This confirms that cancer genes not only operate in the control of proliferation but also in the control of cell differentiation.
1. INTRODUCCIÓN
La expresión de los genes se puede regular a nivel de su transcripción y también a nivel postranscripcional. Los mecanismos de regulación postrans-cripcional incluyen los que controlan la estabilidad de los mRNAs, su tasa de traducción por los ribosomas o la estabilidad de la proteína codificada por el mRNA, siendo este último el mecanismo de regulación postranscripcional más importante. Sin embargo, el mecanismo prevalente por el que se regula la ex-presión de los genes es a nivel de su transcripción, pues los niveles de proteí-na, para una mayoría de genes, se correlacionan con los niveles de mRNA. La transcripción de un gen silente es activada por factores de transcripción, deno-minación muy imprecisa. En un sentido amplio se pueden definir como proteí-nas con capacidad de interaccionar con secuencias específicas de DNA y regu-lar su actividad transcripcional por uno u otro mecanismo. Estos mecanismos
son diversos, como se repasan luego. Para unirse al DNA se dispone de una co-lección limitada de dominios proteicos de interacción con DNA (dedos de zinc, hélice-lazo-hélice, homeodominio, etc). Además de los factores de transcripción «bona fide» hay una serie de co-represores y co-activadores que, si bien no inter-accionan con el DNA o no o hacen de manera específica de secuencia, se unen a los factores de transcripción modificando su actividad en un sentido positivo o negativo.
La diferenciación celular supone un profundo cambio de expresión genéti-ca. El proceso biológico que convierte un zigoto en un recién nacido o una oru-ga en una mariposa es en realidad una reprogramación genética ordenada en el tiempo y en el espacio (específica de tejido) por el que miles de genes se van activando y miles silenciando. Este proceso de desarrollo y diferenciación ce-lular viene controlado por un numeroso conjunto de genes que codifican facto-res de transcripción que a su vez facto-responden a factofacto-res extracelulafacto-res y contac-tos célula-célula. Escontac-tos genes se han ido identificando a partir de las nuevas tecnologías de análisis de la expresión génica a nivel genómico y porque en tu-mores se han encontrado de manera recurrente versiones mutadas de esos ge-nes. En las siguientes secciones se repasaran los mecanismos básicos de la trans-cripción y la actividad de los genes implicados en el control de la diferenciación de células madre pluripotentes y tisulares, tomando en este último caso la he-matopoyesis como modelo.
2. PRINCIPIOS DE LA REGULACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN EN CÉLULAS ANIMALES
Todos los genes que codifican proteína, así como los de microRNA (miR-NA), son transcritos por la RNA polimerasa II (RNAPII), que en realidad es un complejo multiproteico llamado holoenzima RNAPII. La tasa de transcripción depende sobre todo de la tasa de inicio de la transcripción, es decir, de la tasa de unión de la holoenzima RNAPII al sitio de iniciación para arrancar la trans-cripción del gen. Esta unión depende a su vez de la actividad combinada de fac-tores de transcripción que se unen a regiones cercanas al inicio de la transcrip-ción, normalmente hacia el 5’ del inicio de transcriptranscrip-ción, pero también en el primer exón, y a distancias muy variables según el factor y el gen. La forma en que estas proteínas activan o reprimen la transcripción está relacionada con cam-bios en la topología del DNA, con modificaciones de histonas (acetilación/dea-cetilación y metilación de histonas), remodelación de la cromatina y metilación de citosinas del DNA.
Aunque no hay reglas generales y la nomenclatura es confusa en la litera-tura, pueden identificarse cuatro tipos fundamentales de regiones a las que se unen los factores de transcripción: el promotor básico, el promotor proximal, el distal y regiones estimuladoras de la transcripción (enhancers), silenciadoras (silencers) y aislantes (insulators). El «promotor básico» (core promoter) son las secuencias adyacentes al inicio de transcripción donde se une el complejo de la RNAPII. El resto de lo que se denomina promotor viene definido por si-tios de unión a factores de transcripción distintos de la RNA polimerasa II y sus proteínas asociadas (1). El promotor proximal, incluye el básico y regiones ha-cia 5’ (regiones upstream) de longitud variable pero raramente más de 2 kb, que incluyen los sitios de unión uno o varios factores de transcripción. El promotor proximal se define operativamente como las secuencias capaces de conferir ex-presión al gen de manera autónoma y regulada. Por ejemplo, un ratón transgé-nico puede expresar cualquier gen, si está bajo el control del promotor básico de un gen específico de ese tejido o tipo celular.
