Fungiplex Aspergillus IVD PCR Kit

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Instrucciones de uso

Fungiplex Aspergillus IVD PCR Kit

Para la identificación de especies de Aspergillus directamente a partir de sangre con ácido edético, plasma con ácido edético, suero o líquido de lavado

broncoalveolar

Los productos de CARE están diseñados para proporcionar a nuestros clientes de todo el mundo consumibles, accesorios y kits exclusivos de alta calidad.

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1 Uso previsto 3

2 Descripción del producto 3

2.1 Componentes del kit 5

3 Inspección, almacenamiento y estabilidad 7

3.1 Inspección en el momento de llegada 7 3.2 Temperatura de almacenamiento 7 3.3 Área adecuada de almacenamiento 7

3.4 Estabilidad 7

4 Información de riesgo y seguridad 8

4.1 Precauciones generales 8

4.2 Riesgos biológicos 9

4.3 Limitaciones del procedimiento 9

5 Materiales necesarios pero no suministrados 10

5.1 Equipo general 10

5.2 Instrumental para PCR en tiempo real 11

6 Obtención de muestras y extracción de ADN 12

6.1 Protocolos de extracción utilizados en la validación 12

7 Procedimiento de análisis 13

7.1 Configuración de la PCR 13

8 Condiciones del termociclador 15

8.1 ABI 7500 15

8.2 Rotor-Gene Q 17

8.3 CFX96 19

8.4 QuantStudio 5 20

8.5 Protocolo para compensar el color con el LightCycler 480 II 21 8.6 Protocolo para la PCR con el LightCycler 480 II 24

8.7 StepOnePlus 25

9 Interpretación de los resultados 27

9.1 Control interno 27

9.2 Controles positivos y negativos 27 9.3 Muestras del paciente/sin determinar 27

10 Características de rendimiento 29

11 Eliminación 30

12 Explicación de los símbolos 31

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1 Uso previsto

El análisis Fungiplex Aspergillus Real- Time PCR es un análisis de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) múltiple de diagnóstico in vitro (IVD, por sus siglas en inglés) para la detección cualitativa de ADN de Aspergillus extraído a partir de sangre con ácido edético, plasma con ácido edético, suero o líquido de lavado broncoalveolar (BAL) obtenido de pacientes considerados en riesgo de enfermedad fúngica invasora (EFI). El análisis lo debe utilizar personal de laboratorio calificado como una ayuda a la hora de diagnosticar aspergilosis invasora, en concreto la ocasionada por Aspergillus spp. y A. terreus. Los resultados de este análisis no deben usarse como la única base para tomar decisiones sobre el diagnóstico o el tratamiento de los pacientes.

2 Descripción del producto

Enfermedad fúngica invasora

Las enfermedades fúngicas invasoras (EFI) están adquiriendo cada vez más importancia por considerárselas causa de aparición de infecciones potencialmente mortales y representan una causa significativa de morbimortalidad en pacientes con tratamientos inmunodepresores, como los prescritos en los trasplantes de vísceras macizas (TVM) y los trasplantes de hemocitoblastos (TH), y en pacientes con enfermedades que deterioran el sistema inmunitario, como el sida.

La incidencia de infecciones humanas ocasionadas por especies micóticas se ha incrementado rápidamente en las dos décadas pasadas debido a que las poblaciones con inmunodeficiencia están aumentando como resultado de los tratamientos cada vez más eficientes. De estas especies infecciosas, los géneros Aspergillus y Candida son los más predominantes y dan cuenta del 70 al 90 % de todas las enfermedades fúngicas invasoras comunicadas en función de la población de pacientes1 (consulte Tabla 1).

Tabla 1 Proporción de infecciones fúngicas invasivas comunicadas1

Aspergilosis invasora Candidiasis invasora Otra

TH 43,0 % 28,0 % 29,0 %

TVM 18,8 % 52,9 % 28,3 %

NH 33-69 % 13-44 %

-UCI 11,0 % 79,0 % 10,0 %

TH: trasplante de hemocitoblastos TVM: trasplante de vísceras macizas NH: neoplasia hemática

UCI: unidad de cuidados intensivos

Aspergillus

Aspergillus spp. es un género de hongos oportunistas que ocasiona alergias e infecciones invasoras.

Abarca cerca de 175 especies, de las cuales solo un número reducido se ha asociado a enfermedades humanas2_{. La prevalencia de cada una de las especies dentro del género está sujeta a variaciones}

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Diagnóstico

Diagnosticar una enfermedad fúngica invasora plantea obstáculos debido a la gran variación en la manera en que se definen los casos en las fases iniciales del diagnóstico. Los criterios para identificar la EFI establecidos por la Organización europea para la investigación en el tratamiento del cáncer y el Grupo de estudio de micosis (EORTC/MSG) permiten una definición mejor y más homogénea5_{. En la} actualidad, el diagnóstico depende de la presencia de factores de riesgo (características del anfitrión), la microbiología, la serología (análisis con galactomanano [GM] y β-D glucano) y diversos hallazgos radiológicos6_{. El uso de la profilaxis y los tratamientos empíricos sigue siendo generalizado, aunque} está aumentando el uso de biomarcadores para orientar la gestión antimicótica7_.

El interés por el diagnóstico de la enfermedad fúngica invasora basado en la PCR ha aumentado debido a que proporciona mayor rapidez, sensibilidad y especificidad que los métodos existentes8_{. Un} metanálisis de los métodos con la PCR, aplicado a la detección de la aspergilosis invasora en suero y plasma sanguíneos, indicó que el uso de una sola PCR positiva dio como resultado una sensibilidad y especificidad global de 84 % y 76 % respectivamente, mientras que un requisito de dos muestras positivas produjo 64 % y 95 % de sensibilidad y especificidad9_{. Un metanálisis del uso combinado de la} PCR y el GM en una estrategia de supervisión de biomarcadores para pacientes en alto riesgo de aspergilosis invasora (IA, por sus siglas en inglés) indicó que un único resultado positivo en cualquiera de los análisis dio una sensibilidad de 99 %10_{. Al usar tanto la PCR como el GM, la ausencia de un} resultado positivo proporcionó un valor predictivo negativo de 100 %, mientras que dos resultados positivos en el análisis dieron una señal clara de infección activa y proporcionaron un valor predictivo positivo de 88 %10_.

Análisis Fungiplex Aspergillus Real-Time PCR

El análisis Fungiplex Aspergillus Real- Time PCR es un análisis de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) múltiple de diagnóstico in vitro (IVD, por sus siglas en inglés) para la detección cualitativa del ADN de Aspergillus extraído a partir de sangre con ácido edético, plasma con ácido edético, suero o líquido de lavado broncoalveolar (BAL). El análisis se ha diseñado para su uso en varios equipos frecuentes de laboratorio para PCR y puede procesar hasta 100 muestras desde el momento posterior a la extracción hasta la obtención del resultado en menos de dos horas. Las especies detectadas y su formato de notificación respectivo se detallan en la Tabla 2. La rápida y fiable detección que proporciona este análisis puede contribuir a realizar un diagnóstico más temprano, mientras que la fabricación sometida a control de calidad garantiza que el usuario puede confiar plenamente en la calidad y la reproducibilidad del análisis.

Tabla 2 Patógenos micóticos identificados con el análisis Fungiplex Aspergillus Real-Time PCR

Objetivo notificado Especies detectadas

Aspergillus spp. A. fumigatus

A. flavus A. niger

A. terreus A. terreus

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2. M. Richardson, C. Lass-Florl, Clin. Microbiol. Infect., 2008, 14, 15-24 3. W. J. Steinbach et al., Clin. Infect. Dis., 2004, 39, 192-198

4. M. A. Pfaller, P. G. Pappas, J. R. Wingard, Clin. Infect. Dis., 2006, 43, Suppl. 1: S3-S14 5. B. De Pauw et al. EORTC/MSG Cooperative group, Clin. Infect. Dis., 2008, 46, 1813-1821 6. T. F. Patterson et al., Clin. Infect. Dis., 2016, 63, e1-e60

7. J. A. Maertens et al., J. Antimicrob. Chemother., 2016, 71, Suppl 2: ii23–ii29 8. T. K. Kourkoumpetis et al., Clin. Infect. Dis., 2012, 54, 1322-1331

9. M. Aravinitis et al., J. Clin. Microbiol., 2014, 52, 3731–3742 10. M. Aravinitis et al., Clin. Infect. Dis., 2015, 61, 1263-72

2.1 Componentes del kit

Los reactivos se suministran en cantidades que permiten realizar 100 análisis.

Fungiplex Aspergillus PCR Kit

Reactivo Volumen por

tubo Cantidad de tubos Color de la tapa Reacciones por tubo MM para PCR 1,2 mL 1 Naranja 100 MM de Aspergillus 120 µL 1 Violeta 100 Agua de grado PCR 800 µL 1 Blanco 100

Fungiplex Aspergillus Control Kit

Reactivo Volumen por tubo Cantidad de tubos Color de la tapa

Control interno 135 µL 3 Rojo

Control positivo Aspergillus 60 µL 3 Verde

Control negativo 240 µL 3 Blanco

Fungiplex Aspergillus Color Compensation Kit: para su uso con el LightCycler 480 II únicamente

Reactivo Volumen por tubo Cantidad de tubos Color de la tapa

Agua de grado PCR 800 µL 1 Blanco

Control interno 135 µL 1 Rojo

MM para PCR 1,2 mL 1 Naranja

MM de Aspergillus spp. 40 µL 1 Violeta

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Plásmido de Aspergillus spp. 180 µL 1 Rojo

Plásmido de Aspergillus terreus 180 µL 1 Rojo

Información para pedidos

Producto Número de referencia

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3 Inspección, almacenamiento y estabilidad

3.1 Inspección en el momento de llegada

Verifique el Fungiplex Aspergillus IVD PCR Kit a su llegada. Si el paquete está dañado, no utilice el kit. Además, todos los reactivos del Fungiplex Aspergillus IVD PCR Kit se envían congelados y deben llegar congelados. Si los reactivos no están congelados cuando se reciban o si los tubos se han dañado durante el envío, póngase en contacto con Bruker Daltonik GmbH para recibir asistencia.

3.2 Temperatura de almacenamiento

–25 °C

–15 °C El Fungiplex Aspergillus IVD PCR Kit se envía con hielo seco y al recibirse debe almacenarse dentro de este intervalo recomendado de temperatura.

3.3 Área adecuada de almacenamiento

La caja interna de reactivos con el nombre “Fungiplex Aspergillus PCR Kit” debe almacenarse en un laboratorio sin amplicones.