El promotor distal incluye una serie de secuencias de unión a factores de transcripción que pueden situarse a varios kb del inicio de transcripción. Ade-más del promotor, la expresión de los genes está regulada por proteínas que se unen a secuencias llamadas intensificadores o enhancers (que aumentan la expresión del gen), silenciadores (que lo reprimen) o aislantes (insulators). Los intensificadores típicos en animales son secuencias de 200 a 1000 pb y a ellos pueden unirse varios (a veces una docena) de proteínas que interaccio-nan directamente con el DNA (1). Se distinguen de otros elementos del pro-motor en que pueden encontrarse bastante lejos del inicio de la transcripción
FIGURA1. Esquema de las regiones reguladoras de un gen de eucariotas superiores codificante
de proteínas (transcrito por la RNA polimerasa II). Los distintos elementos (promotor básico, proximal y distal) se describen en el texto. Dependiendo del gen en concreto, el número y situación de lo sitios de unión a los factores de transcripción en el promotor proximal y distal, así como de los intensificadores o silenciadores (estos no indicados en el esquema por simplicidad) pueden variar de un gen a otro. Por convenio, los genes se numeran a partir del inicio de la transcripción,
(a veces 50 kb o más) y son activos tanto en 5’ como en posición 3’ del gen. Al igual que los elementos del promotor proximal, la mayoría de Intensifica-dores son específicos de un tipo celular y de un estadío de diferenciación de ese tejido (2).
FIGURA2. Esquema de la activación de un gen. El proceso se inica por la unión de un factor de
transcripción activador (ACT) a su secuencia de unión (SU) que recluta un complejo de remodelación de cromatina (REM) y complejos histonas acetil transferasa (HAT). La actividad de estos complejos hace accesible la cromatina al complejo TFIID, que incluye la proteína de unión a TATA y otras proteínas accesorias (proteínas TAF). Luego, el complejo Mediador (MED) forma un puente que conecta el activador con la RNA polimerasa II (Pol II) para formar el complejo de preiniciación junto con los llamados factores de transcripción generales (TFIIA, B, D, E, F y H). Cuando el complejo es ensamblado sobre el inicio de la transcripción, la RNA polimerasa II es fosforilada y la transcripción comienza. Las diferentes proteínas no están dibujadas a escala.
Los aislantes son secuencias de DNA que hacen de límite al efecto regula-dor de secuencias vecinas, bien bloqueando la acción de intensificaregula-dores o bien bloqueando el efecto represor de la heterocromatina. El ejemplo mejor conoci-do es la proteína de unión a secuencias aislantes CTCF, que actúa sobre toconoci-do por mecanismos de modificación de cromatina y que es tratado en otro capítu-lo de este libro. En la Figura 1 se muestran capítu-los principales elementos de capítu-los pro-motores de los genes de las células animales.
La transcripción se inicia por la unión de factores de transcripción a secuencias del promotor proximal y distal. Normalmente se requiere la cooperación de dos o más factores para activar un gen. La unión de estas proteínas al DNA provoca una apertura de la cromatina y reclutamiento de factores de transcripción llamados ge-néricamente co-activadores. Estos actúan acetilando histonas y demetilando citosi-nas del DNA. Por tanto, el estado transcripcional de cada gen viene regulado por el conjunto de factores de transcripción y proteínas que modifican el estado de com-pactación de la cromatina. A continuación un complejo proteica llamado Medidor actúa de puente entre los factores de transcripción y la holoenzima RNAPII (3). Por último se ensambla un complejo de preiniciación que incluye la RNAPII y los lla-mados factores generales de transcripción: TFIID (un complejo de varias proteínas que hace el contacto inicial con el DNA), TFIIA, TFFIIB, TFIIE, TFIIF y TFIIH. Estos factores posicionan a la RNAPII en el sitio de inicio de la transcripción del gen, separan las dos cadenas de DNA lo que permite el comienzo de la transcrip-ción (4). Este proceso está esquematizado en la Figura 2.
3. REDES REGULADORAS DE FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN
EN DIFERENCIACIÓN CELULAR
El mantenimiento del estado indiferenciado (o de la pluripotencia cuando se trata de células madre), así como el proceso de diferenciación, es producto de la acción de muchos factores de transcripción que intervienen de manera co-ordinada en el tiempo formando distintos complejos sobre los promotores de los genes diana que son así activados secuencialmente. Como se ha dicho en el Pun-to 2, los genes se controlan mediante combinaciones de facPun-tores de transcrip-ción que se unen a sus promotores. Este control combinatorial permite activar secuencialmente los genes necesarios para mantener la célula madre en su es-tado de autorrenovación e indiferenciada o bien para disparar el proceso de di-ferenciación hacia un linaje celular determinado. Las interrelaciones funciona-les entre factores de transcripción se ha podido evidenciar mejor en los últimos años gracias a las técnicas de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)
segui-da de hibrisegui-dación de microarrays o «chips» con las secuencias de los promoto-res de miles de genes (método conocido como ChIP-on-chip). De esta manera, disponiendo de anticuerpos para un factores de transcripción se puede conocer de manera relativamente rápida a qué promotores se unen y por tanto son pro-bablemente regulados por el factor.