La caja interna de reactivos con el nombre “Fungiplex Aspergillus Control Kit”, que incluye un control interno y controles positivo y negativo para el análisis, debe almacenarse en el área del centro donde se añada la plantilla del ADN o de la muestra.

3.4 Estabilidad

Se ha puesto de manifiesto que el rendimiento del análisis Fungiplex Aspergillus Real-Time PCR no se ve afectado si se utiliza para más de 10 ciclos de congelación/descongelación.

Se han validado todos los reactivos incluidos en el Fungiplex Aspergillus IVD PCR Kit para utilizarlos antes de la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del kit y deben utilizarse dentro de este plazo.

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4 Información de riesgo y seguridad

Durante la fabricación del Fungiplex Aspergillus IVD PCR Kit no se utilizan sustancias peligrosas. La composición de todos los reactivos del kit no supone un riesgo específico ni para el usuario ni su propiedad.

Es posible que sea necesario usar sustancias químicas y materiales adicionales en los procedimientos descritos en estas Instrucciones de uso. Lea con atención las advertencias, instrucciones o las Hojas de datos de seguridad del material suministradas por el proveedor y siga las normas generales de seguridad a la hora de manipular sustancias químicas, materiales biológicos peligrosos o de otro tipo.

4.1 Precauciones generales

l El análisis Fungiplex Aspergillus Real-Time PCR es para uso de carácter diagnóstico in vitro. l Este análisis solo debe utilizarse con las plataformas de PCR para las cuales se haya validado

el proceso.

l Un profesional formado debe interpretar los resultados que genere el análisis Fungiplex

Aspergillus Real- Time PCR junto con otros análisis de valor diagnóstico y la forma de presentación clínica.

l El procedimiento del análisis debe realizarse tal como se describe en estas Instrucciones de

uso. Cualquier desvío de los protocolos descritos puede dar lugar a un fallo del análisis o generar resultados erróneos.

l Este análisis es para su uso con ADN extraído a partir de sangre con ácido edético, plasma con

ácido edético, suero o líquido de lavado broncoalveolar (BAL).

l Deben adoptarse precauciones estándar y seguirse las directrices del centro al manipular las

muestras.

l Las concentraciones bajas de ADN pueden ser inestables si se almacenan durante periodos

prolongados. Bruker aconseja reducir al mínimo el tiempo de almacenamiento de la muestra antes de analizarla.

l No utilice los reactivos después de la fecha de caducidad que indica su envase. l No mezcle reactivos de distintos tubos o kits, incluso si son del mismo lote. l No sustituya reactivos de diferentes fabricantes.

l Tome precauciones para preservar la pureza de los reactivos del kit. Evite la contaminación de

los controles positivos y las muestras; para ello, siga las prácticas de laboratorio recomendadas y organice y aísle el flujo de trabajo de la forma adecuada.

l Asegúrese de que ninguno de los demás consumibles necesarios contiene

desoxirribonucleasa ni ribonucleasa.

l Utilice ropa de protección y guantes desechables cuando manipule los reactivos del kit. l No utilice los reactivos del kit si la etiqueta está rota cuando reciba el producto.

l No coma, beba ni fume en las áreas en que se manipulan las muestras o los reactivos del kit. l Elimine los reactivos sin utilizar y los residuos conforme a la normativa nacional, provincial y

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4.2 Riesgos biológicos

El análisis Fungiplex Aspergillus Real- Time PCR implica trabajar con material biológico potencialmente infeccioso y peligroso. El personal que trabaje con estos sistemas es responsable de leer y cumplir con todas las precauciones de higiene y seguridad necesarias.

Es muy importante llevar en todo momento equipo de protección individual adecuado: una bata de laboratorio, guantes de protección y gafas de seguridad como mínimo.

4.3 Limitaciones del procedimiento

l Este análisis es cualitativo y no proporciona datos cuantitativos sobre ninguno de los

microorganismos detectados.

l Pueden obtenerse resultados positivos falsos procedentes de la contaminación externa de la

muestra original o la contaminación durante la configuración de la PCR.

l Todos los resultados generados en este análisis deben ser interpretados por un profesional

sanitario con la formación adecuada junto con otros análisis de valor diagnóstico y la forma de presentación clínica.

l La obtención de resultados positivos no descarta una infección simultánea debida a otros

microorganismos no detectados en este análisis.

l La eficacia de la extracción puede afectar a los resultados y puede dar lugar a resultados

negativos falsos.

l Los datos preliminares indican que el congelamiento y el almacenamiento prolongado pueden

afectar a la estabilidad del ADN extraído. Por lo tanto, se recomienda procesar las muestras tan rápido como sea posible tras obtenerlas.

l Se podría producir un resultado positivo para Aspergillus spp. si el agente infeccioso pertenece

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5 Materiales necesarios pero no suministrados

5.1 Equipo general

Equipo

l Plataforma recomendada para la extracción de ácido nucleico l Instrumento termociclador en tiempo real validado

l Campana de clase II o estación para PCR l Agitador vórtex

l Minicentrifugadora

l Centrifugadora capaz de procesar microplacas (recomendada) l Nevera (de 2 °C a 8 °C) y congeladores (de –25 °C a –15 °C) l Micropipetas para volúmenes desde 1 µL hasta 1000 µL Reactivos

l Reactivos para extracción

l Control positivo para extracción (recomendado; p. ej., muestra positiva caracterizada

previamente)

l Control negativo para extracción (recomendado; p. ej., agua sin nucleasa) Productos consumibles

l Material de plástico adecuado sin desoxirribonucleasa o ribonucleasa para la preparación de la

PCR

l Puntas de pipeta sin desoxirribonucleasa o ribonucleasa l Guantes desechables, sin talco

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5.2 Instrumental para PCR en tiempo real

El análisis Fungiplex Aspergillus Real-Time PCR se ha validado en varios instrumentos para PCR en tiempo real. En la 5.2 se incluyen los instrumentos validados y una lista de consumibles utilizados durante los estudios de verificación y validación.

Tabla 3 Detalles específicos del instrumental para PCR en tiempo real Fabricante del instrumental para PCR en tiempo real Modelo de la plataforma para PCR en tiempo real

Versión del software del instrumento de PCR en tiempo real

Consumibles validados

Applied Biosystems

ABI® 7500 Fast 2.3 MicroAmp® Fast Optical 96-Well

MicroAmp® Optical 8-Cap Strips

Bio-Rad CFX96™ 3.1 MicroAmp® Fast Optical

96-Well

Qiagen Rotor- Gene Q 5plex

HRM

2.3.1 OR Q-Rex 1.0.0 Qiagen Strip Tubes and Caps, 0,1 mL

Roche LightCycler® 480 II 1.5.1 LightCycler® 480 Multiwell

Plate 96

LightCycler® 480 clear caps

QuantStudio™ 5 1.3.1 MicroAmp® Fast Optical 96-Well

StepOnePlus™ 2.2.2 MicroAmp® Fast Optical 96-Well

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6 Obtención de muestras y extracción de ADN

La calidad del ADN extraído está inherentemente vinculada a la sensibilidad que logran los análisis de la PCR en tiempo real y, por lo tanto, las muestras deben obtenerse y almacenarse de la forma adecuada siguiendo las directrices que se mencionan a continuación.

l Las muestras deben extraerse a partir de sangre con ácido edético, plasma con ácido edético,

suero o líquido de lavado broncoalveolar en plataformas de extracción disponibles siguiendo las recomendaciones para la extracción de ADN a partir de Aspergillus fumigatus publicadas por la European Aspergillus PCR Initiative (EAPCRI)11,12_.

l Las prácticas recomendadas de laboratorio sugieren incluir al menos un control positivo y uno

negativo por análisis para la extracción.

l Las muestras extraídas deben almacenarse a una temperatura de entre –80 °C y –20 °C para

un almacenamiento prolongado.

Nota Las concentraciones bajas de ADN pueden ser inestables si se almacenan durante periodos prolongados.

Referencias

11. White, J.Clin.Microbiol., 2010, 3753-5 12. White, J.Clin.Microbiol., 2011, 3842-8

6.1 Protocolos de extracción utilizados en la validación

Los protocolos utilizados para la extracción de ADN en las evaluaciones del rendimiento se mencionan en la Tabla 4. Bruker está en la capacidad de recomendar estos procedimientos de extracción, pero no se hace responsable del rendimiento de ninguno de los protocolos mencionados y aconseja a los usuarios que realicen una validación interna de sus plataformas y procedimientos específicos. Para la extracción de muestras de BAL, se recomienda el batido de microesferas por pasos.

Tabla 4 Protocolos de extracción

Plataforma de extracción Kit de extracción utilizado Volumen de entrada de la extracción Volumen de elución de la extracción Qiagen QIAsymphony DSP virus pathogen

Midi Kit 1000

1000 µL 65 µL

Qiagen EZ1 EZ1 DSP Virus kit 400 µL 60 µL

bioMérieux NucliSENS® easyMag®

Generic 2.0.1 with Nuclisens lysis buffer

500 µL 60 µL Procedimiento de extracción MANUAL QIAamp UltraSens Virus Kit 35 µL 32 µL

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7 Procedimiento de análisis

7.1 Configuración de la PCR

ATENCIÓN

Bruker recomienda utilizar una sala limpia (sala de la PCR) para configurar todas las PCR con la adición de una plantilla en un área adecuada que se encuentre fuera de las instalaciones de la sala limpia. Con el fin de evitar cualquier riesgo de contaminación, los usuarios deben seguir las prácticas recomendadas de laboratorio en todo momento y aislar el flujo de trabajo de la forma adecuada. Debe utilizarse material de plástico

sin desoxirribonucleasa o ribonucleasa.

l Antes de iniciar la configuración de la PCR, el usuario es responsable de asignar las muestras a

los pocillos correspondientes del material de plástico adecuado; esta información debe registrarse con fines de trazabilidad.

l En el área sin amplicones, retire el Fungiplex Aspergillus PCR Kit del congelador y deje que se

descongelen los reactivos.

l Mezcle con un agitador vórtex brevemente y centrifugue la mezcla maestra para PCR

suministrada, “MM para PCR”, y la mezcla maestra de cebador o sonda, MM de Aspergillus.

l Prepare una mezcla maestra para PCR con los reactivos y los volúmenes que se describen en la

Tabla 5. Los volúmenes se ofrecen por pocillo de reacción y deben multiplicarse por la cantidad de pocillos de reacción teniendo en cuenta la cantidad de muestras y los controles positivo y negativo del análisis. La mezcla maestra preparada para la PCR debe mezclarse de forma exhaustiva y centrifugarse durante 10 segundos.