Gracias a estos abordajes se han podido demostrar circuitos de retroali-mentación positiva que tienen lugar tanto en diferenciación como en el mante-nimiento del estado indiferenciado (ver Punto 4). En este circuito, un factor de transcripción activa la expresión de un segundo factor y los dos forman un com-plejo que activan otros genes diana (Figura 3A). Sólo cuando los dos primeros factores (A y B en la Figura 3A) alcanzan un nivel crítico pueden activar coor-dinadamente la expresión de otros genes siguientes en el proceso.
FIGURA3. (A) Esquema de un circuito de regulación positiva de factores de transcripción durante
un proceso de diferenciación. (B) Esquema de una red de factores de transcripción que activa genes secuencialmente en diferenciación celular. Ver texto para detalles.
La otra situación interactiva de factores de transcripción en diferenciación fue descrita hace años (originalmente aplicada a la hematopoyesis) como un «transcription factor party». En este modelo se van formando distintos com-plejos de factores de transcripción que van activando y silenciando distintos ge-nes durante la diferenciación a un linaje determinado. La analogía son los gru-pos de personas que se forman en un cocktail en los que el tema de conversa-ción va cambiando según se retiran o añaden nuevas personas al grupo (5) (Figura 3B). Este tipo de red se ha demostrado recientemente de manera clara en las células pluripotentes con varios factores de transcripción (Oct4, Sox2 y Nanog, ver Punto 4).
4. CONTROL TRANSCRIPCIONAL DEL ESTADO PLURIPOTENTE
Clásicamente se ha establecido una jerarquía de células troncales, distin-guiendo entre células totipotentes (que sería el cigoto, capaz de generar todo el organismo), pluripotentes, multipotentes y las precursoras de un solo tipo celu-lar o unipotentes. Las células pluripotentes son capaces de generar tejidos de las tres capas embrionarias (ectodermo, mesodermo y endodermo) y son las célu-las derivadas de la masa celular interna (ICM) del bcélu-lastocisto. A partir de elcélu-las se han derivado líneas de células troncales embrionarias o (nombre más acep-tado) células madre embrionarias (ES, por Embryonic Stem) de las que ya hay más de 60 líneas a disposición de los investigadores (6). Estas células pluripo-tentes han sido de gran utilidad para conocer sobre el control transcripcional de la diferenciación. Aunque no sean capaces de generar todos los tejidos, las cé-lulas ES pueden dar lugar a distintos tipos celulares dentro de la misma hoja embrionaria. Un ejemplo clásico al que nos volveremos a referir luego son las células madre hematopoyéticas.
El proceso de diferenciación implica una intensa reprogramación génica: miles de genes son activados y miles reprimidos. Por ejemplo, cuando se han comparado los transcriptomas de células ES humanas se ha encontrado que, de unos 32.000 genes estudiados, había diferencias de expresión significativas (>4 veces) en unos 5.000 genes (7). Se puede generalizar diciendo que el balance final es de represión porque el número de genes que se expresan en una célula terminalmente diferenciada suele ser menor que en la célula madre del tejido. Durante la diferenciación celular, se silencian los genes encargados de mante-ner la célula indiferenciada y en un estado proliferativo o de autorrenovación, mientras que se van induciendo los genes que codifican para las proteínas es-pecíficas del tejido correspondiente que dictan el tipo celular maduro.
La diferenciación depende de factores de transcripción que mantienen las células precursoras en un estado indiferenciado. Para que la renovación de un tejido tenga lugar, es necesario que las células madre del mismo, o células pre-cursoras que aún no están terminalmente diferenciadas, se dividan para dar otra célula precursora y una célula más diferenciada o comprometida hacia la dife-renciación. Aunque esto está controlado genéticamente, poco se sabe de los me-canismos que controlan esta división asimétrica.
Una vez que la célula esta comprometida a ser diferenciada, es decir que ya no es una célula madre, entran en acción factores de transcripción que diri-gen la diferenciación hacia un tipo celular determinado. Por tanto, en relación a la diferenciación celular se pueden distinguir dos tipos de factores: los que mantienen la pluripotencia y los que determinan la diferenciación.
5. REPROGRAMACIÓN GENÉTICA DE CÉLULAS MADURAS
HACIA CÉLULAS PLURIPOTENTES
El clonaje de la oveja Dolly demostró que factores de transcripción de los oo-citos de mamífero eran capaces de reprogramar el núcleo de una célula diferen-ciada adulta para dar lugar a una célula totipotente capaz de generar un animal (8). Por otra parte, haciendo uso de la tecnología de microrarrays se ha compara-do el transcriptoma de células diferenciadas con el de células madres embriona-rias, así como el de líneas de células ES no diferenciadas y diferenciadas en cul-tivo (normalmente con ácido retinoico). Como resultado de estos estudios se han encontrado una serie de factores de transcripción que están regulados durante el proceso de diferenciación de estas células, como Oct4, Sox 2, Nanog, Tdgf1, Utf1, Lin28, etc. La importancia de algunos de ellos como Oct2, Sox2 y Nanog para mantener el estado pluripotente y la autorrenovación de células madre se ha po-dido demostrar en estudios de sobrexpresión tras transfección de los correspon-dientes genes y de silenciamiento con siRNA [revisado en (9, 10)]. Para la ma-yoría de estos factores ya se había descrito una mayor expresión en células madre de varios tejidos, y muchos de sus genes-diana estaban relacionados con funcio-nes de relacionadas con autorrenovación y con la represión de gefuncio-nes de diferen-ciación. Por tanto parecían buenos candidatos para ser factores de transcripción capaces de no solo mantener sino inducir el estado pluripotente.