Tabla 5 Volúmenes de preparación para la mezcla maestra para PCR en un área sin amplicones

Reactivos del kit de análisis Mezcla maestra para PCR

MM para PCR 10,0 µL

MM de Aspergillus 1,0 µL

Agua de grado PCR 3,0 µL

Volumen total (por pocillo) 14,0 µL

Ejemplo: para 8 muestras, 1 control positivo y 1 control negativo, el volumen final de la

mezcla maestra para PCR será de 10 × 14 = 140 µL.

l Antes de dispensar la mezcla maestra para PCR en los pocillos de reacción, transfiérala al área

de adición de la plantilla o la muestra para incluir el control interno.

l Retire el Fungiplex Aspergillus Control Kit del congelador y deje que se descongelen los

reactivos.

l Debe añadirse el material de control interno a la mezcla maestra para PCR. El control interno se

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Reactivos de la mezcla maestra y control interno Mezcla maestra para PCR Mezcla maestra para PCR

(de la Tabla 5)

14 µL

Material de control interno 1 µL

Volumen total (por pocillo) 15 µL

Ejemplo: para 10 pocillos de reacción (8 muestras, 1 control positivo y 1 control negativo),

deben añadirse 10 µL del material de control interno a la mezcla maestra total. Para 10 pocillos de reacción, esto proporcionará un volumen final de mezcla maestra para PCR de 150 µL.

l Vierta 15 µL de la mezcla maestra para PCR en los pocillos requeridos del material de plástico

correspondiente.

l Para cada muestra, añada 5 µL del material de muestra extraído a la mezcla maestra para PCR

(consulte Tabla 7).

l Para cada control positivo, añada 5 µL de control positivo Aspergillus a la mezcla maestra para

PCR. Debe incluirse al menos una reacción de control positivo a fin de proporcionar detalles sobre la eficiencia de la reacción.

l Para cada control negativo, añada 5 µL de control negativo a la mezcla maestra para PCR.

Debe incluirse al menos una reacción de control negativo a fin de proporcionar detalles sobre la contaminación.

Tabla 7 Volúmenes dispensados por pocillo de reacción de mezcla maestra para PCR Composición del pocillo de reacción para la PCR Mezcla maestra para PCR

Mezcla maestra para PCR y control interno 15 µL

Plantilla del material de muestra/control 5 µL

Volumen final (por pocillo) 20 µL

l En este momento debe sellarse el material de plástico y transferirse a un termociclador validado

para multiplicación. Asegúrese de haber centrifugado brevemente las muestras antes de colocarlas en el termociclador. Consulte el manual de instrucciones del instrumento para obtener más detalles sobre cómo configurar un ciclo de multiplicación. La multiplicación debe realizarse conforme a los parámetros específicos del instrumento descritos en la sección 8.

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8 Condiciones del termociclador

8.1 ABI 7500

Consulte el manual de instrucciones para obtener información sobre cómo utilizar el instrumento para PCR en tiempo real y realizar análisis de los datos.

Es importante inspeccionar visualmente los trazados de multiplicación de cada muestra con el fin de garantizar que los resultados registrados corresponden a una multiplicación verdadera y no pueden atribuirse al ruido de fondo registrado por encima de los umbrales definidos.

Seleccione el fluorocromo adecuado dentro de cada canal y asígnelo al objetivo relevante, como se muestra en la Tabla 8.

Tabla 8 Canales del detector utilizados para detectar la presencia de objetivos de Aspergillus con el ABI 7500

GREEN YELLOW ORANGE

Canal de tinción indicador FAM JOE Texas Red

Colorante inhibidor Ninguno Ninguno Ninguno

Objetivo detectado con Fungiplex Aspergillus

Control interno Aspergillus spp. A. terreus

Configure el ABI 7500 con los siguientes ajustes:

l Tipo de instrumento: 7500 Fast (96 pocillos)

l Tipo de experimento: cuantificación; curva estándar l Reactivos utilizados: reactivos TaqMan®

l Velocidad de rampa: estándar l Volumen de reacción: 20 µL

l Tinte de referencia pasiva: ninguno

Consulte la Tabla 9 para conocer los ajustes del perfil térmico. Los datos deben obtenerse para los 45 ciclos.

Tabla 9 Parámetros de la PCR para el análisis Fungiplex Aspergillus Real-Time PCR

Paso Temperatura (°C) Duración Cantidad de ciclos Obtención de datos

Activación 95 15 min 1 Desactivada

Desnaturalización 95 5 s 45 Desactivada Hibridación o extensión 60 30 s Activada

Para analizar los datos, garantice que el tinte de referencia pasiva ROX está desactivado y en Options anule la selección de la casilla correspondiente al umbral automático de cada objetivo. La línea base debe continuarse calculando de forma automática.

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Canal FAM JOE TEXAS RED

Target(s) Control interno Aspergillus spp. A. terreus

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8.2 Rotor-Gene Q

Tabla 11 Canales del detector utilizados para detectar la presencia de objetivos de Aspergillus con el Rotor-Gene

Canal de tinción indicador GREEN YELLOW ORANGE

Configure el software del Rotor-Gene Q/Q-Rex con los siguientes ajustes:

l Seleccione “72-well rotor” l Volumen de reacción: 20 µL

l Implemente Auto Gain únicamente para los canales de tinción seleccionados. En el caso de

RotorGene Q, configúrela para implementarse antes de la primera adquisición en el pocillo de control positivo; en el caso de Q-Rex, use el método predeterminado/ganancia automática. Consulte la Tabla 12 para conocer los ajustes del perfil térmico. Los datos deben obtenerse para los 45 ciclos.

Para analizar los datos, aplique los siguientes ajustes:

RotorGene Q

l Normalización: seleccione Dynamic Tube y Slope Correct.

l Analice todos los ciclos e introduzca los valores de extracción de umbral y de valores atípicos

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RotorGene Q-Rex

l Use el método de Absolute Quantification Analysis.

l Normalización: seleccione Dynamic Tube y Use Noise Slope Correction.

l Analice todos los ciclos e introduzca el umbral para cada canal como se describe en la Tabla 13. l Datos de filtro: seleccione remove non-amplified curves with e introduzca el porcentaje de

fluorescent change (cambio de fluorescencia) para cada canal como se describe en la

Tabla 13.

Tabla 13 Valores del umbral de Rotor-Gene Q y Q-Rex para el análisis Fungiplex Aspergillus Real-Time PCR

Canal GREEN YELLOW ORANGE

Threshold 0,100 0,126 0,040

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8.3 CFX96

Tabla 14 Canales del detector utilizados para detectar la presencia de objetivos de Aspergillus con el CFX96

Canal de tinción indicador FAM VIC Texas Red

Configure el CFX96 con los siguientes ajustes:

l Volumen de muestra: 20 µL

l Modo de exploración: todos los canales l Tipo de placa: transparente BR

Para analizar los datos, seleccione lo siguiente en Baseline Setting:

l Baseline Subtracted Curve fit (Ajuste de la curva con sustracción de la línea base) l Apply fluorescent drift correction (Aplicar corrección de la deriva de la fluorescencia)

Para ajustar los valores del umbral de cada canal del detector, vaya a Baseline threshold > Single

threshold > User defined e introduzca los valores de la tabla 16. La línea base debe permanecer

como auto-calculated.

Tabla 16 Valores del umbral de CFX96 para el análisis Fungiplex Aspergillus Real-Time PCR

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8.4 QuantStudio 5

En la Tabla 17 se detallan los objetivos detectados por los canales correspondientes del detector. Configure estos tintes como los tintes indicadores.

Tabla 17 Canales del detector utilizados para detectar la presencia de objetivos de Aspergillus con el QuantStudio 5

Canal de tinción indicador FAM VIC JUN

Configure el QuantStudio 5 con los siguientes ajustes:

l Volumen de muestra: 20 µL

l Modo estándar (con velocidades de rampa de 1,6 °C/s)

Para analizar los datos, garantice que el tinte de referencia pasiva ROX está desactivado y anule la selección de la casilla correspondiente al umbral automático de cada objetivo. La línea base debe continuarse calculando de forma automática.

Utilice la información de la Tabla 19 para ajustar los valores del umbral de cada canal del detector en la ventana Analysis settings.

Tabla 19 Valores del umbral de QuantStudio 5 para el análisis Fungiplex Real Time PCR

Canal FAM VIC JUN

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8.5 Protocolo para compensar el color con el

LightCycler 480 II

El Fungiplex Aspergillus IVD PCR Kit se suministra con un kit de compensación del color para usarlo con el LightCycler 480 II. Siga las instrucciones en esta sección para crear un archivo de compensación del color antes de procesar cualquier muestra con el Fungiplex Aspergillus IVD PCR Kit.

Retire el Fungiplex Aspergillus Color Compensation Kit del congelador y deje que se descongele. Mézclelo completamente con un agitador vórtex una vez se haya descongelado.

Se deben preparar cuatro mezclas maestras independientes combinando cada uno de los reactivos etiquetados y detallados individualmente en la Tabla 20-Tabla 23. En cada mezcla maestra, use las alícuotas de cebador o sonda correspondientes.

Tabla 20 Preparación de cada una de las mezclas maestras para la compensación de color:

Aspergillus spp. (Yakima Yellow)

Componentes de la Mezcla maestra para la compensación de color: Aspergillus spp. Volumen MM de Aspergillus spp. 7 µL MM para PCR 70 µL Agua de grado PCR 28 µL Plásmido de Aspergillus spp. 35 µL Total 140 µL

Tabla 21 Preparación de cada una de las mezclas maestras para la compensación de color:

A. terreus (Texas Red)

Componentes de la Mezcla maestra para la compensación de color: A. terreus Volumen

MM de Aspergillus terreus 7 µL

MM para PCR 70 µL

Agua de grado PCR 28 µL

Plásmido de Aspergillus terreus 35 µL

Total 140 µL

Tabla 22 Preparación de cada una de las mezclas maestras para la compensación de color: control interno (FAM)

Componentes de la Mezcla maestra para la compensación de color: control interno Volumen MM de control interno 7 µL MM para PCR 70 µL Agua de grado PCR 56 µL Control interno 7 µL

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blanco (agua)

Componentes de la Mezcla maestra para la compensación de color: blanco Volumen

MM para PCR 70 µL

Agua de grado PCR 70 µL

Total 140 µL

Después preparar las cuatro mezclas maestras independientes, mézclelas con un agitador vórtex para asegurarse de que estén lo suficientemente mezcladas y centrifugue.