Esta hipótesis se vio confirmada gracias a los trabajos del grupo de Yama-naka, que hizo una análisis sistemático de sobreexpresión de una serie de fac-tores de transcripción mediante transducción retroviral en fibroblastos murinos,
hasta encontrar una mezcla de cuatro capaces de reprogramar un fibroblasto en una célula madre pluripotente: Oct2, Sox2, c-Myc y Klf4 (7, 11). Con los mis-mos factores se ha podido también reprogramar fibroblastos humanos (7, 12, 13) (Figura 4). Las células iPS humanas son morfológicamente indistinguibles de las células ES derivadas de las ICM y las diferencias en el perfil de expre-sión genética son pequeñas (7, 13)
Dado que uno de los factores usados (c-Myc, ver más abajo) es oncogénico, se ensayaron nuevas combinaciones de factores de transcripción y se pudo repro-ducir la reprogramación de células humanas usando otra combinación de factores que no incluían c-Myc, como la mezcla de Oct4, Sox2, Nanog y Lin28 (14) y la de Oct4, Sox y Klf4 (15), aunque en ambos casos con menor eficiencia que cuan-do se usa c-Myc [revisacuan-do en (9, 16)]. Algunos de estos factores como Myc, Klf4 y Lin28 habían sido previamente identificados como posibles candidatos a ser ge-nes «reprogramadores» comparando transcriptomas (17-19) y otros como Oct4 y Sox2 lo fueron a partir de rastreos de genotecas de siRNA para identificar genes que anulaban la capacidad de autorrenovación de células ES murinas (20).
Las células adultas diferenciadas reprogramadas a células pluripotentes con al-guna de estas combinaciones de genes reciben el nombre de células iPS (Induced Pluripotent Stem). Esta pluripotencia se puede evidenciar de manera inequívoca
FIGURA4. Método de reprogramación genética de una células diferenciada adulta (fibroblasto)
para dar una células pluripotente inducida (iPS), capaz de diferenciarse a células de las tres hojas embrionarias. A la izquierda se indican en cajas los diversas mezclas de factores de
por la expresión de una serie de marcadores típicos de células ES y, sobre todo, en el caso de las células iPS murinas, por su capacidad de generar ratones tras inyec-ción en blastocistos y subsiguientes cruces de la progenie. Cuando se comparan los transcriptomas de estas células iPS humanas con el de los fibroblastos de partida, se encuentran diferencias significativas en la expresión de más de 5000 genes, lo que da idea de la profunda reprogramación genética conseguida (7).
TABLA1. Factores de transcripción implicados en la generación de células iPS [modificado
de (9)] B-HLH-LZ: dominio basico-hélice-lazo-hélice-cremallera de leucina
Proteína Dominio de
unión a DNA Expresión Otras características
Oct4 POU Oocitos, ICM, células ES Necesario para la pluripotencia de las células ES. Imprescindible para para la reprogramación Sox2 HMG Expresión en oocitos y Necesario para la pluripotencia de las células
blastocistos y otros tejidos ES. Imprescindible para la reprogramación embrionarios. pero puede ser sustituido por otros genes
de la familia Sox con menor eficiencia Nanog Homeodominio Expresión en mórula, ICN Necesario para la pluripotencia de las células
y células ES. No ES. No imprescindible para la reprogramación imprescindible para
la reprogramación.
Klf4 Krüppel En casi todos los tejidos, Implicado en la diferenciación, apoptosis siendo mayor en médula y ciclo celular. No imprescindible para ósea, intestino, piel la reprogramación. Puede ser sustituido
y células ES por Klf2
Lin28 Dominio de Oocitos, blastocisto, Regula miRNAs. No imprescindible para unión a RNA hueso, hígado y gónadas la reprogramación
del adulto
Myc B-HLH-LZ Casi todos los tejidos, Multiples actividades biológicas. sobre todo en las células Regula miles de genes. No
en proliferación. imprescindible para la reprogramación
Las principales características de estos factores de transcripción se resumen en la Tabla 1. Además de los seis genes usados en reprogramación y que anali-zaremos con más detalle, se han identificado otros factores implicados en plu-ripotencia aunque no son capaces de reprogramar células diferenciadas: Sall4,
Dax1, Essrb, Tbx3, Tcl1, Rif1, Nac1, Zfp281, Stat3, etc. Es esperable que en los próximos años se descubran otros factores de transcripción capaces de re-programar. A continuación se repasan las principales características de estos seis factores de transcripción usados (hasta ahora) en la obtención de células pluri-potentes, y que por tanto son responsables del mantenimiento del estado de plu-ripotencia y autorrenovación de células madre.
6. FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN IMPLICADOS EN EL
MANTENIMIENTO DEL ESTADO INDIFERENCIADO
El factor Klf4 (Kruppel-like factor 4, tambien llamado Gklf o Gut-enriched Kruppel-like factor) pertenece a una familia de factores de transcripción con un dominio de tres dedos de zinc del tipo Cys2/His2. El nombre proviene de su or-tólogo en Drosophila. Otro miembro de la familia ensayado (Klf2) es igual-mente eficiente en la función de reprogramación. El mecanismo por el que Klf4 participa en la reprogramación no está aclarado. Puesto que el supresor tumo-ral p53 reprime Nanog, se ha postulado que Klf4 podría bloquear la parada pro-liferativa debida a p53 durante la reprogramación a células pluripotentes (21, 22). Al igual que Nanog, c-Myc y Lin28, el factor Klf4 no es imprescindible para la reprogramación de células humanas y puede ser sustituido por otros ge-nes de la familia como Klf2 y Klf5 (23).
EL factor Lin28 no es un factor de transcripción, sino que es una proteína con un dominio de unión a RNA. Recientemente se ha demostrado que Lin28 es un regulador negativo de la expresión de los miRNA al bloquear el procesa-miento de pre-miRNAs. Los miRNAs (micro-RNAs) son cortos RNAs no co-dificantes (de aproximadamente 22 nt) que reprimen la expresión de otros ge-nes mediante un mecanismo antisentido a nivel de las regioge-nes no traducidas 3’ de los mRNA (24). Cada miRNA en el genoma humano es capaz de silenciar un conjunto de genes diana, y entre ellos hay genes importantes para el des-arrollo y la diferenciación (25). Se estima que hay 500-1000 miRNAs en el ge-noma humano y por tanto una buena parte de los genes está sometida a regula-ción negativa por algún miRNA. Por tanto se cree que Lin28 revierte el efecto diferenciador de los miRNAs
El factor Oct4 (abreviación de Octamer 4 y también llamado Oct3/4 y Pou5f1) es un factor de transcripción con homeodominio que pertenece a la fa-milia de proteínas POU. Oct4, junto con Sox2, es el único factor necesario para la reprogramación de células adultas en pluripotentes, y también se ha
demos-trado su importancia para mantener la capacidad de pluripotencia y autorreno-vación de las células ES. El primer evento de diferenciación ocurre cuando las células de la capa externa de la mórula se diferencian hacia trofoectodermo for-mando un blastocisto. El trofoectodermo formará luego la placenta, mientras que las células del interior del blastocisto (ICM) dan lugar a todas las células del adulto. La importancia de Oct4 en la diferenciación celular se hace evidente en los embriones de ratón Oct4-/-, que no pueden formar siquiera la ICM y el
em-brión se diferencia a trofoectodermo (26)
Oct4 se encuentra unido a un gran número de genes diana implicados en el mantenimiento de la pluripotencia. La actividad biológica de Oct4 depende en gran medida de sus niveles de expresión. Así, una reducción de Oct4 en células ES humanas conduce a la inducción de marcadores de mesoderno y endodermo, mientras que niveles altos de Oct4 inducen marcadores de endodermo (27). Esto ilustra la complejidad transcripcional del proceso, sugiriendo que a partir de un determinado nivel Oct4 forma parte de nuevos complejos que regulan nuevos genes. Por tanto la situación evoca de nuevo la “fiesta de cocktail” de los facto-res de transcripción (5).
Nanog es un factor de transcripción cuyo dominio de unión a DNA es un homeodominio, al igual que Oct4. Nanog fue identificado por su capacidad de mantener células ES en la ausencia del factor de crecimiento LIF (Leukemia In-hibitory Factor, que de otra manera es necesario para mantener estas células cre-ciendo) (28). La sobreexpresión de Nanog aumenta la capacidad de autorreno-vación y del mantenimiento de un estado indiferenciado de la célula. Consistentemente células ES deficientes en Nanog se diferencian hacia endo-dermo (18, 28).
El factor Sox2 es un miembro de la familia de factores de transcripción Sox (SRY-related HMG box), caracterizados por tener un dominio de unión a DNA del tipo HMG (High Mobility Group). Experimentos de inactivación génica en ratones demuestran que Sox2 es necesario para el desarrollo embrionario y para prevenir la diferenciación de ESC (29). La reducción de la expresión de Sox2 en células ES humanas conduce a la pérdida del estado pluripotente.
El factor c-Myc fue el primer factor de transcripción descubierto (en 1979) y está activado en un 30-50% de tumores humanos (30). c-Myc es una prote-ína con dominio B-HLH-LZ (región básica-hélice lazo hélice-cremallera de leu-cina). La cremallera de leucinas en la segunda hélice le sirve para dimerizar con la proteína Max. Este heterodímero es la forma transcripcionalmente acti-va de c-Myc y se une a una secuencia de seis bases que recibe el nombre de
Secuencia E (E Box), presente en muchos genes. Estudios de expresión a ni-vel genómico y de ChIP-on-chip han reni-velado que c-Myc regula la expresión de más de mil genes y que aparece unido al promotor del 10% de los genes humanos, murinos y de Drosophila, lo que supone cerca de 3000 genes en el genoma humano (31-33). Esto incluye también células ES, en las que se evi-dencia que Myc tiene un perfil diferente al de Nango, Sox y Kfl4 (34). Ade-más regula la expresión de varios miRNAs (35, 36). Este masivo efecto trans-cripcional es debido, al menos en parte, a la capacidad que tiene c-Myc de inducir algunas histona acetil transferasas y demetilasas, induciendo cambios
FIGURA 5. (A) La expresión de c-Myc suele reprimirse cuando la célula se diferencia terminalmente, y la expresión forzada de c-Myc bloquea la diferenciación celular inducida por citoquinas y agentes químicos en células en cultivo. (B) Regresión tumoral al silenciar o desactivar c-Myc en varios modelos de tumorogénesis. La regresión es debida a la re-diferenciación de la
globales en la estructura de la cromatina (37, 38). c-Myc tiene variados efec-tos biológicos, que incluyen la estimulación del ciclo celular y replicación, in-mortalización y un aumento en la síntesis de ribosomas, proteínas y mitocon-drias (con el consiguiente aumento del tamaño celular), inmortalización, etc. Uno de sus efectos es la inhibición de la diferenciación celular en líneas celu-lares de distintos linajes que pueden ser diferenciadas en cultivo (Figura 5A) [revisado en (39, 40)]. Por ejemplo, nuestro laboratorio lo ha demostrado en el caso de diferenciación eritroide (41, 42) y neuronal (43). c-Myc es a su vez un gen de expresión muy regulada en diferenciación, siendo sus niveles altos en células proliferantes y baja en células diferenciadas terminalmente, lo que es consistente con su efecto inhibidor de la diferenciación en modelos celulares en cultivo. En vivo, c-Myc parece tener el paradójico efecto de aumentar la di-ferenciación de algunos tejidos, como el epitelial o el linfoide, pero esto es de-bido a que induce una amplificación de la población de células precursoras [re-visado en (44)]. Aunque c-Myc forma parte del conjunto de cuatro factores de transcripción usados en la reprogramación de células maduras a células iPS, no es imprescindible para ello, aunque aumenta la eficiencia de formación de cé-lulas iPS de dos a diez veces (7, 11, 45, 46).
La importancia de la inhibición de la diferenciación como mecanismos on-cogénico de c-Myc viene ilustrado por los experimentos en ratones transgéni-cos con genes c-Myc inducible por tetraciclina o activable con tamoxifeno. De-pendiendo del promotor proximal usado (ver Punto 2) el c-Myc se puede expresar en distintos tejidos y así se obtienen linfomas, hepatomas, osteosarco-mas, leucemias mieloides y papilomas/hiperplasia de piel. Cuando se inactiva o silencia c-Myc estos tumores remiten, y esta remisión en una mayoría de tu-mores se debe a la re-diferenciación de las células previamente indiferenciadas y con altos niveles de c-Myc (47) (Figura 5B). Esta función de c-Myc como an-tidiferenciador encaja con su capacidad de inducir células iPS, aunque los me-canismos por los que colabora tan eficientemente con Oct4, Sox2 y Klf4 no es-tán aclarados.