Vierta 20 µL de cada mezcla maestra en 6 pocillos de material de plástico adecuado. Esto dará un total de 24 muestras para analizar. Selle las muestras y transfiéralas al LightCycler 480 II.

Configure el LightCycler 480 II con los siguientes ajustes:

l Configure el formato de detección para el ciclo del análisis Fungiplex Aspergillus Real- Time

PCR yendo a Settings > Set detection format y asigne un nombre al archivo nuevo (nombre sugerido del archivo: análisis Fungiplex Aspergillus Real-Time PCR)

o Marque 465-510 y etiquete FAM

o Marque 533-580 y etiquete Yakima Yellow o _{Marque 533-610 y etiquete Texas Red} o Marque 618-660 y etiquete Cy5

o Se deben configurar todos los tintes para que tengan un Melt Factor de 1, un Quant Factor

de 10 y un Maximum Integration Time de 2 segundos

o Guarde el formato de detección l Volumen de reacción: 20 µL

Siga el manual de instrucciones para configurar el perfil térmico que se describe en la Tabla 24. El análisis debería tardar en finalizar cerca de 1 hora y 40 minutos.

Tabla 24 Perfil térmico para la compensación de color en el LightCycler 480 II

Paso Temperatura (°C) Duración Cantidad de ciclos Modo de análisis Obtención de datos

Preincubación 95 15 min 1 Ninguno Ninguna

Desnaturalización 95 5 s 45 Cuantificación Ninguna Hibridación o extensión 60 30 s Adquirir Gradiente de temperatura 95 30 s 1 Compensación de color Ninguna 40 30 s Ninguna 80 5 adquisiciones por °C Continua

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proporcionan en la Tabla 25.

Tabla 25 Canales dominantes asociados a los objetivos de Aspergillus para la creación de archivos de compensación de color

Objetivo de Fungiplex Aspergillus Canal dominante

Control interno FAM

Aspergillus spp. Yakima Yellow

A. terreus Texas Red

Blanco Agua

Use este archivo de compensación de color específico para Aspergillus en los datos resultantes de Fungiplex Aspergillus PCR después del análisis de acuerdo con la sección 8.6.

(24)

8.6 Protocolo para la PCR con el LightCycler 480 II

En la Tabla 26 se detallan los objetivos detectados por los canales correspondientes del detector. Configure estos tintes como los tintes indicadores.

Tabla 26 Canales del detector utilizados para detectar la presencia de objetivos de Aspergillus con el LightCycler 480 II

Canal de tinción indicador FAM Yakima Yellow Texas Red

Use el formato de detección configurado en la sección 8.5 (nombre sugerido del archivo: análisis Fungiplex Aspergillus Real-Time PCR) y use el LightCycler 480 II con los siguientes ajustes:

l Volumen de reacción: 20 µL

Activación 95 15 min 1 Ninguna

Desnaturalización 95 5 s 45 Ninguna Hibridación o extensión 60 30 s Adquirir

Analice los datos con Absolute quantification / second derivative max. Los datos se analizan con el archivo de compensación de color preparado en la sección 8.5.

Utilice la información de Tabla 28 para ajustar los valores del umbral de cada canal del detector en la ventana Analysis settings.

Tabla 28 Valores del umbral de LightCycler 480 II para el análisis Fungiplex Aspergillus Real-Time PCR

Canal FAM Yakima Yellow Texas Red

Threshold 2nd derivative auto-calculated

2nd derivative auto-calculated

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8.7 StepOnePlus

Tabla 29 Canales del detector utilizados para detectar la presencia de objetivos de Aspergillus con el StepOnePlus

Canal de tinción indicador FAM JOE ROX

Configure el StepOnePlus con los siguientes ajustes:

l Tipo de instrumento: StepOnePlus (96 pocillos) l Tipo de experimento: cuantificación

l Método de cuantificación: curva estándar l Reactivos utilizados: reactivos TaqMan® l Velocidad de rampa: estándar

l Volumen de reacción: 20 µL

l Tinte de referencia pasiva: ninguno

Para analizar los datos, garantice que el tinte de referencia pasiva ROX está desactivado y en Options anule la selección de la casilla correspondiente al umbral automático de cada objetivo. La línea base debe continuarse calculando de forma automática.

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PCR

Canal FAM JOE ROX

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9 Interpretación de los resultados

9.1 Control interno

No se requiere la detección de un control interno si existe un resultado positivo. En los casos en que ha fallado un control interno, pero la muestra se ha notificado como positiva para una o más especies de

Aspergillus, el resultado positivo debe considerarse válido.

En los casos en que la muestra se notifique como negativa para todos los objetivos y el control interno sea negativo, el usuario debe repetir el análisis con los mismos extractos. Si, posteriormente, el control interno se notifica como positivo, es probable que el resultado original se debiera a un error de manipulación o de inhibición de la PCR y debe notificarse cualquier nuevo resultado.

Si el control interno sigue notificándose como negativo tras repetir el análisis, debe volver a analizarse la muestra, empezando por el paso de extracción.

9.2 Controles positivos y negativos

En cada análisis debe incluirse al menos un control positivo y uno negativo del kit de controles suministrado. Cada control negativo o positivo debe prepararse y analizarse de la misma forma que se realiza para las muestras del paciente.

Un control negativo que arroja un resultado positivo del análisis indica un problema con la manipulación de la muestra o su contaminación. En este caso, deberá repetirse el ciclo de análisis utilizando una alícuota recién obtenida del material de control negativo garantizando que el área de trabajo y el equipo estén adecuadamente descontaminados y que se tomen precauciones extremas durante la configuración de la PCR.

Un control positivo que arroja un resultado negativo indica un fallo del reactivo o de la manipulación de la muestra. Antes de repetir el ciclo de análisis, y tomando precauciones extremas durante la configuración de la PCR, asegúrese de que todos los reactivos se hayan almacenado de forma correcta y, cuando sea necesario, de que no hayan caducado. En la Tabla 32 se incluyen resultados esperados para el control positivo.

Tabla 32 Resultados esperados para el control positivo

Fungiplex Aspergillus Real-Time PCR

Objetivos positivos esperados Aspergillus spp. POSITIVO

+

A. terreus POSITIVO

9.3 Muestras del paciente/sin determinar

Inspeccione visualmente los trazados de multiplicación de cada muestra en todo momento con el fin de garantizar que los resultados registrados corresponden a una multiplicación verdadera y no pueden atribuirse al ruido de fondo registrado por encima de los umbrales definidos.

Las muestras enviadas para analizar con el análisis Fungiplex Aspergillus Real-Time PCR pueden poseer cargas significantemente distintas de material presente y gran parte de este podría estar muy

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Canal Objetivo notificado Valor C

t Interpretación del resultado

Green Control interno > 10 Control interno APROBADO

N/A o < 10 Control interno RECHAZADO

Yellow Aspergillus spp. < 45 Muestra positiva

N/A Muestra negativa

Orange A. terreus* < 45 Muestra positiva

N/A Muestra negativa

*Los resultados positivos de A. terreus también pueden producir un resultado positivo de

Aspergillus spp. Esto se debe a la similitud de la secuencia. En ocasiones, cuando tanto A. terreus

como Aspergillus spp. son positivos, es más probable que se deba a una muestra positiva de A. terreus y que ello no necesariamente infiera una infección doble.

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10 Características de rendimiento

Las características de rendimiento identificadas durante todo el proceso de verificación y validación del análisis Fungiplex Aspergillus Real-Time PCR se incluyen en la Tabla 34 y la Tabla 35. En la Tabla 34 se proporciona el rendimiento analítico con cantidades conocidas de material analizado en el límite de detección (LD) de 20 copias de entrada y valores superiores (ADN), mientras que en la Tabla 35 se incluyen los datos de rendimiento clínico obtenidos tras una evaluación del rendimiento de varios centros.

Tabla 34 Características de rendimiento analítico del análisis Fungiplex Aspergillus Real-Time PCR

Sensibilidad (%) Especificidad (%)

Muestras sustitutivas 99,33 98,53

Tabla 35 Características de rendimiento clínico del análisis Fungiplex Aspergillus Real-Time PCR

Tipo de muestra Resultado único Resultado duplicado

Muestras simuladas de suero Sensibilidad (%) 95,83

-Especificidad (%) 96,49

-Muestras simuladas de BAL Sensibilidad (%) 85,00

-Especificidad (%) 96,43 -Muestras clínicas retrospectivas Sensibilidad (%) 95,24 70,00

Especificidad (%) 89,66 100,00

Muestras clínicas prospectivas Sensibilidad (%) N/A N/A

Especificidad (%) 90,18 98,55

Las cifras del rendimiento clínico están basadas en:

l Muestras simuladas de suero analizadas en un rango de concentración de 1-1000 UFC/0,5 mL l Muestras simuladas de BAL analizadas en un rango de concentración de 1- 100 genomas y

1-100 conidios/0,5 mL

l El análisis retrospectivo se realizó en 274 muestras obtenidas de 41 pacientes categorizados

como IA comprobada/probable, o “sin evidencia de enfermedad fúngica” (conforme a los criterios de la EORTC)

l El análisis prospectivo se realizó en 132 muestras obtenidas de 65 pacientes con enfermedades

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11 Eliminación

Eliminación general

Elimine cualquier reactivo sin utilizar, residuo y material de envío conforme a la normativa nacional, provincial y local.

Eliminación de hielo seco

El hielo seco contiene CO

2 y debe manipularse con guantes en un área con una ventilación adecuada. Elimine todo hielo seco conforme a la normativa nacional, provincial y local.

Eliminación del paquete

Elimine todos los materiales del paquete conforme a la normativa local de reciclaje.

Las instrucciones de eliminación anteriores se aplican a los Estados miembros de la UE. Eliminar correctamente este producto contribuirá a conservar recursos naturales y garantizar que se recicla de forma que impida posibles consecuencias negativas para el medioambiente y la salud de las personas. Si desea obtener información adicional, póngase en contacto con su centro local de eliminación de residuos.

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12 Explicación de los símbolos

Los siguientes símbolos pueden estar en las etiquetas del Fungiplex Aspergillus IVD PCR Kit o en estas Instrucciones de uso.

Símbolo Descripción

Utilizar antes del DD-MM-AAAA

Número de lote Fabricante

Producto sanitario para diagnóstico in vitro

Contiene suficiente para <n> análisis

Número de referencia del producto

Límite inferior y superior de temperatura de almacenamiento

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13 Fabricante

Bruker Daltonik GmbH

Fahrenheitstraße 4 28359 Bremen Alemania

Soporte técnico

Correo electrónico: [email protected]

Teléfono: 00800-BRKRSUPPORT (00800-27577877678)

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