7. INTERACCIÓN FUNCIONAL ENTRE FACTORES DE
TRANSCRIPCIÓN RESPONSABLES DE LA PLURIPOTENCIA
En las células ES de ratón y humanas se han hecho estudios de ChIP-on-chip (17, 48) o bien de secuenciación directa del DNA precipitado (49) para es-tudiar las dianas transcripcionales de los factores de transcripción «reprogra-madores» descritos arriba. Estos estudios han revelado en primer lugar que los
tres factores (Oct4, Sox2 y Nanog) se encuentran unidos en un complejo a sus propios promotores, formando un circuito de autorregulación positiva que man-tiene la pluripotencia de la célula (18, 50). Además se ha demostrado que estos tres factores o combinaciones de dos de ellos se unen a los promotores de otros cientos de genes. Por tanto, esos factores de transcripción no controlan sus ge-nes diana independientemente sino que trabajan de manera coordinada para man-tener el programa transcripcional requerido para la pluripotencia. Además, cuan-do se analiza la expresión de mRNA de los genes a los que se unen Oct4, Sox y Nanog, se encuentra que aproximadamente la mitad son genes transcripcio-nalmente activos. Sin embargo la otra mitad son genes inactivos y la mayoría de ellos son genes también regulados por proteínas del grupo Polycomb (prote-ínas PcG) (51). Las prote(prote-ínas PcG forman varios tipos de complejos que repri-men la expresión génica (PRC, Polycomb Repressive Complexes). Estos com-plejos son responsables del silenciamiento de genes a través de mecanismos epigenéticos, y principalmente la metilación de histonas, que llevan a la cro-matina aun estado silente (52). La metilación y acetilación de histonas se
abor-FIGURA6. La reprogramacion por factores de transcripción para generar iPSC es un proceso
secuencial. En la parte superior se ilustra el cambio fenotípico desde fibroblastos maduros a células pluripotentes inducidas (iPSC), que ocurre en una plazo de tres semanas y con una frecuencia muy baja En la parte inferior se muestra los cambios a nivel de cromatina, desde un estado silente, con alto grado de compactación de histonas y metilación de citosinas, hasta un estado de cromatina menos compactada y que ha perdido la metilación en citosinas, mientras que muestra metilación y acetilación de algunas histonas, que permite la transcripción de los genes de mantenimiento del
da en detalle en otro capítulo de este libro. Típicamente, los complejos de PcG son responsables de la trimetilación de la lisina 27 de la histona H3 (H3K27me3), y esta metilación está ausente en fibroblastos y reaparece en cé-lulas iPS (46, 53) (Figura 6).
Todos los estudios realizados hasta ahora coinciden en concluir que la programación con estos factores de transcripción es un proceso gradual, que re-quiere la expresión de dichos factores durante dos semanas y finalmente ocurre con una frecuencia baja: menos del 0.1% de los fibroblastos adultos. Esto indi-ca que los genes han de irse silenciado o activando en un proceso que impliindi-ca cambios a nivel de cromatina: acetilación/deacetilación de histonas, metila-cion/demetilación de histonas y metilación/demetilación de citosinas del DNA
8. CONTROL TRANSCRIPCIONAL DE LA HEMATOPOIESIS
Uno de los modelos más estudiados y más interesantes por su diversidad y su impacto en la enfermedad es la hematopoyesis. Es un complejo proceso con-trolado por mecanismos de señalización extracelular e intracelular en el que un solo tipo de células madre hematopoyéticas (HSC, Hematopoietic Stem Cells) es capaz de generar hasta 10 tipos de células diferenciadas, muy diferentes en-tre ellas en tamaño, morfología número y funciones (54). Estos mecanismos nor-malmente activan reguladores transcripcionales que a su vez establecen un pro-grama de diferenciación (55-57). Las HSC van generando una serie de precursores intermedios hacia cada uno de los linajes hematopoyéticos. Aunque aún se debate sobre la identidad de los precursores tempranos, un modelo muy aceptado describe que la HSC se diferencia a un progenitor de linfocitos (CLP, Common Lymphoid Progenitor) o a una célula madre del linaje mieloide (CMP, Common Myeloid Progenitor) que se diferencia a su vez da lugar a progenito-res megacariocítico-eritroide y granulocitos-macrófagos (57). Todas estas célu-las progenitoras intermedias normalmente tienen una vida corta y sufren una rá-pida proliferación antes de dar las formas terminalmente diferenciadas. Este balance entre proliferación y diferenciación está finamente regulado por facto-res de transcripción específicos de cada linaje y estadío. Toda leucemia aguda supone la acumulación de células que tienen la diferenciación detenida en uno u otro estadío (este es el criterio usado para la clasificación de leucemias mie-loides). Es revelador que la mayoría de los factores de transcripción que han de-mostrado ser cruciales para la hematopoyesis han sido previamente identifica-dos como oncogenes en leucemias y linfomas [revisado en (58-60) ]. El papel de estos genes en la hematopoyesis viene confirmado experimentalmente en
mo-delos de ratones deficientes en los correspondientes genes. En estos momo-delos se ha comprobado que la deficiencia en estos genes resulta en bloqueo en la dife-renciación de distintos linajes hematopoyéticos o incluso en la deficiencia de hematopoyesis aberraciones de la hematopoyesis. Los linajes que resultan afec-tados por la mutación en los distintos factores se resumen en la Figura 7.
No es por tanto sorprendente el dato de que la deregulación y/o mutación de estos factores de transcripción conduce a leucemias y linfomas. En efecto, muchos de ellos se han encontrado alterados (mutados, translocados) con
ma-FIGURA7. Esquema de la hematopoyesis indicando los genes de factores de transcripción que
aparecen alterados en leucemias y que son necesarios para la correcta diferenciación hacia los linajes celulares indicados, según los resultados observados en ratones deficientes para el correspondiente factor. Los distintos tipos celulares se indican en cursivas: CLP. Progenitor comun linfoide; CMP, progenitor común mieloide; MEP: progenitor megacariocítico-eritroide; GMP:
yor o menor frecuencia en leucemias tanto de estirpe mieloide como linfoide. El mecanismo más frecuente de activación es el de la translocación cromosó-mica, dando lugar a proteína de fusión con nuevas propiedades. Particularmen-te frecuenParticularmen-te es la translocación de RUNX1/AML1 en leucemia mieloide. La ma-yor parte de ellos son reguladores negativos de la transcripción mientras que sus versiones mutadas pierden su capacidad de reprimir genes (por ej., AML1 y MLL). En otros casos como PML-RARα, la proteína de fusión, aunque sí une al DNA, pierde su actividad transactivadora y no es capaz de activar genes de diferenciación (de la estirpe granulocítica en este caso).
TABLA2. Factores de transcripción y coactivadores transcripcionales implicados en hematopoyesis y leucemia. Se relacionan sólo los factores de transcripción implicados en hematopoyesis y que aparecen mutados en leucemias o linfomas humanos. LMA, leucemia mieloide aguda; LLA-B, leucemia linfoide aguda de células B; LLA-T, leucemia linfoide aguda de
células T; HAT, histona acetiltransferasa
Factor Dominio de Leucemia o linfoma
unión a DNA prevalente Mecanismo de activación
C/EBPα B-LZ LMA Mutación
c-Myc B-HLH-LZ Linfoma de Burkitt Translocación, mutación y sobreexpresión
E2A/TCF3 B-HLH LLA-B Translocación
EVI1 Dedos de Zn LMA Translocación
ERG Dedos de Zn LMA, LLA Translocación
GATA1 Dedos de Zn Síndrome mieloproliferativo Mutación transitorio, leucemia
megacarioblástica aguda
MLL Ganchos AT LMA, LLA-B Translocación
PAX5 Paired box LLA Mutación
PU.1/SPI-1 Dominio ETS LMA Silenciamiento RARα Dedos de Zn LMA (tipo M3) Translocación RUNX1/AML1 Runt
homology LMA Translocación y mutación
SCL/TAL1 B-HLH LLA-T Translocación
CBP No tiene (HAT) LMA Translocación
En la Tabla 2 se indican algunos de los factores de transcripción que apa-recen implicados a la vez en leucemia y en el control de la hematopoyesis y de hecho muchos fueron originalmente identificados como oncogenes en leucemias y linfomas. En ella se incluyen dos histona acetil transferasas (CBP y p300), también activadas en algunas leucemias.
Los factores de transcripción hematopoyéticos también ofrecen ejemplos de cambio de linaje o «transdiferenciación». Así por ejemplo a) la sobreexpresión de C/EBPαinduce la transdiferenciación de precursores linfoides B y T en macrófa-gos (61, 62); b) la coexpresión de PU.1 y C/EBPαes capaz de diferenciar células no hematopoyéticas como fibroblastos en macrófagos (63); c) GATA1 convierte pro-genitores linfoides y mielomonocíticos en células megacariocíticas/eritroides (64); y d) la supresión de Pax5 en células pro-B (precursoras de linfocitos B) las hace di-ferenciarse hacia osteoclastos y granulocitos (65). La diferenciación de precursores hematopoyéticos también ha permitido demostrar en un sistema complejo de dife-renciación, la importancia de los niveles relativos de los distintos factores de trans-cripción y de su expresión en el tiempo. Así, la sobreexpresión de GATA1 convierte células mielomonocíticas en células megacariocíticas/eritroides, mientras que la so-breexpresión de PU.1 convierte estas células en mieloides (66). Por otra parte, la sobreexpresión secuencial de C/EBPαy luego de GATA2 en precursores linfoides en cultivo hace que cambien e linaje se diferencien exclusivamente a eosinófilos, pero si se invierte el orden el que se induce la sobreexpresión de estos factores de transcripción (primero GATA2 y luego C/EBPα) los precursores linfoides se dife-rencian a precursores de basófilos y de mastocitos (67).
La diferenciación de las células precursoras hematopoyéticas demuestra, al igual que en el caso de las células pluripotentes embrionarias, que una serie re-lativamente pequeña de factores de transcripción puede disparar el proceso. Por otra parte, ilustra bien la relación entre diferenciación y cáncer. En efecto, en el cáncer se ve alterado no sólo el control de la proliferación sino también el de la diferenciación, y el papel fisiológico relevante de muchos proto-oncogenes es precisamente el control de la diferenciación celular.
AGRADECIMIENTOS
La investigación en el laboratorio del autor se ha llevado a cabo gracias a los proyectos CICYT SAF05-00461, SAF08-01581 e ISCIII-RETIC RD06/0020. Agradezco a la Dra. M. Dolores Delgado los comentarios sobre el manuscrito.
ABREVIATURAS
ES, Embryonic Stem; HSC, Hematopietic Stem Cell; ICM, Internal Cell Mass; iPS, Induced Pluripotent; ChIP, chromatin Immunoprecipitation.
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